Provberedning för Mass Cytometry Analysis

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (122), e54394, doi:10.3791/54394 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Massa utnyttjar cytometry antikroppar konjugerade med tungmetall etiketter, ett tillvägagångssätt som kraftigt har ökat antalet parametrar och möjligheter för djup analys långt utöver vad som är möjligt med konventionell fluorescensbaserad flödescytometri. Som med all ny teknik, det finns kritiska steg som hjälper säkerställa tillförlitlig generering av data av hög kvalitet. Presenteras här är ett optimerat protokoll som innefattar flera tekniker för bearbetning av cellprover för mass cytometri-analys. De metoder som beskrivs här kommer att hjälpa användaren att undvika vanliga fallgropar och uppnå konsekventa resultat genom att minimera variationer, vilket kan leda till felaktiga uppgifter. Att informera experimentell design är logiken bakom valfria eller alternativa steg i protokollet och deras effektivitet i att upptäcka nya rön i biologi systemet utreds omfattas. Slutligen är representativ data som presenteras för att illustrera förväntade resultat från tekniker presented här.

Introduction

Cytometri möjliggör samtidig mätning av multipla antikropps mål på en enda cell nivå över stora populationer av celler. I traditionell fluorescensbaserad flödescytometri, är antalet parametrar som kan kvantifieras begränsas av spektral överlappning mellan emissionsspektrumet av multipla fluoroforer, som kräver alltmer komplexa beräkningar kompensations som antalet parametrar ökar. Dessa begränsningar adresseras av mass cytometri, där tungmetall-konjugerade antikroppar detekteras och kvantifieras genom flygtiden (TOF) masspektrometri för att kraftigt utöka antalet parametrar som samlats samtidigt och ge en hög dimensions protein-överflöd profil för varje individuell cell.

En grundläggande förståelse av arbetet i massan cytometry instrumentet är till nytta för användaren och kan vara avgörande för felsökning. För en mer ingående beskrivning av trimning och kör en massa cytometry maskin,se relaterade manuskriptet 1. Kortfattat är ett cellprov märkt med en panel av metall konjugerade antikroppar riktade mot cellytemarkörer, cytoplasmiska proteiner, nukleära proteiner, kromatin-bundna proteiner eller andra epitoper av intresse (Figur 1 i). De märkta cellerna lastas på maskinen, antingen en i taget genom manuell injektion eller med användning av en automatisk provtagningsanordning som prov från en 96-brunnsplatta. De laddade cellerna injiceras genom en nebulisator, som alstrar en spray av vätskedroppar som inkapslar cellerna (Figur 1ii). Denna spray är positionerad så att cellerna är joniserade genom en argon plasmabrännare. Denna jonisering genererar en partikelmoln som består av alla de ingående atomerna i varje cell (Figur 1iii). Eftersom detta partikelmoln färdas till detektorn, är låga atommassenatomer separeras från de höga massjoner genom en kvadrupol massfilter. De återstående höga massjoner fortsätter till detektorn, där abundANCE av varje isotop kvantifieras (Figur 1iv). Rådata som samlas in av detektorn, analyseras med mjukvaru cytometri instrumentmassa för att identifiera cellhändelser. För varje identifierad cellhändelse, är den signal som detekteras i varje kanal kvantifierades och sparas till en utgång .fcs fil. Mass kanaler som används för detektering av tungmetall konjugerade antikroppar uppvisar minimal spektral överlappning, som sträcker sig från 0-4% med de flesta bidrag under 1%. På grund av denna låga överhörning mellan kanalerna, är det i allmänhet onödigt att omvandla data med en kompensationsmatris före analys 2. Emellertid bör försiktighet iakttas under utformningen av den experimentella panel av antikroppar för att säkerställa att en antikropp med en hög-överflöd epitop inte är tilldelad till en masskanal som bidrar signal till en kanal tilldelad till en låg-överflöd antikropp, eftersom detta kan skapar en artificiellt hög befolknings i kanalmottagningssignalbidraget.

3, 4. Utförande av cellytan antikroppsfärgning på levande celler kan vara nödvändigt för vissa antikroppar, men detta utesluter möjligheten att streckkodning före märkning antikropp såsom de flesta streckkodning metoder utförs efter fixering 5 även om antikroppsbaserad streckkodning 6, 7 är ett undantag.

Vid beräkningen av antalet av celler som skall förberedas för analys är det viktigt att veta att endast en bråkdel av cellerna lastas på maskinen kommer att detekteras och genererar data. Denna förlust beror främst på bristande effektivitet när nebulisatorn sprutar provet vid facklan. Den exakta procent förlust beror på massan cytometry maskininställning och celltyp, men kan sträcka sig från 50-85% och bör varabeaktas vid utformningen av experimentet. Detta protokoll har optimerats för 2x10 6 celler per prov men kan anpassas för bearbetning av mindre eller större provstorlekar. Detta protokoll kan användas med minimala modifieringar för provstorlekar från 1 x 10 6 till 4 x 10 6, men det är kritiskt att provstorleken hållas överensstämmande inom ett experiment. Förändringar i cellantal kan påverka intensiteten av streckkodning och antikroppsfärgning och bör hållas ungefär konsekvent mellan prover som skall jämföras direkt.

Vissa förfaranden, såsom döda celler märkning och DNA märkning ska utföras i de allra flesta, om inte alla experimentell design. Märkning av döda celler i experiment analysera endast ytmarkörer kan uppnås med användning Rh103, men Rh103 bör undvikas för experiment där permeabilisering krävs eftersom det resulterar i färgning förlust. För experiment som involverar permeabilization, är det lämpligt att använda cisplatin

Kodning prover kan minska bränsle antikropp, minskar anskaffningstiden och eliminera prov-till-prov variation 9. Processen för streckkodning innebär att tillämpa en unik provspecifik kod till alla celler, som används för att tilldela varje cell till dess prov av ursprung. Efter streckkodning proverna kan poolas före antikroppsfärgning, en process som säkerställer alla prover är färgade lika. För att minimera experimentella felet, är det klokt att streckkoder och pool alla prover som ska direkt jämföras med varandra. För närvarande finns det flera metoder för streckkodning prover för mass cytometrianalys 5, 6, 7, varav två presenteras här (se nedan).

Med för närvarande tillgänglig reagents är det möjligt att kvantifiera överflödet av 38 mål antikropps, identifiera celler i S-fas 10, särskilja levande och döda celler 8 och mäta cellulära nivåer av hypoxi 11 i ett multiplexerat experiment av multipla prover. Denna förmåga att samla hög parameter enda celldata för stora cellpopulationer möjliggör förbättrad profilering av mycket heterogena cellpopulationer och har redan producerat ett antal nya biologiska insikter 12, 13, 14, 15, 16. Destillation av den resulterande komplexa data till tolkningsbar information har krävt användning av beräkningsalgoritmer inklusive Spänning Tree Progression av Density Normaliserade evenemang (SPADE) 17 och viSNE 18.

I denna artikel presenteras en tillgängligöversikt över hur du utforma och genomföra en massa cytometry experiment och introducerar grundläggande analys av massa cytometry data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellskörd

  1. Skördar celler från primär vävnad
    OBS: Det beskrivna förfarandet för skörd av celler från primär vävnad är specifikt tillämpliga på mus brösttumörvävnad och kan inte tillämpas som det är till primära vävnader från andra källor.
    1. Förbereda digereringsbuffert genom att lösa upp 5 mg hyaluronidas och 30 mg kollagenas i 10 ml DMEM / F12-media per gram vävnad som skall behandlas. Filtrera sterilisera digestionsbuffert.
    2. Isolera primära bröstkörteltumör från mus och spela tumörvikten.
    3. Mala vävnaden med # 10 skalpell i minst 5 min.
    4. Lägga malda vävnaden till lämplig volym av digereringsbuffert (10 ml buffert per gram vävnad).
    5. Skaka malda vävnaden i matsmältningen buffert vid 100 rpm under 1-3 h vid 37 ° C.
    6. Erhålla enda cellsuspension genom att passera cellerna genom 0,4 um filter in i ett 50 ml rör.
    7. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 10 min vid 4 °; C. Dekantera eller försiktigt aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
    8. Återsuspendera pelleten i 4 ml DMEM / F12 och överföring till 5 ml rundbottnad röret.
  2. Skördar celler från vävnadskultur
    1. Tvätta plattan eller flaskan av vidhäftande celler med kalcium- och magnesiumfri fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid rumstemperatur.
      OBS: Den beskrivna tekniken för skörd av celler är specifikt tillämpliga på vidhäftande human embryonal stamcell (hESC) kulturceller. Emellertid, är återstoden av det beskrivna protokollet brett tillämpbar på andra odlade cellinjer, icke vidhäftande linjer och primära celler.
    2. Lägga värmd (37 ° C) trypsin eller annan enzymatisk spjälkning reagens optimerad för att uppnå en enda cellsuspension från de vidhäftande cellerna. Följ tillverkarens protokoll.
      OBS: trypsin och andra enzymatiska dissociation reagens har potential att påverka cellulära markörer.
    3. Inkubera plattan vid 37° C under 2-5 min för att lösgöra cellerna. För höga konfluens kulturer, knacka försiktigt plattan för att hjälpa lossa cellerna.
    4. Överföra fullt lösgjorda celler från plattan in i en 5 ml rundbottnad röret och försiktigt pipettera under användning av en 1 ml pipett för att dissociera cellerna.
      OBS: För behandling av stora antal prover alla steg kan alternativt utföras i en 96 brunnars rundbottnad platta. För bearbetning av prover i ett 96-brunnsformat kan utföras alla tvättar vid en volym av 250 | il. De volymer som beskrivs i andra steg kan justeras så den totala volymen inte överstiger 300 mikroliter.
    5. Släcka den enzymatiska digere reagenset med en lika stor volym tvättbuffert (0,5% BSA och 0,02% natriumazid i PBS).
      OBS! Natriumazid är en farlig kemikalie. Lämpliga försiktighetsåtgärder säkerhetskraven måste uppfyllas för dess framställning och hantering.
    6. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid 37 ° C. Dekantera eller försiktigt aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
    7. Resuspenderaceller i en ml serumfritt medium.
    8. Räkna celler genom att överföra 10 | il av cellsuspensionen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Späd alikvot till ett känt förhållande i trypanblått och överföring till en hemocytometer eller automatiserad cellräkningssystem.
  3. Märkning av S-fas populationen
    OBS: Om S-fas märkning är inte utföras fortsätter att hejda 1,4.
    1. Förbereda en ml 10 | iM 5-jod-2'-deoxiuridin (IdU) i serumfritt DMEM F12 eller annan lämplig media för varje 2 x 10 6 celler som skall analyseras.
    2. Lägga 500 mikroliter av 10 pM IdU i serumfritt medium för varje 2 x 10 6 celler.
      OBS: Medan IdU märkning kan utföras i media innehållande serum, kommer fritt protein reagera med cisplatin, förhindrar korrekt märkning av döda celler. Om media innehållande serum används under IdU märkning av en ytterligare tvättsteg är serumfria medier är nödvändigt att avlägsna serumproteiner före cisplatin Live / Dead staining.
    3. Försiktigt resuspendera pellets med en ml pipett.
    4. Inkubera i 10 min vid 37 ° C med försiktig skakning.
  4. Live / Dead märkning
    1. För varje prov förbereda 500 mikroliter av 50 | iM cisplatin i serumfritt DMEM-F12 eller celltyp rätt material.
      OBS: Om märkningen av S-fasen populationen genom IdU inte skall utföras, återsuspendera prover vid en koncentration av 4 x 10 6 celler / ml. Återsuspendering av cellerna före tillsats cisplatin möjliggör snabbare blandning av lösningar för enhetlig Live / Dead märkning.
    2. Tillsätt 500 | il av 50 | iM cisplatin per 2 x 10 6 celler till prover.
    3. Inkubera vid rumstemperatur (RT) under 1 min på en orbital skakanordning med konstant blandning.
    4. Släcka cisplatin med en lika stor volym av tvättbuffert.
    5. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid RT. Dekantera eller försiktigt aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
    6. Tvätta prover två gångermed 500 mikroliter tvättbuffert för att avlägsna överskott cisplatin.
    7. Tvätta prov två gånger med 500 | il PBS för att avlägsna överskott av protein.
  5. prov fixering
    1. Återsuspendera provet i 500 | il PBS.
    2. Lägga lika stor volym av 4% PFA i PBS under en slutkoncentration av 2%; pipett för att blanda.
      OBS: Förbered 4% PFA färskt från pulver, justera pH till 6,9 och passera genom en 0,44 um filter. 4% PFA i PBS kan lagras vid 4 ° C i upp till två veckor. Undvika färdiga formalin levereras i ampuller, då en särskild testad, eftersom det ofta innehåller metallföroreningar, som kan interferera med de uppmätta masskanalerna. Lägre koncentration av PFA kan vara tillräckliga och hjälper till att minimera effekten av fixeringen vid antikroppbindning men bör testas empiriskt.
    3. Inkubera i 15 min vid RT på en orbital skakanordning med konstant blandning.
    4. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera eller försiktigt aspirera supernatanten without störa pelleten.
    5. Tvätta prover med PBS för att avlägsna PFA lösning.
      OBS: I detta steg kan lagras prover kortvarigt vid 4 ° C. Långvarig lagring vid 4 ° C kan resultera i nedbrytning av provet och minskad nedfläckning.

2. Kodning

OBS: Även om metoden för att utnyttja monoisotopisk cisplatin barcoding och palladium barcoding presenteras samtidigt kan antingen användas oberoende eller undvikas helt om inte krävs enligt experimentet.

  1. Monoisotopisk Cisplatin Barcoding
    OBS: Eftersom cisplatin barcoding och cisplatin Live / Dead färgning lita på överlappande kanaler försiktighet bör vidtas för att säkerställa att bakgrunds cisplatin Live / Dead färgning i levande celler minimeras eftersom detta kan störa noggrannheten hos cisplatin streckkod.
    1. Späd 1 mM monoisotopisk cisplatin stamlösningar till 200 uM i PBS.
    2. för each unik cisplatin streckkod bereda en 1,5 ml rör med 500 | al PBS under vardera 2 x 10 6 celler som mottar den streckkod.
    3. Att framställa varje unik streckkod lägga varje tillämplig monoisotopisk cisplatin till en slutlig koncentration av 200 nM.
    4. Resuspendera cellerna i 500 | il av PBS per 2 x 10 6 celler.
    5. Lägga till en lika stor volym av den motsvarande streckkod lösning till varje prov.
    6. Inkubera proverna vid RT under 5 min på en orbital skakanordning med konstant blandning.
    7. Släck cisplatin med en lika stor volym av tvättbuffert.
    8. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera eller försiktigt aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
    9. Tvätta prov två gånger med 500 | il tvättbuffert för att avlägsna överskott cisplatin.
  2. palladium Barcoding
    OBS: Palladium streckkodning reagens kan vara antingen beredda 5 eller köpas kommersiellt.
    1. transient partiellpermeabilisering 19
      OBS: Palladium kelering streckkodning kräver partiell permeabilisering för reagensen att passera genom cellmembranet och robust märka cellen.
      1. Tvätta prov med 500 mikroliter PBS.
      2. Tvätta prov med 500 | il PBS plus 0,02% saponin.
      3. Återsuspendera pelleten i restvolym.
    2. Applicera palladium streckkodning.
      1. Späd 100x lager av palladium streckkodning reagens i en ml iskall PBS plus 0,02% saponin.
      2. Snabbt lägga utspädd streckkodning reagens till återsuspenderade provet.
      3. Inkubera i 15 min vid RT på en orbital skakanordning vid med konstant blandning.
      4. Tvätta prov två gånger med 500 | il tvättbuffert.

3. Cell Surface Färgning

OBS: Cell yta färgning kan utföras på levande celler före fixering. Detta kan vara nödvändigt för antikroppar som förlorar affinitet för their-epitop efter fixering. Vissa cellprover kan dra nytta av ytterligare blockering, såsom Fc-blockering för leukocyter, före märkning antikropp för att minska bakgrunden. Optimal blockering bör bestämmas empiriskt för specifik provtyp.

  1. Förbereda cellyte antikroppsfärgning panel.
    1. Kombinera 0,5 ul, eller empiriskt bestämd kvantitet, för varje 0,5 mg / ml cellyte antikropp per prov i en 1,5 ml rör. Lägg tvättbuffert vid behov för att få volym upp till 10 mikroliter per prov. Blanda genom pipettering.
      OBS: Bestäm arbetsutspädning för varje antikropp före experimentet empiriskt genom titrering experiment.
    2. Split cellyte antikroppspool lika i ett 1,5 ml rör för varje prov som skall färgas.
    3. Förbereda 500 pl tvättbuffert i en 1,5 ml rör för varje prov.
  2. Applicera cellytan färgning för att prover normaliserad volym för samtliga prover.
    OBS: För att ENSure märkning konsekvent antikropp över flera prover är det viktigt att noggrant reglera provvolymen och antikroppskoncentrationen. Följande steg syftar till att uppnå denna enhetlighet genom att säkerställa att de slutliga provvolymer efter att antikroppen har tillsatts är enhetliga.
    1. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera eller försiktigt aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
    2. Med en 200 mikroliter pipett uppsättning till 50 ul, ta bort återstående lösningen från prov-pelleten och överför till ett rör enligt alikvoteras cellyte antikroppspoolen.
    3. Pipettera upp all vätska i den alikvot röret utan att dra in luft i pipettspetsen.
    4. Medan du håller pipetten kolven för att undvika att dra luft förflytta spetsen i en förberedd rör av 500 mikroliter tvättbuffert och släpp kolven.
    5. Lägg tillbaka innehållet i pipettspetsen till provet och resuspendera provet i vätskan med försiktig pipettering.
    6. Inkubera proverna för enh vid RT på en orbital skakanordning med konstant blandning.
    7. Tvätta prov två gånger med 500 | il tvättbuffert för att säkerställa att alla fria antikropp tvättas bort.
    8. Tvätta prov med 500 mikroliter PBS.
    9. Resuspendera cellpelleten i 500 | il PBS.
    10. Lägga lika stor volym av 4% PFA i PBS; pipett för att blanda.
    11. Inkubera i 10 minuter på en orbital skakanordning.

4. Cell Permeabilization och intracellulär färgning

  1. cell permeabilization
    1. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera eller försiktigt aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
    2. Resuspendera cellerna i restvolym genom att försiktigt vortexa tills pelleten dissocieras.
      OBS: Underlåtenhet att dissociera cellerna före tillsats av MeOH kommer att resultera i celler som vidhäftar ihop och framställning av en tunn film, som kommer att resultera i partiell provförlust.
    3. Omedelbart lägga en ml 100% MeOH per 2 x 10 6 </ Sup> celler och försiktigt pipett för att blanda.
      OBS: Andra permeabilization metoder kan användas istället för MeOH och kan vara nödvändigt för att uppnå optimal permeabilization för vissa celltyper. För vissa cellkällor en 0,1% Triton X-100, kan 0,2% Tween-20 eller 0,1% saponin i PBS-lösning för permeabilisering upprätthålla cellintegritet bättre samtidigt som det ger konsekvent permeabilization.
    4. Inkubera prover för åtminstone ett h eller upp till maximalt 24 timmar vid 4 ° C under permeabilization.
      OBS: I detta steg prover i MeOH kan förvaras i upp till en månad vid -80 ° C.
    5. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera eller försiktigt aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
    6. Tillsätt 1 ml tvättbuffert för varje ml MeOH som används för att permeabilisera provet. Försiktigt resuspendera cellpelleten.
    7. Tvätta provet två gånger med 500 | il tvättbuffert.
  2. Förbereda intracellulär antikroppsfärgning panel.
    1. Kombinera 0,5 ul, eller empiriskt bestämd kvantitet, för varje 0,5 mg / ml intracellulär antikropp per prov i en 1,5 ml rör. Lägg tvättbuffert vid behov för att få volym upp till 10 mikroliter per prov. Blanda genom pipettering.
    2. Split intracellulär antikropp poolen lika i ett 1,5 ml rör för varje prov.
    3. Förbereda 500 mikroliter tvättbuffert i en 1,5 ml rör för varje prov.
  3. Applicera intracellulär färgning för prover normaliserad volym för samtliga prover.
    OBS: För att säkerställa en enhetlig märkning antikropp över flera prover är det viktigt att noggrant kontrollera provvolymen och antikroppskoncentrationen.
    1. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera eller försiktigt aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
    2. Med 200 mikroliter pipett satt till 50 ^ ta bort kvarvarande lösningen från prov-pelleten och överför till ett rör enligt alikvoteras cellyte antikroppspoolen.
    3. Pipettupp all vätska i den alikvot röret utan att dra in luft i pipettspetsen.
    4. Medan du håller pipetten kolven för att undvika att dra luft förflytta spetsen i en förberedd rör av 500 mikroliter tvättbuffert och släpp kolven, dra upp tvättbuffert för en total provvolym av 50 | il.
    5. Lägg tillbaka innehållet i pipettspetsen till provet och resuspendera provet i vätskan med försiktig pipettering.
    6. Inkubera proverna för en timme vid RT på en orbital skakanordning med konstant blandning.
    7. Tvätta prov två gånger med 500 | il tvättbuffert.
    8. Tvätta prov med 500 mikroliter PBS.

5. Iridium Märkning

  1. Fix prover
    1. Resuspendera prover i 500 pl PBS.
    2. Tillsätt 500 pl av 4% PFA i PBS.
    3. Inkubera under ett minimum av 15 min vid RT på en orbital skakanordning med konstant blandning.
  2. Tillämpa Iridium märkning av DNA
    1. Tillsätt 500 mikroliter 62,5 nM iridium PFA lösning till prover.
      OBS: För experiment med användning av permeabiliserade celler, späd 500x Ir191 / 193 lager för en slutlig spädning av 1: 2000 för att undvika overstaining.
    2. Inkubera i 15 min vid RT på en orbital skakanordning med konstant blandning.
      OBS: Om du utför monoisotopisk cisplatin barcoding inte inkubera prover med iridium längre än 15 minuter eftersom starka Ir193 signaler kan bidra till Pt194 masskanalen och slag barcoding kvalitet negativt.
    3. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera eller försiktigt aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
    4. Tvätta prov två gånger med 500 | il 0,1% BSA i filtrerat avjoniserat vatten.
      OBS: Efter beredning vi rekommenderar att du kör prover inom 24 timmar om det är möjligt. Framställda proverna kan lagras på kort sikt vid 4 ° C,men försiktighet bör vidtas för att undvika nedbrytning. Om möjligt de slutliga tvättar bör utföras i filtrerat avjoniserat vatten utan BSA, eftersom detta kommer att minska avsättningen på spraykammaren och sampler koner av maskinen som kommer att minska instrumentets rengöring. För hESCs är det nödvändigt att utföra dessa tvättar medan inklusive BSA för att undvika provförlust från att fastna vid rörets yta.

6. Bered Prover för Acquisition

  1. räkna celler
    1. Resuspendera cellerna i 500 mikroliter 0,1% BSA i filtrerat avjoniserat vatten och filtrera till ett nytt rör genom ett 35 | im cellfilter cap.
      OBS: Sänka BSA nivån för de slutliga tvättar minskar rester kvar på Mass cytometry nebulisator. Icke vidhäftande celler kan tvättas och återsuspenderas i filtrerat avjoniserat vatten.
    2. Räkna celler genom att överföra 10 | il av cellsuspensionen till ett mikrocentrifugrör. Späd alikvot till ett känt förhållande itrypanblått (för att hjälpa till med cell visualisering) och överför till en hemocytometer eller automatiserad cellräkningssystem.
    3. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera eller försiktigt aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
  2. Förbereda och belastningsprover
    1. För att framställa kalibreringspärlorna bort från kylskåpet och skaka kraftigt för att resuspendera.
    2. Om kör prover med användning av en mass cytometry autosampler, tillsätt 50 | il av kalibreringspärlor till varje brunn i provplattan sedan lägga det önskade antalet celler som skall analyseras. Om kör prover genom manuell injektion lägga 50 mikroliter av kalibreringspärlor till provet, späda prov i filtrerat avjoniserat vatten, blanda väl och belastning provet i Mass cytometry provinjektionsporten. Den lämpliga provspädning kan variera beroende på den celltyp som analyseras, men en utspädning av 10 6 är i allmänhet lämpligt 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det protokoll som presenteras här kan tillämpas i stora drag till en bred variation av odlade och primära cellprover med endast mindre modifieringar. Beroende på kraven av försöket, kan den utföras på ett modulärt sätt när vissa element, såsom streckkodning eller cellytan färgning, inte är nödvändiga. Utnyttjas i sin helhet detta protokoll möjliggör framställning av multiplexerade massa cytometri prover märkta för död cell utslagning, S-fas populationen identifiering och färgades för kvantifiering av upp till 38 mål antikropps.

Förväntade resultat som produceras av de metoder som anges i detta protokoll (Figur 2) är avbildade i Figur 3. Vid insamling av data, kan utföras normalisering av signalintensitet baserat på kalibrerings vulsten intensiteten inom mass cytometry programvara. Efter normalisering, initiala data förfassing att avlägsna kalibreringspärlor, gate på enskilda celler och avlägsna döda celler kan utföras manuellt med användning av någon programvara med förmåga att analysera flödescytometri data. Avlägsnande av kalibreringspärlorna kan utföras manuellt genom gating på Ir191 + Ce140- populationen (figur 3A) eller med ett MATLAB baserad algoritm 20. Encelliga händelser (svart disposition, figur 3B) kan grindas under avlägsnande skräp och cell multipletter, genom gating på den biaxiella tomt på Ir193 och Event Längd (figur 3B). Cisplatin märkning av döda celler kan användas för att kvantifiera mängden av celldöd; visas är exempel på prov med låg (Figur 3D) och högre (figur 3E) kvantiteter av döda celler. Döda celler kan tas bort från data genom att koppla bort den Pt198 + populationen (figur 3E). Streckkodning av prover, om med monoisotopiska cisplatin eller palladiumreagens, resulterar i distinkt separation av samples inom streckkodning parametrar (fig 3C), som tillåter celler att tilldelas till deras ursprungliga providentitet. Ytterligare valfria metoder, såsom IdU märkning, medger detektion av specifika populationer, t ex S-fasceller (figur 3F). Efter initial normalisering, debarcoding och grindning, kan de höga dimensions data analyseras med användning av en mängd olika algoritmer inklusive SPADE 17 och flera andra är utformade för mass cytometri dataanalys och visualisering 18. Algoritmer såsom SPADE ta de höga dimensionsdata, som kan vara svåra att tolka eftersom den inte direkt kan visualiseras i sitt hög dimensions tillstånd, och generera en lägre dimensionell representation av data, som är mer mottagliga för visuell tolkning (figur 3G).

Figur 1 Figur 1: Grundläggande principer för massa cytometry mätningen. Beredning av cellprover för mass cytometri analys innefattar färgande celler med antikroppar märkta med metallisotoper mestadels från lantanidserien av grundämnen. I detta schema varje antikropp alstrad mot en specifik epitop är märkt med en isotop som har en unik atommassa, såsom Samarium 154. Antikroppar mot epitoper som är yta, cytoplasmatiska, nukleär eller kromatin lokaliserad kan potentiellt användas. Märkta celler injiceras och sprutas genom massan cytometry nebulisatorn som enda cell droppar där de joniserade genom en argon plasmabrännare. Den resulterande partikelmoln strippas av låg massa atomer med en kvadrupol massfilter medan överflödet av större atommassjoner mäts av detektorn. Den uppmätta mängden av varje unik massjon motsvarar den cellulära överflöd av dess associerade antikropps målepitop. Medan en teoretisk limit av över 100 parametrar kunde kvantifieras med användning av denna metodik, de nuvarande kommersiellt tillgängliga reagens tillåta detektion av över 40 parametrar per cell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Workflow diagram av försöksförfarande och valfria steg. Skildring av de stora steg som ingår i det protokoll som förbereder celler för mass cytometri. Valfria steg indikeras av apelsinlådor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 3
figur 3: Exempel på data som genereras från m ass cytometry analys. (A) Biaxiell diagram som visar separationen av celler (hög Ir191, låg Ce140), pärlor (låg Ir191, hög Ce140) och kulor och celler dubletter (högt Ir191, hög Ce140). (B) Biaxial diagram som visar förväntade utseendet hos Ir193 vs Händelse längd. Grindning av enskilda celler som avlägsnar cellulär debris och cell multipletter visas. (C) Biaxial diagram som visar exempel vy av två mass kanaler från cisplatin streckkodning. (D - E) Exempel data från cisplatin Live / Dead färgning för prover med en låg andel (D) och en hög procentandel (E) av döda celler. (F) Biaxial plot av H9 hESC celler märkta med IdU att särskilja celler i S-fas och en antikropp mot cyklin B1 för att ytterligare särskilja cellcykeln. (G Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det protokoll som presenteras här har med framgång använts för behandling av olika odlade cellinjer (H1 och H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10a) och primära vävnadsprover (musbenmärg, mus embryonala levern, mus vuxna lever, mustumör). Oberoende av källan, vilken vävnad som helst som kan dissocieras till enstaka celler och samtidigt bevara den cellulära tillstånd bör vara tillgängliga för analys av mass cytometri, men kan kräva viss protokolloptimering. Det är viktigt att notera att vissa epitoper kan påverkas av de specifika dissociation, fixering och permeabilisering behandlingar utnyttjas och dessa metoder kan behöva genomgå prov specifik optimering. Om låg signal observeras för en antikropp kan det vara möjligt att förbättra genom att utföra cellytan märkning på levande celler, ändra permeabilization metoder, eller minskande fixeringstiden.

När det är möjligt inom experimentell design, inklusive streckkodning i the provbearbetning arbetsflöde säkerställer överensstämmelse mellan prover på nivån för cellen och antikroppskoncentrationen. Utan barcoding även när stor omsorg tas för att kontrollera provbearbetning, är det troligt att små variationer i antikroppskoncentration och cellkoncentrationen kommer att införas mellan proven. Vidare, såsom de procenttal av celler positiva för specifika epitoper kommer sannolikt att variera mellan prover, den effektiva antikropp-till-epitop förhållandet kan nödvändigtvis skilja mellan prover, även om den totala antikroppskoncentrationen hålls konsekvent, vilket kan leda till inkonsekvenser i antikroppsfärgning. Dessa variationer, som i allmänhet är mindre när observera en enda kanal, kan bli kraftigt förvärras när utförande av en hög-parameter experimentet och kan misstolkas som biologiskt meningsfulla om man inte är försiktig under dataanalys.

Analys av de resulterande data från en mass cytometry experiment kan ta många former, och ett antal computationella metoder har anpassats specifikt för denna applikation. Samtidigt som en uttömmande undersökning av användbara algoritmer för mass cytometry dataanalys är utanför ramen för detta manuskript är metoder som har framgångsrikt använts fram och intresserade läsare riktas till flera resurser som täcker detta ämne 21, 22, 23. Två av de mest används, för närvarande tillgängliga metoder för analys av mass cytometry data Spanning Tree Progression densitet normalisera Events (SPADE) och viSNE. SPADE bildar kluster från grupper av celler med liknande markör uttryck och representerar varje kluster som en nod. Dessa noder är anordnade i en SPADE träd där liknande noder är förbundna genom en ledning (figur 3G). viSNE utnyttjar t-Distributed Stochastic Neighbor inbäddning algoritmen 24 för att generera en tvådimensionell representation avdata höga dimensions samtidigt som den totala datastruktur. Både spade och viSNE är skrivna i MATLAB, är källkoden fritt tillgängliga och kan köras av användare med MATLAB. Dessutom är en fristående version av SPADE tillgängliga.

Medan mass cytometry tillåter närvarande samling det högsta antalet parametrar kan fluorescerande tag baserad cytometry vara en bättre strategi för vissa tillämpningar. Fluorescens flödescytometri kan analysera fler celler per sekund, upp till 5 x 10 4 jämfört med 500-1000 för mass cytometri, och har mer tillgänglig validerade antikroppar 25. Ytterligare framsteg inom fluorescens flödescytometri, såsom hyperspektral cytometry 26 och nya fluoroforer 27 make fluorescens flödescytometri ett lönsamt alternativ för alla utom mycket höga parameterexperiment. Ytterligare tekniker såsom mätning av RNA 28 tidigare endast möjligtgenom fluorescensbaserad flödescytometri har nyligen anpassats till massa cytometri tillåter samtidig detektering av protein och RNA 29. Framtida utvidgning av tillgängliga isotoper och reagens för att mer fullständigt utnyttja den massfönster av mätbara isotoperna och utöka repertoaren av mätbara cellulära egenskaper kommer att expandera djupet av profilering möjlig genom mass cytometri.

Det stora antal parametrar som kan analyseras samtidigt genom mass cytometri utökar de experimentella frågor som kan undersökas. Vi hoppas att den här artikeln och tillhörande video-protokollet gör det möjligt för intresserade forskare att mer effektivt utnyttja massa cytometry att öka sin forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 medium kit Stem Cell technologies 05850 Warm at room temperature before use
DMEM F-12 ThermoFisher 11330-032 Warm at 37 °C before use
Accutase Stem Cell technologies 07920 Warm at 37 °C before use
Bovine serum albumin Equitech BAH62
phosphate buffered saline Hyclone SH30256.01
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Cell ID Pt194 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt195 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt196 Fluidigm Provided at 1 mM
Cisplatin Enzo Life Sciences ALX-400-040-M250 Soluble to 25 mg/mL in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit Fluidigm 201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich I7125 Soluble to 74 mg/mL in 0.2 N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent Fluidigm 201103A
Methanol Fisher BP1105-4 Chill at -20 °C before use
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
5 mL round bottom tubes Falcon 352058
5 mL 35 μm filter cap tubes Falcon 352235
EQ four element calibration beads Fluidigm 201078
Hyaluronidase Type I-S Sigma-Aldrich H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C9891
Disposable Scalpel #10 Sigma-Aldrich Z69239

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. e4398 (2012).
  2. Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
  3. Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
  4. Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
  5. Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
  6. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
  7. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
  8. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
  9. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
  10. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
  11. Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
  12. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  13. Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).
  14. Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
  15. Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
  16. Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
  17. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
  18. Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
  19. Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
  20. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
  21. Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
  22. Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
  23. Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
  24. van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
  25. Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
  26. Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
  27. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
  28. Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
  29. Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics