Isolering af sammenhørende RNA-protein-komplekser fra celler under anvendelse Oligonucleotid-rettet Eluering

1Department of Veterinary & Biomedical Sciences, University of Minnesota, 2Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University, 3School of Biotechnology, Gautam Buddha University
* These authors contributed equally
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Singh, G., Fritz, S. M., Ranji, A., Singh, D., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution. J. Vis. Exp. (119), e54391, doi:10.3791/54391 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Posttranskriptionel genekspression præcist reguleret, begyndende med DNA-transkription i kernen. Kontrolleret af RNA-bindende proteiner (RBP'er), mRNA biogenese og metabolisme forekommer i meget dynamiske ribonucleoprotein partikler (RNP'er), der associerer og dissocierer med et substrat precursor mRNA under progressionen af RNA-metabolisme 1-3. Dynamiske ændringer i RNP komponenter påvirker post-transkriptionel skæbne en mRNA og giver kvalitetssikring under behandlingen af ​​primære udskrifter, deres nukleare menneskehandel og lokalisering, deres aktivitet som mRNA skabeloner til oversættelse, og den endelige omsætning af modne mRNA.

Talrige proteiner betegnes som RBP'er i kraft af deres konserverede aminosyre-domæner, herunder RNA genkendelsesmotiv (RRM), det dobbeltstrengede RNA-bindende domæne (RBD), og strækninger af basiske rester (fx arginin, lysin og glycin) fire. RBP'er rutinemæssigtisoleres ved immunopræcipitationsanalyser strategier og screenes for at identificere deres beslægtede RNA. Nogle RBP'er co-regulere præ-mRNA, der er funktionelt beslægtede, udpeget som RNA reguloneme 5-8. Disse RBP'er, deres beslægtede mRNA, og nogle gange ikke-kodende RNA, danner katalytiske RNP'er, der varierer i sammensætning; deres unikhed skyldes forskellige kombinationer af forbundne faktorer, såvel som den tidsmæssige sekvens, placering og varigheden af deres vekselvirkninger 9.

RNA immunoprecipitation (RIP) er en kraftfuld teknik til at isolere RNP'er fra celler og til at finde associerede udskrifter ved hjælp af sekvensanalyse 10-13. Flytning fra kandidat til genome-wide screening er mulig gennem RIP kombineret med en microarray analyse 14 eller high-throughput sekventering (RNAseq) 15. Ligeledes kan co-udfælde proteiner identificeres ved massespektrometri, hvis de er tilstrækkeligt rigelige og adskilles fra co-fældning af antistof 16,17. Her har vi fat metoden til isolering af RNP komponenter i en specifik beslægtet RNA fra dyrkede humane celler, selv om tilgang er foranderlige for opløselige lysater af planteceller, svampe, vira og bakterier. Downstream analyser af materialet omfatter kandidat identifikation og validering ved immunoblot, massespektrometri, biokemisk enzymatisk assay, RT-qPCR, microarray, og RNAseq, som opsummeret i figur 1.

I betragtning af den grundlæggende rolle RNP'er kontrollere genekspression på post-transkriptionel niveau, at ændringer i ekspressionen af komponent RBP'er eller deres tilgængelighed beslægtede RNA kan være skadeligt for cellen og er forbundet med flere typer af lidelser, herunder neurologiske sygdomme 18. DHX9 / RNA-helicase A (RHA) er nødvendig til oversættelse af udvalgte mRNA af cellulære og retrovirale oprindelse 6. Disse beslægtede RNA udviser strukturelt relaterede cis-virkende elementer inden for deres5 'UTR, der er udpeget som den post-transkriptionel kontrol element (PCE) 19. RHA-PCE aktivitet er nødvendig for en effektiv cap-afhængige oversættelse af mange retrovirus, herunder HIV-1, og af vækstregulerende gener, herunder Jund 6,20,21. Kodet af et essentielt gen (dhx9), RHA er afgørende for celledeling og dets nedregulering eliminerer cellernes levedygtighed 22. Den molekylære analyse af RHA-PCE RNP'er er et vigtigt skridt til at forstå, hvorfor RHA-PCE aktivitet er nødvendig for at kontrollere celledeling.

Den præcise karakterisering af RHA-PCE RNP komponenter ved steady state eller upon fysiologisk forstyrrelse af cellen kræver selektiv berigelse og fangst af RHA-PCE RNP'er i tilstrækkelig overflod for downstream analyse. Her blev retroviral PCEgag RNA mærket med 6 kopier af cis-agerende RNA bindingssted for MS2-kappeprotein (CP) inden for den åbne læseramme. MS2 coat protein blev exogenously co-udtrykkes med PCEgag RNA ved plasmidtransfektion at lette RNP forsamling i voksende celler. RNP'er indeholdende MS2-kappeprotein med beslægtet MS2-mærkede PCEgag RNA blev immunfældet fra cellen ekstrakt og indfanget på magnetiske perler (figur 2A). For selektivt fange RNP komponenter bundet til PCE, blev det immobiliserede RNP inkuberet med et oligonukleotid komplementært til sekvenser distalt til PCE, danner en RNA-DNA-hybrid, der er substrat for RNase H-aktivitet. Da PCE er positioneret i 5'-terminalen af ​​5'-utranslaterede region, oligonukleotidet var komplementært til RNA-sekvenser tilgrænsende til retrovirale translationsstartstedet (gag-startkodonen). RNase H-spaltning i nærheden af ​​gag-startkodonen frigivet 5'-UTR kompleks fra det immobiliserede RNP, som blev opsamlet som elueringsmiddel. Derefter blev prøven evalueret med RT-PCR for at bekræfte fangst af PCEgag og ved SDS PAGE og immunblot at bekræfte capture af målet MS2-kappeprotein. En validering af PCE-associerede RNA-bindende protein, DHX9 / RNA-helicase A, blev derefter udført.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

buffersammensætninger
Wash Buffer:
50 mM Tris-HCI, pH 7,4
150 mM NaCl
3 mM MgCI2
Low Salt Buffer:
20 mM Tris-HCI, pH 7,5
10 mM NaCl
3 mM MgCI2
2 mM DTT
1x protease inhibitor cocktail EDTA-fri
RNase Out 5 pl / ml (RNase-inhibitor)
Cytoplasmatisk Lysis Buffer:
0,2 M saccharose
1,2% Triton X-100
NETN-150 Wash Buffer:
20 mM Tris-HCI, pH 7,4
150 mMNaCl
0,5% NP-40
3 mM MgCI2
10% glycerol
Binding Buffer:
10 mM HEPES pH 7,6
40 mM KCI
3 mM MgCI2
2 mM DTT
5% glycerol

Tabel 2: Buffer sammensætninger.

1. Fremstilling af celler og Affinity Matrix

  1. Kultur en cellelinie af interesse for sub-konfluens (80%) i en 10 cm skål. Brug 10 cm plader til uafhængige immunopræcipitationer (IP) af en FLAG-mærket NLS-MS2 coat protein. Udfør IP anvendelse af antisera til FLAG-epitopmærket. Når udtrykker FLAG-mærket MS2 coat protein plasmid, transfektion celler 24-48 timer forud for høst 20.
    BEMÆRK: En særlig RNP kan beriges fra nukleare eller cytoplasmaic lysater eller en biokemisk-fraktioneret forberedelse, såsom brøkdele af en sucrosegradient. Det anbefales at høste af lysatet fra ikke-transficerede celler i parallel at indføre en yderligere negativ kontrol.
  2. Transfer 60 pi pr IP af protein G magnetisk perle opslæmning til en 1,7 ml mikrocentrifugerør.
  3. Glasset anbringes på en magnet rack til mikrocentrifugerør at adskille perlerne fra opbevaringsopløsningen.
  4. Fjern lagerløsning ved forsigtigt at trække det op med en mikropipette.
  5. Fjern røret fra magneten rack.
  6. Vask og ækvilibrering perlerne med 600 pi (10 gange den anvendte mængde perler) 1X vaskebuffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,4; 3 mM MgCl2, og 150 mM NaCl) og ende-over-ende rotation i 3 min ved stuetemperatur.
  7. Glasset anbringes på magneten rack og fjern vaskebuffer.
  8. Tilsæt 10 volumener (600 pi) 1X vaskebuffer og immunpræcipitering FLAG antistof til ligevægt PRotein G magnetiske perler (ifølge det beløb anbefalet af fabrikanten for en immunpræcipitation) og rotere ende-over-ende ved stuetemperatur i mindst 30 min at konjugere immunpræcipitering antistof. Brug den tilsvarende isotype IgG som et egnet antistof negativ kontrol.
  9. Glasset anbringes på magneten rack at indsamle perlerne og fjerne supernatanten.
  10. Fjern røret fra magneten rack og vaske de antistof-konjugerede perler med 10 volumener (600 pi) 1X vaskebuffer og rotation i 3 min ved stuetemperatur. Gentag dette trin to gange.
  11. Glasset anbringes på magneten rack og fjern vaskebuffer.

2. Høst den RNP'er

BEMÆRK: Forbered RNP'er under inkubationstiden efter trin 1.8.

  1. Fjern kulturmedium fra cellerne ved aspiration og vaskes cellerne to gange med 1-5 ml iskold 1x phosphatpufret saltvand (PBS). Brug en celleskraber for at fjerne vådt,adhærerende celler før opsamling ved centrifugering ved 226 x g i 4 minutter ved 4 ° C.
  2. Tilføj 375 pi iskold, lav-salt buffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,5; 3 mM MgCl2, 10 mM NaCI; 2 mM DTT; 1x protease-inhibitor cocktail, EDTA-fri, og 5 ul / ml RNase Inhibitor) til cellepelleten og tillade kvældning ved at placere den på is i 5 min.
    BEMÆRK: Tailor mængden af ​​buffer med lavt saltindhold ifølge størrelsen af ​​cellepellet. For 1,2 x 10 6 celler fra en 10 cm plade, 375 pi buffer er tilstrækkelig.
  3. At indsamle den cytoplasmatiske cellelysat, tilsættes 125 pi iskold lysepuffer (0,2 M sucrose / 1,2% Triton X-100), og derefter udføre 10 slag med en Dounce homogenisator, der var forkølet i en ice bucket.
    BEMÆRK: For at indsamle de samlede celle ekstrakt, anbefales standard RIPA lysis buffer for opløseliggøre nukleoplasma / kromatin.
  4. Spin i en mikrocentrifuge ved tophastighed (16.000 x g) i 1 min; dette vil rydde supernatanten af ​​vragrester ennd kerner.
  5. Supernatanten overføres til et nyt 1,7 ml mikrocentrifugerør, der har været på is. Bestemme den totale proteinkoncentration ved en standard, laboratorie-foretrukne fremgangsmåde, såsom Bradford Assay 23. Reservere en alikvot på mindst 10% for en Western blot-analyse, der skal anvendes som input kontrol. Brug det høstede cellelysat straks for immunopræcipitation eller gemme det ved -80 ° C til fremtidig analyse.
    BEMÆRK: Det er vores erfaring, kan disse prøver opbevares og anvendes flere måneder senere for immunopræcipitering analyse uden et kompromis af integritet.

3. Immunpræcipitation

  1. Tilføj det ønskede volumen af ​​den høstede cellelysat, baseret på proteinkoncentrationen bestemt i trin 2.5, til målantistoffet-konjugeret perler. Brug af 1X vaskebuffer, at det samlede rumfang op til 600 pi og rotere ende-over-ende i 90 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Denne tidsperiode er tilstrækkelig til at generereen robust isolering af høj affinitet RNP-komplekser samtidig minimere ikke-specifik binding. Fortynd alternative RNP kilder, såsom brøkdele af en saccharosegradient, mindst 1: 1 med 1X vaskebuffer, og derefter inkubere dem med tidligere fremstillede perle-antistof-komplekser, som nævnt ovenfor.
  2. Efter 90 minutter af inkubation placere IP røret på magneten rack til at indsamle perlerne. Reserve supernatanten som gennemstrømning.
    BEMÆRK: Denne første gennemstrømning er en vigtig kontrolprøve at måle IP effektivitet. Et immunoblot assay vil give en indikation af IP effektivitet, samt specificiteten af ​​de undersøgte interaktioner. Det anbefales at holde denne supernatant for downstream analyse.
  3. Vask RNP-bundne, antistof-konjugerede perler med 10 volumener (600 pi) iskold NETN-150 vaskebuffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,4; 150 mM NaCI; 3 mM MgCl2, 0,5% NP40, og 10% glycerol) under rotation i 3 min ved stuetemperatur. Gentag trin 3 gange.
    BEMÆRK: Denne buffer adskiller sig fra lysisbuffer og effektivt reducerer svage eller ikke-specifikke foreninger.
  4. Efter den sidste vask resuspenderes immobiliserede RNP komplekser i 60 pi iskold 1x binding buffer (10 mM HEPES, pH 7,6; 40 mM KCI; 3 mM MgCI2; 5% glycerol; og 2 mM DTT) og reserve 10% de immobiliserede kompleks kugler til Western blot og 20% ​​for RNA-isolering.

4. Eluering

  1. Juster resterende volumen til 100 pi med iskold 1x bindingsbuffer og opvarme røret ved 70 ° C i 3 minutter.
  2. For at isolere beslægtede RNA-protein-komplekser, tilføje en ~ 30-nt DNA-oligonukleotid, som er komplementær til 3'-sekvensen grænse af RNA'et af interesse og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur under forsigtig vipning (100 nM oligonukleotid er tilstrækkelig).
    BEMÆRK: Oligonucleotidet er antisense til de nukleotidrester støder op til translationsstart-site af PCE-konstruktionen anvendes som et example i denne protokol. Passende sekvens komplementaritet tilvejebringes af ~ 40% GC-indhold. Designe antisense oligonukleotid til effektiv hybridisering til det minimum komplementære region af mål-RNA.
  3. Tilsæt 5-10 enheder af RNase H til røret og inkuber ved stuetemperatur i 1 time for at spalte RNA i RNA: DNA-hybrid. Supernatanten overføres til en steril 1,7 ml mikrocentrifugerør; denne prøve indeholder tilfangetagne RNP komplekser af interesse.
    BEMÆRK: Afhængig af tilgængeligheden af ​​den beslægtede RNA, kan to eller flere runder af RNase H behandling være nyttigt at øge prøven overflod for de efterfølgende analyser.
  4. Bruge 20% af eluatet i et Western-blot for kendte associerede proteiner og 20% ​​af eluatet for RNA-isolering efterfulgt af RT qPCR. De resterende 60% kan anvendes til massespektrometri eller til at identificere protein-komponenter.
  5. Parallelt hermed underkaste en portion af den reserverede cellelysat til RNA-isolering og RT-PCR-analyse. Denne assessment giver en indikation af berigelse af RNA i en RNP-kompleks.
    BEMÆRK: Brug isolerede præparation protein i en kontrol western blot at fastslå, at RNase H spaltning var effektiv til frigivelse af RNP fra immunuoprecipitated kompleks.

5. Protein Elektroforese og Western blot-analyse

  1. Om ca. 10-20% af den samlede prøve til SDS-PAGE og immunoblotanalyse ifølge standard laboratorieprotokol.
    BEMÆRK: Dette trin tjener til at validere IP effektivitet og specificitet før nedstrøms RNA-analyse. Den kan også anvendes til at vurdere proteinsammensætning af det isolerede RNP-kompleks.

6. Samling af immunopræcipiteret RNA

BEMÆRK: RNA-isolering kan udføres ved Trizol fremgangsmåde eller efter den beskrevne protokol.

  1. Resuspender halvdelen af ​​den samlede prøve i 750 pi syreguanidiniumthiocyanat reagens og inkuberes ved stue temperatur i 5 minutter forud for ekstraktion af RNA fra de indfangede PCE-RNP-komplekser.
  2. Tilsæt 200 pi af chloroform til røret rystes kraftigt i 10 sek, og der inkuberes ved stuetemperatur i 3 min.
  3. Efter centrifugering ved 16.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C, overføres den vandige fase i en frisk rør og tilsættes samme volumen isopropanol. Bland godt og inkuber ved stuetemperatur i mindst 10 min. Tilsæt 1 pi glycol blå til prøven og opbevare det ved -20 ° C i fryseren til effektiv udfældning eller forarbejdning på et senere tidspunkt.
  4. Centrifugeres røret ved 16.000 xg i 10 min ved 4 ° C. indsamle og kassér supernatanten, således at ikke forstyrre RNA pellet forsigtigt; anbefales brug af en p-200 mikropipette tip for at lette denne proces.
  5. Der tilsættes 500 pi 75% ethanol til hvert rør, vortex, og centrifuger rørene ved 16.000 xg i 5 min ved 4 ° C. indsamle og kassér supernatanten som i trin 6.4 forsigtigt. Luft-tørre pelleten i 2-3 min og resuspender i 100 pi RNase-frit vand.
    BEMÆRK: Du må ikke forlænge den tid de pellet luft-tørrer for at undgå et problem med resuspension.
  6. Påfør 100 pi RNA-prøve til et RNA oprydning kolonne. Behandle det ved hjælp af producentens protokol. Eluering af RNA i 30 pi RNase-frit vand og opbevares ved -80 ° C i op til 3 måneder.
    BEMÆRK: Denne isolerede RNA er egnet til nedstrøms analyse af RT-realtime PCR (qPCR), microarray, og RNA-sekventering. Afhængig af overflod af RNP og den effektivitet, hvormed den RNP af interesse er isoleret, kan den samme lysat underkastes to eller flere runder af IP til at generere tilstrækkelig RNA gælder for de efterfølgende analyser.

7. RNA Reverse Transcription and Amplifikation af cDNA ved PCR

  1. Underkaste isolerede RNA til revers transkription med en tilfældig primer med en høj kvalitet revers transkriptase (RT), ifølge manufacturer anvisninger.
  2. At amplificere RNA'et af interesse, designe en genspecifik antisense-primer i RNase H spaltning sekvens. Bruger lignende mængder af antisense-oligonukleotidet, en tilfældig primer, eller en oligo-dT-primer (se Materialer tabel).
    BEMÆRK: oligo-dT primer og polyadenyleret mRNA giver positive reaktioner for RT-PCR-reaktionerne kontrol.
  3. Reserve 5% af RT-reaktionen (1 pi) for en præparativ qPCR gjort i tandem med negativ-kontrol lysat IP og positiv-kontrol-DNA prøver at definere cutoff og producere en standardkurve. Hvis CT værdien af ​​den præparative qPCR ligger uden for intervallet af standardkurven, fortyndes RT-reaktionen i konsekutive 1: 5 fortyndinger og gentag trin 7.2.
    BEMÆRK: For en RNA-sekventering og massespektrometri teknik, se supplerende metode fil. Klik her to se supplerende metode fil. (Højreklik for at downloade.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tidligere RIP resultater identificeret retrovirale gag RNA og udvalgte cellulære RNA, som co-bundfald med DHX9 / RHA, herunder hiv-1 6, Jund 6 og Hur (Fritz og Boris-Lawrie, upubliceret). Den retrovirale 5 'UTR er blevet påvist at co-udfælde med DHX9 / RHA i kernen og at co-isolere i cytoplasmaet på polyribosomer. Den er entydigt defineret som de cis-virkende post-transkriptionel kontrol element (PCE) 6. Til isolering PCEgag RNA-RHA ribonucleoprotein komplekser (RNP'er) dannet i prolifererende celler, udførte vi FLAG-MS2 RNP immunfældning i transficerede HEK293 cellelysater. Resultaterne viser effektiv udfældning af FLAG-MS2-protein. Især er DHX9 / RHA identificeret under denne RNP-kompleks og ikke inden for IgG isotypekontrol, og heller ikke i den negative kontrol HEK293-cellelysat (figur 2A). Den matrix med RNP'er blev inkuberet med en komplementær 30-NT oligonucleotid, og derefter en RNase H spaltning af RNA-DNA-hybridet blev udført. Efter RNase H spaltning, blev eluaterne analyseret ved Western blotting. Den demonstreret RNase H spaltning af PCEgag RNA på RNA-DNA-hybrid position frigivet RNP-kompleks specifikt bundet til 5'-UTR. De DHX9 / RHA-associerede RNP'er blev bestemt til at blive beriget med eluenter. Vigtigt er det, de FLAG-MS2-bundne RNP'er forblev med antistof-konjugerede perler (Figur 2B). Co-immunoudfældning af MS2 hårnåle-indeholdende retroviral PCEgag RNA i celler og i eluenter blev valideret ved RT-PCR og qRTPCR (figur 2C). Resultaterne bekræftede en udvalgt forening mellem DHX9 / RHA og retroviral 5 'UTR, der er blevet fremhævet som en unik RNP vigtigt for målrettet oversættelse kontrol 6.

figur 1
Figur 1: RNP isolering og berigelse af specifikke RNP'er forbundet med 5'-UTR af PCEgag af RNase H spaltning. Workflow viser trinene at isolere en udvalgt ribonucleoprotein dannet de novo i celler, dens samling ved oligonukleotid-styret RNaseH spaltning, og den nedstrøms analyse af RNA og protein komponenter. Sammendrag af affinitetskromatografi under anvendelse af en høj-affinitet interaktion mellem multimerer for MS2 RNA stem-loop og MS2-kappeprotein-FLAG-fusionsprotein til at indfange PCE RNA på FLAG perler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: En PCEgag RNA indeholdende 6 MS2 RNA-bindende sites blev fanget af et immobiliseret FLAG-mærket MS2-kappeprotein, og specifikke RNP'er forbundet med 5'-UTR blevfrigivet af oligonucleotid-dirigeret RNase H spaltning. HEK293-celler blev co-transficeret med pAR200 (et plasmid indeholdende PCEgag og 6x MS2 sløjfer i HIV-intron) og et plasmid, der udtrykker FLAG epitop-tagget MS2 protein med en kernelokaliseringssekvens (NLS). Celler blev opsamlet, og cytoplasmaet blev isoleret ved 48 timer efter transfektion. De cytoplasmatiske lysater blev underkastet immunpræcipitation med enten FLAG-antistof eller et IgG-kontrol. (A) IP effektivitet blev bestemt ved immunoblot under anvendelse af et anti-FLAG-antistof. DHX9 / RHA, en PCE bindende protein, tjente som en positiv kontrol; PCE-holdige RNA immunpræcipiteret med MS2-proteinet. Lanes 1-3: Input proteiner, der anvendes til IP. Banerne 4-5: FLAG IP af FLAG MS2 overudtrykt lysat og HEK293 cytoplasmatisk cellelysat. Bane 6: IgG IP af FLAG MS2 overudtrykt lysat. Banerne 7-9: Flow-through af IP-adresser. (B) 5 'UTR-bundne RNP'er blev beriget ved RNase H-spaltning. banerne 1-3: Eluater af 5'-UTR-bundet protein ved RNase H. Bane 4-6: proteiner bundet til antistof-konjugerede perler. (C) Revers transkriptase PCR og real-time kvantitativ PCR af specifik RNA bundet til forskellige fraktioner af RNP'er. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
Dynabeads Protein G Invitrogen 10004D
Anti-FLAG antibody Sigma F3165
Anti-FLAG antibody Sigma F7425
Anti-RHA antibody Vaxron PA-001
TRizol LS reagent Life technology 10296-028
RNase H Ambion AM2292
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1
Isopropanol Fisher Scientific BP26184
RNaeasy clean-up column Qiagen 74204
Omniscript reverse transcriptase Qiagen 205113
RNase Out Invitrogen 10777-019
Protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Triton X-100 Sigma X100
NP-40 Sigma 98379
Glycerol Fisher Scientific 17904
Random hexamer primers Invitrogen N8080127
Oligo-dT primers Invitrogen AM5730G
PCR primers IDT Gene specific primers for  PCR amplification
Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage IDT Anti-sense primer for target RNA
Trypsin Gibco Life technology 25300-054
DMEM tissue culture medium Gibco Life technology 11965-092
Fetal bovine serum Gibco Life technology 10082-147
Tris base Fisher Scientific BP152-5
Sodium chloride Fisher Scientific S642-212
Magnesium chloride Fisher Scientific BP214
DTT Fisher Scientific R0862
Sucrose Fisher Scientific BP220-212
Nitrocellulose membrane Bio-Rad 1620112
Magnetic stand 1.7 ml micro-centrifuge tube holding
Laminar hood For animal tissue culture
CO2 incubator For animal tissue culture
Protein gel apparatus Protein sample separation
Protein transfer apparatus Protein sample transfer
Ready to use protein gels (4-15%) Protein sample separation
Table top centrifuge Pellet down the sample
Table top rotator Mix the sample end to end
Vortex Mix the samples

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3, (4), 431-437 (1989).
  2. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, (10), e255 (2008).
  3. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582, (14), 1977-1986 (2008).
  4. Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8, (6), 479-490 (2007).
  5. Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
  6. Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13, (6), 509-516 (2006).
  7. Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27, (18), 6265-6278 (2007).
  8. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8, (7), 533-543 (2007).
  9. Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309, (5740), 1514-1518 (2005).
  10. Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110, (4), 817-822 (2010).
  11. Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
  12. Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
  13. Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
  14. Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253, (1), 74-88 (2007).
  15. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10, (1), 57-63 (2009).
  16. Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16, (8), 1673-1678 (2010).
  17. Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
  18. Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41, (9), 473-484 (2014).
  19. Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73, (6), 4847-4855 (1999).
  20. Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35, (8), 2629-2642 (2007).
  21. Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38, (5), 1686-1696 (2010).
  22. Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289, (33), 22798-22814 (2014).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
  25. Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1, (1), 302-307 (2006).
  26. Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286, (7), 5328-5337 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics