Bir Klinik öncesi Hasta Türetilmiş Tümör Roman Anti-Kanser Tedaviler Soruşturma Xenograftlarında Modeli Geliştirilmesi ve Bakımı

1Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
Published 9/30/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Cancer Research

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

deri altı klinik öncesi modelde hasta kaynaklı tümörler kullanarak yeni tedavilerin, öngörü biyomarker keşif ve ilaca dirençli yolların etkinliğini incelemek için mükemmel bir yoldur. Bu model, ilaç geliştirme sürecinde, klinik araştırma önce birçok yeni anti-kanser terapisi kaderini belirlemede önemlidir.

Cite this Article

Copy Citation

Bagby, S., Messersmith, W. A., Pitts, T. M., Capasso, A., Varella-­Garcia, M., Klauck, P. J., et al. Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies. J. Vis. Exp. (115), e54393, doi:10.3791/54393 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Kolorektal kanser (KRK) Amerika Birleşik Devletleri'nde kanser ölümlerinin önemli bir katkıda bulunmaktadır. 2015 yılında, 49.700 ölüm 1 ile ÇHS tahmini 132.700 yeni vaka vardı. lokalize hastalığı olan hastalarda prognoz mükemmel olmasına rağmen, ilerlemiş hastalığı olan hastalarda yeni tedavilerin geliştirilmesinde bu önemli bir öncelik haline kötü sonuçlar var. bakım kemoterapötik rejimleri ve bu hastalığa karşı konuşlandırılmış yeni biyolojik standart olmasına rağmen, genel sağkalım sadece bir artan bir artış olmuştur. Buna göre, bu hastalıkta tümör büyümesini kolaylaştırmak katılan sürücü yollarının anlaşılmasında önemli bir çaba var. Kanser Genom Atlas ağ en son sayıda ana CRC bozukluğunun karıştığı ve bunlar yolları belirlemiştir: WNT, fosfoinositid 3-kinaz (PI3K), RAS, dönüştürücü büyüme faktörü-β (TGF-β) ve TP53 2. Birlikte, araştırmalar ot nitelendirdiCRC büyümeyi güçlendirir onun yollar önemli ölçüde bu hasta popülasyonunda 3-5 sağkalımı iyileştirmeyi amaçlayan yeni tedavilerin gelişimini başlatmıştır. Onkoloji ilaç geliştirilmesinde kullanılması klinik öncesi modellerde, bu yeni bileşiklerin klinik aktivite tahmin bu süreçte temel olmuştur.

Çeşitli klinik öncesi modellerde ilaç geliştirme sürecinde kullanılmıştır. Preklinik transgenik hayvan modelleri ve hücre hatları büyük ölçüde insan tümörlerinin karmaşıklığını yansıtacak şekilde yetersizlik, yeni onkoloji tedavilerin klinik etkinliğini belirlemede başarısız olmuştur ölümsüzleştirdi göz önüne alındığında, hasta kaynaklı tümör xenograft (PDTX) modelleri kurulmuştur. Bu modelin en büyük avantajı, tümör heterojen bozulmadan kalır ve yakından menşeli hastanın tümör 6-9 moleküler özelliklerini ve klonalite yansıtır olmasıdır. PDTX modelleri, in vivo bir harikalarını sağlamakpreklinik bir platform yeni ajanlar, ilaç direnci yolları, kombinasyonel stratejileri ve kanser kök hücre biyolojisi 10 incelemek için.

PDTX işleminin genel bir bakış, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu klinik başlar onların aşırı tümör dokusunun bir kısmı, bu araştırma için kullanılan izin vermek için hasta rızası. Sonraki, ameliyatta tümörün bir parça bir patolog tarafından hasılat ve araştırma personeline taşınacak ortama koydu. Bunun hemen ardından, tümör bölümü, küçük parçalar halinde kesilmiş ve deri altından bağışıklık yetersizliği olan farelere transplante edilir. Tümör büyüdükçe sonra, tümör 10 muhafaza edilmesi amacıyla farelerin farklı kuşaklar içine geçirilerek edilir. Tipik haliyle, F3 nesil sonra tümör yeni bileşikler ve / veya kombinasyonel tedaviler değerlendirilir tedavi çalışmaya genişletilebilir. Kullanan Next Gen Dizi (exome Seq, RNA Seq ve SNP dizi) potansiyel öngörü biyolojik belirteçler keşfetmek vardırBelirli bir tedaviden fayda görebilecek hastaların seçiminde yardımcı ed.

1) tek ajan olarak veya kombinasyon halinde yeni tedavilerin etkinliğini değerlendirmek ve 2) öncesinde klinik araştırma duyarlılık veya direnç tahmin biyobelirteçlerini tespit: PDTX modelleri kullanarak kapsayıcı hedefleri şunlardır. Bu yazıda, bir CRC PDTX bankanın başlatılması ve bakım metodoloji sağlamak ve ilaç geliştirme keşfi bu modelin avantajları ve sınırlamaları sağlamaktadır.

Şekil 1
CRC PDTX Modeli Protokolü Şekil 1. Genel. Hasta edilen tümör cerrahisi alınan hemen deri altından atimik çıplak farelere enjekte edilir. Tümör büyüdükçe kez sonraki nesillere genişletilir ve sonuçta tedavi çalışmaları için genişletilir. Tedavi RESPOnses değerlendirilir ve tahmini biyomarkerlar. Hasta seçiminde yardımcı olabilir belirlenmiştir , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik Beyanı: Hasta kaynaklı kolorektal adenokarsinom tümör örnekleri Colorado Çoklu Kurumsal Değerlendirme Kurulu (08-0439) tarafından onaylanmış bir protokol uyarınca Colorado Üniversitesi Hastanesi hastaları rıza elde edilmiştir. Tüm hayvan çalışmaları Colorado Denver Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan hayvan protokol çerçevesinde gerçekleştirildi (IACUC, Protokol # 51412 (06) 1E ve 96813 (04) 1E).

1. Alma ve Hasta Kan hazırlanması

  1. 1 toplayın - 2 sodyum sitrat içeren bir kan / hücre ayırma tüp kan ml (plazma, lenfosit ve monosit bandı, yoğunluk gradyan sıvı, jel bariyer, ve eritrositler ve nötrofiller dahil boru aşamalarını vardır). Dikkat, kan ya da doku ile kan Bazlı Patojen yönergeleri izleyin.
    Not: PBMC'ler ve plazma içerebilir gelecek çalışmalar için kullanılan olabilir: tümör mutasyonları ile germline genetik varyasyonu karşılaştıran, dolaşımına izolevb hücre serbest DNA (cfDNA) incelenmesi proteinler ve microRNA, değerlendirilmesi ting tümör hücreleri.
  2. Oda sıcaklığında hiçbir frenli 15 dakika 2500 xg'de kan / hücre ayırma tüp santrifüj.
  3. periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (lenfosit ve borunun monosit bandında PBMC'ler) toplayın ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü (net, otoklav, DNase, RNase ve pirojen serbest) koymak ve steril fosfat-tamponlu tüpün üst dolgu tuz (PBS).
    1. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 2300 x g'de santrifüj tüpünün dibinde PBMC'ler bir tablet oluşturulur. Sonra, dikkatle süpernatant kaldırmak. 30 saniye boyunca 3.000 xg'de pelet ve santrifüj yıkamak için steril PBS 1 ml ekleyin ve sonra süpernatant kaldırmak.
  4. 1.5 ml steril kriyojenik şişede (tüp plazma aşamasında) kan / hücre ayırma tüpten plazma toplamak için bir pipet kullanın (DNaz ve RNaz ücretsiz, hiçbir insan DNA'sı, endotoksin ücretsiz) ve bir içine PMBV en ve plazma ve pelet koymak -80 ° C Fdepolama reezer.

2. Alma ve Hasta Tümör Numune Hazırlama

  1. Hazırlama RPMI ya da DMEM ortamı 1 ya da: Penisilin-Streptomisin ve temel olmayan amino asitler, 100 (% 10), 1: 1000 (1%) Plasmocin, ve% 10 cenin öküz serumu inaktifleştirilmiş, (tam ortam) ve ekleme 20-25 tümör örnek için steril bir toplama kabına ml.
  2. Buz üzerinde tam bir ortam ihtiva eden bir steril kap içinde, tümör örneğinin almak ya da 4 ° C'de tutun.
    Not: Tümör örneği, bir cerrah ile ayrılmış bir patolog tarafından işlenir ve tam ortam steril bir toplama kabına yerleştirilir fazla hastanın tümör dokusu parçası. Dikkat, kan ya da doku ile kan Bazlı Patojen yönergeleri izleyin. Ayrıca, ideal olarak, beş fare enjekte tümör, yaklaşık 1 cm³ olmalıdır.
  3. immün bozukluk farelere enjekte edilmesi için bir hayvan tesisine, tümör örneğinin getirin.
    Not: en kısa sürede tümör örneği işlemek için en iyisidir.
    1. bir laminar akış başlığı içinde, tümör fincan steril plastik kesme kabı içine, tümör numuneyi. jelatinimsi Protein karışımı çözeltisi 300 ul ile dolu bir otoklava 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 12 yaklaşık 3 x 3 x 3 mm parçalar ve yeri - 10 kesmek için otoklav küçük makas ve forseps. buz üzerinde tüp tutun.
    2. Öncelikli olarak farelere tümörü enjekte ancak arta kalan herhangi bir tümör, varsa flaş dondurulmuş şişeleri (FF), formalin ile sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) bardak ve canlı tümör şişe toplamak.
    3. FF, bu tür bir protein, RNA ya da DNA izolasyonu, daha fazla analiz için steril kriyojenik şişeden tümör dokularında küçük parçaları toplamak. sıvı azot Dewar içine hemen FF yerleştirin ve uzun vadeli saklamak -80 ° C derin dondurucuda.
    4. FFPE için yeterli tümör, yer tümör en az 24 saat süreyle formalin olmuştur kez parafin bloklar halinde 10 ml% 10 formalin fincan ve sürecine 3 küçük parçalar varsa.
      Not: 24 saat dayanırBizim Histoloji Çekirdek önerileri 11 kapatır.
    5. Son olarak, çok düşük bir tüp içine, geri kalan tümör yerleştirin. ortamı tamamlamak için% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) eklenerek uygulanabilir Ortamın. Daha sonra, bir kriyojenik tüpüne 1 ml ilave edilir ve buz üzerinde muhafaza edin. Not: uzun süre boyunca buz üzerinde tutmayın.
      1. 10 tümörleri gelecek 5 fareye enjekte edilmesi için ideal yeterli olacaktır küçük parçalar halinde herhangi bir artık tümör kesin. bir İzopropil Alkol dondurma kabının (yavaş bir defada tümör 1 ° C donar) yerleştirilir ve -80 ° C derin dondurucuda içine konabilir kadar Sonra, tümörler sırasında ölme emin olmak için buz üzerinde canlı tümör tüp yeri dondurma işlemi.
        Not: Uzun süreli saklama için tümörler çıkarılır (2 sonra - 3 gün) ve büyük bir sıvı azot Dewar yerleştirilir. canlı tüpler o farelere enjekte dışarı atılıyor sürece çözülmeye izin verilmemesi gerektiğini lütfen unutmayın.

3..Hasta elde edilen tümör ksenograftlarının Enjeksiyon

  1. her bir ayrı hastanın edilen tümör 8 haftalık erkek ve / veya dişi atimik çıplak fare (eksikliği T-hücresi) - Beş 6 kullanın. 10 tümörlerin toplam (fare başına 2 enjeksiyon) subkütan (SQ) enjekte edilir.
    Not: Orijinal insan tümör F0 olarak belirlenmiş ve daha sonra bir kez nesil F1 farelere enjekte edilir. Ayrıca, her benzersiz eksplant için otoklavlanmış forseps, makas, ve trokarları kullanın.
  2. otoklavlanmış 12 G trokarlardan içine jelatinimsi bir protein karışımı çözeltisinden tümörün yük parçaları ve tümör tamamen delici içine itilir emin olun.
    1. (Anestezi bakımı için% 3 İsofluranın - -% 4 oksijen ve 2% 5 başlangıç ​​hızı İsofluranın başladı, 3) steril bir laminer akış kaputu, bir İsofluranın anestezi makinesine bağlı bir anestezi kutunun içine 5 fareler yerleştirin ve karbon filtre (aşırı gaz emer).
      Not: deneyimli bir teknisyen üzerindeki tüm yordamı gerçekleştirmek gerekirYaklaşık 5 dakika toplam (fare başına yaklaşık 30 sn) içinde 5 farelerin bir kafes. Bu nedenle, ek termal destek ve göz yağlama genellikle kullanılmaz. Daha az deneyimli kişiler için veya eğitim sırasında, son derece bireylerin tek seferde daha az hayvanlar üzerinde yordamı gerçekleştirmek ve / veya hayvan 5 dakika daha uzun anestezi olması durumunda işlem sırasında bir ısınma ped / göz yağlama kullanmak ya önerilir. Prosedür Üniversitemizde IACUC standartlarına dayanmaktadır.
  3. fare artık duyarlı olmasını sağlamak için bir fare ayak tutup İsofluranın kutudan fareyi alır. yan bölge otoklavlanmış 12 G trokarlardan ile ulaşılana kadar orta sırt boyun bölgesinde ve aşağı subkutan trokar sürgülü tümörleri enjekte etmek için temiz bir alan üzerine fare yerleştirin.
    1. Farenin kanadını her tarafında bir tümör subkutan sunun. trokar tümör istenen yan bölgede kalmasını sağlar, çekildiğinde tümörü sıkıştırın. gelatinous protein karışımı farenin vücut sıcaklığı ile sertleşir ve tümör büyümesine yardımcı ve SQ bağ dokusu sabitlemek için yaklaşık 1 hafta tümörü kapsüller. trokar tarafından yapılan lezyon 4 mm daha büyük ve zımba ile cilt kapatmak için gerek yoktur.
      Not: Bizim veterinerler hiçbir kapatma lezyonun çok küçük boyutuna göre gerektiğinde bellidir hızlı iyileşme süresi, bu süre zarfında, not hiçbir zaman enfeksiyon ve hayvanların yakından izlenmesini (orta dorsal boyun bölgesinde herhangi bir cilt gerginliği ya da lezyonun tımar azaltır) .
  4. Fare uzakta tümör enjeksiyon sitesinden tamamen uyanık enjekte Meloksikam 2 mg / kg SQ (ağrı kesici) önce. Sonra, kafesin içine fare koyun ve fare uyanık ve hareketli kadar izler.
    Not: tamamen uyanık kadar sahipsiz hayvanları kurtarma bırakmayın. Meloksikam dozaj Üniversitemizde IACUC standartlarına dayanmaktadır.
    1. Sonraki 4 ile aynı prosedürü tekrarlayınfareler kalan ve nefes izlemek.
      Not: Bu çok hızlı bir işlemdir ve fareler Meloksikam enjeksiyonundan sonra çok kısa bir süre uyanmak unutmayın ama gerektiği gibi İsofluranın ayarlayın. Fare dışarı alınır her zaman, izofluran aşağı çevirin. Meloksikam 24 saat sürecek ve trokarlardan gelen lezyonlar tamamen 1 hafta içinde iyileşir.

Hasta Türetilmiş Tümör Xenograftlarında Bankası 4. Bakım

  1. En az haftada bir kez farelerin büyüme ve sağlığını izlemek. Tümör boyutları, tümör oluşumunu, tümör enjeksiyonundan tarihini ve farelerin sağlığını izlemek için bir elektronik tablo (veya başka bir izleme sistemi) kullanın.
    Not: Fareler 15 orijinal vücut ağırlığının%, düşük vücut kondisyon puanları (≥ 2) kaybettiyseniz, tümör ülserleri, tümörleri 2,000 mm 3 veya toplam tümörler 3.000 mm 3 veya eğilmiş (hastalıklı olan, soğuk, uyuşukluk, vb ulaşan var .) herhangi bir şekilde, farenin CO₂ ile ötenazi veya servikal dislokasyon anestezi sağlarüzere ikincil bir yöntem. tümör toplama aksi farenin CO₂ ve servikal dislokasyon ile ötenazi, anestezi ve servikal dislokasyon ile öldürülür.
  2. Bir tümör yukarıda açıklanan ve daha sonra euthanize servikal dislokasyon gerçekleştirmek yaklaşık olarak 1,500-2,000 mm 3 anestezisi fareler olduğunda.
    1. Fare hiçbir kalp atışı olup olmadığını kontrol edin. otoklava makas ve forseps ile SQ tümörü tüketim.
      NOT: İzin tümörler 1 yıla kadar büyümeye ve tümör görülür ise o zaman ikinci bir yöntem olarak servikal dislokasyon tarafından takip CO 2 üzerinden fareler, euthanize.
    2. Passage (5 farelerin yeni bir dizi aka) bir sonraki kuşağa iyi büyüyen tümör. geçen 12 tümörler ve ayrıca yukarıda tarif edildiği gibi daha sonra artık tümörün toplamak - Kullanım talimatları yukarıda 10 toplamak için.
      Not: Çok sayıda canlı tüpler Toplama erken nesillerin (F1 - F8) çok önemlidir; Bu nedenle, pek çok canlı tüpler, FF tüpler ve generat için 1 FFPE toplamakiyon.
    3. Farelerin yeni nesil yaklaşık 300 mm 3 tümör büyümesini sahip kadar kalan fareler tutun. Geriye kalan farelerin büyük tümörler olduğunda, yukarıda tarif edildiği gibi toplama devam etmektedir.
  3. geçit tümörleri devam edin ve F15 kadar her aşamada toplamak. Bu noktada, sıvı azot dışında en erken nesil uygulanabilir bir tüp alıp buz üzerinde çözülme izin ve yukarıda açıklanan tümör enjekte prosedürlerini izleyin.
    canlı tüplerden büyümek tümörler nesilden nesile geçen kıyasla farelerde büyümeye daha uzun sürer, bu yüzden planlarken akılda tutmak Not:. Belirli PDTX modeli artık herhangi bir geçit gerekiyorsa, ötenazi ve çok sayıda canlı borular ileride kullanılmak üzere toplanır sağlamak için, tümör toplar.

Hasta Türetilmiş tümör ksenograftlarının 5. Developmental Therapeutics

Not: F3 nesil Çoğu tümörler iyi büyüme kinetiği (daha hızlı ve daha co büyümek zorundansistent), bu nedenle, ilaç etkinlik çalışmaları PDTX geçin.

  1. İstenilen tümör çok büyük olduğunda (1,500 - 2,000 mm 3), farelerin istenilen miktarda haline dönüşmeye tümörün toplamak için yukarıdaki prosedürleri takip edin.
    1. hipoteze göre tedavi grubu başına gerekli tümörlerin sayısını belirlemek denenmektedir.
      Not: jelatinimsi bir protein karışımı, çözeltinin 1 ml farelere enjekte edilmesi için yaklaşık uygun 30 küçük tümör parçaları (tümör morfolojisine bağlı olarak) olabilir.
  2. Haftalık tümörleri ve fareler kontrol çoğu tümörler (50 arasında yaklaşık - 300 mm³) gözle küçük olduğunda tümör hacmini belirlemek için kaliperler ile tümör ölçmek. Tümör hacmi = [width² (küçük ölçümü) x uzunluk (en büyük ölçüm)] 0.52 x.
    Not: jelatinimsi bir protein karışımı, çözelti, bir haftalık tümör büyümesi doğru ise sonra, bir hafta süreyle enjekte tümör parçaları çevreler.
  3. 300 mm³ ve - 50 arasında tümör hacimleri kullanınn sol ve sağ tümörleri ortalama. Sonra birbirinden Birkaç sayı içinde bir grup ve bir grup başına ortalama 10 tümörleri tedavi gruplarına rastgele. Sonra, gruplar halinde fareler sıralamak ve arzu edilen tedavi çalışmaya başlar.
  4. İlaç (ilaca bağlı programa) haftada iki kez, tartmak ve ölçmek (tümör) ile fareler Doz. Çalışmanın sonunda, anestezi ve servikal dislokasyon yoluyla fareler euthanize ve laboratuarda gelecek farmakodinamik analizi için tümör toplamak.
    Not: Çalışma araç tümör boyutu ve farelerin sağlığına bağlı 30 gün sürer.

Bir PDTX bankanın 6. organizasyonu

  1. araştırma ve hayvanların uygun kullanım yinelenen önlemek için bir iyi belgelenmiş bir form tutun.
    NOT: Bu, başarılı bir PDTX bankaya anahtarıdır.
    1. PDTX bankada fareler, tedavi, veri, klinikte insan hastada bir tümörün izlemek için elektronik tablolar kullanın ve ne toplanır. Not: Bu dondurucu, sıvı azot Dewars içeriryanı sıra, ve FFPE depolama.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CRC PDTX Modelleri ve TCGA Ortak Mutasyonlarının Benzerlikler

Biz CRC PDTX bankada ortak mutasyonlar (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, APC, CTNNB1 ve TP53) yüzdesi CRC hasta popülasyonunda görülen mutasyon sıklığı temsilcisi olup olmadığını araştırdık. Şekil 2A (TCGA) ve B (CRC PDTX Bankası) 'de gösterildiği gibi, bu genlerdeki mutasyonların sıklığı TCGA (n = 276 hasta) ve CRC PDTX banka (n = 59 CRC hasta) arasında çok benzer olmuştur. % 23 fark görüldü sayede gözlenen en büyük fark, APC geninde oldu. Bu sonuçlar, CRC hasta popülasyonunda gözlenen yaygın mutasyonların de CRC PDTX modelinde temsil olduğunu göstermektedir.

Farklı Arasında Tedavi Cevaplarının stabilitesi değerlendirilmesikuşaklar

Bu CRC PDTX modelinde, biz tedavi etkileri farklı kuşaklar arasında benzer olup olmadığını belirlemek için yola çıktı. Tümörler, atimik çıplak farelerde genişletilmiştir (10 tümör / grup) ve setuksimab (0.4 mg haftada iki kez / fare IP) irinotekan şekilde bakım maddeleri standart etkinliği incelenmiştir (/ kg ip haftada bir 15 mg), iki ayrı kuşak 4 benzersiz CRC PDTX modelleri. Şekil 3A ve B, CRC026 (F3) 'de gösterildiği gibi, CRC010 (F6) tedavisi duyarlılık göstermesine rağmen, Setuksimab tedaviye daha dirençliydi. Bu CRC eksplantlar farklı kuşaklardan tedavi edildiğinde benzer bulgular gözlenmiştir; CRC026 (F9) dirençli ve CRC010 (F7) setuksimabtan duyarlı oldu. PDTX modelinde irinotekan etkinliğini belirlemek için, 2 CRC PDTX modellerinde tümör büyümesi üzerine tedavi etkilerini araştırdık. CRC098 (F8) irinotekan tedavisine dirençli iken, CRC036 (F5) duyarlılık (Şekil 3C ve D) sergiledi. setuksimabtan gözlenmiştir gibi, bu tümörlerde tedavi yanıtını değişmedi farklı nesiller irinotekan ile tedavi; CRC098 (F12) dirençli ve CRC036 (F10) irinotekan (Şekil 3C ve D) duyarlı idi. muamele edilmemiş tümörlerin büyüme kinetikleri kuşaklar arasındaki bazen farklı olsa da, irinotekan ve cetuximab tedavi tepkileri, anti-kanser tedavileri değerlendirilmesinde bu modelin kararlılığını gösteren aynı kalmıştır.

CRC PDTX Modelinde Stroma Bileşeni Araştırılması

Sonra, bu CRC eksplant modeli içinde stroma bileşeni insan ve / veya fare elde edilen kök hücrelerin oluşuyordu olmadığını belirlemede ilgi vardı. Biz fare oluşan bir çift renk Cot-1 BALIK deneyi kullanıldıKatlanır-1 DNA (yeşil fluorofor) ve insan Cot-1 DNA (kırmızı fluorofor) fare ve F0 ve F1 nesiller 25 arasında 10 ayrı CRC eksplantlar insan hücrelerini tespit etmek. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, insan tümörü tüm fare stroma ile olduğundan, F1 neslinden insan stroma, fare stroma ile değiştirilir. Bu bulgular F0 ve F1 nesiller arasında Cot-1 FISH tabi tutuldu 10 CRC eksplantlarda belirgindi. Katlanır-1 balık ek olarak, bu ligandlar için fare ve insan ELISA'lar kullanılarak F0 F1 kuşaklarda fare ve insan HGF ve VEGF'nin ligandlar protein düzeyleri incelendi. F0 üretimi HGF türetilmiş insan F1 neslinden fare HGF ile değiştirilir ise, Şekil 4B ve C de gösterildiği gibi, VEGF ligand F1 neslinden hem insan hem de fare oluşuyordu. Birlikte bu deneyler CRC PDTX fare modelinde fare stroma th insan stroma gelse o önermeke F1 jenerasyonundan, insan ve / veya fare türetilmiş göre değişebilir salgı.

şekil 2
CRC PDTX Bankası ve TCGA Ortak Mutasyonlarının Şekil 2. karşılaştırılması. Biz KRAS, NRA'lar, BRAF, PIK3CA, CTNNB1 ve TP53 ile ilgili TCGA (A) ve CRC PDTX modeli (B) arasında çok benzer mutasyon frekansları gözlenen . Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Tümör Büyümesi Üzerine Setuksimab'a ve irinotekan Tedavisinin Etkileri. (A) CRC026 zaman katı değerlendirme setuksimabtan direnç gösterildiF3 ve F9 nesillere ated ve (B) CRC010 F6 ve F7 nesillere setuksimabtan duyarlılık sergiledi. (C) (D) CRC036 F5 irinotekan duyarlı iken CRC098, F8 ve F12 nesillere irinotekan direnç gösterdi ve F10 nesiller. Her veri noktası, tedavi grubu başına 10 tümörlerin ortalamasını temsil eder. Fareler haftada bir dozlanmıştır setuksimab (100 ul IP 400 ug / fare) haftada iki kez ve irinotekan (20 mg / kg, 100 ul IP) ile muamele edildi. Olarak sunulan veriler ortalama ± SEM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. F0 ve F1 Generasyonlarda Fare Değerlendirilmesi ve Tümör Hücre Bileşenleri. (A) Çift-color insan karyolası-1 DNA (kırmızı) ve fare karyolası-1 DNA (yeşil) için FISH F0 ve F1 nesil tümörler arasındaki farklılıkları araştırmak için kullanıldı. İnsan stroma (F0) CRC098 ve CR174 (ölçek = 20x) fare stroma (F1) ile değiştirilir. azaltılabilir veya DAPI ardalanması ve kırmızı floresan eksikliği nekrotik hücreler tespit edildi. F0 ve F1 arasındaki ELISA (fare ve insan ELISA) ile, fare ve insan HGF ve VEGF'nin ligand ifade incelenmesi. (B) insan HGF F1 neslinden ve (C), insan ve fare VEGF fare ile ikame edilmiş F1 neslinden belirgindi (pikogram / mililitre [ug / ml]). Olarak sunulan veriler ortalama ± SEM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PDTX ilaç keşif platformu yeni bileşiklerin klinik etkinliğini öngörmede güvenilmez diğer preklinik modellerin eksiklikleri gelişmiş bir model sunuyor. Önemli olarak, bu modelde, tümörler, biyolojik olarak kararlı, metastatik potansiyelini korumak ve kuşaktan içindeki ilaç tepki gösterirler. Bu modelde, hastanın türevli tümörler, atimik çıplak farelere enjekte geçişli ve daha sonra tedavi değerlendirmesinde kullanılır. içeren başarılı bir PDTX banka için birkaç kritik adımlar vardır: 1) uyumlu bir klinik ekip / rıza hastaların belirlenmesi ve mükemmel laboratuvar ve teknik hayvan ile kaldırılması ve tümör dokusunun hasılat yapan PDTX modeli için ve 2) güçlü bir araştırma grubu için için tümörler, organizasyon ve PDTX bankanın bakım enjekte ve farelerin sağlığını izlemek için becerileri. Bizim PDTX modellerinde önemli bir avantajı, trokar prosedüre tümörler enjekte. Cu alternatif bir yöntem,Bir tümör cebi tting ve sonra dikilmesi veya deri klipleri kullanan personel için daha zaman alıcı, daha fazla acı fareler için ilaç ve sütüre veya yara kırpılan alana izlenmesini gerektirir. trokar prosedürü, daha az eğitim gerektirir çok hızlı, fareler daha az bir süre için anestezi altında ve daha az ağrı ilaçlar ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bizim deneyim trokarlardan ile tümörlerin enjekte alternatif yöntemlerin karşı en iyi yöntemdir. Bu faktörler önemli ölçüde PDTX banka ve ilaç keşfi sürecinde genel başarı etkileyecektir. Bu in vivo modelde kanseri hücre dizisi kültürlerinde maddeler test önemli ölçüde daha pahalı olsa da, PDTX model test onkoloji bileşikleri bir klinik açıdan daha anlamlı bir yaklaşım sunmaktadır.

CRC PDTX banka olarak, atimik çıplak farelere enjekte edilmiştir 99 tümör örnekleri aldık. 99 (% 68.7 almak oranı) farelerde büyüdü ve birden nesillere içine geçirildi tümörlerin dışında 68 vardı. OradaAldığımız bazı tümörler farelerde büyümeye vermedi birkaç nedeni vardır. Örneğin, zaman zaman sadece ABD tümör oluşturulması olasılığını azaltma tek fareye enjekte izin doku, sadece çok küçük parçalar aldı. Bir başka konu zaman zaman normal ve H & E slayt belirgin tümör hücrelerini içermiyordu hasta doku aldığını oldu. Tedaviye hasta yanıt nerede Buna ek olarak, bazı kötü doku kalitesi zaten nekroze tümör almaya nedeniyle olabilir. Nedenle, tümörün hasılat elde zaman güvenilir bir cerrahi ve patoloji ekibi olması önemlidir. Bu sorunlardan bazıları göz önüne alındığında, biz nihai hedefi ile yeni tedavilerin değerlendirilmesi için bu değerli modeli yapma, mutasyonlar açısından, gen ifadesinde, ve klinik özellikleri ile tam açıklamalı tümörlerin büyük CRC PDTX bankalarından biri kurmak mümkün olmuştur hasta sonuçlarını iyileştirmek.

Çok sayıda biyolojik ve birleşimseltedavileri, kanser kök hücre üzerindeki etkinliğini ilaç direnç mekanizmalarının yanı sıra, tedavi etkilerini belirlemek amacıyla bu modelde incelenmiştir. Grubumuz bu bileşiklerin daha klinik geliştirme değerli bilgiler sağlamıştır bu preklinik modeli 12-18, kullanarak çok sayıda yeni biyolojik yolu inhibitörlerinin etkinliğini incelemiştir. Bu çalışmaların çoğu, gelecekte klinik çalışmalarda hasta seçiminde yardımcı olabilir öngörü biyomarkerlar 12-14,17,18 belirledik. Buna ek olarak, diğer çalışmalar, doğal kombinasyonları 19-24 gelişmesine yol açmıştır, bu model kullanılarak tedavi direnç mekanizmalarını belirledik. Örneğin, Bardelli ve arkadaşları 19 setuksimab tedavi MET amplifikasyon uyarılan ve Met ayrı bir çalışmada altta yatan CRC setuksimabtan tedavi direnç mekanizması. 19 olabilir olduğunu göstermiştir, Bertotti ve ark. 20setuksimabtan dirençli olduğu CRC tümörlerinde bir hedef olarak Her2 belirledi. Tedavi 25,26 sonra kesildi irinotekan CRC kanseri kök hücre ve tümör nüksü indirgendi Son olarak, ve diğer grup bir arada bir çentik yolu inhibitörü ile muamelenin göstermiştir. Bununla birlikte bu araştırmalar yeni bileşiklerin önemli ölçüde daha da geliştirilmesi etkileyebilecek ilaç geliştirme sürecinde PDTX modellerinden faydalanmak potansiyel gücünü göstermektedir.

Yeni bileşiklerin etkinliğinin belirlenmesi, hasta edilen tümörler ile önemli avantajlara rağmen, bu modelde çeşitli sınırlamalar vardır. Bu yazıda deneysel gösterildiği gibi, kaynak tümörün (F0) insan stroma CRC PDTX modelinde F1 nesil fare stroma ile değiştirilir. Fare ligandları insan tümör hücreleri üzerindeki reseptör (ler) aktive edemiyoruz zaman belirli ilaç hedefi bağlı olarak, bu bir sorun olabilir. instanc içinE biz F1 neslinden, HGF fare stroma türetilir ve çalışmalar fare HGF sahip insan c-Met reseptörünün 27,28 aktive edemeyen olduğu tespit olduğunu göstermektedir. Bunun bir sonucu olarak, c-Met inhibitörü, bu PDTX modellerinde anti-tümör büyüme etkileri göstermezler olabilir. Aslında, insanlaştırılmış HGF SCID fareleri bu potansiyel sorun 28 çözmek için geliştirilmiştir. deri altı tümörleri kullanmanın diğer bir dezavantajı metastatik potansiyelin üzerinde tedavi etkilerini incelemek için yetersizliğidir. teknik açıdan daha zor olasılıkla metastaz tedavinin etkilerinin içine daha iyi görmemizi sağlayacak, görüntü tümör büyümesini kurmak ve her ne kadar, ortotopik modelleri kullanarak. Bu modelin son bir sınırlama tümör büyümesini ve tedaviye karşı direnç kolaylaştırmada kendi fonksiyonunu güçlendirmek bağışıklık sisteminin rolünü araştırmak için yetersizliğidir. Ayrıca, immunodeficie kullanarak en son klinikte gösterilmiştir immünoterapilerin mükemmel aktiviteye sahipnt fareler bağışıklık hedefe yönelik ajanların soruşturma önler. Bu duruma göre, insanlaştırılmış fare modelleri, immün tümör etkileşimleri temel rolünü anlamak hem de diğer yeni ve onaylanmış bileşikler ile kombinasyon halinde immünoterapilerin araştırılması için izin değeri sağlayabilir bu sınırlamaları, gidermek için geliştirilmiştir.

Sonuç olarak, gelişmekte olan ve terapötik etkinlik, akıllı biyomarkerları ve yeni anti-kanser maddelerinin ilaç direnç yollarının belirlenmesinde çok değerli bir CRC PDTX modeli sürdürmek bir yöntem sağlar. Bu modelin doğal zorlukları olmasına rağmen, bu modelin yarar yakından klinik değerlendirme öncesinde yeni tedavilerin daha kesin ve klinik olarak anlamlı bir soruşturma sunuyor orijinal tümör, tümör heterojenitesini özetlediği olmasıdır. Bu preklinik PDTX modelinin ilaç geliştirme klinik etkisi gelecekteki değerlendirme sonunda bu gücünü belirleyecekkanser tedavilerinin klinik aktivite tahmin modeli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI or DMEM Corning 10-040-CV
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
Non-essential Amino Acids Corning 25-025-CI
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV Thaw in -4 °C, then activate for 30 min at 60 °C water bath
CPT blood tube BD vacutainer 362761
Microcentrifuge tube Surelock A-7002
Phosphate-Buffered Saline Corning 21-040-CV
Cyrogenic vials Cyroking C0732901
Plastic tumor cutting dish Trueline TR4001
Scissors Roboz RS-5881
Forceps Roboz RS-5135
Matrigel (gelatinous protein mixture) Corning 354234 Store at -20 or -80 °C, then thaw on ice, do not leave at RT
10% Formalin cups Protocol 032-059
Liquid Nitrogen Dewar Storage Thermolyne CY50900
Portable liquid nitrogen dewar Nalgene 4150-2000
Dimethyl Sulfoxide Fischer 67-68-5
Freezing container: Mr Frosty Nalgene 5100-0001
Isopropyl Alcohol Decon 64-17-5
Trocars Innovative Research of America MP-182
Anesthesia machine Patterson Veterinary
Anesthesia box Patterson Veterinary
Isoflurane Vet one 1038005
F-Air Canister Bickford Omnicon 80120
Meloxicam Vet one 5182-90C
Calipers Fowler 54-100-167
Weight scale Ohaus Scout Pro SP601

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. 2015. CA Cancer J Clin. 65, (1), 5-29 (2015).
  2. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487, (7407), 330-337 (2012).
  3. Arcaroli, J. J., et al. Tumours with elevated levels of the Notch and Wnt pathways exhibit efficacy to PF-03084014, a gamma-secretase inhibitor, in a preclinical colorectal explant model. Br J Cancer. 109, (3), 667-675 (2013).
  4. Hubbard, J., Grothey, A. Antiangiogenesis agents in colorectal cancer. Curr Opin Oncol. 22, (4), 374-380 (2010).
  5. van Es, J. H., et al. Notch/gamma-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells. Nature. 435, (7044), 959-963 (2005).
  6. Cassidy, J. W., Caldas, C., Bruna, A. Maintaining Tumor Heterogeneity in Patient-Derived Tumor Xenografts. Cancer Res. 75, (15), 2963-2968 (2015).
  7. Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12, (7), 473-480 (2010).
  8. Julien, S., et al. Characterization of a large panel of patient-derived tumor xenografts representing the clinical heterogeneity of human colorectal cancer. Clin Cancer Res. 18, (19), 5314-5328 (2012).
  9. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73, (17), 5315-5319 (2013).
  10. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9, (6), 338-350 (2012).
  11. Carson, F. L. Histotechnology: A Self-Assessment Workbook. American Society of Clinical Pathologists Press. Chicago, IL. (1996).
  12. Arcaroli, J. J., et al. Common PIK3CA mutants and a novel 3' UTR mutation are associated with increased sensitivity to saracatinib. Clin Cancer Res. 18, (9), 2704-2714 (2012).
  13. Arcaroli, J. J., et al. A NOTCH1 gene copy number gain is a prognostic indicator of worse survival and a predictive biomarker to a Notch1 targeting antibody in colorectal cancer. Int J Cancer. 138, (1), 195-205 (2016).
  14. Arcaroli, J. J., et al. Gene array and fluorescence in situ hybridization biomarkers of activity of saracatinib (AZD0530), a Src inhibitor, in a preclinical model of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 16, (16), 4165-4177 (2010).
  15. Lieu, C. H., et al. Antitumor activity of a potent MEK inhibitor, TAK-733, against colorectal cancer cell lines and patient derived xenografts. Oncotarget. 6, (33), 34561-34572 (2015).
  16. Pitts, T. M., et al. Association of the epithelial-to-mesenchymal transition phenotype with responsiveness to the p21-activated kinase inhibitor, PF-3758309, in colon cancer models. Front Pharmacol. 4, 35 (2013).
  17. Song, E. K., et al. Potent antitumor activity of cabozantinib, a c-MET and VEGFR2 inhibitor, in a colorectal cancer patient-derived tumor explant model. Int J Cancer. 136, (8), 1967-1975 (2015).
  18. Tentler, J. J., et al. Identification of predictive markers of response to the MEK1/2 inhibitor selumetinib (AZD6244) in K-ras-mutated colorectal cancer. Mol Cancer Ther. 9, (12), 3351-3362 (2010).
  19. Bardelli, A., et al. Amplification of the MET receptor drives resistance to anti-EGFR therapies in colorectal cancer. Cancer Discov. 3, (6), 658-673 (2013).
  20. Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discov. 1, (6), 508-523 (2011).
  21. Davis, S. L., et al. Combined inhibition of MEK and Aurora A kinase in KRAS/PIK3CA double-mutant colorectal cancer models. Front Pharmacol. 6, 120 (2015).
  22. Morelli, M. P., et al. Preclinical activity of the rational combination of selumetinib (AZD6244) in combination with vorinostat in KRAS-mutant colorectal cancer models. Clin Cancer Res. 18, (4), 1051-1062 (2012).
  23. Pitts, T. M., et al. Dual pharmacological targeting of the MAP kinase and PI3K/mTOR pathway in preclinical models of colorectal cancer. PLoS One. 9, (11), e113037 (2014).
  24. Spreafico, A., et al. Rational combination of a MEK inhibitor, selumetinib, and the Wnt/calcium pathway modulator, cyclosporin A, in preclinical models of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19, (15), 4149-4162 (2013).
  25. Arcaroli, J. J., et al. ALDH+ tumor-initiating cells exhibiting gain in NOTCH1 gene copy number have enhanced regrowth sensitivity to a gamma-secretase inhibitor and irinotecan in colorectal cancer. Mol Oncol. 6, (3), 370-381 (2012).
  26. Hoey, T., et al. DLL4 blockade inhibits tumor growth and reduces tumor-initiating cell frequency. Cell Stem Cell. 5, (2), 168-177 (2009).
  27. Ikebuchi, F., et al. Dissociation of c-Met phosphotyrosine sites in human cells in response to mouse hepatocyte growth factor but not human hepatocyte growth factor: the possible roles of different amino acids in different species. Cell Biochem Funct. 31, (4), 298-304 (2013).
  28. Zhang, Y. W., et al. Enhanced growth of human met-expressing xenografts in a new strain of immunocompromised mice transgenic for human hepatocyte growth factor/scatter factor. Oncogene. 24, (1), 101-106 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats