Preparação de Amostras para Análise Mass Citometria

Biology

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McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (122), e54394, doi:10.3791/54394 (2017).

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Abstract

Mass citometria utiliza anticorpos conjugados com etiquetas de metal pesado, uma abordagem que aumentou muito o número de parâmetros e oportunidades para a análise profunda bem além do que é possível com fluxo baseado em fluorescência convencional citometria. Tal como acontece com qualquer nova tecnologia, há passos críticos que ajudam a garantir a geração confiável de dados de alta qualidade. Apresentada aqui é um protocolo optimizado que incorpora várias técnicas para o processamento de amostras de células para análise de citometria de massa. Os métodos descritos aqui vai ajudar o utilizador a evitar erros comuns e alcançar resultados consistentes, minimizando variabilidade, que pode levar a dados incorrectos. Para informar desenho experimental, a lógica subjacente a passos opcionais ou alternativos no protocolo e a sua eficácia na descoberta de novas descobertas na biologia do sistema a ser investigada é coberto. Finalmente, os dados representativo é apresentado para ilustrar os resultados esperados a partir da Presente técnicasd aqui.

Introduction

Citometria permite a medição simultânea de múltiplos alvos de anticorpos a um nel de cula ica em grandes populações de células. Em citometria de fluxo baseado em fluorescência tradicional, o número de parâmetros que podem ser quantificados é limitada pela sobreposição espectral entre o espectro de emissão de vários fluoróforos, que requer cálculos de compensação cada vez mais complexos, como o número de parâmetros aumenta. Estas limitações são abordados por massa citometria, onde anticorpos de metal-conjugado pesados ​​são detectadas e quantificadas por tempo de voo (TOF) espectrometria de massa para expandir o número de parâmetros recolhidos ao mesmo tempo e produzir um perfil de proteína de abundância alta dimensional para cada célula individual.

Uma compreensão básica do funcionamento da massa citometria instrumento é benéfico para o usuário e pode ser essencial para solução de problemas. Para uma descrição mais completa do ajuste e executando uma máquina de citometria de massa,ver o manuscrito relacionados 1. Resumidamente, uma amostra celular é marcada com um painel de anticorpos conjugados de metal de segmentação marcadores da superfície celular, proteínas citoplasmáticas, proteínas nucleares, proteínas ligadas a cromatina ou outros epitopos de interesse (Figura 1-I). As células marcadas são carregados na máquina, quer uma de cada vez através de injecção manual ou usando um amostrador automático que amostras a partir de uma placa de 96 poços. As células carregadas foram injectados através de um nebulizador, a qual gera uma pulverização de gotículas de líquido que encapsulam as células (Figura 1ii). Esta pulverização é posicionado de modo que as células são ionizados por uma tocha de plasma de árgon. Este ionização gera uma nuvem de partículas formada por todos os átomos constituintes de cada uma das células (Figura 1iii). Como esta nuvem de partículas viaja para o detector, átomos de baixa massa atómica são separados dos iões de massa elevadas por um filtro de massa de quadrupolo. Os restantes iões de massa de alta continuar para o detector, onde o abunddade de cada isótopo é quantificado (Figura 1iv). Os dados brutos recolhidos pelo detector, são analisados ​​pelo software do instrumento de citometria de massa para identificar eventos celulares. Para cada evento celular identificado, o sinal detectado em cada canal é quantificado e guardada num ficheiro de saída um .fcs. Os canais de massa utilizados para detectar os anticorpos de metal pesado conjugados apresentam um mínimo de sobreposição espectral, que varia de 0-4%, com a maioria das contribuições abaixo de 1%. Devido a essa baixa diafonia entre canais, geralmente não é necessário para transformar os dados com uma matriz de compensação antes da análise 2. No entanto, deve ser tomado cuidado durante a concepção do painel experimental de anticorpos para assegurar que um anticorpo com um epitopo de alta abundância não é atribuído a um canal de massa que contribui sinal a um canal atribuído a um anticorpo de baixa abundância, pois isso pode criar uma população artificialmente elevados no canal de receber a contribuição de sinal.

3, 4. Realizando a coloração de anticorpos de superfície celular em células vivas pode ser necessária para alguns anticorpos, mas este opõe-se a opção de código de barras de antes da marcação do anticorpo como a maioria dos métodos de códigos de barras são realizadas após a fixação 5, embora o código de barras à base de anticorpo 6, 7 é uma excepção.

Ao determinar o número de células a ser preparados para análise, é importante saber que apenas uma fracção das células carregadas dentro da máquina será detectado e produzir dados. Esta perda é principalmente devido a ineficiências quando o nebulizador pulveriza a amostra a tocha. A perda exata cento depende da massa citometria de configuração da máquina e tipo de célula, mas pode variar de 50-85% e deve serconsiderado na concepção do experimento. Este protocolo foi optimizado para 2x10 6 culas por amostra mas pode ser adaptado para o processamento de tamanhos de amostras menores ou maiores. Este protocolo pode ser utilizado com modificações mínimas para tamanhos de amostra a partir de 1 x 10 6 4 x 10 6, no entanto, é crítico que o tamanho da amostra ser mantidos consistentes dentro de uma experiência. As alterações no número de células pode afectar a intensidade de código de barras e anticorpo coloração e deve ser mantido aproximadamente constante entre as amostras a serem comparadas directamente.

Alguns procedimentos, tais como a rotulagem de células mortas e de marcao de ADN, deve ser levada a cabo na grande maioria, se não todos os modelos experimentais. A marcação das células mortas em experiências de análise de marcadores de superfície apenas pode ser conseguida utilizando Rh103, mas Rh103 deve ser evitado para experiências onde permeabilização é necessária, uma vez que resulta em perda de coloração. Para experiências envolvendo permeabilização, é aconselhável utilizar a cisplatina

Amostras de código de barras pode reduzir o consumo de anticorpo, diminuir o tempo de aquisição e eliminar amostra-a-amostra variabilidade 9. O processo de barcoding envolve a aplicação de um código específico de amostra única para todas as células, que é usado para atribuir cada célula para sua amostra de origem. Depois de código de barras das amostras podem ser reunidas antes da coloração do anticorpo, um processo que assegura que todas as amostras são igualmente coradas. Para minimizar o erro experimental, é prudente de código de barras e reunir as amostras que estão a ser comparados directamente uns com os outros. Actualmente existem vários métodos para o código de barras de amostras para análise de citometria de massa 5, 6, 7, dois dos quais são aqui apresentados (ver abaixo).

Com Reagen atualmente disponívelts é possível quantificar a abundância de 38 alvos de anticorpos, identificar as células na fase S 10, distinguir as células vivas e mortas 8 e medir os níveis celulares de hipoxia 11 numa experiência multiplexado de múltiplas amostras. Esta capacidade de recolher os dados de uma única célula elevado de parâmetros para as populações de células grandes permite uma melhor perfis de populações de células altamente heterogéneos e já produziu um número de novos conhecimentos biológicos 12, 13, 14, 15, 16. Destilando os dados complexo resultante à informação interpretável tem exigido o uso de algoritmos computacionais incluindo Spanning Tree Progressão da densidade normalizados Eventos (PÁ) 17 e vişne 18.

Este artigo apresenta uma acessíveisvisão geral de como projetar e realizar uma massa citometria de experiência e introduz análise básica de massa citometria de dados.

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Protocol

Colheita 1. celular

  1. Colheita de células a partir de tecido primário
    NOTA: O processo descrito para a colheita de células a partir de tecido primário é especificamente aplicável ao tecido do tumor da mama do rato e podem não ser aplicáveis ​​como é para os tecidos primários a partir de outras fontes.
    1. Preparar tampão de digestão por dissolução de 5 mg de hialuronidase e colagenase de 30 mg em 10 mL de meio DMEM / F12 por grama de tecido a ser processado. Filtro de esterilizar tampão de digestão.
    2. Isolar tumor da glândula mamaria primária de rato e de tumor ficha peso.
    3. Picar o tecido com 10 # bisturi durante pelo menos 5 min.
    4. Adicionar tecido moído até ao volume apropriado de tampão de digestão (10 mL de tampão por grama de tecido).
    5. Agitar tecido moído em tampão de digestão a 100 rpm durante 1-3 horas a 37 ° C.
    6. Obter a suspensão de células individuais, passando células através de filtro de 0,4 um para um tubo de 50 ml.
    7. células de centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 °; C. Decantar ou aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
    8. Ressuspender o sedimento em 4 ml de DMEM / F12 e transferência para 5 mL de tubo de fundo redondo.
  2. Colheita de células de cultura de tecidos
    1. Lavar a placa ou frasco de células aderentes com fosfato de cálcio e magnésio livre salina tamponada (PBS) à temperatura ambiente.
      NOTA: A técnica descrita para a colheita de células é especificamente aplicável ao aderente de cultura de células humanas em células estaminais embrionárias (células estaminais embrionárias humanas). No entanto, o restante do protocolo descrito é largamente aplicável a outras linhas celulares cultivadas, de linhas não-aderentes e as células primárias.
    2. Adicionar tripsina aquecido (37 ° C) ou outro reagente de digestão enzimática optimizada para alcançar uma suspensão de células isoladas a partir das células aderentes. Siga o protocolo do fabricante.
      NOTA: tripsina e outros reagentes dissociação enzimática tem o potencial de afetar marcadores celulares.
    3. Incubar a placa a 37° C durante 2-5 minutos para separar as células. Para as culturas de alto confluência, bata suavemente a placa para ajudar a separar as células.
    4. Transferir células totalmente isoladas a partir da placa para um tubo de fundo redondo de 5 ml e suavemente pipeta usando uma pipeta de 1 ml para dissociar as células.
      NOTA: Para o processamento de grandes números de amostras de todas as etapas pode ser, alternativamente, realizada numa placa de 96 poços de fundo redondo. Para o processamento de amostras num formato de 96 poços todas as lavagens podem ser realizadas num volume de 250 uL. Os volumes descritos noutros passos pode ser ajustado de modo que o volume total não seja superior a 300 uL.
    5. Extingue-se a reagente de digestão enzimática com um tampão de igual volume de lavagem (0,5% de BSA e 0,02% de azida de sódio em PBS).
      NOTA: A azida de sódio é um produto químico perigoso. devidas precauções de segurança devem ser observados para a sua preparação e manuseio.
    6. células centrifugar a 300 xg durante 5 min a 37 ° C. Decantar ou aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
    7. Ressuspendercélulas em meio isento de 1 ml de soro.
    8. Contagem de células por transferência de 10 mL da suspensão de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Diluir alíquota para uma relação conhecida em azul de tripano e transferência para um hemocitómetro ou sistema de contagem de células automatizado.
  3. Rotulagem de população na fase S
    NOTA: Se rotulagem da fase S não é para ser realizada proceder para conter 1,4.
    1. Prepare 1 mL de 10? M de 5-iodo-2'-desoxiuridina (IdU) em meio F12 de DMEM isento de soro ou de outros meios apropriados para cada 2 x 10 6 culas a ser analisadas.
    2. Adicionar 500 uL de 10 uM IdU em meios isentos de soro para cada 2 x 10 6 culas.
      Nota: Embora a rotulagem IdU pode ser realizada em meios contendo soro, a proteína livre irá reagir com cisplatina, impedindo rotulagem apropriada de células mortas. Se meio contendo soro é utilizado durante IdU rotular um passo de lavagem adicional é meios livres de soro é necessário para remover proteínas do soro antes da cisplatina vivo sta / mortoining.
    3. Suavemente ressuspender peletes com 1 mL de uma pipeta.
    4. Incubar durante 10 min a 37 ° C com agitação suave.
  4. Rotulagem Live / Morto
    1. Para cada amostra, preparar 500 mL de 50 pM de cisplatina em DMEM-F12 isento de soro ou tipo de célula de suporte adequado.
      NOTA: Se rotulagem da população em fase S por IdU não é para ser executada, Suspenda as amostras, a uma concentração de 4 x 10 6 culas / mL. Ressuspensão das células antes da adição de cisplatina permite mais rápido de mistura de soluções para rotulagem uniforme ao vivo / morto.
    2. Adicionar 500 uL de 50 pM de cisplatina por 2 x 10 6 culas de amostras.
    3. Incubar à temperatura ambiente (TA) durante 1 min num agitador orbital, com agitação constante.
    4. Extingue-se a cisplatina com um volume igual de tampão de lavagem.
    5. células centrifugar a 300 xg durante 5 min à TA. Decantar ou aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
    6. Lavar duas vezes amostrascom 500 ul de tampão de lavagem para remover o excesso de cisplatina.
    7. Lavar as amostras duas vezes com 500 de PBS para remover o excesso de proteínas.
  5. fixação amostra
    1. amostra ressuspender em 500 de PBS.
    2. Adicionar igual volume de 4% de PFA em PBS para uma concentração final de 2%; pipeta para misturar.
      NOTA: Preparar PFA a 4% fresco a partir de pó, ajuste do pH a 6,9 e passar através de um filtro de 0,44? M. 4% de PFA em PBS pode ser armazenado a 4 ° C durante até duas semanas. Evitar formalina premade fornecido em ampolas, a menos que especificamente testado, uma vez que muitas vezes contém contaminantes metálicos que podem interferir com os canais de massa medidos. Uma concentração mais baixa de PFA podem ser suficiente e para ajudar a minimizar o efeito de fixação na ligação do anticorpo, mas deve ser testada empiricamente.
    3. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente num agitador orbital, com agitação constante.
    4. células centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar ou aspirar cuidadosamente o sobrenadante wiThout perturbar o sedimento.
    5. Lavar as amostras com PBS para remover a solução de PFA.
      NOTA: Neste passo as amostras podem ser armazenadas brevemente a 4 ° C. O armazenamento prolongado a 4 ° C pode resultar na degradação da amostra e diminuição da coloração.

2. Código de Barras

NOTA: Enquanto metodologia para a utilização de códigos de barras monoisotópico cisplatina e paládio código de barras é apresentada simultaneamente, qualquer um deles pode ser utilizado independentemente ou totalmente evitada se não for exigido pela experiência.

  1. Monoisotopica Cisplatina Barcoding
    NOTA: Uma vez que barcoding cisplatina e cisplatina coloração Live / Morto contar com sobreposição de canais deve ser tomado cuidado para assegurar que fundo cisplatina coloração Live / Dead in as células vivas é minimizado, pois isso pode interferir com a precisão do código de barras cisplatina.
    1. Dilui-se 1 mM de soluções de estoque de cisplatina monoisotópico a 200? M em PBS.
    2. para each cisplatina único código de barras preparar um tubo de 1,5 mL com 500 de PBS para cada 2 X 10 6 células receptoras que código de barras.
    3. Para preparar cada código de barras único adicionar cada cisplatina monoisotópico aplicável a uma concentração final de 200 nM.
    4. Ressuspender as células em 500 ul de PBS por 2 x 10 6 culas.
    5. Adicionar um volume igual da solução de código de barras correspondentes a cada amostra.
    6. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 5 min num agitador orbital, com agitação constante.
    7. Extingue-se a cisplatina com um volume igual de tampão de lavagem.
    8. células centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar ou aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
    9. Lavar as amostras duas vezes com tampão de lavagem de 500 mL para remover o excesso de cisplatina.
  2. Barcoding Palladium
    NOTA: reagentes de códigos de barras de paládio pode ser preparado 5 ou adquiridos comercialmente.
    1. transitória parcialpermeabilização 19
      NOTA: Palladium quelação código de barras exige a permeabilização parcial para os reagentes para passar através da membrana celular e robustamente rotular a célula.
      1. Lavar as amostras com 500 uL de PBS.
      2. Lavar as amostras com 500 uL de PBS mais 0,02% de saponina.
      3. Ressuspender o sedimento em volume residual.
    2. Aplicar paládio barcoding.
      1. Diluir 100 vezes de reagente de código de barras de paládio em 1 ml de PBS gelado mais 0,02% de saponina.
      2. Rapidamente adicionar reagente de código de barras diluído a amostra ressuspensa.
      3. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente num agitador orbital a com mistura constante.
      4. Lavar as amostras duas vezes com 500 uL de tampão de lavagem.

A coloração da superfície celular 3.

NOTA: a coloração da superfície celular pode ser realizada em células vivas antes da fixação. Isso pode ser necessário para anticorpos que perdem afinidade para their epítopo após a fixação. Algumas amostras de células podem beneficiar de bloqueio adicional, tal como Fc de bloqueio para os leucócitos, antes da marcação do anticorpo para reduzir o fundo. bloqueio óptimo deve ser determinado empiricamente para o tipo de amostra específica.

  1. Prepare painel coloração de anticorpos da superfície celular.
    1. Combine 0,5? L, ou empiricamente determinada quantidade, de cada um dos anticorpos da superfície celular de 0,5 mg / ml por amostra para um tubo de 1,5 mL. Adicionar tampão de lavagem, se necessário, para levar o volume até 10 l por amostra. Misturar por pipetagem.
      NOTA: Determinar a diluição de trabalho de cada anticorpo antes da experiência empiricamente por experiência de titulação.
    2. piscina anticorpo superfície celular dividida igualmente em um tubo de 1,5 mL para cada amostra a ser corado.
    3. Preparar 500 ul de tampão de lavagem em um tubo de 1,5 mL para cada amostra.
  2. Aplicar a coloração da superfície celular para amostras de volume normalizado para todas as amostras.
    NOTA: Para ensure marcação com anticorpos consistente em amostras múltiplas é vital para controlar cuidadosamente o volume da amostra e a concentração de anticorpo. Os passos que se seguem destinam-se a alcançar esta consistência, assegurando que os volumes de amostra final depois de ter sido adicionado o anticorpo são uniformes.
    1. células centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar ou aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
    2. Com uma pipeta de 200 uL a 50 uL conjunto, remover a solução restante a partir de sedimento de amostra e transferência para um tubo do conjunto de anticorpo superfície celular alíquota.
    3. Pipeta-se todo o líquido no tubo de tiragem sem alíquota de ar dentro da ponta de pipeta.
    4. Enquanto mantém o êmbolo da pipeta para evitar aspirar o ar move a ponta dentro de um tubo preparado de 500 uL tampão de lavagem e libertar o êmbolo.
    5. Adicionar volta do conteúdo da ponta da pipeta com a amostra e ressuspender a amostra no líquido com pipetagem suave.
    6. Incubar as amostras durante 1h à temperatura ambiente num agitador orbital, com agitação constante.
    7. Lavar as amostras duas vezes com tampão de lavagem de 500 mL para assegurar que todos anticorpo livre é removido por lavagem.
    8. Lavar as amostras com 500 uL de PBS.
    9. Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de PBS.
    10. Adicionar igual volume de 4% de PFA em PBS; pipeta para misturar.
    11. Incubar durante 10 min num agitador orbital.

4. celular permeabilização e intracelular Coloração

  1. permeabilização celular
    1. células centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar ou aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
    2. Ressuspender as células em volume residual por vortex suavemente até que o sedimento é dissociado.
      Observação: A falha para dissociar as células antes de se adicionar MeOH irá resultar em células que aderem em conjunto e a produção de um filme fino que irá resultar na perda parcial da amostra.
    3. Imediatamente adicionar 1 mL de MeOH a 100% por 2 x 10 6 </ Sup> células e gentilmente pipeta para misturar.
      NOTA: Outros métodos de permeabilização pode ser substituído por MeOH e pode ser necessário para atingir a permeabilização óptima para alguns tipos de células. Para algumas fontes de células de 0,1% de Triton X-100, 0,2% de Tween-20 ou 0,1% de saponina em solução de PBS para permeabilização pode manter a integridade celular melhor, enquanto ainda fornecendo permeabilização consistente.
    4. Incubar as amostras durante pelo menos 1 hora ou até a um máximo de 24 h a 4 ° C durante a permeabilização.
      NOTA: Nesta etapa amostras em MeOH pode ser armazenado durante até um mês à temperatura de -80 ° C.
    5. células centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar ou aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
    6. Adicionar 1 mL de tampão de lavagem por cada mL de MeOH usado para permeabilizar a amostra. Suavemente ressuspender sedimento celular.
    7. Lavar amostra duas vezes com 500 uL de tampão de lavagem.
  2. Prepare painel coloração do anticorpo intracelular.
    1. Combine 0,5? L, ou empiricamente determinada quantidade, de cada um 0,5 mg de anticorpo intracelular / ml por amostra para um tubo de 1,5 mL. Adicionar tampão de lavagem, se necessário, para levar o volume até 10 l por amostra. Misturar por pipetagem.
    2. Dividir piscina anticorpo intracelular igualmente em um tubo de 1,5 mL para cada amostra.
    3. Preparar 500 uL de tampão de lavagem em um tubo de 1,5 mL para cada amostra.
  3. Aplicar a coloração intracelular para amostras de volume normalizado para todas as amostras.
    NOTA: Para assegurar a rotulagem de anticorpos consistente em amostras múltiplas é vital para controlar cuidadosamente o volume da amostra e a concentração de anticorpo.
    1. células centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar ou aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
    2. Com 200 ul pipeta ajustado para 50 mL remover restante solução de sedimento da amostra e transferência para um tubo do conjunto de anticorpo superfície celular alíquota.
    3. Pipeta-se todo o líquido no tubo de tiragem sem alíquota de ar dentro da ponta de pipeta.
    4. Enquanto mantém o êmbolo da pipeta para evitar aspirar o ar move a ponta dentro de um tubo preparado de 500 uL tampão de lavagem e liberte o êmbolo, puxando-se tampão de lavagem para um volume total de amostra de 50 ul.
    5. Adicionar volta do conteúdo da ponta da pipeta com a amostra e ressuspender a amostra no líquido com pipetagem suave.
    6. Incubar as amostras durante 1 h à temperatura ambiente num agitador orbital, com agitação constante.
    7. Lavar as amostras duas vezes com 500 uL de tampão de lavagem.
    8. Lavar as amostras com 500 uL de PBS.

5. Iridium Rotulagem

  1. amostras fix
    1. Suspenda as amostras em 500 de PBS.
    2. Adicionar 500 mL de 4% de PFA em PBS.
    3. Incuba-se durante um mínimo de 15 minutos à temperatura ambiente num agitador orbital, com agitação constante.
  2. Aplicar rotulagem Iridium de DNA
    1. Adicionar 500? L 62,5 nM irídio solução PFA para amostras.
      NOTA: Para as experiências utilizando células permeabilizadas, diluir a Ir191 / 193 estoque 500x para uma diluição final de 1: 2000 para evitar overstaining.
    2. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente num agitador orbital, com agitação constante.
      NOTA: Se se realizarem código de barras cisplatina monoisotópico não incubar com amostras de irídio por mais de 15 min uma vez que os sinais de Ir193 fortes podem contribuir para o canal de massa Pt194 e impactar negativamente a qualidade do código de barras.
    3. células centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar ou aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
    4. Lavar as amostras duas vezes com 500 uL de 0,1% de BSA em água desionizada filtrada.
      NOTA: Depois de preparado recomendamos a execução de amostras no prazo de 24 h, se possível. As amostras preparadas podem ser armazenadas a curto prazo, a 4 ° C,mas cuidados devem ser tomados para evitar a degradação. Se possível, as lavagens finais deve ser realizada em água desionizada filtrada sem BSA como esta vai diminuir a deposição sobre os cones câmara de pulverização e dispositivo de amostragem da máquina o que irá diminuir a limpeza de instrumentos. Para hESCs é necessário para realizar estas lavagens, enquanto incluindo BSA para evitar a perda de amostra se colem à superfície do tubo.

6. Prepare amostras de Aquisição

  1. contagem de células
    1. Ressuspender as células em 500 uL de 0,1% de BSA em água desionizada filtrada e filtrar para um tubo fresco através de um tampão de filtro de 35 um da célula.
      NOTA: A diminuição do nível de BSA durante as lavagens finais diminui o resíduo deixado no nebulizador citometria de massa. As culas n aderentes podem ser lavadas e ressuspensas em água desionizada filtrada.
    2. Contagem de células por transferência de 10 mL da suspensão de células para um tubo de microcentrífuga. Diluir alíquota para uma relação conhecida emtripano azul (para ajudar com a visualização de células) e transferir para um hemocitómetro ou sistema de contagem de células automatizado.
    3. células centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar ou aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
  2. Preparar e amostras de carregamento
    1. Para preparar grânulos de calibragem de remover da geladeira e agitar vigorosamente para voltar a suspender.
    2. Se a execução de amostras usando uma massa de citometria de amostrador automático, adicionar 50? L de esferas de calibração para cada poço da placa de amostra, em seguida, adicionar o número desejado de células a serem analisadas. Se a execução de amostras por injecção manual de adicionar 50? L de esferas de calibração para amostra, diluir a amostra em água desionizada filtrada, misturar bem e amostra de carga em massa da amostra citometria porta de injecção. A diluição da amostra apropriada pode variar dependendo do tipo de célula a ser analisado, mas uma diluição de 10 6 é geralmente apropriada uma.

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Representative Results

O protocolo aqui apresentado pode ser amplamente aplicada a uma vasta variedade de amostras de células cultivadas e primárias, com apenas pequenas modificações. Dependendo dos requisitos de uma experiência, que pode ser realizada de uma maneira modular, quando certos elementos, tais como o código de barras ou de coloração da superfície celular, não são necessários. Utilizado na sua totalidade, este protocolo permite a preparação de massa multiplexado por citometria de amostras marcadas para identificação população exclusão de células mortas, a fase-S e coradas para a quantificação de até 38 alvos de anticorpos.

Resultados esperados produzidos pelos métodos descritos neste protocolo (Figura 2) estão representados na Figura 3. Após a recolha de dados, a normalização da intensidade do sinal com base na intensidade do grânulo de calibração pode ser realizado dentro do software de citometria de massa. Após a normalização, proce dados iniciaisssing para remover grânulos de calibragem, portão em células individuais e remover as células mortas pode ser realizada manualmente, utilizando qualquer software capaz de analisar os dados de citometria de fluxo. A remoção de grânulos de calibragem pode ser realizada manualmente por gating na população Ir191 + Ce140- (Figura 3A) ou com um algoritmo baseado MATLAB 20. Eventos de célula única (contorno preto, Figura 3B) pode ser fechado durante a remoção de detritos celulares e multipletos, por gating na trama biaxial de Ir193 e Corpo Evento (Figura 3B). rotulagem cisplatina de células mortas pode ser utilizado para quantificar a quantidade de morte celular; mostrados são exemplos de amostras com baixo (Figura 3D) e (3E) quantidades mais elevadas de células mortas. As células mortas pode ser removido a partir dos dados por gating fora da população Pt198 + (Figura 3E). O código de barras de amostras, quer com cisplatina ou paládio reagentes monoisotópicos, resulta em separação distinta de samples dentro dos parâmetros de códigos de barras (Figura 3C), o qual permite que as células a ser atribuído à sua identidade amostra original. Métodos opcionais adicionais, tais como a rotulagem IdU, permitir a detecção de populações específicas, por exemplo, as células em fase S (Figura 3F). Seguindo normalização inicial, debarcoding e intermitcia, os dados dimensionais altas podem ser analisados utilizando uma variedade de algoritmos, incluindo PÁ 17 e vários outros concebidos para citometria de massa de análise de dados e de visualização 18. Algoritmos como PÁ tomar os dados dimensionais elevadas, que podem ser difíceis de interpretar uma vez que não pode ser visualizado directamente no seu estado alto dimensional, e gerar uma representação tridimensional inferior dos dados, o qual é mais favorável para a interpretação visual (Figura 3G).

figura 1 Figura 1: Princípios básicos da massa citometria de medição. Preparação de amostras de células para análise de citometria de massa envolve as células de coloração com anticorpos marcados com isótopos de metal principalmente a partir da série dos lantanídeos de elementos. Neste esquema de cada anticorpo criado contra um epitopo específico é marcado com um isótopo possuindo uma massa atómica única, tal como samário 154. Os anticorpos contra epitopos que são superfície, citoplasmática, cromatina nuclear ou localizada pode potencialmente ser usado. As células marcadas são injectadas e pulverizado através da massa citometria nebulizador como gotículas de células únicas, onde eles são ionizados por uma tocha de plasma de árgon. A nuvem de partículas resultante é despojado de baixa átomos de massa por um filtro de massa quadrupolar, enquanto a abundância de iões maiores de massa atómica são medidos pelo detector. A quantidade medida de cada ião de massa única corresponde à abundância celular de epitopo alvo do seu anticorpo associado. Enquanto um l teóricaimit de mais de 100 parâmetros poderiam ser quantificados utilizando esta metodologia, as correntes reagentes disponíveis comercialmente permitir a detecção de parâmetros de mais de 40 por célula. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: diagrama de fluxo de trabalho de procedimento experimental e passos opcionais. Descrição dos principais passos envolvidos no protocolo de preparação de células por citometria de massa. Passos opcionais são indicados por caixas de laranja. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Exemplo de dados gerados a partir de m cu análise de citometria. (A) trama biaxial mostrando a separação de células (alta Ir191, baixo CE140), grânulos (de baixo Ir191, alta CE140) e dubletos de células do grânulo (alta Ir191, alta CE140). (B) trama biaxial mostrando a aparência esperada de Ir193 vs comprimento de evento. Gating de células individuais que remove os restos celulares e de células multipletos é mostrado. (C) que mostra a trama biaxial exemplo vista de dois canais de massa a partir de códigos de barras de cisplatina. (D - E) Exemplo de dados a partir de cisplatina vivo inoperante coloração / para amostras com uma percentagem baixa (D) e uma percentagem elevada (E) de células mortas. (F) Biaxial trama de células H9, células estaminais embrionárias humanas marcadas com IdU para distinguir as células em fase S e um anticorpo contra a ciclina B1 para distinguir mais do ciclo celular. (L Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O protocolo aqui apresentado tem sido empregue com sucesso para o tratamento de várias linhas de cultura de células (H1 e H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) e amostras de tecido primárias (de medula óssea de ratinho, rato fígado embrionário, rato adulto fígado, tumor de rato). Independentemente da fonte, qualquer tecido que pode ser dissociado em células individuais, preservando o estado celular devem ser passíveis de análise por citometria de massa, mas pode requerer alguma optimização protocolo. É importante notar que alguns epitopos podem ser afectadas pelos tratamentos específicos de dissociação, de fixação e permeabilização utilizados e estes métodos podem precisar de se submeter a optimização específicas da amostra. Se baixo sinal é observado para um anticorpo, pode ser possível melhorar a rotulagem através da realização de superfície celular em células vivas, mudando métodos permeabilização, ou diminuindo o tempo de fixação.

Quando possível, dentro do projeto experimental, incluindo o código de barras no the fluxo de trabalho de processamento da amostra assegura a consistência entre as amostras ao nível de concentração de células e o anticorpo. Sem o código de barras, mesmo quando é tomado grande cuidado para controlar o processamento de amostras, é provável que as ligeiras variações na concentração de anticorpos e a concentração de células será introduzido entre as amostras. Além disso, como as percentagens de células positivas para epitopos específicos provavelmente irá variar entre amostras, a proporção eficaz de anticorpo-a-epitopo pode necessariamente ser diferente entre as amostras, mesmo se a concentração total de anticorpos é mantida consistente, conduzindo potencialmente a inconsistências na coloração de anticorpos. Estas variações, embora geralmente menor quando se observa um canal único, pode tornar-se bastante agravado quando se realiza um ensaio de alta parâmetro e pode ser interpretado como biologicamente significativa, se não for tomado cuidado durante a análise de dados.

A análise dos dados resultantes de uma massa citometria de experiência pode assumir muitas formas, e uma série de computacionais abordagens foram adaptados especificamente para esta aplicação. Enquanto fornece um levantamento exaustivo de algoritmos úteis para a massa citometria de análise de dados está além do escopo deste manuscrito, abordagens que têm sido utilizados com sucesso são destacadas e leitores interessados são encaminhados para vários recursos que cobrem este assunto 21, 22, 23. Duas das abordagens mais utilizados atualmente disponível para análise da massa citometria dados são Spanning Tree Progressão de Densidade normalizar Eventos (pá) e vişne. PÁ forma agrupamentos de grupos de células com expressão marcador semelhante e representa cada grupo como um nó. Estes nós são dispostas numa árvore PÁ onde os nós semelhantes estão ligados por uma linha (Figura 3G). vişne utiliza o Stochastic Vizinho Distributed-t Incorporação algoritmo 24 para gerar um representação bidimensional deos dados de elevada dimensão, preservando a estrutura geral de dados. Ambos pá e vişne são escritos em MATLAB, o código fonte está disponível gratuitamente e pode ser executado por usuários com MATLAB. Além disso, uma versão independente do PÁ está disponível.

Enquanto citometria de massa atualmente permite recolha do maior número de parâmetros, etiqueta fluorescente citometria de base pode ser a melhor abordagem para algumas aplicações. A fluorescência por citometria de fluxo pode analisar mais células por segundo, até 5 x 10 4 em comparação com 500-1000 por citometria de massa, e tem anticorpos 25 validada mais disponível. Avanços adicionais no fluxo de fluorescência citometria, como hyperspectral citometria 26 e novas fluoróforos 27 fazer o fluxo de fluorescência citometria uma alternativa viável para todos, mas as experiências de parâmetros muito elevados. Técnicas adicionais tais como medição de ARN de 28, anteriormente só possívelpor fluxo com base fluorescência citometria foram recentemente adaptado para citometria de massa permitindo a detecção simultânea de proteína e ARN 29. Futura expansão de isótopos e reagentes disponíveis para utilizar mais completamente a janela massa de isótopos mensuráveis ​​e expandir o repertório de características celulares mensuráveis ​​irá expandir a profundidade de perfilar possível em massa citometria.

O grande número de parâmetros que podem ser analisadas em simultâneo por citometria de massa expande grandemente as perguntas experimentais que podem ser investigados. Desejamos que este artigo e protocolo de vídeo que acompanha permitirá que os investigadores interessados ​​a utilizar mais eficazmente massa citometria para avançar sua pesquisa.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 medium kit Stem Cell technologies 05850 Warm at room temperature before use
DMEM F-12 ThermoFisher 11330-032 Warm at 37 °C before use
Accutase Stem Cell technologies 07920 Warm at 37 °C before use
Bovine serum albumin Equitech BAH62
phosphate buffered saline Hyclone SH30256.01
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Cell ID Pt194 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt195 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt196 Fluidigm Provided at 1 mM
Cisplatin Enzo Life Sciences ALX-400-040-M250 Soluble to 25 mg/mL in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit Fluidigm 201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich I7125 Soluble to 74 mg/mL in 0.2 N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent Fluidigm 201103A
Methanol Fisher BP1105-4 Chill at -20 °C before use
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
5 mL round bottom tubes Falcon 352058
5 mL 35 μm filter cap tubes Falcon 352235
EQ four element calibration beads Fluidigm 201078
Hyaluronidase Type I-S Sigma-Aldrich H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C9891
Disposable Scalpel #10 Sigma-Aldrich Z69239

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References

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