Preparación de muestras para análisis de masas Citometría

Biology

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McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (122), e54394, doi:10.3791/54394 (2017).

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Abstract

Masa utiliza citometría de anticuerpos conjugados con etiquetas de metales pesados, un enfoque que ha aumentado considerablemente el número de parámetros y oportunidades para el análisis profundo mucho más allá de lo que es posible con el flujo basado en la fluorescencia convencional citometría. Como con cualquier nueva tecnología, hay pasos críticos que ayudan a asegurar la generación fiable de datos de alta calidad. Se presenta aquí un protocolo optimizado que incorpora múltiples técnicas para el procesamiento de muestras de células para análisis de masas citometría. Los métodos descritos aquí ayudarán al usuario a evitar los errores comunes y lograr resultados consistentes al minimizar la variabilidad, que puede conducir a datos inexactos. Para informar el diseño experimental, la razón de pasos opcionales o alternativos en el protocolo y su eficacia en el descubrimiento de nuevos hallazgos en la biología del sistema que está siendo investigado está cubierto. Por último, los datos representativos se presenta para ilustrar resultados esperados de la Presente técnicasd aquí.

Introduction

Citometría permite la medición simultánea de múltiples objetivos de anticuerpos en un único nivel celular a través de grandes poblaciones de células. En tradicional citometría de flujo basada en fluorescencia, el número de parámetros que pueden cuantificarse está limitada por la superposición espectral entre el espectro de emisión de múltiples fluoróforos, que requiere cálculos de compensación cada vez más complejos como el número de parámetros aumenta. Estas limitaciones se abordan en masa citometría, donde se detectan y cuantifican por tiempo de vuelo (TOF) espectrometría de masas para ampliar en gran medida el número de parámetros recogidos simultáneamente y producir un alto perfil de proteínas-abundancia dimensional para cada célula individual anticuerpos conjugados de metales pesados.

Un conocimiento básico del funcionamiento de los medios de citometría de instrumentos es beneficioso para el usuario y puede ser esencial para la resolución de problemas. Para una descripción más completa de ajuste y funcionamiento de una máquina de masa citometría,ver el manuscrito relacionado 1. Brevemente, una muestra celular se marca con un panel de anticuerpos conjugados de metal de orientación marcadores de superficie celular, proteínas citoplásmicas, proteínas nucleares, proteínas de la cromatina unida u otros epítopos de interés (Figura 1i). Las células marcadas se cargan en la máquina, ya sea de una en una por inyección manual o el uso de un muestreador automático que las muestras de una placa de 96 pocillos. Las células cargadas se inyectan a través de un nebulizador, que genera una pulverización de gotitas líquidas que encapsulan las células (Figura 1ii). Este spray se coloca de modo que las células son ionizados por un soplete de plasma de argón. Esta ionización genera una nube de partículas comprendido de todos los átomos constituyentes de cada célula (Figura 1III). Como esta nube de partículas viaja al detector, átomos de baja masa atómica se separan de los altos iones de masas por un filtro de masas de cuadrupolo. Los iones de masas de alta restantes siguen el detector, donde el abundance de cada isótopo se cuantifica (Figura 1iv). Los datos brutos recogidos por el detector, son analizados por el software del instrumento de citometría de masas para identificar eventos celulares. Para cada evento célula identificada, la señal detectada en cada canal se cuantifica y se guarda en el archivo una salida .fcs. Los canales de masa utilizados para la detección de los anticuerpos de metales pesados ​​conjugados exhiben solapamiento espectral mínimo, que oscila de 0-4% con la mayoría de las contribuciones por debajo de 1%. Debido a esta baja diafonía entre canales, generalmente es innecesario para transformar los datos con una matriz de compensación antes del análisis 2. Sin embargo, se debe tener cuidado durante el diseño del panel experimental de anticuerpos para garantizar que un anticuerpo con un epítopo de alta abundancia no se asigna a un canal de masa que contribuye señal a un canal asignado a un anticuerpo de baja abundancia, ya que puede crear una población artificialmente alta en el canal de recepción de la contribución de la señal.

3, 4. Realización de la tinción de anticuerpos de la superficie celular en células vivas puede ser necesario para algunos anticuerpos, pero esto excluye la opción de códigos de barras antes del marcaje de anticuerpos como la mayoría de los métodos de código de barras se realizan después de la fijación 5, aunque el código de barras basado en anticuerpos 6, 7 es una excepción.

Al determinar el número de células que se preparó para el análisis, es importante saber que será detectado sólo una fracción de las células cargadas en la máquina y producir datos. Esta pérdida se debe principalmente a las ineficiencias cuando el nebulizador pulveriza de la muestra a la antorcha. La pérdida exacta ciento depende de la masa de citometría de configuración de la máquina y el tipo celular, pero puede variar de 50-85% y debe estarcuenta en el diseño del experimento. Este protocolo se ha optimizado para 2x10 6 células por muestra, pero puede ser adaptado para el procesamiento de tamaños de muestra más pequeños o más grandes. Este protocolo se puede utilizar con modificaciones mínimas para tamaños de muestra de 1 x 10 6 4 x 10 6, sin embargo, es crítico que tamaño de la muestra se mantiene constante dentro de un experimento. Los cambios en el número de células pueden afectar a la intensidad de los códigos de barras y la tinción de anticuerpos y debe ser mantenido más o menos constante a través de muestras que deben compararse directamente.

Algunos procedimientos, como el etiquetado de células muertas y de marcaje de ADN, deberían llevarse a cabo en la gran mayoría, si no todos los diseños experimentales. El etiquetado de células muertas en los experimentos de análisis de marcadores de superficie sólo se puede lograr utilizando Rh103, pero Rh103 se debe evitar por experimentos en los que se requiere la permeabilización, que resultará en la pérdida de tinción. Para los experimentos que implican la permeabilización, es aconsejable utilizar cisplatino

Muestras de código de barras pueden reducir el consumo de anticuerpo, disminuir el tiempo de adquisición y eliminar de la muestra a muestra variabilidad 9. El proceso de código de barras consiste en aplicar un código de muestra específica única para todas las células, que se utiliza para asignar a cada célula a su muestra de origen. Después de códigos de barras las muestras podrán mezclarse antes de la tinción de anticuerpo, un proceso que asegura todas las muestras se tiñen por igual. Para reducir al mínimo el error experimental, es prudente código de barras y Piscina ninguna de las muestras que van a ser directamente comparados entre sí. Actualmente existen varios métodos para códigos de barras muestras para análisis de citometría de masa 5, 6, 7, dos de los cuales se presentan aquí (véase abajo).

Con reagen disponibles en la actualidadts es posible cuantificar la abundancia de 38 dianas de anticuerpos, identificar las células en la fase S 10, distinguir las células vivas y muertas 8 y medir los niveles celulares de la hipoxia 11 en un experimento de multiplexado de múltiples muestras. Esta capacidad de recoger datos de células individuales alta de parámetros para las poblaciones de células grandes permite mejorar de perfiles de poblaciones de células altamente heterogéneos y ya ha producido una serie de puntos de vista biológicos novedosos 12, 13, 14, 15, 16. Destilar los datos complejo resultante a la información interpretable ha requerido el uso de algoritmos computacionales incluyendo Spanning Tree progresión de la densidad de Eventos normalizada (SPADE) 17 y Visne 18.

En este artículo se presenta un formato accesiblevisión general de cómo diseñar y llevar a cabo una masa citometría de experimento e introduce el análisis básico de datos de citometría de masas.

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Protocol

1. La recolección celular

  1. Recolección de células de tejido primario
    NOTA: El proceso descrito para las células de recolección de tejido primario es específicamente aplicable a los tejidos de tumor de mama de ratón y puede no ser aplicable como es de tejidos primarios de otras fuentes.
    1. Preparar tampón de digestión por disolución de 5 mg de hialuronidasa y colagenasa 30 mg en 10 ml de medio DMEM / F12 por gramo de tejido a procesar. Filtrar esterilizar tampón de digestión.
    2. Aislar tumor de la glándula mamaria primaria de ratón y tumor ficha peso.
    3. Picar tejido con # 10 bisturí durante al menos 5 min.
    4. Añadir tejido picado a volumen apropiado de tampón de digestión (10 ml de tampón por gramo de tejido).
    5. Agitar tejido picado en tampón de digestión a 100 rpm durante 1-3 h a 37 ° C.
    6. Obtener suspensión de células individuales haciendo pasar las células a través de 0,4 micras filtro en un tubo de 50 ml.
    7. Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min a 4 °;DO. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
    8. Resuspender el sedimento en 4 ml de DMEM / F12 y la transferencia a 5 ml de tubos de fondo redondo.
  2. Recolección de células de cultivo de tejidos
    1. Lavar la placa o matraz de células adherentes con calcio y magnesio fosfato libre solución salina tamponada (PBS) a temperatura ambiente.
      NOTA: La técnica descrita para las células de recolección es específicamente aplicable a adherente células de cultivo de células madre embrionarias humanas (células madre). Sin embargo, el resto del protocolo descrito es ampliamente aplicable a otras líneas celulares cultivadas, líneas no adherentes y células primarias.
    2. Añadir tripsina calentado (37 ° C) u otro reactivo de digestión enzimática optimizada para lograr una única suspensión celular de las células adherentes. Siga el protocolo del fabricante.
      NOTA: La tripsina y otros reactivos de disociación enzimáticos tienen el potencial de afectar marcadores celulares.
    3. Incubar la placa a 37° C durante 2-5 min para separar las células. Para los cultivos de altos confluencia, golpear suavemente la placa para ayudar a separar las células.
    4. Transferencia de células completamente separados de la placa en un tubo de fondo redondo de 5 ml y suavemente pipeta usando una pipeta de 1 ml para disociar las células.
      NOTA: Para el procesamiento de grandes cantidades de muestras de todos los pasos, alternativamente, se puede realizar en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Para el procesamiento de muestras en un formato de 96 pocillos todos los lavados se pueden realizar en un volumen de 250! L. Los volúmenes descritos en otras etapas pueden ser ajustados de modo que el volumen total no exceda de 300! L.
    5. Se inactiva el reactivo de digestión enzimática con un tampón de lavado igual volumen (0,5% de BSA y azida sódica al 0,02% en PBS).
      NOTA: La azida sódica es una sustancia química peligrosa. las precauciones de seguridad deben tener en cuenta para su preparación y manipulación.
    6. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 37 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
    7. Resuspenderlas células en medio libre de 1 ml de suero.
    8. Recuento de células mediante la transferencia de 10? L de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Diluir alícuota a una relación conocida en azul de tripano y la transferencia a un hemocitómetro o sistema de conteo de células automatizado.
  3. Etiquetado de la población de la fase S
    NOTA: Si el etiquetado de la fase S no a realizar es proceder para contener 1,4.
    1. Preparar 1 ml de 10? M de 5-yodo-2'-desoxiuridina (IDU) en suero F12 DMEM libre u otros medios apropiados para que se analizaron cada 2 x 10 6 células.
    2. Añadir 500! L de 10? M UDI en medio libre de suero por cada 2 x 10 6 células.
      NOTA: Mientras etiquetado IdU se puede realizar en medios que contienen suero, proteína libre reaccionará con cisplatino, la prevención de etiquetado apropiado de células muertas. Si se usa un medio que contiene suero durante IdU etiquetado de una etapa de lavado adicional es medio libre de suero es necesario para eliminar las proteínas de suero antes de cisplatino en vivo sta / muertosnando.
    3. resuspender suavemente pellets con 1 ml pipeta.
    4. Incubar durante 10 min a 37 ° C con agitación suave.
  4. Etiquetado Live / Dead
    1. Para cada muestra de preparar 500 l de 50? M de cisplatino en suero libre de DMEM-F12 o tipo de célula medio de comunicación adecuado.
      NOTA: Si el etiquetado de la población de la fase S por IdU no se va a realizar, las muestras de volver a suspender a una concentración de 4 x 10 6 células / ml. Resuspensión de las células antes de añadir cisplatino permite mezclar más rápido de soluciones para el etiquetado uniforme en vivo / muerto.
    2. Añadir 500 l de 50? M cisplatino por 2 x 10 6 células a las muestras.
    3. Se incuba a temperatura ambiente (RT) durante 1 min en un agitador orbital con mezclado constante.
    4. Se detiene la cisplatino con un volumen igual de tampón de lavado.
    5. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a TA. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
    6. Lavar las muestras dos vecescon 500! l de tampón de lavado para eliminar el exceso cisplatino.
    7. muestras de lavado dos veces con 500 l de PBS para eliminar el exceso de proteínas.
  5. la fijación de la muestra
    1. muestra Resuspender en 500! l de PBS.
    2. Añadir un volumen igual de PFA al 4% en PBS para una concentración final de 2%; pipeta para mezclar.
      NOTA: Preparar 4% PFA fresco a partir de polvo, ajustar el pH a 6,9 y pasar a través de un filtro de 0,44! M. PFA al 4% en PBS se puede almacenar a 4 ° C durante hasta dos semanas. Evitar formalina premade suministrado en ampollas, a menos probado específicamente, ya que a menudo contiene contaminantes metálicos que pueden interferir con los canales de masa medida. menor concentración de PFA puede ser suficiente y ayudar a minimizar el efecto de fijación en la unión del anticuerpo, pero debe ser probado empíricamente.
    3. Incubar durante 15 min a TA en un agitador orbital con mezclado constante.
    4. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar con cuidado el sobrenadante wiThout perturbar el sedimento.
    5. muestras de lavado con PBS para eliminar la solución PFA.
      NOTA: En este paso muestras puede almacenarse brevemente a 4 ° C. el almacenamiento prolongado a 4 ° C puede dar lugar a la degradación de la muestra y la disminución de la tinción.

2. El código de barras

NOTA: Mientras metodología para la utilización de códigos de barras monoisotopic cisplatino y paladio códigos de barras se presenta de forma simultánea, ya sea se puede utilizar independientemente o evitarse por completo si no es requerido por el experimento.

  1. El código de barras monoisotopic cisplatino
    NOTA: Dado que los códigos de barras cisplatino y cisplatino tinción Live / Dead se basa en la superposición de canales de atención deben tomarse medidas para garantizar que los antecedentes cisplatino tinción Live / Dead en las células vivas se reduce al mínimo, ya que puede interferir con la precisión del código de barras cisplatino.
    1. Diluir 1 mM cisplatino monoisotopic soluciones de reserva hasta 200? M en PBS.
    2. DelanteroACH cisplatino único código de barras preparar un tubo de 1,5 ml con 500 l de PBS por cada 2 x 10 6 células que reciben que código de barras.
    3. Para preparar cada código de barras único añadir cada cisplatino monoisotopic aplicable a una concentración final de 200 nM.
    4. Resuspender las células en 500 l de PBS por 2 x 10 6 células.
    5. Añadir un volumen igual de la solución de código de barras correspondiente a cada muestra.
    6. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 min en un agitador orbital con mezclado constante.
    7. Se inactiva cisplatino con un volumen igual de tampón de lavado.
    8. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
    9. muestras de lavado dos veces con tampón de lavado 500 l para eliminar el exceso cisplatino.
  2. El código de barras paladio
    NOTA: reactivos de código de barras de paladio pueden ser preparados 5 o comprar comercialmente.
    1. transitoria parcialpermeabilización 19
      NOTA: los códigos de barras Palladium quelación requiere la permeabilización parcial para los reactivos pasen a través de la membrana celular y la etiqueta robustamente la célula.
      1. muestras de lavado con 500 l de PBS.
      2. muestras de lavado con 500! l de PBS más 0,02% de saponina.
      3. Resuspender el sedimento en el volumen residual.
    2. Aplicar el código de barras paladio.
      1. Diluir de stock 100x de reactivo de códigos de barras de paladio en 1 ml de PBS enfriado en hielo más 0,02% de saponina.
      2. Rápidamente añadir códigos de barras del reactivo diluido para la muestra se volvió a suspender.
      3. Incubar durante 15 min a TA en un agitador orbital a con mezclado constante.
      4. muestras de lavado dos veces con 500! l tampón de lavado.

3. celular tinción de la superficie

NOTA: tinción de la superficie celular se puede realizar en células vivas antes de la fijación. Esto puede ser necesario para los anticuerpos que pierden afinidad por their epítopo después de la fijación. Algunas muestras de células pueden beneficiarse de bloqueo adicional, tal como Fc de bloqueo para los leucocitos, antes del marcaje de anticuerpos para reducir el fondo. bloqueo óptima debe determinarse empíricamente para el tipo específico de la muestra.

  1. Preparar la superficie celular panel de tinción de anticuerpos.
    1. Combinar 0,5 ml, o determinada empíricamente la cantidad, de cada 0.5 mg / mL de anticuerpo de la superficie celular por muestra en un tubo de 1,5 ml. Añadir tampón de lavado si es necesario para llevar el volumen hasta 10 l por muestra. Mezclar con la pipeta.
      NOTA: Determinar dilución de trabajo para cada anticuerpo antes del experimento empíricamente por experimento de valoración.
    2. pool de anticuerpo de la superficie celular divide por igual en uno 1,5 tubo ml para cada muestra a ser manchado.
    3. Preparar 500 l de tampón de lavado en un tubo de 1,5 ml para cada muestra.
  2. Aplicar tinción de la superficie celular para muestras de volumen normalizado para todas las muestras.
    NOTA: Para ensure etiquetado anticuerpo consistente a través de múltiples muestras es vital para controlar cuidadosamente el volumen de muestra y la concentración de anticuerpo. Los pasos siguientes pretenden lograr esta consistencia, garantizando que los volúmenes finales de la muestra después de que el anticuerpo ha sido añadido son uniformes.
    1. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
    2. Con una pipeta conjunto 200! L de 50! L, eliminar la solución remanente de pellet de muestra y transferir a un tubo de la piscina alícuotas de anticuerpo de la superficie celular.
    3. Pipetear hasta que todo el líquido en el tubo alícuota sin aire en la punta de la pipeta.
    4. Mientras sostiene el émbolo de la pipeta para evitar aspirar aire mover la punta en un tubo preparado de 500! L de tampón de lavado y liberar el émbolo.
    5. Volver a agregar el contenido de la punta de la pipeta de la muestra y volver a suspender la muestra en el líquido con pipeteo suave.
    6. Incubar las muestras para 1h a TA en un agitador orbital con mezclado constante.
    7. muestras de lavado dos veces con tampón de lavado 500 l para asegurar que todo el anticuerpo libre se elimina por lavado.
    8. muestras de lavado con 500 l de PBS.
    9. Resuspender el sedimento celular en 500 l de PBS.
    10. Añadir un volumen igual de PFA al 4% en PBS; pipeta para mezclar.
    11. Incubar durante 10 min en un agitador orbital.

4. Cell permeabilización e intracelular tinción

  1. permeabilización celular
    1. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
    2. Resuspender las células en el volumen residual agitando con vórtex suavemente hasta que se disocia el sedimento.
      NOTA: Si no disociar células antes de la adición de MeOH dará lugar a células que se adhieren entre sí y producir una película delgada que se traducirá en la pérdida de muestra parcial.
    3. Inmediatamente añadir 1 ml de 100% de MeOH por 2 x 10 6 </ Sup> células y suavemente la pipeta para mezclar.
      NOTA: Otros métodos de permeabilización puede ser sustituido por MeOH y puede ser necesario para lograr la permeabilización óptima para algunos tipos de células. Para algunas fuentes de células de un 0,1% de Triton X-100, 0,2% de Tween-20 o 0,1% de saponina en solución de PBS para la permeabilización puede mantener la integridad celular mejor, mientras que todavía proporciona permeabilización consistente.
    4. Incubar las muestras durante al menos 1 h o hasta un máximo de 24 horas a 4 ° C para la permeabilización.
      NOTA: En este paso muestras en MeOH se pueden almacenar durante un máximo de 1 mes a -80 ° C.
    5. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
    6. Añadir 1 ml de tampón de lavado por cada ml de MeOH utiliza para permeabilizar la muestra. resuspender suavemente el sedimento celular.
    7. Lavar la muestra dos veces con 500! L tampón de lavado.
  2. Preparar panel de tinción de anticuerpos intracelular.
    1. Combinar 0,5 ml, o determinada empíricamente la cantidad, de cada 0.5 mg / mL de anticuerpo intracelular por muestra en un tubo de 1,5 ml. Añadir tampón de lavado si es necesario para llevar el volumen hasta 10 l por muestra. Mezclar con la pipeta.
    2. Dividir pool de anticuerpo intracelular igualmente en un tubo de 1,5 ml para cada muestra.
    3. Preparar 500 l de tampón de lavado en un tubo de 1,5 ml para cada muestra.
  3. Aplicar la tinción intracelular para muestras de volumen normalizado para todas las muestras.
    NOTA: Para garantizar el etiquetado de anticuerpos consistente a través de múltiples muestras es vital para controlar cuidadosamente el volumen de la muestra y la concentración de anticuerpos.
    1. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
    2. Con 200 pipeta l ajustado a 50 l eliminar la solución de sedimento de la muestra y la transferencia restante a un tubo de la piscina alícuotas de anticuerpo de la superficie celular.
    3. Pipetahasta que todo el líquido en el tubo alícuota sin aire en la punta de la pipeta.
    4. Mientras sostiene el émbolo de la pipeta para evitar aspirar aire mover la punta en un tubo preparado de 500! L de tampón de lavado y liberar el émbolo, la elaboración de tampón de lavado para un volumen total de muestra de 50 mL.
    5. Volver a agregar el contenido de la punta de la pipeta de la muestra y volver a suspender la muestra en el líquido con pipeteo suave.
    6. Se incuban las muestras durante 1 hora a RT en un agitador orbital con mezclado constante.
    7. muestras de lavado dos veces con 500! l tampón de lavado.
    8. muestras de lavado con 500 l de PBS.

5. Iridium etiquetado

  1. Fix muestras
    1. muestras Resuspender en 500 l de PBS.
    2. Añadir 500 l de PFA al 4% en PBS.
    3. Incubar durante un mínimo de 15 min a TA en un agitador orbital con mezclado constante.
  2. Aplicar etiquetado Iridium de DNA
    1. Añadir solución de PFA 500 l 62,5 nM iridio a las muestras.
      NOTA: Para los experimentos utilizando células permeabilizadas, se diluye la 500x Ir191 / 193 de stock para una dilución final de 1: 2000 para evitar la sobretinción.
    2. Incubar durante 15 min a TA en un agitador orbital con mezclado constante.
      NOTA: Si la realización de códigos de barras cisplatino monoisotopic No incubar las muestras con iridio durante más de 15 min desde fuertes señales Ir193 pueden contribuir a la canal de masa Pt194 y perjudicar la calidad del código de barras.
    3. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
    4. muestras de lavado dos veces con 500! l de 0,1% de BSA en agua desionizada filtrada.
      NOTA: Una vez preparadas las muestras se recomienda correr el plazo de 24 horas si es posible. Las muestras preparadas se pueden almacenar a corto plazo a 4 ° C,pero se debe tener cuidado para evitar la degradación. Si es posible los lavados finales deben realizarse en agua desionizada filtrada sin BSA como esto disminuirá la deposición en la cámara de pulverización y Sampler conos de la máquina que disminuirá la limpieza de instrumentos. Para hESCs es necesario para llevar a cabo estos lavados mientras incluyendo BSA para evitar la pérdida de muestra se pegue a la superficie del tubo.

6. Preparar muestras para Adquisición

  1. Recuento de células
    1. Resuspender las células en 500 l 0,1% de BSA en agua desionizada filtrada y el filtro en un tubo fresco a través de un tapón de filtro de 35 micras celular.
      NOTA: Reducir el nivel de BSA durante los lavados finales disminuye el residuo dejado en el nebulizador citometría de masas. Las células no adherentes se pueden lavar y se resuspendieron en agua desionizada filtrada.
    2. Recuento de células mediante la transferencia de 10? L de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga. Diluir alícuota a una relación conocida enazul de tripano (para ayudar con la visualización de células) y transferir a un hemocitómetro o sistema de conteo de células automatizado.
    3. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
  2. Preparar y muestras de carga
    1. Para preparar perlas de calibración retirar del refrigerador y agitar vigorosamente para resuspender.
    2. Si se ejecuta muestras usando una masa citometría de inyector automático, añadir 50 l de perlas de calibración a cada pocillo de placa de muestra a continuación, añadir el número deseado de células a analizar. Si las muestras que se ejecutan por inyección manual añaden 50! L de perlas de calibración a la muestra, diluir la muestra en agua desionizada filtrada, mezclar bien y muestra de carga en el puerto de inyección de muestras de citometría de masas. La dilución apropiada de la muestra puede variar dependiendo del tipo de célula que se está analizando, pero una dilución de 10 6 es generalmente apropiado 1.

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Representative Results

El protocolo que se presenta aquí se puede aplicar en general a una amplia variedad de muestras de células cultivadas y primario con sólo modificaciones menores. Dependiendo de los requisitos del experimento, se puede realizar de una manera modular cuando ciertos elementos, tales como códigos de barras o de la superficie celular de la tinción, no son necesarios. Utilizado en su totalidad este protocolo permite la preparación de la masa multiplexada citometría de muestras marcadas para la identificación población exclusión de células muertas, la fase S y se tiñeron para la cuantificación de hasta 38 objetivos de anticuerpos.

Resultados esperados producidos por los métodos descritos en este protocolo (Figura 2) se representan en la Figura 3. Tras la recogida de datos, la normalización de la intensidad de señal en base a la intensidad de perlas de calibración se puede realizar en el software de masa citometría. Tras la normalización, proce datos inicialesssing para eliminar perlas de calibración, puerta en las células individuales y eliminar las células muertas se puede realizar manualmente usando cualquier software capaz de analizar citometría de flujo de datos. La eliminación de los granos de calibración se puede realizar manualmente por gating en la población Ir191 + Ce140- (Figura 3A) o con un algoritmo basado en MATLAB 20. Eventos de una sola célula (contorno negro, Figura 3B) se pueden gated mientras que la eliminación de desechos y de células multipletes, por gating en la parcela biaxial de Ir193 y Longitud de eventos (Figura 3B). etiquetado cisplatino de las células muertas se puede utilizar para cuantificar la cantidad de muerte celular; muestran son ejemplos de muestras con baja (Figura 3D) y (Figura 3E) las cantidades de células muertas más altas. Las células muertas se pueden eliminar de los datos por gating de la población Pt198 + (Figura 3E). Código de barras de las muestras, ya sea con cisplatino o paladio reactivos monoisotopic, resultados en distinta separación de samples dentro de los parámetros de código de barras (Figura 3C), que permite a las células que se asignará a su identidad original de la muestra. Métodos opcionales adicionales, tales como el etiquetado IdU, permiten la detección de las poblaciones específicas, por ejemplo, células en fase S (Figura 3F). Tras la normalización inicial, debarcoding y gating, los datos dimensionales altos se pueden analizar utilizando una variedad de algoritmos, incluyendo SPADE 17 y varios otros diseñados para la masa citometría de análisis de datos y la visualización 18. Algoritmos tales como SPADE toman los datos de alta dimensión, que pueden ser difíciles de interpretar ya que no puede ser visualizada directamente en su estado dimensional alta, y generan una representación dimensional inferior de los datos, que es más susceptible a la interpretación visual (Figura 3G).

Figura 1 Figura 1: Principios básicos de la masa citometría de medición. Preparación de muestras de células para análisis de citometría de masa implica tinción de las células con anticuerpos marcados con isótopos de metal en su mayoría de la serie de los lantánidos de elementos. En este esquema cada anticuerpo generado contra un epítopo específico está marcado con un isótopo que posee una masa atómica único, tales como samario 154. Los anticuerpos contra epítopos que son de superficie, citoplasmática, la cromatina nuclear o localizada puede potencialmente ser utilizado. Las células marcadas se inyectan y se pulverizaron a través de la masa de citometría de nebulizador en forma de gotitas de células individuales donde son ionizados por un soplete de plasma de argón. La nube de partículas resultante es despojado de átomos de baja masa por un filtro de masas de cuadrupolo mientras que la abundancia de los iones de masa atómica más grandes se mide por el detector. La cantidad medida de cada ion de masa único corresponde a la abundancia celular de epítopo diana de su anticuerpo asociado. Mientras que un l teóricoIMIT de más de 100 parámetros se pudo cuantificar la utilización de esta metodología, los actuales reactivos disponibles comercialmente permiten la detección de más de 40 parámetros por célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Diagrama de flujo de trabajo de procedimiento experimental y pasos opcionales. Representación de las principales etapas implicadas en el protocolo de preparación de células para citometría de masas. Los pasos opcionales se indican con cajas de naranja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
figura 3: Ejemplo de datos generados a partir de m culo análisis de citometría. (A) parcela biaxial que muestra la separación de las células (alta Ir191, bajo CE140), perlas (bajo Ir191, alta CE140) y dobletes de células talón (alta Ir191, alta CE140). (B) parcela biaxial que muestra aparición esperada de Ir193 vs longitud Evento. se muestra Gating de las células individuales, que elimina los desechos celulares y de células multipletes. (C) parcela biaxial que muestra ejemplo vista de dos canales de masa a partir de los códigos de barras cisplatino. (D - E) Datos de ejemplo de cisplatino tinción Live / Dead para muestras con un bajo porcentaje (D) y un alto porcentaje (E) de las células muertas. (F) parcela biaxial de células H9 de células madre marcadas con IdU para distinguir las células en fase S y un anticuerpo contra la ciclina B1 de distinguir más del ciclo celular. (G Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo aquí presentado se ha empleado con éxito para el tratamiento de varias líneas cultivadas de células (H1 y H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) y muestras de tejidos primarios (médula ósea de ratón, el hígado embrionario de ratón, ratón adulto hígado, tumor de ratón). Independientemente de la fuente, cualquier tejido que puede ser disociado en las células individuales, preservando el estado celular debe ser susceptibles de análisis por citometría de masa, pero puede requerir alguna optimización de protocolo. Es importante señalar que algunos epítopos pueden verse afectados por los tratamientos específicos de disociación, fijación y permeabilización utilizados y estos métodos pueden tener que someterse a la optimización de la muestra específica. Si se observa una señal baja para un anticuerpo, puede ser posible mejorar mediante la realización de marcaje de la superficie celular en células vivas, el cambio de métodos de permeabilización, o disminuyendo el tiempo de fijación.

Cuando sea posible dentro del diseño experimental, incluyendo el código de barras en la XXe flujo de trabajo de procesamiento de la muestra garantiza la coherencia entre las muestras a nivel de la concentración de células y el anticuerpo. Sin códigos de barras, incluso cuando se toma gran cuidado para controlar el procesamiento de la muestra, es probable que se introducirán ligeras variaciones en la concentración de anticuerpo y la concentración celular entre muestras. Además, como los porcentajes de células positivas para epítopos específicos probablemente variar entre muestras, la efectiva relación de anticuerpo a epítopo puede diferir necesariamente entre las muestras, incluso si la concentración total de anticuerpo se mantiene constante, que puede conducir a inconsistencias en la tinción de anticuerpos. Estas variaciones, mientras que generalmente menor cuando la observación de un solo canal, puede convertirse agravado en gran medida cuando se realiza un experimento de alta parámetro y puede ser mal interpretado como biológicamente significativo si no se tiene cuidado durante el análisis de datos.

El análisis de los datos resultantes de una masa citometría de experimento puede tomar muchas formas, y un número de computacionales enfoques han sido adaptados específicamente para esta aplicación. Mientras que proporciona un estudio exhaustivo de los algoritmos útiles para el análisis de citometría de masas de datos está más allá del alcance de este manuscrito, los enfoques que se han utilizado con éxito están resaltados y lectores interesados se dirigen a múltiples recursos que cubren este tema 21, 22, 23. Dos de los métodos más ampliamente utilizados, actualmente disponibles para el análisis de citometría de masas de datos están Spanning Tree La progresión de la densidad normalizar Eventos (ESPADA) y Visne. SPADE forma racimos de grupos de células con expresión del marcador similar y representa cada clúster como un nodo. Estos nodos están dispuestos en un árbol SPADE donde los nodos similares están conectados por una línea (Figura 3G). Visne utiliza el Vecino estocástico t-Distributed Incrustación algoritmo 24 para generar una representación bidimensional delos datos de alta dimensión preservando al mismo tiempo la estructura general de datos. Tanto pala y Visne están escritos en MATLAB, el código fuente está disponible libremente y se puede ejecutar por los usuarios con MATLAB. Además, una versión independiente de la ESPADA está disponible.

Mientras que la citometría de masas actualmente permite la recogida del mayor número de parámetros, citometría basada etiqueta fluorescente puede ser un mejor enfoque para algunas aplicaciones. Fluorescencia citometría de flujo puede analizar más células por segundo, hasta 5 x 10 4 en comparación con 500-1.000 para la masa de citometría, y tiene más disponibles anticuerpos 25 validado. Avances adicionales en el flujo de citometría de fluorescencia, tales como hiperespectral citometría 26 y los nuevos fluoróforos 27 hacer que el flujo de citometría de fluorescencia en una alternativa viable para todos, pero experimentos muy altos parámetros. Técnicas adicionales tales como la medición de ARN 28 anteriormente sólo es posiblepor flujo basado en citometría de fluorescencia han sido recientemente adaptado a masa citometría permitiendo la detección simultánea de la proteína y el ARN 29. La expansión futura de isótopos y reactivos disponibles para utilizar más completamente la ventana de masa de isótopos medibles y ampliar el repertorio de características celulares medibles se expandirá la profundidad de perfilado posible en masa citometría.

El gran número de parámetros que pueden ser analizadas simultáneamente por citometría de masa amplía enormemente las preguntas experimentales que pueden ser investigados. Esperamos que este artículo y acompañando protocolo de vídeo permitirán a los investigadores interesados ​​a utilizar más eficazmente la masa citometría de avanzar en su investigación.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 medium kit Stem Cell technologies 05850 Warm at room temperature before use
DMEM F-12 ThermoFisher 11330-032 Warm at 37 °C before use
Accutase Stem Cell technologies 07920 Warm at 37 °C before use
Bovine serum albumin Equitech BAH62
phosphate buffered saline Hyclone SH30256.01
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Cell ID Pt194 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt195 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt196 Fluidigm Provided at 1 mM
Cisplatin Enzo Life Sciences ALX-400-040-M250 Soluble to 25 mg/mL in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit Fluidigm 201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich I7125 Soluble to 74 mg/mL in 0.2 N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent Fluidigm 201103A
Methanol Fisher BP1105-4 Chill at -20 °C before use
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
5 mL round bottom tubes Falcon 352058
5 mL 35 μm filter cap tubes Falcon 352235
EQ four element calibration beads Fluidigm 201078
Hyaluronidase Type I-S Sigma-Aldrich H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C9891
Disposable Scalpel #10 Sigma-Aldrich Z69239

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References

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