विकास और एक Preclinical रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर उपन्यास विरोधी कैंसर उपचार की जांच के लिए Xenograft मॉडल का रखरखाव

1Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
Published 9/30/2016
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Cancer Research

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Summary

एक चमड़े के नीचे preclinical मॉडल में रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर का उपयोग उपन्यास चिकित्सा, भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर की खोज, और दवा प्रतिरोधी रास्ते की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए एक शानदार तरीका है। यह मॉडल, नशीली दवाओं के विकास की प्रक्रिया में, चिकित्सीय जांच करने से पहले कई उपन्यास विरोधी कैंसर चिकित्सा के भाग्य का निर्धारण करने में आवश्यक है।

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Bagby, S., Messersmith, W. A., Pitts, T. M., Capasso, A., Varella-­Garcia, M., Klauck, P. J., et al. Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies. J. Vis. Exp. (115), e54393, doi:10.3791/54393 (2016).

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Abstract

Introduction

कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) संयुक्त राज्य अमेरिका में कैंसर से होने वाली मौतों के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान है। 2015 में, वहाँ 49,700 लोगों की मृत्यु 1 के साथ सीआरसी की अनुमानित 132,700 नए मामले थे। हालांकि स्थानीय रोग के साथ रोगियों में रोग का निदान उत्कृष्ट है, उन्नत रोग के साथ रोगियों गरीब परिणाम है, उपन्यास के उपचारों के विकास में यह एक प्रमुख प्राथमिकता बन गया है। देखभाल कीमोथेराप्युटिक परहेजों और नए बायोलॉजिक्स है कि इस रोग के खिलाफ तैनात किए गए हैं के मानक के बावजूद, वहाँ केवल समग्र अस्तित्व में एक वृद्धिशील वृद्धि हुई है। तदनुसार, वहाँ चालक इस रोग में ट्यूमर के विकास को सुविधाजनक बनाने में शामिल रास्ते को समझने में एक महत्वपूर्ण प्रयास है। कैंसर जीनोम एटलस नेटवर्क ने हाल ही में कई मुख्य मार्ग है कि सीआरसी अनियंत्रण में फंसा है और शामिल हैं की पहचान की है: WNT, phosphoinositide 3-kinase (PI3K), रास, बदलने वृद्धि कारक β (TGF- β) और TP53 2। साथ में, जांच ओटी का वर्णन के साथउसकी रास्ते में है कि सीआरसी में विकास को शक्ति महत्वपूर्ण इस रोगी जनसंख्या 3-5 में अस्तित्व में सुधार के उद्देश्य से नए उपचारों के विकास प्रज्वलित है। ऑन्कोलॉजी दवा के विकास में उपयोग preclinical मॉडल इन उपन्यास यौगिकों के नैदानिक ​​गतिविधि की भविष्यवाणी करने में इस प्रक्रिया में आवश्यक किया गया है।

विभिन्न preclinical मॉडल दवा के विकास की प्रक्रिया में उपयोग किया गया है। यह देखते हुए कि preclinical ट्रांसजेनिक पशु मॉडल और अमर सेल लाइनों उपन्यास ऑन्कोलॉजी चिकित्सा के नैदानिक ​​गतिविधि का पता लगाने में असफल रहा है, काफी हद तक मानव ट्यूमर की जटिलता को प्रतिबिंबित करने के लिए अपनी असमर्थता के कारण, रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर जेनोग्राफ्ट (PDTX) मॉडल स्थापित किया गया है। इस मॉडल का सबसे बड़ा लाभ यह है कि ट्यूमर विविधता बरकरार है और बारीकी से आणविक विशेषताओं और उद्भव रोगी ट्यूमर 6-9 की clonality को दर्शाता है। PDTX मॉडल विवो में एक उत्कृष्ट प्रदानpreclinical मंच उपन्यास एजेंटों, दवा प्रतिरोध रास्ते, संयोजन रणनीतियों, और कैंसर स्टेम कोशिका जीव विज्ञान में 10 अध्ययन करने के लिए।

PDTX प्रक्रिया की एक सामान्य अवलोकन चित्रा 1 में सचित्र है। यह क्लिनिक में शुरू होता है रोगियों की सहमत उनके अतिरिक्त ट्यूमर के ऊतक के कुछ इस शोध के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति है। अगले, सर्जरी में, ट्यूमर का एक टुकड़ा एक पैथोलॉजिस्ट ने कमाई की और अनुसंधान कर्मियों के लिए ले जाया जा करने के लिए मीडिया में डाल दिया है। इसके तुरंत बाद, ट्यूमर के एक वर्ग छोटे टुकड़ों में काट और subcutaneously immunodeficient चूहों में प्रत्यारोपित किया जाता है। एक बार ट्यूमर बढ़ता है, यह क्रम में ट्यूमर 10 बनाए रखने के लिए चूहों के विभिन्न पीढ़ियों में passaged है। आमतौर पर, F3 पीढ़ी के बाद ट्यूमर एक इलाज के अध्ययन जहां उपन्यास यौगिकों और / या संयोजन के उपचारों मूल्यांकन कर रहे हैं में विस्तार किया जा सकता है। उपयोग अगले जनरल Seq (exome Seq, आरएनए Seq और एसएनपी सरणी) संभावित भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर की खोज कर रहे हैंएड कि रोगियों है कि एक विशेष उपचार से लाभ प्राप्त कर सकते हैं के चयन में सहायता करते हैं।

1) एकल एजेंट के रूप में या संयोजन में उपन्यास के उपचारों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन और 2) संवेदनशीलता या चिकित्सीय जांच के लिए पूर्व प्रतिरोध का भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर की पहचान: PDTX मॉडल का उपयोग करने के व्यापक लक्ष्यों के लिए कर रहे हैं। इस पांडुलिपि में, हम दीक्षा और एक सीआरसी PDTX बैंक के रखरखाव में कार्यप्रणाली प्रदान करते हैं और फायदे और दवा के विकास की खोज में इस मॉडल की सीमाओं को प्रदान करते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. सीआरसी PDTX मॉडल प्रोटोकॉल का अवलोकन। एक मरीज को निकाली गई ट्यूमर सर्जरी से प्राप्त होता है और तुरंत subcutaneously athymic नग्न चूहों में इंजेक्शन। एक बार ट्यूमर बढ़ता है यह बाद की पीढ़ियों में विस्तार किया जाता है और अंत में इलाज के अध्ययन के लिए विस्तार किया। उपचार respoNSES मूल्यांकन कर रहे हैं और भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर की पहचान कर रहे है कि मरीज को चयन में सहायता कर सकते हैं। कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

आचार वक्तव्य: रोगी व्युत्पन्न कोलोरेक्टल ग्रंथिकर्कटता ट्यूमर नमूनों एक प्रोटोकॉल कोलोराडो एकाधिक संस्थागत समीक्षा बोर्ड (08-0439) द्वारा अनुमोदित के अनुसार कोलोराडो अस्पताल के विश्वविद्यालय में रोगियों की सहमत से प्राप्त किया गया। सभी जानवर काम कोलोराडो डेनवर संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के तहत किया गया था (IACUC, प्रोटोकॉल # 51,412 (06) 1E और 96813 (04) 1E)।

1. प्राप्त करने और रोगी के रक्त तैयारी

  1. 1 लीजिए - सोडियम साइट्रेट युक्त एक रक्त / सेल जुदाई ट्यूब में रक्त के 2 मिलीलीटर (ट्यूब चरणों शामिल प्लाज्मा, लिम्फोसाइट और monocyte बैंड, घनत्व ढाल तरल पदार्थ, जेल बाधा है, और एरिथ्रोसाइट्स और न्यूट्रोफिल) कर रहे हैं। सावधानी, रक्त या ऊतक के साथ रक्त जनित पैथोजन दिशा-निर्देशों का पालन करें।
    नोट: PBMCs और प्लाज्मा भविष्य के अध्ययनों कि शामिल हो सकते हैं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: ट्यूमर परिवर्तन के साथ germline आनुवंशिक परिवर्तन की तुलना, circula को अलग-थलगटिंग ट्यूमर कोशिकाओं, सेल मुक्त डीएनए (cfDNA), जांच के प्रोटीन और microRNAs, आदि का मूल्यांकन।
  2. आरटी पर कोई ब्रेक के साथ 15 मिनट के लिए 2500 XG पर खून / सेल जुदाई ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  3. परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (लिम्फोसाइट और ट्यूब के एककेंद्रकश्वेतकोशिका बैंड में PBMCs) लीजिए और एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब (स्पष्ट है, autoclavable, DNase, RNase, और pyrogen मुफ्त) में डाल दिया, और बाँझ फॉस्फेट बफर के साथ ट्यूब के शीर्ष करने के लिए भरने खारा (पीबीएस)।
    1. आरटी पर 3 मिनट के लिए 2300 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे PBMCs की एक गोली के रूप में। इसके बाद, सतह पर तैरनेवाला ध्यान हटा दें। बाँझ पीबीएस के 1 मिलीलीटर 30 सेकंड के लिए 3,000 XG पर गोली और सेंट्रीफ्यूज धोने के लिए जोड़ें और फिर सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  4. (DNase और RNase मुक्त, कोई मानव डीएनए, endotoxin मुक्त) और एक में प्लाज्मा और PMBC के गोली डाल एक 1.5 मिलीलीटर बाँझ क्रायोजेनिक शीशी में एक पिपेट का उपयोग रक्त / सेल जुदाई ट्यूब से प्लाज्मा इकट्ठा करने के लिए (ट्यूब के प्लाज्मा चरण में) -80 डिग्री सेल्सियस चभंडारण के लिए reezer।

2. प्राप्त करने और रोगी ट्यूमर नमूना तैयारी

  1. तैयार करें तो RPMI या DMEM मीडिया के साथ 1: 100 (10%) पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन और गैर आवश्यक अमीनो एसिड की, 1: 1000 (1%) Plasmocin, और 10% निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (पूरा मीडिया) और जोड़ने के 20 - 25 ट्यूमर नमूना के लिए एक बाँझ संग्रह कप के लिए मिलीलीटर।
  2. एक बाँझ बर्फ पर पूरा मीडिया युक्त कप में ट्यूमर नमूना निकालते हैं या 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।
    नोट: ट्यूमर नमूना अतिरिक्त रोगी ट्यूमर के ऊतक का एक टुकड़ा है कि, एक सर्जन द्वारा हटाया एक पैथोलॉजिस्ट ने कार्रवाई की है, और पूरा मीडिया के साथ एक बाँझ संग्रह कप में रखा गया है। सावधानी, रक्त या ऊतक के साथ रक्त जनित पैथोजन दिशा-निर्देशों का पालन करें। इसके अलावा, आदर्श पांच चूहों इंजेक्षन करने के लिए, ट्यूमर लगभग 1 सेमी ³ होना चाहिए।
  3. immunocompromised चूहों में इंजेक्शन लगाने के लिए जानवरों की सुविधा के लिए ट्यूमर नमूना ले आओ।
    नोट: यह जितनी जल्दी हो सके ट्यूमर नमूना प्रक्रिया करने के लिए सबसे अच्छा है।
    1. एक लामिना का प्रवाह हुड में, ट्यूमर कप से एक बाँझ प्लास्टिक काटने डिश में ट्यूमर नमूना रखें। autoclaved-छोटी कैंची और संदंश का प्रयोग 10 में कटौती करने के लिए - एक autoclaved 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge पतला प्रोटीन मिश्रण समाधान के 300 μl के साथ भरा ट्यूब में 12 के लगभग 3 एक्स 3 एक्स 3 मिमी टुकड़े और जगह है। बर्फ पर ट्यूब रखें।
    2. एक प्राथमिकता के रूप चूहों में ट्यूमर इंजेक्षन, लेकिन अगर कोई ट्यूमर पर छोड़ दिया है, फ्लैश जमे हुए शीशियों (एफएफ), formalin तय आयल एम्बेडेड (FFPE) कप, और एक व्यवहार्य ट्यूमर शीशी इकट्ठा।
    3. एफएफ के लिए, छोटे ऐसे प्रोटीन, आरएनए, या डीएनए अलगाव के रूप में आगे के विश्लेषण के लिए एक बाँझ क्रायोजेनिक शीशी से ट्यूमर ऊतकों के टुकड़े इकट्ठा। एफएफ तुरंत एक तरल नाइट्रोजन देवर में रखें और एक में लंबे समय तक स्टोर -80 सेल्सियस फ्रीजर।
    4. FFPE के लिए, अगर वहाँ पर्याप्त ट्यूमर, जगह आयल एम्बेडेड ब्लॉकों में एक 10 मिलीलीटर 10% formalin कप और इस प्रक्रिया में 3 छोटे टुकड़े एक बार ट्यूमर कम से कम 24 घंटे के लिए formalin में किया गया है।
      नोट: 24 घंटा आधारित हैहमारे प्रोटोकॉल कोर सुझाव 11 बंद।
    5. अन्त में, एक क्रायोजेनिक ट्यूब में शेष ट्यूमर जगह है। मीडिया को पूरा करने के लिए 10% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) जोड़कर व्यवहार्य मीडिया बनाओ। इसके बाद, एक क्रायोजेनिक ट्यूब के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ने और बर्फ पर दुकान। नोट: समय की लंबी अवधि के लिए बर्फ पर न रखें।
      1. छोटे टुकड़ों में किसी भी बचे हुए ट्यूमर है कि आदर्श के लिए पर्याप्त होगा 10 ट्यूमर के लिए भविष्य में 5 चूहों में इंजेक्शन जा कट। फिर, बर्फ पर व्यवहार्य ट्यूमर ट्यूब जगह जब तक यह एक isopropyl शराब ठंड कंटेनर (धीरे-धीरे एक समय में ट्यूमर 1 डिग्री सेल्सियस जमा देता है) में रखा जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में डाल दिया कि यह सुनिश्चित करने के ट्यूमर के दौरान मर नहीं जमने की प्रक्रिया।
        नोट: लंबी अवधि के भंडारण के लिए ट्यूमर को हटा रहे हैं (2 के बाद - 3 दिन) और एक बड़े तरल नाइट्रोजन देवर में रखा। कृपया ध्यान दें व्यवहार्य नलियों पिघलना करने के लिए जब तक कि इसे बाहर ले जाया जा रहा है चूहों में सुई की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए।

3।रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर Xenografts इंजेक्शन

  1. प्रत्येक अलग रोगी निकाली गई ट्यूमर के लिए 8 सप्ताह पुराने पुरुष और / या महिला athymic नग्न चूहों (टी सेल की कमी) - पाँच 6 का प्रयोग करें। 10 ट्यूमर के कुल (माउस प्रति 2 इंजेक्शन) subcutaneously (वर्ग) इंजेक्षन।
    नोट: मूल मानव ट्यूमर F0 के रूप में नामित किया गया है और फिर एक बार चूहों में इंजेक्शन अगली पीढ़ी के एफ 1 है। इसके अलावा, प्रत्येक अद्वितीय explant के लिए Autoclaved संदंश, कैंची, और Trocars का उपयोग करें।
  2. autoclaved 12 ग्राम Trocars में पतला प्रोटीन मिश्रण समाधान से ट्यूमर का लोड टुकड़े और यह सुनिश्चित करें कि ट्यूमर पूरी तरह से trocar में धकेल दिया है।
    1. (संज्ञाहरण के रखरखाव के लिए 3% Isoflurane - - 4% ऑक्सीजन, और 2 से 5% की प्रारंभिक दर Isoflurane पर शुरू कर दिया, 3) एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में, एक संज्ञाहरण बॉक्स है कि एक isoflurane संज्ञाहरण मशीन से जुड़ा है में 5 चूहों जगह और लकड़ी का कोयला फिल्टर (अतिरिक्त गैस को अवशोषित)।
      नोट: एक अनुभवी तकनीशियन पर पूरी प्रक्रिया को करने में सक्षम होना चाहिएलगभग 5 मिनट के कुल (माउस प्रति लगभग 30 सेकंड) के भीतर 5 चूहों के एक पिंजरे। इसलिए अतिरिक्त थर्मल समर्थन और आंख स्नेहन आम तौर पर इस्तेमाल नहीं किया है। कम अनुभवी व्यक्तियों के लिए या प्रशिक्षण के दौरान, यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि व्यक्तियों या तो एक समय में कम जानवरों पर प्रक्रिया का प्रदर्शन और / या प्रक्रिया के दौरान एक वार्मिंग पैड / आँख स्नेहन का उपयोग जानवरों 5 मिनट से अधिक समय anesthetized किया जाएगा। प्रक्रिया हमारे विश्वविद्यालय में IACUC मानकों पर आधारित है।
  3. एक माउस पैर की अंगुली चुटकी सुनिश्चित करने के लिए माउस उत्तरदायी नहीं रह गया है, तो Isoflurane बॉक्स से बाहर माउस ले। एक साफ मैदान पर माउस प्लेस तक पार्श्व क्षेत्र autoclaved 12 ग्राम Trocars साथ पहुँच जाता है बीच पृष्ठीय गर्दन क्षेत्र और नीचे subcutaneously trocar रपट पर ट्यूमर इंजेक्षन करने के लिए।
    1. माउस के पार्श्व के प्रत्येक पक्ष को एक ट्यूमर subcutaneously उद्धार। ट्यूमर चुटकी जब trocar बाहर निकाला जाता है, यह सुनिश्चित करना है कि ट्यूमर वांछित पार्श्व क्षेत्र में रहता है। जीईlatinous प्रोटीन मिश्रण माउस के शरीर के तापमान के साथ मज़बूत बनाता है और ट्यूमर के बढ़ने में मदद और वर्ग संयोजी ऊतक के लिए यह सुरक्षित करने के लिए लगभग 1 सप्ताह के लिए ट्यूमर encapsulates। घाव trocar द्वारा की गई कोई 4 मिमी से भी बड़ा है और स्टेपल के साथ त्वचा को बंद करने की कोई जरूरत नहीं है।
      नोट: हमारी पशु चिकित्सकों कोई बंद घाव के बहुत छोटे आकार के आधार पर निर्धारित की जरूरत है, जल्दी उपचार समय इस समय अवधि के दौरान कोई संक्रमण का उल्लेख किया है, और जानवरों की करीब से निगरानी (मध्य पृष्ठीय गर्दन क्षेत्र कोई भी त्वचा तनाव या घाव के सौंदर्य को कम करता है) ।
  4. इससे पहले माउस ट्यूमर इंजेक्शन के स्थल से दूर पूरी तरह से जाग इंजेक्षन Meloxicam 2 मिलीग्राम / किग्रा वर्ग (दर्द की दवा) है। इसके बाद, पिंजरे में माउस जगह है और जब तक माउस जाग और बढ़ रहा है पर नजर रखने के।
    नोट: जानवरों के पूरी तरह से जाग तक पहुंच से बाहर उबरने मत छोड़ो। Meloxicam खुराक हमारे विश्वविद्यालय में IACUC मानकों पर आधारित है।
    1. अगले, 4 के साथ एक ही प्रक्रिया दोहराएँशेष चूहों और उनकी सांस लेने की निगरानी।
      नोट: कृपया ध्यान दें कि यह एक बहुत ही त्वरित प्रक्रिया है और चूहों Meloxicam इंजेक्शन के बाद बहुत जल्द ही जाग, लेकिन जरूरत के रूप में Isoflurane समायोजित करें। हर बार एक माउस बाहर ले जाया जाता है, isoflurane नीचे बारी। Meloxicam 24 घंटा तक चलेगा और Trocars से घावों को पूरी तरह से 1 सप्ताह में ठीक हो जायेगा।

4. रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर Xenograft बैंक का रखरखाव

  1. कम से कम एक बार प्रति सप्ताह चूहों के विकास और स्वास्थ्य की निगरानी। ट्यूमर के आकार, ट्यूमर पीढ़ी, ट्यूमर इंजेक्शन की तारीख, और चूहों के स्वास्थ्य पर नज़र रखने के लिए एक स्प्रेडशीट (या अन्य ट्रैकिंग सिस्टम) का प्रयोग करें।
    नोट: चूहों उनके मूल शरीर के वजन का 15%, कम शरीर हालत स्कोर (≥ 2) को खो दिया है, तो ट्यूमर छालों, ट्यूमर 2,000 मिमी 3 या कुल ट्यूमर 3,000 मिमी 3, या hunched बीमार (कर रहे हैं, ठंड, सुस्ती, आदि तक पहुंच गया है ।) किसी भी तरह से, चूहों CO₂ के माध्यम से euthanized हैं या के रूप में के रूप में ग्रीवा अव्यवस्था के बाद anesthetizedecondary विधि। संज्ञाहरण और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से Euthanize यदि ट्यूमर का संग्रह है, अन्यथा चूहों CO₂ और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से euthanized हैं।
  2. जब एक ट्यूमर लगभग 1,500-2,000 मिमी 3 Anesthetize चूहों के ऊपर वर्णित है और फिर euthanize करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन के रूप में है।
    1. चेक माउस कोई दिल की धड़कन है। autoclaved कैंची और संदंश के साथ वर्ग ट्यूमर आबकारी।
      नोट: अनुमति दें ट्यूमर अप करने के लिए 1 वर्ष के लिए विकसित करने के लिए है और यदि कोई ट्यूमर में देखा जाता है तो सीओ 2 के माध्यम से चूहों, एक माध्यमिक विधि के रूप में ग्रीवा अव्यवस्था के बाद euthanize।
    2. पैसेज अगली पीढ़ी में सबसे अच्छा बढ़ ट्यूमर (5 चूहों का एक नया सेट उर्फ)। पासिंग के लिए 12 ट्यूमर और उसके बाद के रूप में भी ऊपर वर्णित बचे हुए ट्यूमर इकट्ठा - उपयोग निर्देश के ऊपर 10 इकट्ठा करने के लिए।
      नोट: कई व्यवहार्य नलियों एकत्रित जल्दी पीढ़ियों (एफ 1 - F8) में बहुत महत्वपूर्ण है; इसलिए कई व्यावहारिक ट्यूब, एफएफ, ट्यूब और generat प्रति 1 FFPE इकट्ठाआयन।
    3. शेष चूहों रखें जब तक चूहों की एक नई पीढ़ी लगभग 300 मिमी 3 के ट्यूमर के विकास है। शेष चूहों में ट्यूमर है कि बड़े हैं जब है, जैसा कि ऊपर वर्णित इकट्ठा करने के लिए जारी है।
  3. पारित होने के ट्यूमर को जारी रखें और F15 जब तक प्रत्येक चरण में इकट्ठा। इस बिंदु पर, जल्द से जल्द पीढ़ी तरल नाइट्रोजन से बाहर संभव का एक व्यावहारिक ट्यूब ले और बर्फ पर पिघलना करते हैं और ट्यूमर इंजेक्शन प्रक्रियाओं ऊपर वर्णित का पालन करें।
    नोट: ट्यूमर है कि व्यवहार्य ट्यूब से बढ़ने में लंबा समय लग पीढ़ी से दूसरी पीढ़ी को पारित करने के लिए की तुलना चूहों में विकसित करने के लिए है, तो ध्यान में रखें कि जब योजना। एक विशेष PDTX मॉडल अब किसी भी पारित होने पर की जरूरत है, तो euthanize और ट्यूमर एकत्रित करते हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए कई व्यवहार्य नलियों भविष्य में उपयोग के लिए एकत्र कर रहे हैं।

5. रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर Xenografts के साथ विकास चिकित्सा

नोट: F3 पीढ़ी में अधिकांश ट्यूमर अच्छा विकास कैनेटीक्स (तेजी से और अधिक सह बढ़ती हैnsistent), इसलिए, दवा प्रभावकारिता के अध्ययन PDTX करने के लिए आगे बढ़ें।

  1. जब वांछित ट्यूमर बहुत बड़ी है (1500 - 2000 मिमी 3), प्रक्रियाओं ऊपर चूहों के वांछित राशि में विस्तार करने के ट्यूमर को इकट्ठा करने का पालन करें।
    1. परिकल्पना के आधार पर इलाज के समूह प्रति की जरूरत ट्यूमर की संख्या का निर्धारण परीक्षण किया जा रहा है।
      नोट: पतला प्रोटीन मिश्रण समाधान के 1 मिलीलीटर लगभग फिट 30 छोटे ट्यूमर टुकड़े (ट्यूमर आकृति विज्ञान पर निर्भर करता है) कर सकते हैं चूहों में इंजेक्शन लगाने के लिए।
  2. साप्ताहिक और ट्यूमर के साथ चूहों की जाँच करें सबसे ट्यूमर (50 के बीच लगभग - 300 मिमी ³) दिख छोटे हैं जब नली का व्यास के साथ ट्यूमर को मापने के ट्यूमर की मात्रा निर्धारित करने के लिए। ट्यूमर मात्रा = [width² (छोटी माप) x लंबाई (सबसे बड़ा माप)] x 0.52।
    नोट: पतला प्रोटीन मिश्रण समाधान एक सप्ताह के लिए इंजेक्शन ट्यूमर के टुकड़े चारों ओर से घेरे है, तो एक के बाद एक सप्ताह के ट्यूमर के विकास को सही हो जाएगा।
  3. 300 मिमी ³ और - 50 के बीच ट्यूमर आयतन का प्रयोगn छोड़ दिया और सही ट्यूमर औसत। फिर एक दूसरे की कुछ संख्या के भीतर समूह और एक समूह के औसत प्रति 10 ट्यूमर के साथ उपचार समूहों में randomize। अगले, समूहों में चूहों से हल करने और वांछित उपचार अध्ययन शुरू करते हैं।
  4. दवा (अनुसूची दवा पर निर्भर), वजन और उपाय (ट्यूमर) प्रति सप्ताह दो बार के साथ चूहों खुराक। अध्ययन के अंत में, संज्ञाहरण और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से चूहों euthanize और प्रयोगशाला में भविष्य pharmacodynamic विश्लेषण के लिए ट्यूमर इकट्ठा।
    नोट: अध्ययन वाहन ट्यूमर के आकार और चूहों के स्वास्थ्य के आधार पर 30 दिनों के लिए रहता है।

6. एक PDTX बैंक के संगठन

  1. अनुसंधान और जानवरों के उचित उपयोग का दोहरा रोकने के लिए एक अच्छी तरह से प्रलेखित प्रपत्र रखें।
    नोट: यह एक सफल PDTX बैंक की कुंजी है।
    1. क्लिनिक में मानव रोगी से एक ट्यूमर का ट्रैक रखने के लिए, PDTX बैंक में चूहों, उपचार, आंकड़ों के स्प्रेडशीट का उपयोग करें, और क्या एकत्र किया जाता है। नोट: इस फ्रीजर, तरल नाइट्रोजन Dewars शामिलऔर FFPE के रूप में अच्छी तरह से भंडारण।

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Representative Results

सीआरसी PDTX मॉडल और TCGA में आम उत्परिवर्तनों की समानता

हम जांच की कि सीआरसी PDTX बैंक में आम म्यूटेशन (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, एपीसी, CTNNB1 और TP53) का प्रतिशत उत्परिवर्तन आवृत्ति सीआरसी रोगी जनसंख्या में देखा करने के प्रतिनिधि थे। जैसा कि चित्र 2A (TCGA) और बी (सीआरसी PDTX बैंक) में दिखाया गया है, इन जीनों में परिवर्तन की आवृत्ति TCGA (एन = 276 रोगियों) और सीआरसी PDTX बैंक (एन = 59 सीआरसी रोगियों) के बीच बहुत समान थे। सबसे बड़ा अंतर मनाया एपीसी जीन में था जिससे एक 23% अंतर देखा गया था। ये परिणाम है कि आम म्यूटेशन सीआरसी रोगी जनसंख्या में मनाया अच्छी तरह से सीआरसी PDTX मॉडल में प्रतिनिधित्व किया है सुझाव देते हैं।

विभिन्न बीच उपचार प्रतिक्रियाएँ स्थिरता का मूल्यांकनपीढ़ियों

इस सीआरसी PDTX मॉडल में, हम यह निर्धारित करने के लिए कि क्या उपचार प्रभाव अलग-अलग पीढ़ियों के बीच समान थे निकल पड़े। ट्यूमर athymic नग्न चूहों में विस्तार किया गया (10 ट्यूमर / समूह) और ऐसे सेटुक्सीमब (0.4 मिलीग्राम प्रति सप्ताह दो बार / माउस आईपी) और Irinotecan के रूप में देखभाल एजेंटों के मानक की प्रभावकारिता (15 मिलीग्राम / किग्रा आईपी प्रति सप्ताह में एक बार) में जांच की गई 4 दो अलग-अलग पीढ़ियों में अद्वितीय सीआरसी PDTX मॉडल। जबकि CRC010 (F6) उपचार संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया जैसा कि चित्र 3 ए और बी, CRC026 (F3) में सचित्र, अधिक सेटुक्सीमब उपचार के लिए प्रतिरोधी था। जब इन सीआरसी explants अलग पीढ़ियों में इलाज किया गया इसी तरह के निष्कर्ष मनाया गया; CRC026 (F9) प्रतिरोधी था और CRC010 (F7) सेटुक्सीमब के प्रति संवेदनशील था। PDTX मॉडल में Irinotecan की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए, हम 2 सीआरसी PDTX मॉडल में ट्यूमर के विकास पर उपचार के प्रभाव की जांच की। CRC098 (F8) Irinotecan उपचार के लिए प्रतिरोधी था जबकि, CRC036 (F5) संवेदनशीलता (चित्रा -3 सी और डी) का प्रदर्शन किया। सेटुक्सीमब के साथ मनाया गया के रूप में, अलग-अलग पीढ़ियों इन ट्यूमर में उपचार की प्रतिक्रिया में परिवर्तन नहीं किया Irinotecan साथ उपचार; CRC098 (F12) प्रतिरोधी था और CRC036 (F10) Irinotecan (चित्रा -3 सी और डी) के प्रति संवेदनशील था। हालांकि इलाज ट्यूमर के विकास कैनेटीक्स कभी कभी पीढ़ियों के बीच अलग था, Irinotecan और सेटुक्सीमब को उपचार प्रतिक्रियाएं ही बने रहे, विरोधी कैंसर उपचार के मूल्यांकन में इस मॉडल की स्थिरता के संकेत मिलते हैं।

सीआरसी PDTX मॉडल में स्ट्रोमा घटक की जांच

अगला, हम का निर्धारण इस सीआरसी explant मॉडल के भीतर स्ट्रोमा घटक मानव और / या माउस ली गई कोशिकाओं के शामिल किया गया था कि अगर में रुचि रखते थे। हम एक दोहरी रंग खटिया -1 मछली परख है कि माउस के शामिल इस्तेमाल कियाखटिया -1 डीएनए (हरी fluorophore) और मानव खटिया -1 डीएनए (लाल fluorophore) माउस और F0 और F1 पीढ़ियों 25 के बीच 10 अलग सीआरसी explants में मानव कोशिकाओं का निर्धारण। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है -4 ए, एफ 1 पीढ़ी में मानव स्ट्रोमा, माउस स्ट्रोमा द्वारा प्रतिस्थापित के बाद से मानव ट्यूमर अब सभी माउस स्ट्रोमा से घिरा हुआ है। इन निष्कर्षों को सभी 10 सीआरसी explants कि F0 और F1 पीढ़ियों के बीच खाट 1 मछली के अधीन थे में स्पष्ट किया गया है। खटिया-1 मछली के अलावा, हम इन ligands के लिए माउस और मानव ELISAs का उपयोग कर F0 और F1 पीढ़ियों में माउस और मानव HGF और वीईजीएफ़ ligands के प्रोटीन का स्तर की जांच की। के रूप में, चित्रा 4 बी और सी में दिखाया गया है, जबकि सभी मानव F0 पीढ़ी में HGF निकाली गई F1 पीढ़ी में माउस HGF साथ बदल दिया है, वीईजीएफ़ ligand दोनों मानव और F1 पीढ़ी में माउस शामिल थे। एक साथ इन प्रयोगों का सुझाव है कि सीआरसी PDTX माउस मॉडल में है कि माउस स्ट्रोमा वीं में मानव स्ट्रोमा overtakesई एफ 1 पीढ़ी और ligands बीइंग ह्यूमन और / या माउस व्युत्पन्न के संबंध में भिन्न हो सकते हैं स्रावित।

चित्र 2
चित्रा 2. सीआरसी PDTX बैंक और TCGA में आम म्यूटेशन की तुलना करें। हम KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, CTNNB1 और TP53 के लिए सम्मान के साथ TCGA (ए) और सीआरसी PDTX मॉडल (बी) के बीच बहुत समान उत्परिवर्तन आवृत्तियों मनाया । यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. ट्यूमर के विकास पर सेटुक्सीमब और Irinotecan उपचार के प्रभाव। (ए) CRC026 जब evalu सेटुक्सीमब के लिए प्रतिरोध दिखाया गया हैF3 और F9 पीढ़ियों में पैदा और (बी) CRC010 F6 और F7 पीढ़ियों में सेटुक्सीमब के प्रति संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया। (सी) CRC098 F8 और F12 पीढ़ियों में Irinotecan के लिए प्रतिरोध दिखाया है, जबकि (डी) CRC036 F5 में Irinotecan के प्रति संवेदनशील था और F10 पीढ़ियों। प्रत्येक डेटा बिंदु इलाज के समूह प्रति 10 ट्यूमर के एक औसत प्रतिनिधित्व करता है। चूहे सेटुक्सीमब (100 μl आईपी 400 माइक्रोग्राम / माउस) सप्ताह में दो बार और Irinotecan (100 μl आईपी 20 मिलीग्राम / किग्रा) एक सप्ताह में एक बार dosed गया था के साथ इलाज किया गया। के रूप में प्रस्तुत डाटा ± SEM मतलब है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. F0 और F1 पीढ़ियों में माउस का मूल्यांकन और ट्यूमर सेल घटकों। (ए) दोहरे गOlor मानव खाट -1 डीएनए (लाल) और माउस खाट -1 डीएनए (हरा) के लिए मछली F0 और F1 पीढ़ी में ट्यूमर के बीच मतभेद की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। मानव स्ट्रोमा (F0) CRC098 और CR174 (पैमाने = 20x) में माउस स्ट्रोमा (एफ 1) द्वारा बदल दिया है। परिगलित कोशिकाओं की पहचान के द्वारा कम या DAPI मध्यनिवेश और लाल प्रतिदीप्ति की कमी थी। एलिसा (माउस और मानव ELISAs) F0 और F1 के बीच से माउस और मानव HGF और वीईजीएफ़ ligand अभिव्यक्ति की जांच। (बी) मानव HGF F1 पीढ़ी और (सी) मानव और माउस वीईजीएफ़ में माउस द्वारा बदल दिया गया था F1 पीढ़ी में स्पष्ट किया गया (picograms / मिली लीटर [स्नातकोत्तर / एमएल])। के रूप में प्रस्तुत डाटा ± SEM मतलब है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

PDTX दवाओं की खोज मंच है कि उपन्यास यौगिकों के नैदानिक ​​गतिविधि की भविष्यवाणी करने में अविश्वसनीय हैं अन्य preclinical मॉडल की कमियों के लिए एक बेहतर मॉडल प्रदान करता है। महत्वपूर्ण बात है, इस मॉडल में ट्यूमर जैविक रूप से स्थिर हैं, metastatic क्षमता बनाए रखने के लिए, और पीढ़ी दर पीढ़ी समान दवा जवाबदेही दिखा रहे हैं। इस मॉडल में, रोगी निकाली गई ट्यूमर, athymic नग्न चूहों में इंजेक्शन हैं passaged, और बाद में चिकित्सकीय मूल्यांकन में इस्तेमाल किया। वहाँ एक सफल PDTX बैंक के लिए कई महत्वपूर्ण कदम है कि शामिल हैं: 1) / सहमति के रोगियों की पहचान और PDTX मॉडल के लिए हटाने और ट्यूमर के ऊतक की कमाई करने वाली और उत्कृष्ट प्रयोगशाला और पशु तकनीकी के साथ 2) एक मजबूत अनुसंधान समूह के लिए करने के लिए एक एकजुट नैदानिक ​​टीम ट्यूमर, संगठन और PDTX बैंक के रखरखाव के इंजेक्शन लगाने और चूहों के स्वास्थ्य की निगरानी के लिए कौशल। हमारे PDTX मॉडल में एक महत्वपूर्ण लाभ trocar प्रक्रिया के साथ ट्यूमर इंजेक्शन है। घन की वैकल्पिक विधिएक ट्यूमर जेब tting और फिर suturing या त्वचा क्लिप का उपयोग कर अधिक समय के कर्मियों के लिए लगता है, चूहों के लिए अधिक दर्द की दवा, और sutured या घाव काटा क्षेत्र की निगरानी की आवश्यकता है। trocar प्रक्रिया है, कम प्रशिक्षण की आवश्यकता बहुत जल्दी है, चूहों कम समय के लिए संज्ञाहरण के तहत कर रहे हैं, और कम दर्द दवाओं की जरूरत है। इसलिए, हमारे अनुभव Trocars के साथ ट्यूमर इंजेक्शन लगाने में वैकल्पिक तरीकों की तुलना में सबसे अच्छा तरीका है। इन कारकों में काफी PDTX बैंक की और दवाओं की खोज की प्रक्रिया में समग्र सफलता को प्रभावित करती है। हालांकि इस विवो मॉडल कैंसर कोशिका लाइन संस्कृतियों में एजेंटों के परीक्षण की तुलना में काफी अधिक महंगा है, PDTX मॉडल परीक्षण ऑन्कोलॉजी यौगिकों में एक और अधिक प्रासंगिक चिकित्सकीय दृष्टिकोण प्रदान करते हैं।

सीआरसी PDTX बैंक में, हम 99 ट्यूमर के नमूनों कि athymic नग्न चूहों में इंजेक्शन थे प्राप्त हुआ है। वहाँ 68 99 (68.7% ले दर) ट्यूमर है कि चूहों में वृद्धि हुई है और कई पीढ़ियों में पारित किए गए से बाहर थे। क्या आप वहां मौजूद हैंकई वजहों से कुछ ट्यूमर है कि हम प्राप्त चूहों में विकसित नहीं किया हैं। उदाहरण के लिए, हम कभी कभी ऊतक के केवल बहुत छोटे टुकड़े कि केवल हमें केवल एक माउस एक ट्यूमर की स्थापना की संभावना कम में इंजेक्षन करने की अनुमति प्राप्त किया। एक और मुद्दा यह है कि कई बार हम रोगी ऊतक कि सामान्य था और ट्यूमर कोशिकाओं एच एंड ई स्लाइड पर स्पष्ट शामिल नहीं किया था प्राप्त किया था। इसके अलावा, कुछ गरीब ऊतक गुणवत्ता पहले से ही necrosed ट्यूमर प्राप्त करने के कारण जहां उपचार के लिए एक मरीज को जवाब नहीं था हो सकता है। इसलिए, यह जब ट्यूमर कमाई करने वाली एक विश्वसनीय शल्य चिकित्सा और विकृति टीम के लिए महत्वपूर्ण है। इन मुद्दों में से कुछ को देखते हुए, हम म्यूटेशन के लिए सम्मान, जीन अभिव्यक्ति, और नैदानिक ​​विशेषताओं के साथ सबसे बड़ा सीआरसी PDTX पूरी तरह से एनोटेट ट्यूमर के बैंकों में से एक स्थापित करने में सक्षम हो गया है, इस अंतिम लक्ष्य के साथ उपन्यास के उपचारों के मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान मॉडल बनाने के रोगी परिणामों में सुधार।

कई जैविक और संयोजनउपचारों कैंसर स्टेम सेल की आबादी पर प्रभावकारिता, दवा प्रतिरोध तंत्र, साथ ही उपचार के प्रभाव का निर्धारण करने के उद्देश्य से इस मॉडल में जांच की गई है। हमारे समूह इस preclinical मॉडल 12-18, जो इन यौगिकों के आगे नैदानिक विकास में बहुमूल्य जानकारी प्रदान की गई है का उपयोग कर कई उपन्यास जैविक मार्ग अवरोधकों की प्रभावकारिता की जांच की गई। इन अध्ययनों से कई भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर 12-14,17,18 है कि भविष्य में क्लिनिकल परीक्षण में रोगी चयन में सहायता कर सकते हैं की पहचान की है। इसके अलावा, अन्य अध्ययनों से आगे इस मॉडल है, जो तर्कसंगत संयोजन 19-24 के विकास के लिए नेतृत्व किया गया है का उपयोग कर उपचार प्रतिरोध के तंत्र को निर्धारित किया है। उदाहरण के लिए, BARDELLI और उनके सहयोगियों ने दिखा दिया है कि 19 सेटुक्सीमब उपचार एमईटी प्रवर्धन प्रेरित और कहा कि मौसम विभाग के एक अंतर्निहित। सीआरसी में सेटुक्सीमब को उपचार के प्रतिरोध की व्यवस्था 19 एक अलग अध्ययन में हो सकता है, Bertotti एट अल। 20सीआरसी ट्यूमर है कि सेटुक्सीमब लिए प्रतिरोधी रहे थे में एक लक्ष्य के रूप में Her2 की पहचान की। अंत में, हम और एक अन्य समूह के संयोजन में एक पायदान मार्ग अवरोध करनेवाला के साथ कि इलाज से पता चला है Irinotecan साथ सीआरसी कैंसर स्टेम सेल की आबादी और ट्यूमर पुनरावृत्ति को कम उपचार के बाद 25,26 बंद किया गया था। साथ में, इन अध्ययनों दवा के विकास की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण है कि उपन्यास यौगिकों के आगे विकास पर असर पड़ सकता है में PDTX मॉडल के उपयोग के संभावित शक्ति प्रदर्शित करता है।

नए यौगिकों की प्रभावकारिता का निर्धारण करने में रोगी निकाली गई ट्यूमर का उपयोग कर एक प्रमुख लाभ के बावजूद, इस मॉडल में कई सीमाएं हैं। इस पत्र में प्रयोगात्मक दिखाया गया है, उद्भव ट्यूमर (F0) से मानव स्ट्रोमा सीआरसी PDTX मॉडल में F1 पीढ़ी पर माउस स्ट्रोमा साथ बदल दिया है। विशेष दवा लक्ष्य पर निर्भर करता है, यह एक मुद्दा हो सकता है जब माउस ligands मानव ट्यूमर कोशिकाओं पर रिसेप्टर (ओं) को सक्रिय करने में असमर्थ हैं। instanc के लिएई, हम बताते हैं F1 पीढ़ी में, HGF माउस स्ट्रोमा से ली गई है और अध्ययन निर्धारित किया है कि माउस HGF कार्यात्मक मानव सी-मेट रिसेप्टर 27,28 को सक्रिय करने के काबिल नहीं है। नतीजतन, सी-मेट अवरोधकों इन PDTX मॉडलों में एंटी-ट्यूमर के विकास प्रभाव का प्रदर्शन नहीं कर सकते हैं। वास्तव में, humanized HGF SCID चूहों इस संभावित समस्या 28 संबोधित करने के लिए विकसित किया गया है। चमड़े के नीचे ट्यूमर का उपयोग करने का एक और नुकसान ट्यूमर के मेटास्टेटिक क्षमता पर उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने में असमर्थता है। , ओर्थोटोपिक मॉडल का उपयोग हालांकि अधिक तकनीकी रूप से कठिन स्थापित करने के लिए और छवि ट्यूमर के विकास, संभावना मेटास्टेसिस पर उपचार के प्रभाव में बेहतर जानकारी प्रदान करेगा। इस मॉडल की एक अंतिम सीमा ट्यूमर के विकास और उपचार के लिए प्रतिरोध को सुविधाजनक बनाने में अपने कार्य potentiating में प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका की जांच करने में असमर्थता है। इसके अलावा, हाल ही में immunotherapies क्लिनिक में प्रदर्शन के उत्कृष्ट गतिविधि immunodeficie उपयोग कर के साथNT चूहों प्रतिरक्षा लक्षित एजेंटों की जांच से बचाता है। तदनुसार, humanized माउस मॉडल इन सीमाओं, जो प्रतिरक्षा ट्यूमर बातचीत की मौलिक भूमिका को समझने के साथ ही अन्य उपन्यास और मंजूरी दे दी यौगिकों के साथ संयोजन में immunotherapies की जांच के लिए अनुमति देने में मूल्य प्रदान कर सकता है संबोधित करने के लिए विकसित किया गया है।

अंत में, हम विकास और एक सीआरसी PDTX मॉडल है कि चिकित्सीय प्रभावकारिता, भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर और उपन्यास विरोधी कैंसर एजेंटों की दवा प्रतिरोध रास्ते का निर्धारण करने में अमूल्य है बनाए रखने पर एक विधि प्रदान करते हैं। हालांकि इस मॉडल निहित चुनौतियों का सामना किया है, इस मॉडल की उपयोगिता है कि यह बारीकी से मूल ट्यूमर है, जो उपन्यास के उपचारों का एक और अधिक सटीक और प्रासंगिक चिकित्सकीय जांच नैदानिक ​​मूल्यांकन करने से पहले प्रदान की ट्यूमर विविधता का स्मरण दिलाता है। इस preclinical PDTX मॉडल की दवा के विकास में नैदानिक ​​प्रभाव का भविष्य मूल्यांकन अंततः इस की शक्ति का निर्धारण करेगाकैंसर में चिकित्सा के नैदानिक ​​गतिविधि की भविष्यवाणी करने में मॉडल।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI or DMEM Corning 10-040-CV
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
Non-essential Amino Acids Corning 25-025-CI
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV Thaw in -4 °C, then activate for 30 min at 60 °C water bath
CPT blood tube BD vacutainer 362761
Microcentrifuge tube Surelock A-7002
Phosphate-Buffered Saline Corning 21-040-CV
Cyrogenic vials Cyroking C0732901
Plastic tumor cutting dish Trueline TR4001
Scissors Roboz RS-5881
Forceps Roboz RS-5135
Matrigel (gelatinous protein mixture) Corning 354234 Store at -20 or -80 °C, then thaw on ice, do not leave at RT
10% Formalin cups Protocol 032-059
Liquid Nitrogen Dewar Storage Thermolyne CY50900
Portable liquid nitrogen dewar Nalgene 4150-2000
Dimethyl Sulfoxide Fischer 67-68-5
Freezing container: Mr Frosty Nalgene 5100-0001
Isopropyl Alcohol Decon 64-17-5
Trocars Innovative Research of America MP-182
Anesthesia machine Patterson Veterinary
Anesthesia box Patterson Veterinary
Isoflurane Vet one 1038005
F-Air Canister Bickford Omnicon 80120
Meloxicam Vet one 5182-90C
Calipers Fowler 54-100-167
Weight scale Ohaus Scout Pro SP601

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References

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