בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

1Department of Veterinary & Biomedical Sciences, University of Minnesota, 2Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University, 3School of Biotechnology, Gautam Buddha University
* These authors contributed equally
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Singh, G., Fritz, S. M., Ranji, A., Singh, D., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution. J. Vis. Exp. (119), e54391, doi:10.3791/54391 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

שלאחר תעתיק ביטוי גנים מוסדר בדיוק, החל שעתוק ה- DNA בגרעין. בשליטת RNA מחייב חלבונים (RBPs), biogenesis mRNA וחילוף החומרים להתרחש חלקיקים ribonucleoprotein מאוד דינמי (RNPs), אשר כלולות לנתק עם mRNA מבשר המצע במהלך ההתקדמות של RNA מטבוליזם 1-3. שינויים דינמיים רכיבי RNP להשפיע על הגורל שלאחר התעתיק של mRNA ולספק אבטחת איכות במהלך העיבוד של תמלילים עיקריים, הסחר ולוקליזציה הגרעין שלהם, פעילותם כתבניות mRNA לתרגום, ואת המחזור הסופי של mRNAs הבוגרת.

חלבונים רבים מיועדים RBPs מכוח תחומי חומצת אמינו המשומר שלהם, כוללים מוטיב הכרת רנ"א (RRM), תחום מחייב פעמים התקועות RNA (RBD), והוא משתרע של שאריות בסיסיות (למשל, ארגינין, ליזין, גליצין) 4. RBPs הם שגרתימבודד על ידי אסטרטגיות immunoprecipitation ו מוקרנים לזהות RNAs מאותו המקור שלהם. חלק RBPs שיתוף להסדיר-mRNAs מראש כי הם-קשורות מבחינה פונקציונלית, יועד regulons RNA 5-8. RBPs אלה, mRNAs מאותו המקור שלהם, ולפעמים RNA ללא קידוד, יוצרים RNPs קטליטי שמשתנה רכב; ייחודם נובע שילובים שונים של גורמים הקשורים, כמו גם לרצף הזמני, מיקום, ומשך האינטראקציות ביניהם 9.

Immunoprecipitation RNA (RIP) היא טכניקה רבת עוצמה כדי לבודד RNPs מתאי ולזהות תמלילי הקשורים באמצעות רצף ניתוח 10-13. מעבר מ מועמד הגנום כולו הקרנה אינה ריאלית באמצעות RIP בשילוב עם ניתוח microarray 14 או רצף תפוקה גבוהה (RNA-seq) 15. כמו כן, חלבונים-מזרז שיתוף יכולים להיות מזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה, אם הם נמצאים בשפע מספיק להפרדת הנוגדן מזרז-שיתוף 16,17. כאן, אנחנו כתובת המתודולוגיה לבידוד רכיבי RNP של רנ"א מאותו מקור ספציפי מתא אדם תרבותי, אם כי הגישה היא עָשׂוּי לְהִשׁתָנוֹת עבור lysates המסיס של תאי צמח, פטריות, וירוסים, חיידקים. ניתוחים Downstream של החומר כוללים זיהוי המועמד ואימות על ידי immunoblot, ספקטרומטריית מסה, assay האנזימטית ביוכימיים, RT-qPCR, microarray, ו RNA-seq, כפי שמסוכם איור 1.

בהתחשב התפקיד הבסיסי של RNPs בשליטת ביטוי גנים ברמה שלאחר התעתיק, שינויים בביטוי של RBPs רכיב או נגישותן מאותו מקור RNAs יכול להיות מזיק עבור התא ומזוהה עם כמה סוגים של הפרעות, כולל מחלות נוירולוגיות 18. DHX9 / RNA helicase A (RHA) הוא הכרחי עבור התרגום של mRNAs שנבחרו ממוצא הסלולר retroviral 6. RNAs מאותו מקור אלה להפגין אלמנטים ציס-מתנהג מבנית הקשורה בתוך שלהם5 'UTR, אשר יועד אלמנט השליטה שלאחר תעתיק (PCE) 19. RHA-PCE שפעילות מתבקשת על תרגום הכובע תלוי היעיל של רטרווירוסים רבים, כולל HIV-1, ושל גני רגולטוריים צמיחה, כוללים ג'ונד 6,20,21. קודד על ידי גן חיוני (dhx9), RHA חיוני התפשטות תא ומטה בתקנה שלה מבטל כדאיויות תא 22. הניתוח המולקולרי של RHA-PCE RNPs הוא צעד חיוני כדי להבין מדוע פעילות RHA-PCE יש צורך לשלוט התפשטות תאים.

האפיון המדויק של רכיבי RNP RHA-PCE על מצב יציב או על הפרעות פיסיולוגיות של התא דורש להעשרת סלקטיבית לכידתו של RNPs RHA-PCE בשפע מספיק לניתוח במורד זרם. הנה, retroviral PCEgag RNA תויגה עם 6 עותקים של אתר הקישור RNA ציס-מתנהג לחלבון מעיל MS2 (CP) בתוך מסגרת קריאה פתוחה. החלבון מעיל MS2 היה Exoהשיתוף הביע genously עם RNA PCEgag ידי transfection פלסמיד כדי להקל על הרכבת RNP בתאים גדלו. RNPs המכיל חלבון מעיל MS2 עם RNA PCEgag מאותו מקור MS2-tagged היו immunoprecipitated מהתמצית התא שנתפסו על חרוזים מגנטיים (איור 2 א). כדי סלקטיבי ללכוד את רכיבי RNP המאוגדים PCE, את משותקת RNP הודגר עם oligonucleotide משלים רצפי דיסטלי PCE, ויוצרים היברידי RNA-DNA כי הוא המצע לפעילות RNase H. מאז PCE ממוקמת ב 'מסוף של 5' 5 באזור הלא מתורגם, את oligonucleotide היה משלים רצפי הרנ"א סמוך לאתר תחילת התרגום retroviral (קודון ההתחלה איסור פרסום). RNase H מחשוף בסמוך לנקודת התחלת איסור פרסום קודון שוחרר במתחם UTR '5 מן RNP המשותקת, אשר נאספה כמו eluent. לאחר מכן, המדגם הוערך על ידי RT-PCR כדי לאשר את לכידתו של PCEgag ועל ידי PAGE ו immunoblot SDS כדי לאשר את captuמחדש של חלבון מעיל MS2 היעד. אימות של חלבון מחייב PCE הקשורים RNA, DHX9 / RNA helicase A, בוצע אז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

קומפוזיציות הצפה
לשטוף הצפה:
50 mM Tris-HCl, pH 7.4
150 מ"מ NaCl
3 מ"מ MgCl2
נמוך מלח הצפה:
20 mM Tris-HCl, 7.5 pH
10 מ"מ NaCl
3 מ"מ MgCl2
2 מ"מ DTT
EDTA ללא קוקטייל מעכבי פרוטאז 1x
RNase מתוך 5 μl / מ"ל ​​(מעכב RNase)
Cytoplasmic הצפת תמוגה:
0.2 M סוכרוז
1.2% Triton X-100
NETN-150 לשטוף הצפה:
20 mM Tris-HCl, pH 7.4
150 מ"מNaCl
0.5% NP-40
3 מ"מ MgCl2
10% גליצרול
חיץ מחייב:
10 מ"מ HEPES pH 7.6
40 מ"מ KCl
3 מ"מ MgCl2
2 מ"מ DTT
גליצרול 5%

טבלה 2: קומפוזיציות הצפה.

1. הכנת התאים ואת מטריקס הזיקה

  1. תרבות קו תא מעניין-מפגש קטן (80%) בצלחת 10 סנטימטרים. השתמש 10 ס"מ צלחות עבור immunoprecipitations עצמאית (IP) של חלבון מעיל FLAG-מתויג NLS-MS2. בצעו את IP באמצעות נסיובי לתג FLAG-epitope. היא הביעה את הפלסמיד חלבון מעיל MS2-tagged FLAG, transfect תאים 24-48 שעות מראש של הקציר 20.
    הערה: RNP מסוים עשוי להיות מועשרת גרעיני או בציטופלסמהlysates ic או הכנה ביוכימית-מופרדים, כגון שברים של שיפוע סוכרוז. מומלץ לקצור את lysate מתאי הלא transfected במקביל להנהיג פקד שלילי נוסף.
  2. העברת 60 μl לכל IP של slurry חרוז מגנטי חלבון G לצינור 1.7 מ"ל microcentrifuge.
  3. מניחים את הצינור על מדף אבן שואבת צינורות microcentrifuge להפריד את החרוזים מן פתרון אחסון.
  4. הסר את פתרון האחסון על ידי בקפידה ציור אותו עם micropipette.
  5. הסר את הצינור ממדף המגנט.
  6. לשטוף לאזן את החרוזים עם 600 μl (10 פעמים את נפח בשימוש של חרוזים) של חיץ לשטוף 1x (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 3 מ"מ MgCl 2; ו -150 מ"מ NaCl) וסיבוב הקצה מעל לקצה עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. מניחים את הצינור על מתלה מגנט ולהסיר למאגר לשטוף.
  8. הוסף 10 כרכים (600 μl) של חיץ 1x לשטוף נוגדן FLAG immunoprecipitating אל pr equilibratedחרוזים מגנטיים otein G (בהתאם לסכום המומלץ על ידי היצרן עבור immunoprecipitation) וסוף-יתר בסוף הסיבוב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות כדי להטות את הנוגדן immunoprecipitating. השתמש IgG isotype המקביל כביקורת שלילית נוגדן מתאים.
  9. מניחים את הצינור על מתלה מגנט לאסוף את החרוזים ולהסיר את supernatant.
  10. הסר את הצינור ממדף המגנט ולשטוף את חרוזי מצומדות נוגדן עם 10 כרכים (600 μl) של חיץ וסיבוב לשטוף 1x עבור 3 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על פעולה זו פעמיים.
  11. מניחים את הצינור על מתלה מגנט ולהסיר למאגר לשטוף.

2. קציר RNPs

הערה: הכן את RNPs בזמן הדגירה לאחר שלב 1.8.

  1. הסר בינוני תרבות מן התאים על ידי שאיפה לשטוף את התאים פעמיים עם 1-5 מ"ל של בופר פוספט 1x קר כקרח (PBS). השתמש מגרד תא כדי לסלק רטוב,תאים חסידים לפני לאוסף על ידי צנטריפוגה ב 226 XG במשך 4 דקות ב 4 ° C.
  2. להוסיף 375 μl של קר כקרח, חיץ מלח נמוכה (20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 3 מ"מ MgCl 2; 10 מ"מ NaCl; 2 מ"מ DTT; קוקטייל פרוטאז-מעכב 1x, EDTA ללא; ו -5 μl / מ"ל RNase מונע) אל התא הגלול ולאפשר נפיחות ידי הצבתו על קרח במשך 5 דקות.
    הערה: חייט בהיקף של חיץ מלח נמוך פי לגודל התא הגלול. עבור 1.2 x 10 6 תאים מצלחת 10 סנטימטרים, 375 μl של חיץ מספיק.
  3. כדי לאסוף את lysate תא cytoplasmic, להוסיף 125 μl של חיץ תמוגה קרים כקרח (0.2 M סוכרוז / 1.2% Triton X-100), ולאחר מכן לבצע 10 משיכות עם homogenizer Dounce כי היה מראש צונן בתוך דלי קרח.
    הערה: כדי לאסוף את תמצית התא הכולל, חיץ תמוגה תקן ריפה מומלץ solubilizing nucleoplasm / הכרומטין.
  4. ספין microfuge במהירות שיא (16,000 XG) במשך 1 דקות; זו תנקה את supernatant של פסולתגרעיני nd.
  5. מעבירים את supernatant לצינור microcentrifuge 1.7 מ"ל חדש כי כבר על הקרח. קביעת ריכוז החלבון הכולל על ידי תקן, שיטה מועדפת ומעבדה, כגון ברדפורד Assay 23. שמורת aliquot של 10% לפחות לניתוח כתם מערבי, כדי לשמש פקד קלט. השתמש lysate תא שנקטפו מיד immunoprecipitation או לאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס למשך ניתוח עתידי.
    הערה: מניסיוננו, דגימות אלה ניתן לאחסן ולהשתמש בהם כמה חודשים מאוחר יותר לניתוח immunoprecipitation ללא פשרה של שלמות.

3. Immunoprecipitation

  1. מוסיפים את העוצמה הרצויה של lysate התא שנקטפו, מבוסס על ריכוז החלבון נקבע בשלב 2.5, את החרוזים נוגדן מצומדות היעד. באמצעות חיץ לשטוף 1x, ולהביא את הנפח הכולל עד 600 μl ולסובב-סוף סוף-על במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: פרק זמן זה מספיק כדי ליצורבידוד חזק של מתחמי RNP גבוהה זיקה תוך מזעור הלא ספציפי מחייב. לדלל מקורות RNP חלופיים, כגון שברים של שיפוע סוכרוז, לפחות 1: 1 עם חיץ לשטוף 1x, ולאחר מכן לדגור אותם עם מתחמי חרוז-נוגדן בעבר סיים, כאמור לעיל.
  2. לאחר 90 דקות של דגירה, במקום צינור IP על המדף מגנט לאסוף את החרוזים. שומרים לעצמנו את supernatant כמו זרימה דרך.
    הערה: זה זרימת דרך הראשונה היא מדגם מלא חשוב למדוד יעילות IP. ב assay immunoblot יספק אינדיקציה היעילה IP, כמו גם את הספציפיות של האינטראקציות הנחקרות. מומלץ לשמור supernatant זה לניתוח במורד הזרם.
  3. שטפו את החרוזים RNP הנכנס, מצומדות נוגדן עם 10 כרכים (600 μl) של חיץ לשטוף קר כקרח NETN-150 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 מ"מ NaCl; 3 מ"מ MgCl 2; 0.5% NP40; ו 10% גליצרול) תחת סיבוב עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב 3 פעמים.
    הערה: מאגר זה נבדל למאגר תמוגה וביעילות מפחית עמותות חלשות או שאינן ספציפיות.
  4. בעקבות לשטוף האחרון, resuspend מתחמי RNP משותקת 60 μl של חיץ מחייב 1x קרים כקרח (10 HEPES מ"מ, pH 7.6, 40 KCl מ"מ; 3 מ"מ MgCl 2; 5% גליצרול; ו -2 מ"מ DTT) ובמילואים 10% של חרוזים המורכבים המשותקים עבור כתם מערבי ו -20% עבור בידוד RNA.

4. Elution

  1. התאם את העוצמת הנותרת עד 100 μl עם חיץ מחייב 1x קר כקרח לחמם את הצינור ב 70 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
  2. כדי לבודד מתחמי RNA חלבון מאותו מקור, להוסיף oligonucleotide DNA ~ 30-NT כי הוא משלים את הגבול 3 'רצף של RNA של עניין דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדין (100 ננומטר של oligonucleotide מספיקה).
    הערה: oligonucleotide הוא antisense אל שאריות נוקלאוטיד סמוך התרגום להתחיל באתר של לבנות PCE משמש examplדואר בפרוטוקול זה. השלמת רצף מתאימה מסופקת על ידי תוכן GC ~ 40%. לעצב את מולקולת אנטיסנס קצר הכלאה יעילה באזור משלים המינימום של רנ"א היעד.
  3. להוסיף 5-10 יחידות של RNase H כדי צינור דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 לדבוק רנ"א של RNA: היברידית DNA. מעבירים את supernatant לצינור 1.7 מ"ל microcentrifuge סטרילית; מדגם זה מכיל מתחמי RNP בשבי של עניין.
    הערה: בהתאם הנגישות של רנ"א מאותו המקור, שתיים או יותר סבבי טיפול RNase H עשויים להיות שימושיים כדי להגדיל את שפע המדגם עבור הניתוחים במורד הזרם.
  4. השתמש 20% של eluate בתוך כתם המערבי עבור חלבונים הקשורים ידוע ו -20% של eluate עבור בידוד RNA ואחריו RT qPCR. 60% הנותרים יכולים לשמש עבור ספקטרומטריית מסה או לזהות מרכיבי חלבון.
  5. במקביל, לייחד aliquot של lysate התא השמור בידוד RNA וניתוח RT-PCR. asse זהssment מספק אינדיקציה להעשרת RNA בתוך קומפלקס RNP.
    הערה: יש להשתמש בתכשיר החלבון המבודד כתם מלא מערבי כדי לוודא כי מחשוף RNase H היה יעיל בשחרור RNP ממתחם immunuoprecipitated.

5. חלבון אלקטרופורזה ומערב ניתוח כתם

  1. כ נושא 10-20% מכלל המדגם כדי SDS-PAGE וניתוח immunoblot פי פרוטוקול מעבדה סטנדרטי.
    הערה: שלב זה משמש כדי לאמת IP יעיל וספציפי לפני ניתוח RNA במורד זרם. זה יכול לשמש גם כדי להעריך את רכב החלבון של מתחם RNP מבודד.

אוסף 6. של RNA immunoprecipitated

הערה: בידוד RNA יכול להיעשות על ידי שיטת Trizol או בעקבות הפרוטוקול המתואר.

  1. Resuspend חצי מכלל המדגם ב 750 μl של מגיב thiocyanate guanidinium חומצה לדגור בחדר temperature במשך 5 דקות לפני חילוץ RNA מן מתחמי PCE-RNP בשבי.
  2. הוסף 200 μl של כלורופורם אל הצינור, לנער במרץ ל -10 שניות, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
  3. לאחר צנטריפוגה ב XG 16,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C, לאסוף את השלב המימי לתוך צינור מחדש ולהוסיף נפח שווה של isopropanol. מערבבים היטב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפחות. הוסף 1 μl של כחול גליקול למדגם ולאחסן אותו ב -20 ° C במקפיא במשך ממטרים או עיבוד יעילים במועד עתידי.
  4. צנטריפוגה הצינור ב XG 16,000 במשך 10 דקות ב 4 °. בזהירות לאסוף וזורקים supernatant כדי לא להפריע גלולה RNA; השימוש טיפ micropipette p-200 מומלץ כדי להקל על התהליך.
  5. הוסף 500 μl של אתנול 75% על צינור אחד, מערבולת, ו צנטריפוגות צינורות ב XG 16,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות לאסוף וזורקים supernatant כמו בשלב 6.4. אוויר-לייבש את הגלולה במשך 2-3 דקות ו resuspend ב 100 μl של RNase ללא מים.
    הערה: אין להאריך את זמן האוויר-מתייבש גלולה על מנת למנוע בעיה עם resuspension.
  6. החל 100 μl של מדגם RNA לעמודה לנקות RNA. לעבד אותו באמצעות הפרוטוקול של היצרן. Elute רנ"א 30 μl של מים ולאחסן RNase ללא ב -80 ° C עד 3 חודשים.
    הערה: RNA בודד זו מתאימה לניתוח במורד הזרם על ידי RT-PCR בזמן אמת (qPCR), microarray, וסדר RNA. בהתאם השפע של RNP ואת היעילות שבה RNP עניין מבודד, אותו lysate עלול להיות כפוף להם שניים או יותר סיבובים של IP כדי ליצור RNA מספיק רלוונטי עבור הניתוחים במורד הזרם.

7. RNA שעתוק לאחור והגברה של cDNA על ידי PCR

  1. נושא רנ"א המבודד להפוך שעתוק על ידי פריימר אקראי עם transcriptase הפוך באיכות גבוהה (RT), על פי manufaההוראות של cturer.
  2. כדי להגביר את RNA של עניין, לעצב פריימר antisense גן ספציפי בתוך רצף מחשוף H RNase. השתמש כמויות דומות של מולקולת אנטיסנס קצר, פריימר אקראי, או פריימר אוליגו-DT (ראה לוח חומרים).
    הערה: פריימר אוליגו-DT ו mRNA-adenylated פולי לספק תגובות בקרה חיוביות עבור תגובות RT-PCR.
  3. שמור 5% של תגובת RT (1 μl) עבור preparative qPCR נעשתה בד בבד עם IP lysate שלילי מלא דגימות DNA חיובי שליטה להגדיר את החיתוך לייצר עקומת סטנדרט. אם הערך CT של qPCR preparative הוא מעבר לטווח של עקומת סטנדרט, לדלל את התגובה RT ב ברציפות 1: 5 דילולים וחזור על שלב 7.2.
    הערה: עבור רצף RNA וטכניקת ספקטרומטריית מסה, עיין קובץ השיטה המשלים. אנא לחץ כאן to לקבלת קובץ שיטת משלים זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות RIP לפני מזוהה RNAs איסור פרסום retroviral נבחרים RNAs הסלולר כי שיתוף המשקע עם DHX9 / RHA, כולל HIV-1 6, ג'ונד 6 וחור (פריץ ובוריס-לאוורי, לא פורסם). 5 retroviral 'UTR הודגמה לשתף המשקע עם DHX9 / RHA בגרעין לשתף לבודד בציטופלסמה על polyribosomes. זה מוגדר באופן ייחודי כמו אלמנט השליטה שלאחר תעתיק -acting cis (PCE) 6. כדי לבודד PCEgag מתחמי ribonucleoprotein RNA-RHA (RNPs) נוצר בתאים מתרבים, ביצענו FLAG-MS2 immunoprecipitation RNP lysates תא HEK293 transfected. התוצאות מראות ממטרים יעילים של חלבון FLAG-MS2. יש לציין, DHX9 / RHA מזוהה בתוך מורכבות RNP זה אינם מצויים בשליטת אלוטיפ IgG, ולא בתוך lysate התא שלילי שליטה HEK293 (איור 2 א). המטריצה ​​המכילה את RNPs הודגר עם משלימים 30oligonucleotide -nt, ואחר כך מחשוף H RNase של היברידית RNA-DNA בוצע. לאחר עיכול RNase H, eluates נותח על ידי מערבי סופג. המחשוף הפגין RNase H של RNA PCEgag במיקום ההיברידי RNA-DNA פרסם את מורכבות RNP כבול ספציפית UTR '5. DHX9 / RHA הקשורים RNPs נקבעו להיות מועשר ב eluents. חשוב לציין כי RNPs הנכנס FLAG-MS2 נשאר עם חרוזי נוגדן מצומדות (איור 2 ב). שיתוף immunoprecipitation של לולאה גזע MS2 המכיל retroviral PCEgag RNA בתאים וב eluents קיבלה תוקף על ידי RT-PCR ו qRTPCR (איור 2 ג). התוצאות אישרו עמותה בחר בין DHX9 / RHA ואת 5 retroviral 'UTR, אשר כבר מסומן בתור RNP ייחודי חשוב לשליטה התרגום ממוקד 6.

איור 1
איור 1: Rבידוד NP ואת העשרת RNPs ספציפיות הקשורות 5 'UTR של PCEgag ידי מחשוף RNase H. Workflow מראה את השלבים לבודד ribonucleoprotein שנבחר יצר דה נובו בתאי, גבייתו ידי מחשוף RNaseH מונחה oligonucleotide, ועל הניתוח במורד הזרם של רכיבי RNA וחלבונים. סיכום של זיקה כרומטוגרפיה באמצעות אינטראקציה גבוהה זיקה בין multimers עבור גזע לולאה RNA MS2 ואת החלבון MS2 במעטה חלבוני-FLAG היתוך ללכוד RNA PCE על חרוזים FLAG. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: RNA PCEgag המכיל 6 אתרי הקישור MS2 RNA נתפס על ידי חלבון מעיל MS2 FLAG-מתויג משותקת, ו RNPs ספציפיות הקשורות 5 'UTR היושפורסם על ידי מחשוף RNase H מכוון oligonucleotide. HEK293 תאים היו שיתוף transfected עם pAR200 (פלסמיד המכיל את PCEgag ו 6x MS2 לולאות אינטרון HIV) פלסמיד המבטאים את חלבון MS2 FLAG-מתויג epitope עם רצף לוקליזציה גרעיני (NLS). תאים נאספו בציטופלסמה היה מבודד ב 48 שעות שלאחר transfection. את lysates cytoplasmic היו נתונים immunoprecipitation עם נוגדן או FLAG או פקד IgG. (א) יעילות IP נקבעה על ידי immunoblot באמצעות נוגדן אנטי דגל. DHX9 / RHA, חלבון מחייב PCE, שימש כביקורת חיובית; PCE המכילים RNA immunoprecipitated עם חלבון MS2. Lanes 1-3: חלבוני קלט המשמשים IP. Lanes 4-5: FLAG IP של FLAG MS2 overexpressed lysate ו lysate תא cytoplasmic HEK293. ליין 6: IgG IP של FLAG MS2 overexpressed lysate. Lanes 7-9: זרימה דרך של כתובות IP. (ב) 5 'UTR הנכנס RNPs הועשר על ידי מחשוף RNase H. Lanes 1-3: Eluates של חלבון UTR נכנס '5 על ידי RNase ח Lanes 4-6: חלבונים חייבים חרוזי מצומדות נוגדנים. (C) PCR טרנסקריפטאז הפוך ו PCR כמותי בזמן אמת של RNA ספציפי חייב שברים שונים של RNPs. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בידוד RNP ואסטרטגית זיהוי RNA מאותו המקור המתואר כאן הוא אמצעי סלקטיבית של חוקרת אינטראקצית RNA חלבון ספציפית לגילוי חלבוני מועמד שיתוף ויסות RNP ספציפי בתאים.

היתרון של שימוש מכוון oligonucleotide מחשוף RNase H לבודד RNPs הוא היכולת ללכוד במיוחד לנתח את ציס-מתנהג RNP אלמנט RNA מעל RNPs הטרוגנית הכבול במורד לאלמנט RNA ציס-בפועל של עניין. בגלל השפע של רנ"א מאותו מקור בתוך RNP נתונה הנו חלק מינורי של RNPs שנאסף מבודד ללא מחשוף RNase H, החסרון העיקרי זרימת עבודה זו הוא המחסור של RNP מאותו המקור. מניסיוננו, מגבלה זו חייבה 5 עד פי 10 חומר-מוצא יותר IP RNA קונבנציונאלי לגילוי ב immunoblot רגיש פרוטאומיקה מנתח. יתרון נוסף שמספק לשתק את RNP הוא הנוחות של חזרה על Tre RNase Hatment ואיסוף eluate נוסף. מניסיוננו, 2-4 סיבובים של טיפול RNase H היו רצויים לאסוף eluate נוסף.

בפרוטוקול זה, בעיות טכניות המפתח לשמירה על טמפרטורה אופטימאלית והבטחת טיפול סטרילי של חומרים כימיים. ריאגנטים כל צריכים להיות RNase- ו פרוטאז-חינם. היושרה של מדגם RNA היא מכשול אפשרי לשקול אם אינטראקצית RNA חלבון בלתי ניתנת לגילוי.

טכניקה זו דורשת תמוגה היעיל של התאים כדי לגשת RNPs בכמות שנכנסה לגילוי. בעוד אזהרה חשובה היא תמוגה תא שלמה, טיפולים נמרצים עשויים להגדיל אינטראקציות הלא ספציפיות עם RNA. לכן, תנאי הניסוי צריכים להימדד על מנת להעשיר אינטראקציות חלבון-רנ"א ספציפיים. עם זאת, השימוש של שטיפות גבוהה חומרא עלול לחסל אינטראקציות חשובות עדיין חולפות. לכן, תנאי הכביסה משתנים נוסף considאה בדרישות הספציפיות של ניסוי מסוים.

יעילות RIP היא טכניקה רבה עצמה כדי לבודד שותפי RNA חלבון מאותו המקור, אבל כמה אינטראקציות חולפות או חלשות, כי הם בעלי חשיבות פיזיולוגית הם אבדו במהלך השלבים המחייבים או כביסה. Cross-linking של מתחם mRNP הוא אופציה לשקול ניתוח. יתר על כן, תנאי גידול פיסיולוגיים צריכים להישמר בחשבון בעת ​​ניתוח RNPs רגולטוריים, ככל שרמת הביטוי של רנ"א מאותו המקור או RBP עשוי להיות כפוף לתנודות פיסיולוגיות בתנאים מסוימים. יתר על כן, סוג של ניתוח במורד הזרם גם תשחק תפקיד בבחירת התנאים תמוגה כביסה במהלך immunoprecipitation.

בנוסף, immunoprecipitation המוצלח דורש כי lysate התא להיות לדלל משמעותי (לפחות 1: 1). 1x חיץ לשטוף (20 mM Tris-HCl, pH 7.3; 3 מ"מ MgCl 2; ו -150 מ"מ NaCl) הוא diluent נבחרים, כמו הרכב שלהאינו משפיע שלמות RNP, מסיסות פתרון, או אינטראקציות אנטיגן נוגדן.

עבור ספקטרומטריית מסה במורד זרם, דגימות צריכות להיות מוגנות מפני מלחים, כולל Na +, Cl -, ו טריס, כמו גם חומרים הללו. במידת צורך, רכיבים של מאגרים-the היוני תרכובות עשויים להיות מופחתים על ידי דיאליזה או סינון חליפין יוני, ובמקרים מסוימים, מאגרים נדיפים שימושיים השלבים הסופיים. במקרים כאשר antiserum משמש לבודד חלבון epitope מתויג שהביעו transfection, אימות כתם המערבי של חלבון רקומביננטי באמצעות lysate התא הראשוני צריך להיות מוצא להורג לפני ניתוח נוסף. במקרה תג epitope משמש (כלומר, דגל, MYC, GFP, וכו '), החשיפה של התג הוא קריטי להצלחת הצעד מחייב נוגדנים. להקפיא להפשיר של דגימות יש להימנע.

טכניקת RIP הועסקה נרחב כדי להבהיר מנגנונים מגוונים שליטת גן שלאחר תעתיק10,25. זה כולל זיהוי של רומן חלבון-mRNA, חלבוני microRNA, אינטראקציות חלבון-חלבון 10,25. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף לקביעת הרכב RNP בתוך תרבית תאים. השיטה שלנו מאפשרת ההערכה הממוקדת הגנום כולו של אינטראקציות חלבון-RNA קריטיים, כמו גם עבור לכידתו של מתחמי RNP נדירים ו / או חולפים.

היישום של טכניקה זו תרם האפיון שלנו של RNAs כבול DHX9 / RNA helicase A ו- עזר לנו להגדיר את התקנה שלאחר התעתיק הקריטית של רטרווירוסים ואת אונקוגנים-פרוטו הסלולר ג'ונד 6,26 והחור (פריץ ובוריס-לאוורי , נתונים שלא פורסמו). אנו מצפים כי היישום של טכניקה זו במחקרים עתידיים כדי לקדם את ההבנה שלנו של המנגנונים הקריטיים לשליטת גנים, כוללים אלה מתווכים על ידי מתחמי RNP ללא קידוד ארוך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

המחברים מודים תמיכה בהכרת תודה על ידי NIH P50GM103297, P30CA100730 ומקיף סרטן P01CA16058.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
Dynabeads Protein G Invitrogen 10004D
Anti-FLAG antibody Sigma F3165
Anti-FLAG antibody Sigma F7425
Anti-RHA antibody Vaxron PA-001
TRizol LS reagent Life technology 10296-028
RNase H Ambion AM2292
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1
Isopropanol Fisher Scientific BP26184
RNaeasy clean-up column Qiagen 74204
Omniscript reverse transcriptase Qiagen 205113
RNase Out Invitrogen 10777-019
Protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Triton X-100 Sigma X100
NP-40 Sigma 98379
Glycerol Fisher Scientific 17904
Random hexamer primers Invitrogen N8080127
Oligo-dT primers Invitrogen AM5730G
PCR primers IDT Gene specific primers for  PCR amplification
Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage IDT Anti-sense primer for target RNA
Trypsin Gibco Life technology 25300-054
DMEM tissue culture medium Gibco Life technology 11965-092
Fetal bovine serum Gibco Life technology 10082-147
Tris base Fisher Scientific BP152-5
Sodium chloride Fisher Scientific S642-212
Magnesium chloride Fisher Scientific BP214
DTT Fisher Scientific R0862
Sucrose Fisher Scientific BP220-212
Nitrocellulose membrane Bio-Rad 1620112
Magnetic stand 1.7 ml micro-centrifuge tube holding
Laminar hood For animal tissue culture
CO2 incubator For animal tissue culture
Protein gel apparatus Protein sample separation
Protein transfer apparatus Protein sample transfer
Ready to use protein gels (4-15%) Protein sample separation
Table top centrifuge Pellet down the sample
Table top rotator Mix the sample end to end
Vortex Mix the samples

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3, (4), 431-437 (1989).
  2. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, (10), e255 (2008).
  3. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582, (14), 1977-1986 (2008).
  4. Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8, (6), 479-490 (2007).
  5. Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
  6. Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13, (6), 509-516 (2006).
  7. Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27, (18), 6265-6278 (2007).
  8. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8, (7), 533-543 (2007).
  9. Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309, (5740), 1514-1518 (2005).
  10. Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110, (4), 817-822 (2010).
  11. Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
  12. Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
  13. Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
  14. Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253, (1), 74-88 (2007).
  15. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10, (1), 57-63 (2009).
  16. Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16, (8), 1673-1678 (2010).
  17. Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
  18. Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41, (9), 473-484 (2014).
  19. Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73, (6), 4847-4855 (1999).
  20. Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35, (8), 2629-2642 (2007).
  21. Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38, (5), 1686-1696 (2010).
  22. Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289, (33), 22798-22814 (2014).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
  25. Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1, (1), 302-307 (2006).
  26. Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286, (7), 5328-5337 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics