Preparazione del campione per l'analisi di massa Citometria

Biology

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McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (122), e54394, doi:10.3791/54394 (2017).

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Abstract

Massa utilizza citometria anticorpi coniugati con le etichette di metalli pesanti, un approccio che ha notevolmente aumentato il numero di parametri e opportunità per l'analisi pozzo profondo di quanto sia possibile con i tradizionali flusso basato sulla fluorescenza citometria. Come per ogni nuova tecnologia, ci sono passaggi critici che aiutano a garantire la generazione affidabile di dati di alta qualità. Qui presentata è un protocollo ottimizzato che comprende molteplici tecniche per il trattamento di campioni di cellule per l'analisi di citometria di massa. I metodi descritti qui aiuterà l'utente a evitare problemi comuni e raggiungere risultati coerenti minimizzando variabilità, che può portare a dati accurati. Per informare disegno sperimentale, la logica alla base operazioni opzionali o alternative nel protocollo e la loro efficacia nello scoprire nuove scoperte nella biologia del sistema oggetto di indagine è coperto. Infine, i dati rappresentativi è presentato per illustrare i risultati attesi dalle tecniche Presented qui.

Introduction

Citometria consente la misurazione simultanea di più target anticorpali a livello di singola cellula attraverso grandi popolazioni di cellule. Nel tradizionale citometria di flusso basato sulla fluorescenza, il numero di parametri che possono essere quantificate è limitato dalla sovrapposizione spettrale tra lo spettro di emissione dei fluorofori multipli, che richiede calcoli di compensazione sempre più complessi come il numero di parametri aumenta. Queste limitazioni sono rivolte in massa citometria, dove vengono rilevati e quantificati mediante tempo di volo (TOF) spettrometria di massa per espandere notevolmente il numero di parametri raccolti simultaneamente e produrre un alto dimensionale profilo proteico-abbondanza per ogni singola cella anticorpi metallo coniugati pesanti.

Una conoscenza di base del funzionamento della massa citometria strumento è vantaggioso per l'utente e può essere essenziale per la risoluzione dei problemi. Per una descrizione più approfondita di messa a punto e l'esecuzione di una macchina citometria di massa,consultare il relativo manoscritto 1. Brevemente, un campione di cellule è etichettato con un pannello di metallo anticorpi coniugati destinati marcatori di superficie cellulare, le proteine citoplasmatiche, proteine nucleari, proteine cromatina-bound o altri epitopi di interesse (Figura 1i). Le cellule marcate vengono caricate sulla macchina, uno alla volta mediante iniezione manuale o mediante un autocampionatore che i campioni da una piastra a 96 pozzetti. Le cellule caricate vengono iniettate attraverso un nebulizzatore, che genera uno spruzzo di goccioline di liquido che incapsulano le cellule (Figura 1ii). Questo spray è posizionato in modo che le cellule vengono ionizzati da una torcia al plasma di argon. Questo ionizzazione genera una nube di particelle comprendente tutti gli atomi costituenti ciascuna cella (Figura 1iii). Poiché questa nube particella viaggia verso il rivelatore, bassi atomi di massa atomica sono separati dalle alte ioni massa da un filtro di massa a quadrupolo. I restanti alti ioni di massa continuano al rivelatore, dove l'abundance di ciascun isotopo viene quantificato (Figura 1iv). I dati grezzi raccolti dal rivelatore, vengono analizzati dal software dello strumento citometria di massa per identificare gli eventi cellulari. Per ciascun evento cella identificata, il segnale rilevato in ciascun canale viene quantificata e salvata in un file un'uscita .fcs. I canali di massa utilizzati per rilevare gli anticorpi metallo pesante coniugati presentano minima sovrapposizione spettrale, che va da 0,4% con la maggior parte dei contributi inferiori all'1%. A causa di questa cross-talk tra i canali, è generalmente necessario trasformare i dati con una matrice di compensazione prima dell'analisi 2. Tuttavia, occorre prestare attenzione durante la progettazione del pannello sperimentale di anticorpi per garantire che un anticorpo con un epitopo alta abbondanza non è assegnato a un canale di massa che contribuisce segnale ad un canale assegnato ad un anticorpo a bassa abbondanza, in quanto ciò può creare artificialmente elevati della popolazione nel canale di ricezione del segnale del contributo.

3, 4. Esecuzione di superficie cellulare colorazione anticorpale su cellule vive può essere necessario per alcuni anticorpi, ma esclude la possibilità di codici a barre prima dell'etichettatura anticorpo come maggior parte dei metodi di codici a barre vengono eseguiti dopo fissazione 5 sebbene codici a barre a base di anticorpi 6, 7 è un'eccezione.

Nel determinare il numero di cellule da preparare per l'analisi, è importante sapere che solo una frazione delle cellule caricate sulla macchina sarà rilevato e produrre dati. Questa perdita è dovuta in primo luogo a inefficienze quando il nebulizzatore spray campione al cannello. La perdita percentuale esatta dipende dalla massa citometria configurazione della macchina e tipo cellulare, ma può variare da 50-85% e deve essereconsiderati quando si progetta l'esperimento. Questo protocollo è stato ottimizzato per 2x10 6 cellule per campione, ma può essere adatta a lavorare campioni di dimensioni più piccole o più grandi. Questo protocollo può essere utilizzato con minime modifiche per dimensioni del campione da 1 x 10 6 a 4 x 10 6, tuttavia è fondamentale che la dimensione del campione essere mantenuta costante in un esperimento. Cambiamenti nel numero di cellule possono influenzare l'intensità dei codici a barre e colorazione degli anticorpi ed essere comunque ridotti all'incirca costante attraverso campioni da confrontare direttamente.

Alcune procedure, come l'etichettatura di cellule morte e l'etichettatura del DNA, devono essere effettuate nella stragrande maggioranza, se non tutti i disegni sperimentali. L'etichettatura di cellule morte in esperimenti analizzare solo marcatori di superficie può essere ottenuta utilizzando Rh103, ma Rh103 dovrebbe essere evitato per esperimenti in cui è richiesta permeabilizzazione come si verifica una perdita di colorazione. Per gli esperimenti che coinvolgono permeabilizzazione, si consiglia di utilizzare cisplatino

Campioni codici a barre possono ridurre il consumo di anticorpi, ridurre il tempo di acquisizione ed eliminare campione a campione variabilità 9. Il processo di barcoding comporta l'applicazione di un codice specifico di esempio unico per tutte le celle, che viene utilizzato per assegnare ogni cella per il campione di origine. Dopo barcoding i campioni possono essere riuniti prima della colorazione anticorpale, un processo che assicura tutti i campioni sono macchiati ugualmente. Per ridurre al minimo errore sperimentale, è prudente codice a barre e piscina i campioni che devono essere direttamente confrontate tra di loro. Attualmente esistono diversi metodi per codici a barre dei campioni per l'analisi di citometria di massa 5, 6, 7, due dei quali sono qui presentati (vedi sotto).

Con Reagen attualmente disponibilits è possibile quantificare l'abbondanza di 38 bersagli degli anticorpi, identificare le cellule in fase S 10, distinguere le cellule vive e morte 8 e misurare i livelli cellulari di ipossia 11 in un esperimento multiplex di campioni multipli. Questa capacità di raccogliere dati monocellulari alta parametro per grandi popolazioni cellulari consente una migliore profilatura di popolazioni cellulari altamente eterogenee e ha già prodotto una serie di dati biologici nuovi 12, 13, 14, 15, 16. Distillando i dati complesso risultante per informazioni interpretabili ha richiesto l'uso di algoritmi di calcolo includendo Spanning Tree progressione della densità Eventi normalizzati (SPADE) 17 e 18 viSNE.

Questo articolo presenta una accessibilipanoramica di come progettare e realizzare una massa citometria esperimento e introduce analisi di base della massa citometria dati.

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Protocol

1. cellule da raccolta

  1. Che raccolgono le cellule da tessuto primario
    NOTA: Il procedimento descritto per le cellule raccolta da tessuto primario è specificamente applicabile al tessuto tumorale mammario mouse e non può essere applicato come ai tessuti primari da altre fonti.
    1. Preparare tampone di digestione sciogliendo 5 mg e 30 mg ialuronidasi collagenasi in 10 ml DMEM / F12 supporti per grammo di tessuto da trattare. Filtrata sterilizzare tampone di digestione.
    2. Isolare primario del tumore della ghiandola mammaria di topo e registrare tumore peso.
    3. Tritare il tessuto con il # 10 bisturi per almeno 5 minuti.
    4. Aggiungere tessuto tritato al volume appropriato di tampone di digestione (10 mL tampone per grammo di tessuto).
    5. Agitare tessuto tritato in tampone di digestione a 100 rpm per 1-3 ore a 37 ° C.
    6. Ottenere la sospensione singola cella passando cellule attraverso 0,4 micron filtro in un tubo da 50 ml.
    7. centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a 4 °; C. Decantare o aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet.
    8. Risospendere pellet in 4 mL DMEM / F12 e trasferimento 5 mL tubo fondo rotondo.
  2. Che raccolgono le cellule da coltura tissutale
    1. Lavare la piastra o pallone di cellule aderenti con calcio e magnesio fosfati salina tamponata (PBS) a temperatura ambiente.
      NOTA: La tecnica descritta per le celle di raccolta è specificamente applicabile a aderenti cellule di coltura umane cellule staminali embrionali (hESC). Tuttavia, il resto del protocollo descritto è ampiamente applicabile ad altre linee cellulari in coltura, le linee non aderenti e cellule primarie.
    2. Aggiungere riscaldato (37 ° C) tripsina o altro reagente di digestione enzimatica ottimizzata per ottenere una sospensione di cellule singole dalle cellule aderenti. Seguire il protocollo del produttore.
      NOTA: tripsina e altri reagenti dissociazione enzimatica hanno il potenziale per influenzare i marcatori cellulari.
    3. Incubare la piastra a 37° C per 2-5 minuti per staccare le cellule. Per alte culture confluenza, toccare delicatamente la piastra per aiutare staccare le cellule.
    4. Trasferire cellule completamente staccate dalla piastra in una provetta a fondo tondo da 5 ml e pipettare delicatamente con una pipetta 1 mL di dissociarsi cellule.
      NOTA: per un vasto numero di campioni tutti i passi possono alternativamente essere eseguite in una piastra di fondo pozzo rotondo 96. Per l'elaborazione dei campioni in un formato ben 96 tutti i lavaggi possono essere eseguite in un volume di 250 microlitri. I volumi descritti in altre fasi possono essere regolati in modo che il volume totale non supera i 300 ml.
    5. Quench il reagente digestione enzimatica con un tampone di lavaggio pari di volume (0,5% di BSA e 0,02% di sodio azide in PBS).
      NOTA: azide di sodio è una sostanza chimica pericolosa. devono essere osservate le misure di sicurezza adeguate per la sua preparazione e la manipolazione.
    6. centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min a 37 ° C. Decantare o aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet.
    7. Risospenderecellule in media liberi 1 ml di siero.
    8. Contare le cellule trasferendo 10 microlitri della sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5. Diluire un'aliquota ad un rapporto noto trypan blu e trasferimento in un emocitometro o sistema di conteggio automatico di cellule.
  3. Etichettatura della popolazione fase S
    NOTA: Se l'etichettatura S-fase non deve essere eseguita è procedere per arginare 1.4.
    1. Preparare 1 ml di 10 pM 5-iodo-2'-deossiuridina (IdU) nel siero F12 DMEM privo o altri mezzi appropriati per ogni 2 x 10 6 cellule da analizzare.
    2. Aggiungere 500 ml di 10 micron Idu in media liberi siero per ogni cellule 2 x 10 6.
      NOTA: Durante l'etichettatura IDU può essere eseguita in mezzi contenenti siero, proteine ​​gratis reagirà con cisplatino, impedendo una corretta etichettatura delle cellule morte. Se i supporti contenenti siero viene utilizzato durante IdU marcare una fase di lavaggio supplementare è siero media liberi è necessario rimuovere le proteine ​​sieriche prima cisplatino vivo STA / mortivorazio.
    3. Risospendere delicatamente pellet con 1 ml pipetta.
    4. Incubare per 10 minuti a 37 ° C con dolce dondolio.
  4. / Etichettatura diretta Morto
    1. Per ogni campione preparare 500 ml di 50 mM cisplatino nel siero connessione DMEM-F12 o tipo cellulare di supporto appropriato.
      NOTA: Se l'etichettatura della popolazione fase S da IdU non è da eseguire, i campioni risospendere alla concentrazione di 4 x 10 6 cellule / ml. Risospendere le cellule prima di aggiungere cisplatino consente più rapida miscelazione di soluzioni per l'etichettatura uniforme dal vivo / morto.
    2. Aggiungere 500 ml di 50 micron cisplatino per 2 x 10 6 cellule di campioni.
    3. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 1 min in un agitatore orbitale con costante miscelazione.
    4. Quench il cisplatino con un volume uguale di tampone di lavaggio.
    5. cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Decantare o aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet.
    6. Lavare i campioni due voltecon 500 microlitri di tampone di lavaggio per rimuovere l'eccesso cisplatino.
    7. campioni lavare due volte con 500 microlitri di PBS per rimuovere le proteine ​​in eccesso.
  5. fissazione del campione
    1. campione risospendere in 500 microlitri di PBS.
    2. Aggiungere uguale volume di 4% PFA in PBS per una concentrazione finale del 2%; pipetta per mescolare.
      NOTA: Preparare 4% PFA fresco da polvere, regolare il pH a 6,9 e passare attraverso un filtro di 0,44 micron. 4% PFA in PBS può essere conservato a 4 ° C per un massimo di due settimane. Evitare formalina premade forniti in fiale, se non specificatamente testato, in quanto spesso contiene contaminanti metallici che possono interferire con i canali massa misurata. Minore concentrazione di PFA può essere sufficiente e contribuire a minimizzare l'effetto di fissaggio sul legame degli anticorpi ma deve essere testato empiricamente.
    3. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orbitale con costante miscelazione.
    4. centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare o aspirare accuratamente la wi surnatantethout disturbare il pellet.
    5. Lavare i campioni con PBS per rimuovere soluzione PFA.
      NOTA: In questa fase i campioni possono essere conservati brevemente a 4 ° C. stoccaggio prolungato a 4 ° C può provocare la degradazione del campione e diminuita colorazione.

2. Codici a barre

NOTA: Durante la metodologia per l'utilizzo monoisotopico cisplatino codici a barre e codici a barre palladio è presentata simultaneamente, o possono essere utilizzati in modo indipendente o evitare del tutto se non richiesto dall'esperimento.

  1. Monoisotopico Cisplatino Barcoding
    NOTA: Dal momento che barcoding cisplatino e cisplatino Live / colorazione Morto si basano sulla sovrapposizione cura canali dovrebbero essere prese per garantire che sfondo cisplatino vivo colorazione / Morto nelle cellule vive è ridotto al minimo in quanto ciò potrebbe interferire con la precisione del codice a barre cisplatino.
    1. Diluire 1 mM soluzioni madre monoisotopico cisplatino a 200 pM in PBS.
    2. per l'egni cisplatino unico codice a barre preparare una provetta da 1,5 ml con 500 microlitri di PBS per ogni 2 x 10 6 cellule ricevente che il codice a barre.
    3. Per preparare ogni codice a barre univoco aggiungere ogni cisplatino monoisotopico applicabile ad una concentrazione finale di 200 Nm.
    4. Risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS per 2 x 10 6 cellule.
    5. Aggiungere un volume uguale di soluzione di codice a barre corrispondente per ogni campione.
    6. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 5 minuti in un agitatore orbitale con costante miscelazione.
    7. Quench cisplatino con un volume uguale di tampone di lavaggio.
    8. centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare o aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet.
    9. Lavare i campioni due volte con tampone di lavaggio 500 microlitri per rimuovere l'eccesso cisplatino.
  2. Palladium Barcoding
    NOTA: Palladium reagenti codici a barre possono essere sia preparato 5 o acquistati in commercio.
    1. Transient parzialepermeabilizzazione 19
      NOTA: Palladium chelazione barcoding richiede permeabilizzazione parziale per i reagenti di passare attraverso la membrana cellulare e robusta etichettare la cella.
      1. Lavare i campioni con 500 microlitri di PBS.
      2. Lavare i campioni con 500 microlitri PBS più 0,02% saponina.
      3. Risospendere pellet in volume residuo.
    2. Applicare il palladio barcoding.
      1. Diluire 100x magazzino di palladio reagente barcoding in 1 ml ghiacciata PBS più 0,02% saponina.
      2. Rapidamente aggiungere diluito barcoding reagente campione risospeso.
      3. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a costante miscelazione.
      4. Lavare i campioni due volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio.

3. superficie cellulare colorazione

NOTA: Cell superficie colorazione può essere eseguita su cellule vive prima della fissazione. Questo può essere necessario per anticorpi che perdono affinità per their epitopo dopo la fissazione. Alcuni campioni di cellule possono beneficiare di blocco aggiuntivi, come Fc di blocco per leucociti, prima di etichettatura degli anticorpi per ridurre sfondo. bloccaggio ottimale dovrebbe essere empiricamente determinato per specifico tipo di campione.

  1. Preparare pannello colorazione anticorpale superficie cellulare.
    1. Combinare 0,5 mL o empiricamente determinata quantità, di ogni 0,5 mg / ml di anticorpo superficie cellulare per campione in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere il tampone di lavaggio, se necessario, per portare il volume fino a 10 ml per campione. Mescolare pipettando.
      NOTA: Determinare diluizione di lavoro per ogni anticorpo prima a sperimentare empiricamente da esperimenti di titolazione.
    2. Spaccatura pool di anticorpi superficie cellulare equamente in una 1.5 mL provetta per ogni campione da colorare.
    3. Preparare 500 ml di tampone di lavaggio in una provetta da 1,5 ml per ciascun campione.
  2. Applicare superficie colorazione cellulare per campioni di volume normalizzato per tutti i campioni.
    NOTA: Per ENSure etichettatura degli anticorpi coerente su più campioni è di vitale importanza per controllare con attenzione il volume del campione e la concentrazione di anticorpi. Le seguenti operazioni sono finalizzate a raggiungere questa coerenza garantendo che i volumi del campione finale dopo l'anticorpo è stato aggiunto sono uniformi.
    1. centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare o aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet.
    2. Con una pipetta set 200 microlitri di 50 microlitri, rimuovere la soluzione restante dal pellet campione e trasferirli in una provetta della piscina aliquotate anticorpo superficie cellulare.
    3. Pipetta su tutto il liquido nel tubo aliquota senza aspirare aria nella punta della pipetta.
    4. Tenendo lo stantuffo della pipetta per evitare aspirando aria spostare la punta in un tubo preparato di 500 microlitri tampone di lavaggio e rilasciare lo stantuffo.
    5. Aggiungere di nuovo il contenuto della punta della pipetta al campione e risospendere il campione nel liquido con dolce pipettaggio.
    6. Incubare i campioni per 1h a TA su un agitatore orbitale con costante miscelazione.
    7. Lavare i campioni due volte con tampone di lavaggio 500 microlitri per garantire che tutti anticorpo libero viene lavato via.
    8. Lavare i campioni con 500 microlitri di PBS.
    9. Risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di PBS.
    10. Aggiungere uguale volume di 4% PFA in PBS; pipetta per mescolare.
    11. Incubare per 10 minuti su un agitatore orbitale.

4. cellulare Permeabilization e colorazione intracellulare

  1. cellulare permeabilizzazione
    1. centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare o aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet.
    2. Risospendere le cellule in volume residuo vortexando delicatamente fino il pellet viene dissociato.
      NOTA: mancata dissociare le cellule prima di aggiungere MeOH si tradurrà in cellule aderenti insieme e produrre un film sottile che si tradurrà in perdita di campione parziale.
    3. Immediatamente aggiungere 1 ml di 100% MeOH a 2 x 10 6 </ Sup> cellule e delicatamente pipetta per mescolare.
      NOTA: Altri metodi permeabilizzazione può essere sostituito con MeOH e può essere necessario per conseguire permeabilizzazione ottimale per alcuni tipi di cellule. Per alcune fonti di cellule 0,1% Triton X-100, 0,2% Tween-20 allo 0,1% saponina in soluzione PBS per permeabilizzazione può mantenere l'integrità delle cellule meglio pur fornendo permeabilizzazione coerente.
    4. Incubare i campioni per almeno 1 ora o fino ad un massimo di 24 ore a 4 ° C per permeabilizzazione.
      NOTA: A questo punto i campioni in MeOH possono essere conservati fino a 1 mese a -80 ° C.
    5. centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare o aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet.
    6. Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio per ogni ml MeOH utilizzato per permeabilize campione. Risospendere delicatamente pellet di cellule.
    7. Lavare campione due volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio.
  2. Preparare pannello anticorpo colorazione intracellulare.
    1. Combinare 0,5 mL o empiricamente determinata quantità, di ogni 0,5 mg / ml di anticorpo intracellulare a campione in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere il tampone di lavaggio, se necessario, per portare il volume fino a 10 ml per campione. Mescolare pipettando.
    2. Raggruppati piscina anticorpo intracellulare equamente in una 1.5 mL provetta per ogni campione.
    3. Preparare 500 microlitri di tampone di lavaggio in una provetta da 1,5 ml per ciascun campione.
  3. Applicare la colorazione intracellulare per campioni di volume normalizzato per tutti i campioni.
    NOTA: per garantire l'etichettatura degli anticorpi coerente su più campioni è di vitale importanza per controllare con attenzione il volume del campione e la concentrazione di anticorpi.
    1. centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare o aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet.
    2. Con 200 microlitri pipetta impostato a 50 microlitri rimuovi rimanente soluzione da pellet campione e trasferirli in una provetta della piscina aliquotate anticorpo superficie cellulare.
    3. Pipettaup tutto il liquido nel tubo aliquota senza aspirare aria nella punta della pipetta.
    4. Tenendo lo stantuffo della pipetta per evitare aspirando aria spostare la punta in un tubo preparato di 500 microlitri tampone di lavaggio e rilasciare lo stantuffo, elaborazione tampone di lavaggio per un volume di campione totale di 50 microlitri.
    5. Aggiungere di nuovo il contenuto della punta della pipetta al campione e risospendere il campione nel liquido con dolce pipettaggio.
    6. Incubare i campioni per 1 ora a RT su un agitatore orbitale con costante miscelazione.
    7. Lavare i campioni due volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio.
    8. Lavare i campioni con 500 microlitri di PBS.

5. Iridium Etichettatura

  1. campioni fix
    1. campioni risospendere in 500 microlitri di PBS.
    2. Aggiungere 500 ml di PFA 4% in PBS.
    3. Incubare per almeno 15 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orbitale con costante miscelazione.
  2. Applicare l'etichettatura Iridium del DNA
    1. Aggiungere 500 microlitri 62,5 nM iridio soluzione PFA ai campioni.
      NOTA: Per gli esperimenti usando le cellule permeabilizzate, diluire il 500X Ir191 / 193 magazzino per diluizione finale di 1: 2.000 per evitare overstaining.
    2. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orbitale con costante miscelazione.
      NOTA: Se si effettuano monoisotopico barcoding cisplatino Non incubare campioni con iridio per più di 15 minuti dal momento che forti segnali Ir193 possono contribuire al canale di massa Pt194 e avere un impatto negativo la qualità barcoding.
    3. centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare o aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet.
    4. campioni lavare due volte con 500 microlitri 0,1% BSA in acqua deionizzata filtrata.
      NOTA: Una volta pronti si consiglia di eseguire i campioni entro 24 ore, se possibile. campioni preparati possono essere conservati a breve termine a 4 ° C,ma occorre prestare attenzione per evitare il degrado. Se possibile i lavaggi finali devono essere effettuate in acqua deionizzata filtrata senza BSA quanto diminuirebbero la deposizione sulla camera di nebulizzazione e campionatore coni della macchina che diminuirà pulizia strumento. Per hESCs è necessario eseguire questi lavaggi pur comprendendo BSA per evitare perdite di campione di attaccarsi alla superficie del tubo.

6. preparare i campioni per l'acquisizione

  1. contare le celle
    1. Risospendere le cellule in 500 microlitri 0,1% BSA in acqua deionizzata filtrata e il filtro in una nuova provetta attraverso un tappo filtro 35 micron cella.
      NOTA: L'abbassamento del livello BSA per i lavaggi finali diminuisce il residuo lasciato sul citometria nebulizzatore Messa. le cellule non aderenti possono essere lavati e risospesi in acqua deionizzata filtrata.
    2. Contare le cellule trasferendo 10 microlitri della sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga. Diluire un'aliquota ad un rapporto nototrypan blue (per aiutare con visualizzazione delle cellule) e trasferimento in un emocitometro o sistema di conteggio automatico di cellule.
    3. centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare o aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet.
  2. Preparare campioni e di carico
    1. Per preparare perle di calibrazione togliere dal frigo e agitare vigorosamente per risospendere.
    2. Se l'esecuzione campioni utilizzando una massa citometria autocampionatore, aggiungere 50 ml di gocce di taratura in ciascun pozzetto della piastra campione e poi aggiungere il numero desiderato di celle da analizzare. Se i campioni correnti di iniezione manuale aggiungono 50 ml di sferette di calibrazione a campione, diluire il campione in acqua deionizzata filtrata, mescolare bene e campione carico nella massa campione citometria porta di iniezione. La diluizione del campione appropriata può variare a seconda del tipo di cellula analizzato, ma una diluizione di 10 6 è generalmente appropriato 1.

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Representative Results

Il protocollo presentato qui può essere ampiamente applicata ad una vasta gamma di campioni di cellule in coltura e primario con modifiche solo minori. A seconda delle esigenze dell'esperimento, può essere eseguita in modo modulare quando alcuni elementi, come codici a barre o superficie cellulare colorazione, non sono necessarie. Utilizzato nella sua interezza questo protocollo consente la preparazione di massa multiplato citometria campioni etichettati per identificazione popolazione morto esclusione di cellule, S-fase e colorate per la quantificazione di fino a 38 bersagli anticorpali.

Risultati attesi prodotte mediante i metodi descritti in questo protocollo (Figura 2) sono rappresentati in figura 3. Al momento della raccolta dei dati, la normalizzazione di intensità del segnale base all'intensità tallone calibrazione può essere effettuata all'interno del software citometria a massa. Dopo la normalizzazione, proce dati inizialissing per rimuovere gocce di taratura, cancello singole cellule e rimuovere le cellule morte può essere eseguita manualmente utilizzando un software in grado di analizzare citometria a flusso di dati. Rimozione di gocce di taratura può essere eseguita manualmente gating sulla Ir191 + Ce140- popolazione (Figura 3A), oppure con un algoritmo basato MATLAB 20. Eventi monocellulari (contorno nero, figura 3B) possono essere gated durante la rimozione di detriti e cellulari multipletti, dal gating sulla trama biassiale di Ir193 e Lunghezza evento (Figura 3B). etichettatura Cisplatino di cellule morte può essere utilizzato per quantificare la quantità di morte cellulare; mostrate sono esempi di campioni con basso (Figura 3D) e superiore (Figura 3E) le quantità di cellule morte. Le cellule morte possono essere rimossi dai dati gating fuori Pt198 + popolazione (Figura 3E). Codici a barre dei campioni, sia con monoisotopiche cisplatino o palladio reagenti, risultati in distinta separazione di samples entro i parametri di codici a barre (Figura 3C), che permette alle cellule da assegnare alla loro identità campione originale. Metodi opzionali, come l'etichettatura IdU, permettono la rilevazione di specifiche popolazioni, ad esempio, le cellule in fase S (Figura 3F). Seguendo normalizzazione iniziale, debarcoding e gating, i dati dimensionali elevate possono essere analizzati utilizzando una varietà di algoritmi compresi SPADE 17 e molti altri progettati per massa citometria analisi dei dati e visualizzazione 18. Algoritmi come SPADE prendere i dati dimensionali elevate, che possono essere difficili da interpretare in quanto non può essere visualizzata direttamente nel suo stato alto dimensionale, e generare una rappresentazione tridimensionale inferiore dei dati, che è più suscettibile di interpretazione visiva (figura 3G).

Figura 1 Figura 1: Principi di base di massa citometria di misura. Preparazione dei campioni di cellule per l'analisi di citometria di massa coinvolge cellule di colorazione con anticorpi marcati con isotopi metallici principalmente della serie dei lantanidi della elementi. In questo schema ciascun anticorpo sollevata contro un epitopo specifico è marcato con un isotopo possiede una massa atomica unico, come samario 154. Gli anticorpi contro epitopi che sono superficie, citoplasmatica, cromatina nucleare o localizzata può potenzialmente essere utilizzato. cellule marcate vengono iniettati e spruzzato attraverso la massa citometria nebulizzatore come goccioline singola cella dove vengono ionizzati da una torcia al plasma di argon. La nube di particelle risultante viene spogliato delle basse atomi di massa tramite un filtro di massa a quadrupolo, mentre l'abbondanza di grandi ioni di massa atomica sono misurati dal rivelatore. La quantità misurata di ciascuno ione massa unica corrisponde all'abbondanza cellulare di epitopo bersaglio del suo anticorpo associato. Mentre un l teoricaIMIT di oltre 100 parametri potrebbe essere quantificato utilizzando questa metodologia, gli attuali reagenti commercialmente disponibili permettono il rilevamento di oltre 40 parametri per cella. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Diagramma di flusso della procedura sperimentale e gradini opzionali. Raffigurazione dei principali fasi del protocollo preparazione di cellule per citometria a massa. passaggi facoltativi sono indicati da scatole arancioni. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Esempio di dati generati da m ass citometria analisi. (A) diagramma biassiale mostra la divisione delle cellule (alta Ir191, basso Ce140), perline (basso Ir191, alta Ce140) e doppietti cordone cellule (alto Ir191, alta Ce140). (B) Terreno biassiale che mostra l'aspetto previsto di Ir193 vs lunghezza evento. è mostrato gating di singole cellule che rimuove i residui cellulari e cellulari multipletti. (C) diagramma che mostra biassiale esempio vista di due canali di massa da cisplatino barcoding. (D - E) i dati di esempio da cisplatino vivo colorazione / Morto per campioni con una percentuale bassa (D) e una percentuale elevata (E) delle cellule morte. (F) trama biassiale di cellule H9 hESC etichettati con IdU distinguere cellule in fase S e un anticorpo contro ciclina B1 distinguere ulteriormente ciclo cellulare. (G Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo presentato qui è stato impiegato con successo per il trattamento di varie linee in coltura di cellule (H1 e H9 hESC, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) e campioni di tessuti primari (midollo osseo di topo, il mouse del fegato embrionale, il mouse per adulti fegato, tumore mouse). Indipendentemente dalla fonte, qualsiasi tessuto che può essere dissociato in singole cellule preservando lo stato cellulare dovrebbe essere suscettibile di analisi mediante citometria di massa, ma può richiedere alcuni ottimizzazione protocollo. E 'importante notare che alcuni epitopi possono essere influenzate dagli specifici trattamenti di dissociazione, di fissazione e permeabilizzazione utilizzati e questi metodi possono avere bisogno di sottoporsi ottimizzazione specifica per campione. Se si osserva un segnale basso per un anticorpo può essere possibile migliorare effettuando etichettatura superficie cellulare su cellule vive, cambiando metodi permeabilizzazione, o diminuendo il tempo di fissazione.

Quando è possibile all'interno del disegno sperimentale, tra cui barcoding in the workflow campione trasformazione garantisce la coerenza tra campioni a livello di concentrazione cellulare e anticorpi. Senza codici a barre, anche quando grande cura è presa per controllare l'elaborazione del campione, è probabile che lievi variazioni nella concentrazione di anticorpi e la concentrazione cellulare sarà introdotto tra i campioni. Inoltre, le percentuali di cellule positive per epitopi specifici probabilmente variano tra i campioni, l'effettivo rapporto anticorpo-to-epitopo può necessariamente differire tra i campioni, anche se la concentrazione totale anticorpo viene mantenuta costante, che porta a incoerenze colorazione anticorpale. Queste variazioni, mentre generalmente minore quando osservando un singolo canale, possono diventare notevolmente aggravato quando si esegue un esperimento di alta parametro e può essere erroneamente interpretato come biologicamente significativo se non è preso cura durante l'analisi dei dati.

L'analisi dei dati risultanti da una massa di citometria esperimento può assumere molte forme, e un certo numero di Computaapprocci zionali sono state adattate specificamente per questa applicazione. Oltre a fornire un sondaggio esaustivo di algoritmi utili per la massa di citometria l'analisi dei dati è oltre la portata di questo manoscritto, gli approcci che sono stati utilizzati con successo sono evidenziati e lettori interessati sono diretti a molteplici risorse che riguardano questo tema 21, 22, 23. Due degli approcci attualmente disponibili più largamente impiegati per l'analisi della massa citometria dati sono Spanning Tree progressione della densità normalizzare Eventi (SPADE) e viSNE. SPADE forma cluster da gruppi di cellule con espressione marcatore simile e rappresenta ogni cluster come un nodo. Questi nodi sono disposti in un albero SPADE cui nodi simili sono collegati da una linea (figura 3G). viSNE utilizza Stochastic Vicina t-Distributed Incorporare algoritmo 24 per generare una rappresentazione bidimensionale dii dati elevate dimensioni pur mantenendo la struttura generale di dati. Sia SPADE e viSNE sono scritti in MATLAB, il codice sorgente è liberamente disponibile e può essere eseguito da utenti con MATLAB. Inoltre, una versione autonoma di SPADE è disponibile.

Mentre citometria di massa attualmente permette la raccolta del maggior numero di parametri, citometria a base etichetta fluorescente può essere un approccio migliore per alcune applicazioni. Fluorescenza citometria di flusso può analizzare più cellule al secondo, fino a 5 x 10 4 rispetto a 500-1000 per massa citometria, e ha anticorpi 25 convalidato più disponibile. Avanzamenti aggiuntivi nel flusso di fluorescenza citometria, come iperspettrale citometria a 26 e nuovi fluorofori 27 make flusso di fluorescenza citometria una valida alternativa per tutti, ma gli esperimenti molto elevati parametri. Tecniche aggiuntive come la misurazione di RNA 28 precedentemente possibile solodal flusso basato fluorescenza citometria sono stati recentemente adattato a massa citometria consentendo la rilevazione simultanea di proteine e RNA 29. Futura espansione di isotopi e reagenti possibile utilizzare più completamente la finestra massa di isotopi misurabili ed espandere il repertorio di caratteristiche cellulari misurabili espanderà la profondità di profilatura possibile dalla massa citometria.

Il gran numero di parametri che possono essere analizzati simultaneamente mediante citometria di massa espande notevolmente le domande sperimentali che possono essere studiate. Ci auguriamo che questo articolo e che accompagna protocollo video permetterà ai ricercatori interessati di utilizzare in modo più efficace di massa citometria a portare avanti la loro ricerca.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 medium kit Stem Cell technologies 05850 Warm at room temperature before use
DMEM F-12 ThermoFisher 11330-032 Warm at 37 °C before use
Accutase Stem Cell technologies 07920 Warm at 37 °C before use
Bovine serum albumin Equitech BAH62
phosphate buffered saline Hyclone SH30256.01
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Cell ID Pt194 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt195 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt196 Fluidigm Provided at 1 mM
Cisplatin Enzo Life Sciences ALX-400-040-M250 Soluble to 25 mg/mL in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit Fluidigm 201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich I7125 Soluble to 74 mg/mL in 0.2 N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent Fluidigm 201103A
Methanol Fisher BP1105-4 Chill at -20 °C before use
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
5 mL round bottom tubes Falcon 352058
5 mL 35 μm filter cap tubes Falcon 352235
EQ four element calibration beads Fluidigm 201078
Hyaluronidase Type I-S Sigma-Aldrich H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C9891
Disposable Scalpel #10 Sigma-Aldrich Z69239

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References

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