Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

1Department of Veterinary & Biomedical Sciences, University of Minnesota, 2Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University, 3School of Biotechnology, Gautam Buddha University
* These authors contributed equally
Biochemistry

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Singh, G., Fritz, S. M., Ranji, A., Singh, D., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution. J. Vis. Exp. (119), e54391, doi:10.3791/54391 (2017).

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Abstract

Introduction

Posttranskriptionale Genexpression ist genau geregelt, mit DNA-Transkription im Zellkern beginnt. Gesteuert durch RNA - Proteine (RBPs) Bindung, mRNA Biogenese und Stoffwechsel auftreten in hochdynamischen Ribonukleoproteinpartikel (RNPs), die Gesellschafter und distanziere mit einem Substrat - Vorläufer - mRNA während der Progression von RNA - Metabolismus 1-3. Dynamische Veränderungen in RNP-Komponenten beeinflussen die posttranskriptionales Schicksal einer mRNA und bieten Qualitätssicherung bei der Verarbeitung von primären Transkripte, deren Kernhandel und Lokalisierung, ihre Tätigkeit als mRNA-Vorlagen für die Übersetzung und die eventuelle Umsatz von reifen mRNAs.

Zahlreiche Proteine werden als RBPs aufgrund ihrer konservierten Aminosäuredomänen bezeichnet, einschließlich des RNA - Erkennungsmotiv (RRM), das doppelsträngige RNA - Bindungsdomäne (RBD), und erstreckt sich von basischen Resten (beispielsweise Arginin, Lysin und Glycin) 4. RBPs sind routinemßigisoliert durch Immunpräzipitation Strategien und gesiebt, um ihre spezifischen RNAs identifizieren. Einige RBPs co regulieren pre-mRNAs , die funktionell verwandt sind, bezeichnet als RNA Regulons 5-8. Diese RBPs, ihre zugehörigen mRNAs, und manchmal nicht-kodierenden RNA bilden katalytische RNPs, die in ihrer Zusammensetzung variieren; ihre Einzigartigkeit ist auf verschiedene Kombinationen von zugeordneten Faktoren sowie der zeitlichen Abfolge, die Lage und Dauer ihrer Wechselwirkungen 9.

RNA Immunpräzipitation (RIP) ist ein leistungsfähiges Verfahren RNPs aus Zellen zu isolieren und zu 10-13 assoziierten Transkripte unter Verwendung von Sequenzanalyse identifiziert werden . Der Umzug von Kandidaten zu genomweite Screening möglich durch RIP ist mit einem Microarray - Analyse 14 oder Hochdurchsatz - Sequenzierung (RNA-Seq) 15 kombiniert. Ebenso Mitfällung Proteine mittels Massenspektrometrie identifiziert werden können, wenn sie ausreichend reichlich vorhanden und trennbar von dem Co-Ausfällen Antikörper 16 sind,17. Hier sprechen wir die Methodik für RNP Komponenten einer spezifischen kognaten RNA aus kultivierten menschlichen Zellen zu isolieren, obwohl der Ansatz für lösliche Lysate von Pflanzenzellen änderbaren ist, Pilze, Viren und Bakterien. Downstream - Analysen des Materials umfassen Kandidaten Identifizierung und Validierung durch Immunoblot, Massenspektrometrie, biochemische enzymatische Assays RT-qPCR, Microarray, und RNA-Seq, wie in Abbildung 1 zusammengefasst.

In Anbetracht der grundlegenden Rolle der RNPs bei der Kontrolle der Genexpression in der post-transkriptioneller Ebene, Veränderungen in der Expression der Komponente RBPs oder deren Zugänglichkeit zu stammverwandt RNAs für die Zelle schädlich sein können und mit verschiedenen Arten von Störungen in Verbindung gebracht, darunter neurologische Krankheit 18. DHX9 / RNA - Helikase A (RHA) ist , die für die Übersetzung der ausgewählten mRNAs von zellulären und retroviralen Ursprungs 6. Diese verwandtes RNAs zeigen strukturell verwandten cis-wirkende Elemente innerhalb ihrer5 'UTR, die als posttranskriptionelles Steuerungselement (PCE) 19 bezeichnet wird. RHA-PCE - Aktivität ist für die effiziente cap-abhängige Translation von vielen Retroviren, einschließlich HIV-1 und von wachstumsregulierenden Genen, einschließlich JUND 6,20,21. Codierte durch ein essentielles Gen (dhx9), ist RHA wesentlich für die Zellproliferation und die Herunterregulierung beseitigt die Lebensfähigkeit der Zellen 22. Die molekulare Analyse von RHA-PCE RNPs ist ein wesentlicher Schritt zum Verständnis, warum RHA-PCE-Aktivität ist notwendig, die Zellproliferation zu steuern.

Die genaue Charakterisierung der RHA-PCE RNP Komponenten im stationären Zustand oder auf physiologische Störung der Zelle erfordert die selektive Anreicherung und Erfassung der RHA-PCE RNPs in ausreichender Menge für Downstream-Analyse. Hier retroviralen PCEgag RNA wurde mit 6 Kopien des cis-aktiven RNA-Bindungsstelle für das MS2-Hüllprotein (CP) innerhalb des offenen Leserahmens markiert. Der MS2-Hüllprotein wurde exogenously coexprimiert mit PCEgag RNA durch Plasmid-Transfektion die RNP Anordnung in wachsenden Zellen zu erleichtern. RNPs das MS2 - Hüllprotein mit kognaten MS2-tagged PCEgag RNA enthielten , wurden aus dem Zellextrakt und erfasst auf Magnetkügelchen (Figur 2a) immunpräzipitiert. Um selektiv die RNP-Komponenten erfassen zu dem PCE gebunden wurde das immobilisierte RNP mit einem Oligonucleotid distal der PCE komplementär zu Sequenzen inkubiert, ein RNA-DNA-Hybrid bildet, die das Substrat für RNase-H-Aktivität ist. Da PCE in der "Klemme des 5'5 positioniert ist untranslatierten Region, war das Oligonukleotid komplementär zu den RNA-Sequenzen benachbart zu dem retroviralen Translationsstartstelle (gag-Startcodons). RNase H-Spaltung in der Nähe des gag-Startcodons freigegeben die 5'-UTR-Komplexes aus dem immobilisierten RNP, die als Eluent gesammelt. Danach wurde die Probe mittels RT-PCR ausgewertet, um die Erfassung von PCEgag und durch SDS-PAGE und Immunoblot zur Bestätigung der captu zu bestätigenre des Ziel MS2-Hüllprotein. Eine Validierung der PCE-assoziierten RNA-Bindungsprotein, DHX9 / RNA-Helikase A, wurde dann durchgeführt.

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Protocol

Pufferzusammensetzungen
Waschpuffer:
50 mM Tris-HCl, pH 7,4
150 mM NaCl
3 mM MgCl2
Niedrigsalzpuffer:
20 mM Tris-HCl, pH 7,5
10 mM NaCl
3 mM MgCl2
2 mM DTT
1x Protease-Inhibitor-Cocktail EDTA-frei
RNase Out 5 ul / ml (RNase-Inhibitor)
Zytoplasmatischen Lysepuffer:
0,2 M Sucrose
1,2% Triton X-100
NETN-150 Waschpuffer:
20 mM Tris-HCl, pH 7,4
150 mMNaCl
0,5% NP-40
3 mM MgCl2
10% Glycerol
Binding Buffer:
10 mM HEPES pH 7,6
40 mM KCl
3 mM MgCl2
2 mM DTT
5% Glycerol

Tabelle 2: Pufferzusammensetzungen.

1. Herstellung der Zellen und die Affinitätsmatrix

  1. Kultur eine Zelllinie von Interesse Subkonfluenz (80%) in einem 10-cm-Schale. Verwenden Sie 10 cm-Platten für unabhängige Immunpräzipitationen (IP) eines FLAG-markierten NLS-MS2-Hüllprotein. Führen Sie die IP-Antiseren an das FLAG-Epitop-Tag. MS2 - Hüllprotein Plasmid Wenn die FLAG-markierten exprimieren, transfizieren Zellen 24-48 h vor der Ernte 20.
    HINWEIS: Eine besondere RNP kann aus Kern- oder Zytoplasma anreichernic Lysaten oder ein biochemisch-fraktionierte Zubereitung, wie beispielsweise Bruchteilen eines Sucrosegradienten. Es wird empfohlen, das Lysat von nicht-transfizierten Zellen parallel zur Ernte eine zusätzliche negative Kontrolle zu stehen.
  2. Transfer 60 ul pro IP von Protein G magnetischen Kügelchenaufschlämmung zu einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  3. Das Röhrchen wird auf einem Magnetträger für Mikrozentrifugenröhrchen, die Perlen aus der Speicherlösung zu trennen.
  4. Entfernen Sie die Speicherlösung durch vorsichtiges Ziehen mit einer Mikropipette auf.
  5. Entfernen Sie den Schlauch vom Magnethalter.
  6. Waschen und die Perlen mit 600 & mgr; l (10 - fache der verwendeten Volumen der Kügelchen) der 1x - Waschpuffer äquilibriert (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 3 mM MgCl 2 und 150 mM NaCl) und End-over-End - Rotation für 3 min bei Raumtemperatur.
  7. Das Röhrchen wird auf dem Magnetgestell und entfernen Sie den Waschpuffer.
  8. In 10 Volumen (600 ul) 1x Waschpuffer und Immunopräzipitieren FLAG-Antikörper auf die äquilibrierte protein G magnetische Kügelchen (entsprechend der Menge der vom Hersteller für eine Immunpräzipitation empfohlen) und rotate end-over-end bei Raumtemperatur für mindestens 30 min die Immunpräzipitation Antikörper zu konjugieren. Verwenden Sie die entsprechenden Isotyp IgG als geeigneter Antikörper negative Kontrolle.
  9. Das Röhrchen wird auf dem Magnetgestell um die Perlen zu sammeln und den Überstand zu entfernen.
  10. Entfernen Sie den Schlauch vom Magnetstange und waschen Sie die antikörperkonjugierten Perlen mit 10 Volumen (600 ul) 1x Waschpuffer und Rotation für 3 Minuten bei Raumtemperatur. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt.
  11. Das Röhrchen wird auf dem Magnetgestell und entfernen Sie den Waschpuffer.

2. Ernten der RNPs

HINWEIS: Bereiten Sie die RNPs während der Inkubationszeit nach dem Schritt 1.8.

  1. Entfernen Kulturmedium aus den Zellen durch Absaugen und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1-5 ml eiskaltem 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Verwenden Sie einen Zellschaber zu entfernen nass,adhärenten Zellen vor der Entnahme durch Zentrifugation bei 226 × g für 4 min bei 4 ° C.
  2. In 375 ul eiskaltem, salzarme Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 mM MgCl 2, 10 mM NaCl, 2 mM DTT; 1x Protease-Inhibitor - Cocktail, EDTA-frei; und 5 & mgr; l / ml RNase Inhibitor) auf die Zellpellet und erlauben durch Quellen auf Eis für 5 min platzieren.
    HINWEIS: Tailor das Volumen des Niedrigsalzpuffers um die Größe des Zellpellets nach. 1,2 x 10 6 Zellen aus einer 10 cm - Platte, 375 & mgr; l Puffer ausreichend.
  3. Um die Cytoplasma-Zelllysat sammeln, fügen 125 ul eiskaltem Lysepuffer (0,2 M Saccharose / 1,2% Triton X-100), und führen Sie dann 10 Schläge mit einem Dounce-Homogenisator, der in einem Eiskübel vorgekühlte war.
    HINWEIS: Zum sammeln, um den gesamten Zellextrakt, Standard RIPA Lysepuffer für die Solubilisierung des Nukleoplasma / Chromatin empfohlen.
  4. Spin in einer Mikrofuge bei Höchstgeschwindigkeit (16.000 × g) für 1 min; Dies wird der Überstand von Schutt eine klarend Kerne.
  5. Den Überstand in ein neues 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das auf Eis gewesen ist. Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration von einem Standard-Labor bevorzugte Verfahren, wie beispielsweise dem Bradford - Assay 23. Reservieren eines Aliquots von mindestens 10% für eine Western-Blot-Analyse als Eingangssteuerung verwendet werden. Verwenden Sie das geerntete Zelllysat sofort für die Immunpräzipitation oder lagern Sie es bei -80 ° C für eine spätere Analyse.
    HINWEIS: In unserer Erfahrung können diese Proben gespeichert und ohne einen Kompromiß an Integrität einige Monate später für die Immunpräzipitation Analyse verwendet werden.

3. Immunoprecipitation

  1. Füge das gewünschte Volumen des geernteten Zelllysat, bezogen auf die Proteinkonzentration in bestimmt Schritt 2.5, in die Ziel antikörperkonjugierten Perlen. end-over-end für 90 Minuten bei Raumtemperatur mit 1x Waschpuffer, das Gesamtvolumen von bis zu 600 & mgr; l und drehen.
    HINWEIS: Diese Zeit reicht aus, um zu erzeugen,RNP-Komplexe eine robuste Isolierung von hochaffinen bei gleichzeitiger Minimierung der unspezifischen Bindung. Verdünnte alternative RNP Quellen, wie beispielsweise Bruchteilen eines Saccharosegradienten, mindestens 1: 1 mit 1x-Waschpuffer und dann inkubieren sie mit zuvor vorbereiteten bead-Antikörper-Komplexe, wie oben erwähnt.
  2. Nach 90 Minuten Inkubation, legen Sie die IP-Rohr auf dem Magnetgestell, das die Perlen zu sammeln. Reservieren Sie den Überstand als Flow-Through.
    HINWEIS: Dieser erste Durchfluss ist ein wichtiger Kontrollprobe IP Effizienz zu messen. Ein Immunoblot-Assay wird einen Hinweis auf IP Effizienz sowie die Spezifität der untersuchten Interaktionen bereitzustellen. Es wird empfohlen, diesen Überstand für die nachfolgende Analyse zu halten.
  3. Waschen Sie die RNP-gebundenen Antikörper-konjugierten Perlen mit 10 Volumina (600 ul) eiskaltem NETN-150 Waschpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 3 mM MgCl 2; 0,5% NP40; und 10% Glycerol) unter Rotation für 3 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie den Schritt 3 mal.
    HINWEIS: Dieser Puffer unterscheidet sich von dem Lysepuffer und reduziert effektiv schwach oder nicht-spezifischen Assoziationen.
  4. Nach der letzten Waschung resuspendieren immobilisiertem RNP - Komplexe in 60 ul eiskaltem 1x Bindungspuffer (10 mM HEPES, pH 7,6; 40 mM KCl, 3 mM MgCl 2; 5% Glycerin und 2 mM DTT) und Reserve 10% der immobilisierten Komplex Perlen für Western-Blot und 20% für die RNA-Isolierung.

4. Elution

  1. Stellen Sie die verbleibende Volumen auf 100 ul mit eiskaltem Bindungspuffer 1x und erhitze das Rohr bei 70 ° C für 3 min.
  2. Um verwandtes RNA-Protein-Komplexe zu isolieren, fügen Sie ein ~ 30-nt DNA-Oligonukleotid, das für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln (100 nM Oligonukleotid ist ausreichend) komplementär zu der 3'-Sequenz Grenze der RNA von Interesse und brüten.
    HINWEIS: Das Oligonukleotid ist Antisense zu den Nukleotidreste neben dem Translationsstart-Seite des PCE-Konstrukt als exampl verwendete in diesem Protokoll. Entsprechende Sequenz Komplementarität wird durch die ~ 40% GC-Gehalt zur Verfügung gestellt. Entwerfen das Antisense-Oligonukleotid für eine effiziente Hybridisierung an die minimale komplementäre Region der Ziel-RNA.
  3. Hinzufügen 5-10 Einheiten von RNase H auf das Rohr und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur die RNA der RNA zu spalten: DNA-Hybrid. Den Überstand in ein steriles 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen; Dieses Beispiel enthält die erfassten RNP-Komplexe von Interesse.
    HINWEIS: In Abhängigkeit von der Zugänglichkeit der kognaten RNA, zwei oder mehr Runden der RNase H-Behandlung nützlich sein kann, um die Probe Überfluß für die Downstream-Analysen zu erhöhen.
  4. Verwenden von 20% des Eluats in einem Western-Blot für bekannte assoziierte Proteine ​​und 20% des Eluats zur RNA-Isolierung, gefolgt von RT qPCR. Die restlichen 60% können für die Massenspektrometrie verwendet werden, oder Proteinkomponenten zu identifizieren.
  5. Parallel wurde eine Aliquote des reservierten Zelllysat zu RNA-Isolierung und RT-PCR Analyse unterziehen. Diese assessment liefert einen Hinweis auf die Anreicherung von RNA in einem RNP-Komplex.
    HINWEIS: Verwenden Sie das isolierte Proteinpräparat in einer Kontroll Western-Blot, um festzustellen, dass die RNase H-Spaltung bei der Freigabe der RNP vom immunuoprecipitated Komplex wirksam war.

5. Protein-Elektrophorese und Western-Blot-Analyse

  1. Vorbehaltlich etwa 10-20% der Gesamtprobe auf SDS-PAGE und Immunoblot-Analyse nach Standardlaborprotokoll.
    HINWEIS: Dieser Schritt dient IP Effizienz und Spezifität vor der nachgelagerten RNA-Analyse zu validieren. Es kann auch die Protein-Zusammensetzung des isolierten RNP-Komplex zu bewerten, verwendet werden.

6. Sammlung der immunpräzipitierten RNA

HINWEIS: RNA-Isolierung kann durch Trizol-Verfahren oder nach dem beschriebenen Protokoll durchgeführt werden.

  1. Resuspendieren die Hälfte der gesamten Probe in 750 & mgr; l Säure Guanidiniumthiocyanat Reagens und bei Raum temperatur für 5 min vor der RNA aus den erfassten PCE-RNP-Komplexe zu extrahieren.
  2. In 200 ul Chloroform zu dem Rohr, kräftig schütteln für 10 Sekunden, und bei Raumtemperatur für 3 min.
  3. Nach Zentrifugation bei 16.000 xg für 15 min bei 4 ° C, Sammeln der wässrigen Phase in neuem Rohr und ein gleiches Volumen Isopropanol. Gut mischen und bei Raumtemperatur für mindestens 10 min. 1 & mgr; l Glykol blau auf die Probe und lagern Sie es bei -20 ° C im Gefrierschrank für eine effiziente Fällung oder Verarbeitung zu einem späteren Zeitpunkt.
  4. Zentrifugiere die Röhrchen bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Vorsichtig sammeln und den Überstand verwerfen, um nicht das RNA-Pellet zu stören; die Verwendung eines p-Mikropipettenspitze 200 wird empfohlen, diesen Prozess zu erleichtern.
  5. Hinzufügen, 500 & mgr; l 75% Ethanol zu jedem Röhrchen, Wirbel- und zentrifugieren die Röhrchen bei 16.000 xg für 5 min bei 4 ° C. Vorsichtig sammeln und den Überstand, wie in Schritt 6.4 zu verwerfen. Luft-Trocknen Sie das Pellet für 2-3 min und resuspendieren in 100 ul RNase-freies Wasser.
    Hinweis: Die Zeit, um die Pellets an Luft getrocknet, um nicht zu verlängern ein Problem mit Aufwirbelung zu vermeiden.
  6. Bewerben 100 ul RNA-Probe zu einer RNA-Clean-up-Säule. Verarbeiten Protokoll des Herstellers verwendet wird. Eluieren der RNA in 30 ul RNase-freies Wasser und bei -80 ° C für bis zu 3 Monate.
    HINWEIS: Diese isolierte RNA ist geeignet für Downstream-Analyse mittels RT-Real-Time PCR (qPCR), Microarray, und RNA-Sequenzierung. In Abhängigkeit von der Fülle der RNP und die Effizienz, mit der das RNP von Interesse isoliert ist, kann das gleiche Lysat auf zwei oder mehr Runden der IP unterzogen werden, um eine ausreichende RNA anwendbar für die nachfolgenden Analysen erzeugen.

7. RNA reverse Transkription und Amplifikation der cDNA durch PCR

  1. Gegenstand Die isolierte RNA-Transkription durch eine zufällige Primer an Rückseite mit einem hochwertigen Reverse Transkriptase (RT), nach dem manufacturer Anweisungen.
  2. Um die RNA von Interesse zu verstärken, die Gestaltung eines Gen-spezifischen Antisense-Primer in der RNase H-Spaltung-Sequenz. Verwenden Sie ähnliche Mengen des Antisense - Oligonukleotid, ein Random - Primer oder eine Oligo-dT - Primer (siehe Werkstoff - Tabelle).
    HINWEIS: Die Oligo-dT-Primer und poly-adenylierte mRNA liefern positive Kontrollreaktionen für die RT-PCR-Reaktionen.
  3. Reserve 5% der RT-Reaktion (1 ul) für eine präparative qPCR im Tandem durchgeführt mit Negativ-Kontrolle Lysat IP und positive Kontroll-DNA-Proben, um die Cutoff zu definieren und eine Standardkurve herzustellen. Wenn der CT-Wert der präparativen qPCR über den Bereich der Standardkurve ist, verdünnen Sie die RT-Reaktion in aufeinander folgenden 1: 5 Verdünnungen und wiederholen Sie Schritt 7.2.
    HINWEIS: Für eine RNA-Sequenzierung und Massenspektrometrie-Technik finden Sie in der Zusatz Methode Datei. Bitte klicken Sie hier to sehen diese ergänzende Methode Datei. (Rechtsklick zum Download bereit.)

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Representative Results

Vor RIP Ergebnisse retroviralen gag - RNAs und ausgewählten zellulären RNAs identifiziert , die Co-Ausfällung mit DHX9 / RHA, einschließlich HIV-1 6, Jund 6 und Hur (Fritz und Boris-Lawrie, nicht veröffentlicht). Die retroviralen 5 'UTR ist gezeigt worden, mit DHX9 / RHA im Kern zusammen auszufällen und im Zytoplasma auf Polyribosomen zusammen isolieren. Es ist eindeutig als das cis - wirkende posttranskriptionales Steuerelement (PCE) 6 definiert. Zur Isolierung in wuchernden Zellen gebildet PCEgag RNA-RHA Ribonukleoproteinkomplexe (RNPs), führten wir FLAG-MS2 RNP Immunpräzipitation in HEK293 Zelllysaten. Die Ergebnisse zeigen eine effiziente Fällung des FLAG-MS2 Protein. Bemerkenswerterweise wird DHX9 / RHA innerhalb dieses RNP - Komplex identifiziert und nicht innerhalb der IgG Isotyp - Kontrolle, noch in der Negativkontrolle HEK293 Zelllysat (2A). Die Matrix die RNPs enthielt, wurde mit einem komplementären inkubiert 30-nt Oligonucleotid, und dann wurde eine RNase-H-Spaltung des RNA-DNA-Hybrid durchgeführt. Nach RNase H Verdauung wurden die Eluate mittels Western-Blot analysiert. Die nachgewiesene RNase H-Spaltung von PCEgag RNA an der RNA-DNA-Hybrid-Position veröffentlicht die RNP-Komplex speziell auf die UTR "5 gebunden. Die DHX9 / RHA-assoziierten RNPs wurden bestimmt in den Eluenten angereichert werden. Wichtig ist , blieben die FLAG-MS2-gebundenen RNPs mit den Antikörper-konjugierten Kügelchen (2B). Der Co-Immunpräzipitation des MS2 - Stamm-Schleife wurde durch RT-PCR und qRTPCR (2C) validiert retroviralen PCEgag RNA in Zellen und in Elutionsmitteln enthält. Die Ergebnisse bestätigten eine ausgewählte Verbindung zwischen DHX9 / RHA und den retroviralen 5 'UTR, die als eine einzigartige RNP wichtig für gezielte Übersetzungssteuerung 6 hervorgehoben wurde.

Abbildung 1
Abbildung 1: RNP Isolierung und die Anreicherung von spezifischen RNPs im Zusammenhang mit dem 5'-UTR von PCEgag durch RNase H-Spaltung. Workflow zeigt die Schritte , um eine ausgewählte ribonucleoprotein zu isolieren gebildet de novo in Zellen, die Sammlung durch Oligonukleotid-gesteuerte RNaseH Spaltung und die Downstream - Analyse von RNA und Protein - Komponenten. Zusammenfassung der Affinitätschromatographie eine hochaffine Wechselwirkung zwischen Multimere für die MS2 RNA Stamm-Schleife unter Verwendung und dem MS2-Hüllprotein-FLAG-Fusionsprotein zu PCE RNA auf FLAG Perlen einzufangen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: PCEgag RNA mit 6 MS2 RNA - Bindungsstellen wurde durch ein immobilisiertes FLAG-markierten MS2 - Hüllprotein erfasst und spezifische RNPs mit dem 5' - UTR assoziiert warendurch Oligonukleotid-gerichtete RNase H-Spaltung freigesetzt. HEK293-Zellen wurden kotransfiziert mit pAR200 (ein Plasmid, das die PCEgag und 6x MS2 Schleifen in der HIV-Intron enthält) und ein Plasmid, das das FLAG-Epitop-markierte MS2 Protein mit einer Kernlokalisierungssequenz (NLS). Die Zellen wurden gesammelt und das Zytoplasma wurde bei 48 h nach der Transfektion isoliert. Die Cytoplasma-Lysate wurden Immunpräzipitation unterworfen entweder mit FLAG-Antikörper oder einem Kontroll-IgG. (A) Das wurde IP - Effizienz durch Immunoblot bestimmt eine Anti-FLAG - Antikörper verwendet wird . DHX9 / RHA, ein PCE-bindendes Protein, diente als positive Kontrolle; PCE-enthaltende RNA mit dem MS2-Protein immunpräzipitiert. Bahnen 1-3: Eingangs Proteine ​​für IP verwendet. 4-5 Lanes: FLAG IP von FLAG MS2 überexprimiert Lysat und Cytoplasma Zelllysat HEK293. Spur 6: IgG IP von FLAG MS2 überexprimiert Lysat. 7-9 Lanes: Durchfluss der IPs. (B) 5 'UTR-gebundenen RNPs wurden mittels RNase H - Spaltung angereichert. Bahnen 1-3Die Eluate der UTR-gebundenen Proteins durch RNase H. Spuren 4-6 '5: Proteine ​​gebunden an Antikörper-konjugierten Perlen. (C) Die reverse Transkriptase PCR und Echtzeit quantitative PCR spezifischer RNA zu verschiedenen Fraktionen von RNPs gebunden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die RNP Isolierung und artverwandten RNA Identifizierung hier beschriebene Strategie ist ein selektiver mittels eines spezifischen RNA-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen und Kandidatenproteine ​​Co-Regulierung in den Zellen einen bestimmten RNP zu entdecken.

Der Vorteil der Verwendung von Oligonucleotid-gerichtete RNase H-Spaltung RNPs zu isolieren, ist die Fähigkeit, die RNP cis-wirkende RNA-Element über heterogene RNPs stromabwärts des cis-wirkende RNA-Element von Interesse gebunden zu erfassen und gezielt analysieren. Wenn sich die Menge einer kognaten RNA in einer bestimmten RNP eine kleinere Fraktion der gesammelten RNPs ohne RNase H-Spaltung isoliert ist, ist der Hauptnachteil dieser Arbeitsablauf die Knappheit des kognaten RNP. Nach unserer Erfahrung erforderte diese Einschränkung 5- bis 10-fach Ausgangsmaterial mehr als herkömmliche RNA IP für den Nachweis in sensiblen Immunoblot und Proteomik-Analysen. Ein weiterer Vorteil, der durch die RNP Immobilisierung ist die Bequemlichkeit, die RNase H tre des Wiederholensatment und zusätzliche Eluat zu sammeln. Unserer Erfahrung nach waren 2-4 Runden von RNase H-Behandlung ratsam, zusätzliche Eluat zu sammeln.

In diesem Protokoll werden die Aufrechterhaltung wichtige technische Belange, die optimale Temperatur und die sterile Handhabung der Reagenzien zu gewährleisten. Alle Reagenzien sollten RNase- und Protease-frei sein. Die Integrität der RNA-Probe ist ein potentielles pitfall zu prüfen, ob ein RNA-Protein-Wechselwirkung nicht nachweisbar ist.

Diese Technik erfordert die effiziente Lyse der Zellen zum Nachweis der RNPs in einer geeigneten Menge zuzugreifen. Während eine wichtige Einschränkung mit der RNA erhöhen können unspezifische Wechselwirkungen unvollständig Zell-Lyse, kräftig Behandlungen ist. Daher sollten die Versuchsbedingungen gemessen werden, um spezifische Protein-RNA-Interaktionen zu bereichern. Jedoch kann die Verwendung hoher Stringenz Wäschen wichtig noch transiente Interaktionen zu eliminieren. Daher sind die Waschbedingungen eine andere Variable zu consider in den spezifischen Anforderungen eines bestimmten Experiments.

RIP Effizienz ist eine leistungsstarke Technik kognaten RNA-Protein-Partner zu isolieren, aber einige transiente oder schwache Interaktionen, die physiologische Bedeutung sind, werden während des Bindens oder Waschschritte verloren. Vernetzung des mRNP Komplexes ist eine Option in einer Analyse zu berücksichtigen. Darüber hinaus sollte physiologischen Wachstumsbedingungen im Auge behalten werden, während regulatorische RNPs zu analysieren, wie die Expressionsniveau des artverwandten RNA oder RBP kann zu physiologischen Schwankungen unter bestimmten Bedingungen unterliegen. Darüber hinaus spielen die Art der Downstream-Analyse wird auch eine Rolle bei der Lyse und Waschbedingungen während der Immunpräzipitation bei der Auswahl.

Darüber hinaus erfordert die erfolgreiche Immunpräzipitation daß das Zelllysat wesentlich (mindestens 1: 1) verdünnt werden. 1x - Waschpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,3, 3 mM MgCl 2 und 150 mM NaCl) ist das gewählte Verdünnungsmittel, wie die Zusammensetzunghat keine Auswirkungen auf RNP Integrität, Lösung Löslichkeit oder Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen.

Für nachgeschaltete Massenspektrometrie, sollten die Proben frei von Salzen, einschließlich Na +, Cl - und Tris, sowie einige Reinigungsmittel. Falls notwendig, Komponenten des Puffer-die ionischen Verbindungen-können durch Dialyse oder Ionenaustausch Filtration reduziert werden, und in einigen Fällen flüchtige Puffer sind brauchbar in den letzten Schritten. In Fällen, in denen Antiserum ein Epitop-markiertes Protein verwendet wird, durch Transfektion, Western blot Validierung des rekombinanten Proteins unter Verwendung von anfänglichen Zelllysat exprimiert zu isolieren sollte, bevor eine weitere Analyse durchgeführt werden. Falls ein Epitop - Tag verwendet (dh, FLAG, MYC, GFP, etc.), ist die Belichtung des Etiketts von entscheidender Bedeutung für den Erfolg der Antikörperbindungsschritt. Gefrier-Auftau-Proben sollten vermieden werden.

Die RIP Technik wurde sehr unterschiedlichen Mechanismen der posttranskriptionellen Gen-Kontroll aufzuklären verwendet10,25. Dazu gehört auch die Identifizierung neuer Protein-mRNA, Protein-mikroRNA und Protein-Protein - Wechselwirkungen 10,25. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Bestimmung von RNP-Zusammensetzung in einer Zellkultur. Unsere Methode ermöglicht die gezielte und genomweite Bewertung kritischer Protein-RNA-Wechselwirkungen, sowie für die Erfassung von seltenen und / oder transienten RNP-Komplexe.

Die Anwendung dieser Technik ist in unsere Charakterisierung von RNAs beigetragen gebunden durch DHX9 / RNA - Helikase A und half uns die kritische postTranskriptionsRegulation von Retroviren und die zellulären Protoonkogene Jund 6,26 und Hur (Fritz und Boris-Lawrie zu definieren , nicht veröffentlichte Daten). Wir erwarten, dass die Anwendung dieser Technik in zukünftigen Studien unser Verständnis der kritischen Mechanismen für die Gen-Kontrolle zu fördern, einschließlich der von langen nicht-kodierenden RNP-Komplexe vermittelt.

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Acknowledgements

Die Autoren danken Unterstützung durch die NIH P50GM103297, P30CA100730 und Comprehensive Cancer P01CA16058.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
Dynabeads Protein G Invitrogen 10004D
Anti-FLAG antibody Sigma F3165
Anti-FLAG antibody Sigma F7425
Anti-RHA antibody Vaxron PA-001
TRizol LS reagent Life technology 10296-028
RNase H Ambion AM2292
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1
Isopropanol Fisher Scientific BP26184
RNaeasy clean-up column Qiagen 74204
Omniscript reverse transcriptase Qiagen 205113
RNase Out Invitrogen 10777-019
Protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Triton X-100 Sigma X100
NP-40 Sigma 98379
Glycerol Fisher Scientific 17904
Random hexamer primers Invitrogen N8080127
Oligo-dT primers Invitrogen AM5730G
PCR primers IDT Gene specific primers for  PCR amplification
Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage IDT Anti-sense primer for target RNA
Trypsin Gibco Life technology 25300-054
DMEM tissue culture medium Gibco Life technology 11965-092
Fetal bovine serum Gibco Life technology 10082-147
Tris base Fisher Scientific BP152-5
Sodium chloride Fisher Scientific S642-212
Magnesium chloride Fisher Scientific BP214
DTT Fisher Scientific R0862
Sucrose Fisher Scientific BP220-212
Nitrocellulose membrane Bio-Rad 1620112
Magnetic stand 1.7 ml micro-centrifuge tube holding
Laminar hood For animal tissue culture
CO2 incubator For animal tissue culture
Protein gel apparatus Protein sample separation
Protein transfer apparatus Protein sample transfer
Ready to use protein gels (4-15%) Protein sample separation
Table top centrifuge Pellet down the sample
Table top rotator Mix the sample end to end
Vortex Mix the samples

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References

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