Préparation d'échantillons pour l'analyse de masse Cytométrie

Biology

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McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (122), e54394, doi:10.3791/54394 (2017).

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Abstract

Masse utilise cytométrie anticorps conjugués avec des étiquettes de métaux lourds, une approche qui a considérablement augmenté le nombre de paramètres et les possibilités d'une analyse approfondie bien au-delà de ce qui est possible avec la cytométrie de flux par fluorescence conventionnelle. Comme pour toute nouvelle technologie, il y a des étapes essentielles qui contribuent à assurer la production fiable de données de haute qualité. Présenté ici est un protocole optimisé qui intègre plusieurs techniques pour le traitement des échantillons de cellules pour l'analyse de cytométrie de masse. Les méthodes décrites ici aideront l'utilisateur à éviter les pièges courants et obtenir des résultats cohérents en réduisant au minimum la variabilité, qui peut conduire à des données inexactes. Pour éclairer la conception expérimentale, la raison d'être des étapes facultatives ou alternatives dans le protocole et leur efficacité dans la découverte de nouvelles découvertes dans la biologie du système étudié est couvert. Enfin, des données représentatives sont présentées pour illustrer les résultats attendus des techniques presented ici.

Introduction

Cytometry permet la mesure simultanée de plusieurs cibles d'anticorps au niveau de la cellule unique sur de grandes populations de cellules. En cytométrie de flux à base de fluorescence classique, le nombre de paramètres qui peuvent être quantifiés est limitée par le chevauchement spectral entre le spectre d'émission de multiples fluorophores, ce qui nécessite des calculs de compensation de plus en plus complexes comme le nombre d'augmentations de paramètres. Ces limitations sont traitées par cytométrie de masse, où les anticorps conjugués à métaux lourds sont détectés et quantifiés par le temps de la spectrométrie de masse de vol (TOF) d'élargir considérablement le nombre de paramètres collectés en même temps et donner un profil de protéines d'abondance dimensionnelle élevée pour chaque cellule individuelle.

Une compréhension de base du fonctionnement de l'instrument de cytométrie de masse est bénéfique pour l'utilisateur et peut être essentielle pour le dépannage. Pour une description plus complète de mise au point et l'exécution d'une machine à cytométrie de masse,voir le manuscrit lié 1. En bref, un échantillon de cellules est marqué avec un panel d'anticorps conjugués métalliques ciblant des marqueurs de surface cellulaire, des protéines cytoplasmiques, des protéines nucléaires, des protéines de la chromatine lié ou d' autres epitopes d'intérêt (figure 1i). Les cellules marquées sont chargés sur la machine, soit un à la fois par injection manuelle ou en utilisant un passeur d'échantillons que les échantillons à partir d'une plaque à 96 puits. Les cellules chargées sont injectés par l' intermédiaire d' un nébuliseur, qui génère une pulvérisation de gouttelettes de liquide d' encapsulation des cellules (Figure 1ii). Cette pulvérisation est positionnée de telle sorte que les cellules sont ionisés par une torche à plasma d'argon. Cette ionisation génère un nuage de particules comprenant tous les atomes constitutifs de chaque cellule (Figure 1iii). Comme ce nuage de particules se déplace vers le détecteur, les atomes de faible masse atomique sont séparés des ions de masse élevée par un filtre de masse quadripolaire. Les hauts ions de masse restants continuent au détecteur, où le abundance de chaque isotope est quantifiée (Figure 1IV). Les données brutes recueillies par le détecteur, sont analysés par le logiciel d'instruments de cytométrie de masse pour identifier les événements cellulaires. Pour chaque événement de cellule identifiée, le signal détecté dans chaque canal est quantifié et enregistré dans le fichier de sortie. Les canaux de masse utilisés pour détecter les anticorps conjugués métal lourd présentent un recouvrement spectral minimal, qui varie de 0,4% avec la plupart des contributions inférieures à 1%. En raison de ce faible diaphonie entre les canaux, il est généralement nécessaire de transformer les données avec une matrice de compensation avant l' analyse 2. Cependant, il faut prendre soin lors de la conception du panneau expérimental d'anticorps pour assurer qu'un anticorps avec un épitope de haute abondance n'est pas affecté à un canal de masse qui contribue signal à un canal attribué à un anticorps à faible abondance, car cela pourrait créer une population artificiellement élevé dans le canal de réception de la contribution du signal.

3, 4. Exécution d'une coloration d'anticorps de surface cellulaire sur des cellules vivantes peut être nécessaire pour certains anticorps, mais cela exclut la possibilité de barcoding avant le marquage de l' anticorps comme la plupart des méthodes de codes - barres sont effectuées après fixation 5 , bien que le code à barres à base d' anticorps 6, 7 est une exception.

Lors de la détermination du nombre de cellules devant être préparé pour l'analyse, il est important de savoir que seule une fraction des cellules chargées sur la machine sera détecté et produire des données. Cette perte est principalement due à l'inefficacité lorsque le nébulisateur pulvérise l'échantillon à la torche. La perte exacte pour cent dépend de la masse configuration de la machine cytométrie et le type cellulaire, mais peut varier 50-85% et devrait êtreconsidéré lors de la conception de l'expérience. Ce protocole a été optimisé pour 2x10 6 cellules par échantillon , mais peut être adapté pour le traitement des petites ou plus grandes tailles d'échantillon. Ce protocole peut être utilisé avec des modifications minimes pour la taille des échantillons de 1 x 10 6 4 x 10 6, mais il est essentiel que la taille de l' échantillon soit maintenu au sein d' une expérience cohérente. Les modifications du nombre de cellules peuvent affecter l'intensité de la coloration des anticorps et Code à barres et doivent être conservés à peu près cohérente à travers à être directement comparés échantillons.

Certaines procédures, telles que l'étiquetage des cellules mortes et l'étiquetage de l'ADN, doivent être effectuées dans la grande majorité, sinon tous les modèles expérimentaux. Le marquage des cellules mortes dans des expériences analysant uniquement les marqueurs de surface peut être réalisée à l'aide Rh103, mais Rh103 doit être évitée pour des expériences où perméabilisation est nécessaire, car il entraîne une perte de coloration. Pour les expériences impliquant perméabilisation, il est conseillé d'utiliser le cisplatine

Code - barres échantillons peuvent réduire la consommation d'anticorps, diminuer le temps d'acquisition et d' éliminer la variabilité échantillon à échantillon 9. Le procédé de codage à barres consiste à appliquer un code unique spécifique à l'échantillon à toutes les cellules, ce qui permet d'affecter chaque cellule à son échantillon d'origine. Après barcoding les échantillons peuvent être mis en commun avant la coloration d'anticorps, un processus qui assure que tous les échantillons sont colorés de manière égale. Pour minimiser l'erreur expérimentale, il est prudent de code à barres et des échantillons piscine qui doivent être directement comparés les uns aux autres. À l' heure actuelle , il existe plusieurs méthodes pour les échantillons barcoding pour l' analyse de cytométrie de masse 5, 6, 7, dont deux sont présentées ici (voir ci - dessous).

Avec Reagen actuellement disponiblets , il est possible de quantifier l'abondance de 38 cibles d'anticorps, identifier des cellules en phase S 10, distinguer les cellules vivantes et mortes 8 et de mesurer les niveaux cellulaires de 11 l' hypoxie dans une expérience multiplexé d'échantillons multiples. Cette capacité à recueillir des données sur une seule cellule de haute paramètres pour les grandes populations de cellules permet une amélioration du profil des populations de cellules très hétérogènes et a déjà produit un certain nombre de nouvelles connaissances biologiques 12, 13, 14, 15, 16. Les données complexes distillant résultant des informations interprétable a nécessité l'utilisation d'algorithmes de calcul , y compris Spanning Tree Progression de la densité des événements Normalisé (SPADE) 17 et 18 Visne.

Cet article présente un accèsaperçu de la façon de concevoir et de réaliser une masse cytométrie expérience et présente une analyse de base de données de cytométrie de masse.

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Protocol

1. Récolte de cellules

  1. Récolte des cellules provenant d'un tissu primaire
    NOTE: Le procédé décrit pour la récolte de cellules à partir du tissu primaire est spécifiquement applicable aux tissus de tumeur du sein de la souris et peut ne pas être applicable est de tissus primaires provenant d'autres sources.
    1. Préparer le tampon de digestion en dissolvant 5 mg de hyaluronidase et 30 mg de collagénase dans 10 ml de milieu DMEM / F12 par gramme de tissu à traiter. Filtre à stériliser le tampon de digestion.
    2. Isoler tumeur mammaire primaire à partir de la glande poids tumeur de souris et d'enregistrement.
    3. Hacher le tissu avec un scalpel n ° 10 pendant au moins 5 min.
    4. Ajouter tissu haché à un volume approprié de tampon de digestion (10 mL de tampon par gramme de tissu).
    5. Agiter tissu haché dans un tampon de digestion à 100 tpm pendant 1-3 h à 37 ° C.
    6. Obtenir une suspension de cellules isolées par des cellules passant à travers le filtre de 0,4 pm dans un tube de 50 ml.
    7. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C; C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    8. Resuspendre le culot dans 4 ml de DMEM / F12 et le transfert de 5 mL de tube à fond rond.
  2. Récolte des cellules de culture de tissus
    1. Laver la plaque ou le flacon de cellules adhérentes avec une solution saline tamponnée au phosphate de magnésium et de calcium libre (PBS) à température ambiante.
      NOTE: La technique décrite pour les cellules de récolte est spécifiquement applicable aux adhérentes les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) cellules de culture. Cependant, le reste du protocole décrit est largement applicable à d'autres lignées cellulaires cultivées, les lignes non-adhérentes et des cellules primaires.
    2. Ajouter réchauffé (37 ° C) de la trypsine ou d'un autre réactif de digestion enzymatique optimisée pour obtenir une suspension de cellules isolées à partir des cellules adhérentes. Suivez le protocole du fabricant.
      REMARQUE: trypsine et d'autres réactifs de dissociation enzymatiques ont le potentiel d'affecter des marqueurs cellulaires.
    3. Incuber la plaque à 37° C pendant 2-5 min pour détacher les cellules. Pour les hautes cultures de confluence, tapotez doucement la plaque pour aider à détacher les cellules.
    4. Transfert des cellules entièrement détachées de la plaque dans un tube à fond rond de 5 mL et pipeter doucement à l'aide d'une pipette de 1 ml pour dissocier les cellules.
      REMARQUE: Pour traiter un grand nombre d'échantillons toutes les étapes peuvent également être effectuées dans une plaque à 96 puits à fond rond. Pour les échantillons de traitement dans un format à 96 puits tous les lavages peuvent être effectués à un volume de 250 pi. Les volumes décrits dans d'autres étapes peuvent être réglées de sorte que le volume total ne dépasse pas 300 pi.
    5. Stopper le réactif de digestion enzymatique avec un tampon de lavage à volume égal (0,5% de BSA et 0,02% d'azoture de sodium dans du PBS).
      NOTE: L'azoture de sodium est un produit chimique dangereux. doivent respecter les précautions de sécurité pour sa préparation et la manipulation.
    6. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 37 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    7. Resuspendreles cellules dans 1 ml de milieu sans sérum.
    8. Compter les cellules en transférant 10 ul de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Diluer aliquote à un rapport connu dans le bleu trypan et un hémocytomètre de transfert ou d'un système de comptage de cellules automatisé.
  3. L' étiquetage de la population en phase S
    REMARQUE: Si l'étiquetage de la phase S ne doit pas être effectué de procéder à la tige 1.4.
    1. Préparer 1 ml de 10 pM de 5-iodo-2'-désoxyuridine (IDU) en F12 de DMEM exempt de sérum ou d'un autre support approprié pour chaque 2 x 10 6 cellules à analyser.
    2. Ajouter 500 ul de 10 uM IdU dans un milieu exempt de sérum pour chaque 2 x 10 6 cellules.
      REMARQUE: Bien que l'étiquetage IdU peut être réalisée dans des milieux contenant du sérum, protéine libre réagira avec le cisplatine, ce qui empêche l'étiquetage approprié des cellules mortes. Si un milieu contenant du sérum est utilisé lors de l'étiquettage IdU une étape de lavage supplémentaire est un média sans sérum est nécessaire pour éliminer les protéines sériques avant le cisplatine vivants / morts staining.
    3. Resuspendre doucement granulés avec 1 ml Pipet.
    4. Incuber pendant 10 min à 37 ° C avec agitation légère.
  4. Étiquetage direct / Dead
    1. Pour chaque échantillon, préparer 500 pi de 50 pM de cisplatine dans du DMEM-F12 sans sérum ou du type cellulaire support approprié.
      REMARQUE: si l' étiquetage de la population en phase S par IdU ne doit pas être effectué, des échantillons de remettre en suspension à une concentration de 4 x 10 6 cellules / ml. Les cellules remise en suspension avant d'ajouter cisplatine permet un mélange plus rapide des solutions pour l'étiquetage uniforme vivants / morts.
    2. Ajouter 500 ul de 50 uM de cisplatine par 2 x 10 6 cellules pour des échantillons.
    3. Incuber à température ambiante (TA) pendant 1 min sur un agitateur orbital avec mélange constant.
    4. Stopper la cisplatine avec un volume égal de tampon de lavage.
    5. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à température ambiante. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    6. Laver deux fois les échantillonsavec 500 ul de tampon de lavage pour éliminer l'excès de cisplatine.
    7. échantillons laver deux fois avec 500 ul de PBS pour éliminer les protéines en excès.
  5. fixation échantillon
    1. Extrait Remettre en suspension dans 500 ul de PBS.
    2. Ajouter un volume égal de 4% de PFA dans du PBS pour une concentration finale de 2%; pipette pour mélanger.
      NOTE: Préparer 4% PFA frais à partir de poudre, ajuster le pH à 6,9 et passer à travers un filtre de 0,44 um. 4% de PFA dans du PBS peut être stocké à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines. Évitez formaline premade fourni dans des ampoules, à moins testé spécifiquement, car il contient souvent des contaminants métalliques qui peuvent interférer avec les canaux de masse mesurés. Une concentration plus faible de PFA peut être suffisante et aider à minimiser l'effet de la fixation sur la liaison d'anticorps, mais doit être testé de façon empirique.
    3. Incuber pendant 15 min à température ambiante sur un agitateur orbital avec mélange constant.
    4. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant wiThout perturber le culot.
    5. les échantillons de lavage avec du PBS pour éliminer la solution de PFA.
      NOTE: A ce échantillons étape peut être brièvement à 4 stockée ° C. un stockage prolongé à 4 ° C peut entraîner une dégradation de l'échantillon et une diminution de la coloration.

2. Barcoding

NOTE: Bien que la méthodologie pour l'utilisation monoisotopique cisplatine Code à barres et le palladium est présenté le codage à barres en même temps, que ce soit peut être utilisé indépendamment ou complètement évité si non requis par l'expérience.

  1. Monoisotopique Cisplatine Barcoding
    NOTE: Depuis le cisplatine et le cisplatine coloration codage à barres en direct / Dead comptent sur les soins des canaux qui se chevauchent doivent être prises pour faire en sorte que le cisplatine fond coloration en direct / Dead dans les cellules vivantes est réduit au minimum, car cela pourrait interférer avec la précision du code à barres de cisplatine.
    1. Diluer 1 mM de solutions mères monoisotopique de cisplatine de 200 uM dans du PBS.
    2. pour each code à barres unique de cisplatine préparer un tube de 1,5 ml avec 500 ul de PBS pour chaque 2 x 10 6 cellules recevant ce code à barres.
    3. Pour préparer chaque code à barres unique ajouter chaque cisplatine monoisotopique applicable à une concentration finale de 200 nM.
    4. Resuspendre les cellules dans 500 ul de PBS par 2 x 10 6 cellules.
    5. Ajouter un volume égal de la solution de code-barres correspondant à chaque échantillon.
    6. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 5 min sur un agitateur orbital avec mélange constant.
    7. Stopper cisplatine avec un volume égal de tampon de lavage.
    8. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    9. échantillons laver deux fois avec 500 ul de tampon de lavage pour éliminer l'excès de cisplatine.
  2. palladium Barcoding
    NOTE: Palladium réactifs peuvent être soit barcoding préparé 5 ou achetés dans le commerce.
    1. Transient partielleperméabilisation 19
      REMARQUE: Palladium chélation nécessite perméabilisation partielle codage à barres pour les réactifs de passer à travers la membrane cellulaire et la cellule étiquette avec vigueur.
      1. Laver les échantillons avec 500 ul de PBS.
      2. Laver les échantillons avec 500 ul de PBS plus 0,02% de saponine.
      3. granulés de volume résiduel en Resuspendre.
    2. Appliquer le codage à barres de palladium.
      1. Diluer actions 100x de réactif de codes à barres de palladium dans du PBS 1 ml glacé plus 0,02% de saponine.
      2. ajouter rapidement réactif à l'échantillon dilué le codage à barres remis en suspension.
      3. Incuber pendant 15 min à température ambiante sur un agitateur orbital à sous agitation constante.
      4. les échantillons de lavage deux fois avec 500 ul de tampon de lavage.

3. Cellule coloration de surface

REMARQUE: coloration de la surface cellulaire peut être effectuée sur des cellules vivantes avant la fixation. Cela peut être nécessaire pour les anticorps qui perdent affinité pour Theiépitope r après fixation. Des échantillons de cellules peuvent bénéficier de blocage supplémentaire, tel que le blocage de Fc pour les leucocytes, avant le marquage d'anticorps pour réduire le fond. blocage optimale doit être déterminée de manière empirique pour le type d'échantillon spécifique.

  1. Préparer panneau de coloration d'anticorps de surface de cellule.
    1. Combiner 0,5 uL, ou une quantité déterminée de manière empirique, de chaque anticorps de surface de cellule de 0,5 mg / mL par échantillon dans un tube de 1,5 ml. Ajouter tampon de lavage si nécessaire pour amener le volume jusqu'à 10 pi par échantillon. Mélanger par pipetage.
      REMARQUE: Déterminer la dilution de travail pour chaque anticorps avant d'expérimenter de façon empirique par l'expérience de titrage.
    2. pool d'anticorps de surface cellulaire divisé en parts égales dans un tube de 1,5 ml pour chaque échantillon à colorer.
    3. Préparer 500 ul de tampon de lavage dans un tube de 1,5 ml pour chaque échantillon.
  2. Appliquer une coloration de surface cellulaire à des échantillons de volume normalisé pour tous les échantillons.
    REMARQUE: Pour ensure marquage d'anticorps constante sur plusieurs échantillons, il est essentiel de contrôler soigneusement le volume de l'échantillon et la concentration d'anticorps. Les étapes suivantes visent à parvenir à cette cohérence en veillant à ce que les volumes de l'échantillon final après l'anticorps a été ajouté sont uniformes.
    1. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    2. Avec une solution ensemble de pipette de 200 pi à 50 pi, retirer restant de pastille de l'échantillon et transférer dans un tube du pool d'anticorps de surface cellulaire aliquoté.
    3. Pipeter jusqu'à la totalité du liquide dans le tube d'air aliquote sans dessin dans l'embout de pipette.
    4. Tout en maintenant le piston de la pipette pour éviter d'attirer l'air déplace l'embout dans un tube disposé de 500 ul tampon de lavage et de libérer le piston.
    5. Rajouter le contenu de la pointe de la pipette à l'échantillon et l'échantillon dans la remise en suspension liquide avec pipetage doux.
    6. Incuber les échantillons à 1h à la température ambiante sur un agitateur orbital avec mélange constant.
    7. échantillons laver deux fois avec 500 ul de tampon de lavage afin d'assurer que tous les anticorps libre est éliminé par lavage.
    8. Laver les échantillons avec 500 ul de PBS.
    9. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de PBS.
    10. Ajouter un volume égal de 4% de PFA dans du PBS; pipette pour mélanger.
    11. Incuber pendant 10 min sur un agitateur orbital.

4. Cellule perméabilisation et Intracellulaire Staining

  1. cellule perméabilisation
    1. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    2. Remettre en suspension les cellules dans le volume résiduel par vortex doucement jusqu'à ce que le culot est dissocié.
      NOTE: Le fait de dissocier les cellules avant d'ajouter du MeOH se traduira par des cellules qui adhèrent ensemble et la production d'un film mince qui se traduira par une perte partielle de l'échantillon.
    3. Immédiatement ajouter 1 mL de MeOH à 100% par 2 x 10 6 </ Sup> cellules et pipette doucement pour mélanger.
      NOTE: D'autres méthodes de perméabilisation peut être remplacé par MeOH et peut être nécessaire pour atteindre perméabilisation optimale pour certains types de cellules. Pour certaines sources cellulaires a 0,1% de Triton X-100, 0,2% de Tween-20 ou 0,1% de saponine dans une solution PBS pendant perméabilisation peut maintenir l'intégrité des cellules tout en offrant une meilleure perméabilisation cohérente.
    4. Incuber les échantillons pendant au moins 1 h ou jusqu'à un maximum de 24 h à 4 ° C pendant perméabilisation.
      NOTE: A ce échantillons étape dans MeOH peuvent être stockées pendant 1 mois à -80 ° C.
    5. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    6. Ajouter 1 mL de tampon de lavage pour chaque ml de MeOH utilisé pour perméabiliser l'échantillon. Doucement remettre en suspension culot cellulaire.
    7. Laver l'échantillon deux fois avec 500 ul de tampon de lavage.
  2. Préparer panneau de coloration d'anticorps intracellulaire.
    1. Combiner 0,5 uL, ou une quantité déterminée de manière empirique, de chaque anticorps intracellulaire 0,5 mg / mL par échantillon dans un tube de 1,5 ml. Ajouter tampon de lavage si nécessaire pour amener le volume jusqu'à 10 pi par échantillon. Mélanger par pipetage.
    2. Diviser pool d'anticorps intracellulaire également dans un tube de 1,5 ml pour chaque échantillon.
    3. Préparer 500 uL de tampon de lavage dans un tube de 1,5 ml pour chaque échantillon.
  3. Appliquer coloration intracellulaire des échantillons dans le volume normalisé pour tous les échantillons.
    REMARQUE: Pour assurer l'étiquetage des anticorps cohérent sur plusieurs échantillons, il est essentiel de bien contrôler le volume de l'échantillon et la concentration d'anticorps.
    1. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    2. Avec une pipette de 200 ul à 50 ul fixé enlever restante solution de culot de l'échantillon et transférer dans un tube du pool d'anticorps de surface cellulaire aliquoté.
    3. Pipettejusqu'à la totalité du liquide dans le tube d'air aliquote sans dessin dans l'embout de pipette.
    4. Tout en maintenant le piston de la pipette pour éviter d'attirer l'air déplace l'embout dans un tube disposé de 500 ul tampon de lavage et de libérer le piston, l'élaboration d'un tampon de lavage pour un volume total d'échantillon de 50 ul.
    5. Rajouter le contenu de la pointe de la pipette à l'échantillon et l'échantillon dans la remise en suspension liquide avec pipetage doux.
    6. Incuber les échantillons pendant 1 heure à température ambiante sur un agitateur orbital avec mélange constant.
    7. les échantillons de lavage deux fois avec 500 ul de tampon de lavage.
    8. Laver les échantillons avec 500 ul de PBS.

5. L'étiquetage Iridium

  1. Fix échantillons
    1. Des échantillons de remettre en suspension dans 500 ul de PBS.
    2. Ajouter 500 pi de 4% PFA dans du PBS.
    3. Incuber pendant un minimum de 15 min à température ambiante sur un agitateur orbital avec mélange constant.
  2. Appliquer l' étiquetage Iridium de l' ADN
    1. Ajouter une solution 500 ul 62,5 nM iridium PFA aux échantillons.
      NOTE: Pour les expériences utilisant des cellules perméabilisées, diluer le 500x Ir191 / 193 stock pour une dilution finale de 1: 2000 pour éviter overstaining.
    2. Incuber pendant 15 min à température ambiante sur un agitateur orbital avec mélange constant.
      REMARQUE: Si vous effectuez monoisotopique cisplatine ne pas incuber le codage à barres des échantillons avec iridium pendant plus de 15 minutes puisque les signaux Ir193 forts peuvent contribuer à la chaîne de masse Pt194 et un impact négatif sur la qualité de codage de barre.
    3. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    4. échantillons laver deux fois avec 500 ul de 0,1% de BSA dans de l'eau déminéralisée filtrée.
      REMARQUE: Une fois préparés, nous vous recommandons d'exécuter des échantillons dans les 24 h si possible. Les échantillons préparés peuvent être stockés à court terme à 4 ° C,mais il faut prendre soin d'éviter la dégradation. Si possible, les lavages finaux doivent être effectués dans de l'eau déminéralisée filtrée sans BSA, car cela diminue le dépôt sur les cônes de la chambre de pulvérisation et échantillonneur de la machine qui diminuera le nettoyage des instruments. Pour CSEh il est nécessaire d'effectuer ces lavages tout en incluant BSA pour éviter la perte d'échantillon de coller à la surface du tube.

6. Préparer des échantillons pour l'acquisition

  1. Nombre de cellules
    1. Resuspendre les cellules dans 500 ul de 0,1% de BSA dans de l'eau désionisée filtrée et le filtre dans un nouveau tube à travers un bouchon de tamis cellulaire de 35 um.
      REMARQUE: L'abaissement du niveau de BSA pour les lavages finaux diminue le résidu laissé sur le nébulisateur cytométrie de masse. Les cellules non adhérentes peuvent être lavées et remises en suspension dans de l'eau déminéralisée filtrée.
    2. Compter les cellules en transférant 10 ul de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation. Diluer aliquote à un rapport connu dansbleu trypan (pour faciliter la visualisation de la cellule) et transférer dans un hémocytomètre ou d'un système de comptage de cellules automatisé.
    3. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
  2. Préparer et des échantillons de charge
    1. Pour préparer des perles d'étalonnage retirer du réfrigérateur et agiter vigoureusement pour remettre en suspension.
    2. Si des échantillons en cours d'exécution à l'aide d'une masse cytométrie échantillonneur automatique, ajouter 50 ul de billes d'étalonnage pour chaque puits de la plaque d'échantillon, puis ajouter le nombre souhaité de cellules à analyser. Si des échantillons en cours d'exécution par injection manuelle ajouter 50 ul de billes d'étalonnage à l'échantillon, l'échantillon dilué dans de l'eau déminéralisée filtrée, mélanger l'échantillon bien et la charge dans le port d'injection d'échantillon de cytométrie de masse. La dilution appropriée de l' échantillon peut varier en fonction du type de cellules en cours d' analyse, mais une dilution de 10 6 1 est généralement approprié.

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Representative Results

Le protocole présenté ici peut être largement appliquée à une grande variété d'échantillons de cellules en culture et primaire avec seulement quelques modifications mineures. En fonction des besoins de l'expérience, elle peut être réalisée de manière modulaire lorsque certains éléments, tels que la coloration surface cellulaire ou le codage à barres, ne sont pas nécessaires. Utilisé dans son intégralité ce protocole permet la préparation de la masse multiplexé cytométrie échantillons marqués d'exclusion de cellules mortes, l'identification de la population de la phase S et colorées pour la quantification d'un maximum de 38 cibles d'anticorps.

Résultats attendus produites par les procédés décrits dans le présent protocole (figure 2) sont représentés sur la figure 3. Lors de la collecte des données, la normalisation de l'intensité du signal sur la base de l'intensité de billes d'étalonnage peut être effectuée dans le logiciel de cytométrie de masse. À la suite de la normalisation, les données initiales procéssing pour éliminer les billes d'étalonnage, porte sur des cellules uniques et éliminer les cellules mortes peut être effectuée manuellement à l'aide de tout logiciel capable d'analyser les données de cytométrie de flux. L' élimination des billes d'étalonnage peut être effectué manuellement par gating sur la population Ir191 + Ce140- (figure 3A) ou avec un algorithme basé sur 20 MATLAB. Événements unicellulaires (contour noir, figure 3B) peuvent être gated tout en enlevant les débris et les multiplets cellulaires, par gating sur le tracé deux axes de Ir193 et durée de l' événement (figure 3B). étiquetage Cisplatine des cellules mortes peut être utilisée pour quantifier la quantité de la mort cellulaire; représentés sont des exemples d'échantillons avec des quantités faibles (Figure 3D) et plus élevées (Figure 3E) des cellules mortes. Les cellules mortes peuvent être éliminées à partir des données de déclenchement de la population Pt198 + (Figure 3E). Code-barres d'échantillons, que ce soit avec les réactifs monoisotopiques de cisplatine ou de palladium, les résultats de séparation distincte de samples dans les paramètres de code barre (figure 3C), ce qui permet aux cellules d'être affectés à leur identité d' origine de l' échantillon. Méthodes optionnelles supplémentaires, telles que l' étiquetage IdU, permettent la détection de populations spécifiques, par exemple, des cellules en phase S (Figure 3F). À la suite de la normalisation initiale, debarcoding et gating, les données de grande dimension peuvent être analysées en utilisant une variété d'algorithmes dont SPADE 17 et plusieurs autres conçus pour la cytométrie de masse analyse des données et la visualisation 18. Des algorithmes tels que SPADE prennent les données de grande dimension, qui peuvent être difficiles à interpréter car il ne peut pas être visualisée directement dans son état dimensionnelle, et générer une représentation dimensionnelle inférieure des données, ce qui est plus favorable à l' interprétation visuelle (figure 3G).

Figure 1 Figure 1: Principes de base de cytométrie de masse mesure. Préparation des échantillons de cellules pour analyse par cytométrie en masse implique des cellules de coloration avec des anticorps marqués avec des isotopes métalliques principalement de la série des lanthanides. Dans ce schéma, chaque anticorps dirigé contre un épitope spécifique est marqué par un isotope possédant une masse atomique unique, comme samarium 154. Les anticorps contre des épitopes qui sont surface, cytoplasmique, nucléaire ou chromatine localisée peut potentiellement être utilisé. Les cellules marquées sont injectées et pulvérisé à travers la masse de cytométrie nébuliseur sous forme de gouttelettes de cellules isolées où ils sont ionisés par une torche à plasma d'argon. Le nuage de particules résultant est débarrassé des atomes de faible masse par un filtre de masse quadripolaire tandis que l'abondance des ions de masse plus importantes atomiques sont mesurées par le détecteur. La quantité mesurée de chaque ion de masse unique, correspond à l'abondance cellulaire de son l'épitope cible de l'anticorps associé. Alors qu'un théorique lIMIT de plus de 100 paramètres peut être quantifié en utilisant cette méthode, les réactifs actuels disponibles dans le commerce permettent la détection de plus de 40 paramètres par cellule. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Diagramme de flux de travail procédé expérimental et les étapes facultatives. Représentation des principales étapes impliquées dans la préparation des cellules protocole pour la cytométrie de masse. Les étapes optionnelles sont indiquées par des boîtes oranges. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
figure 3: Exemple de données générées à partir de cul m analyse par cytométrie. (A) parcelle Biaxial montrant la séparation des cellules (haute Ir191, faible CE140), des billes (faible Ir191, haute CE140) et doublets bourrelet de cellules (haute Ir191, haute CE140). (B) parcelle biaxiale montrant l' aspect attendu de Ir193 vs durée de l' événement. Gating des cellules simples qui élimine multiplets de débris cellulaires et cellules est montré. (C) parcelle biaxiale montrant vue par exemple de deux canaux de masse de cisplatine codage à barres. (D - E) Exemple de données de cisplatine coloration Vivant / Mort pour des échantillons ayant un faible pourcentage (D) et un pourcentage élevé (E) de cellules mortes. (F) parcelle biaxial de cellules H9 hESC marquées avec IdU de distinguer les cellules en phase S et un anticorps dirigé contre la cycline B1 à distinguer en outre cycle cellulaire. (G S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le protocole présenté ici a été utilisé avec succès pour le traitement de diverses lignées cellulaires en culture (H1 et H9 CSEh, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) et des échantillons de tissus primaires (moelle osseuse de la souris, la souris foie embryonnaire, adultes de souris foie, une tumeur de la souris). Quelle que soit la source, tout tissu qui peut être dissociées en cellules individuelles tout en préservant l'état cellulaire devrait être prête à l'analyse par cytométrie de masse, mais peut nécessiter une optimisation des protocoles. Il est important de noter que certains épitopes peuvent être affectés par la dissociation spécifiques, la fixation et les traitements utilisés perméabilisation et ces méthodes peuvent avoir besoin de subir une optimisation spécifique à l'échantillon. Si le signal faible est observée pour un anticorps, il peut être possible d'améliorer en effectuant l'étiquetage de la surface cellulaire sur des cellules vivantes, en changeant les méthodes de perméabilisation, ou en réduisant le temps de fixation.

Lorsque cela est possible dans la conception expérimentale, y compris dans le codage à barres eflux de traitement électronique de l'échantillon assure la cohérence entre les échantillons au niveau de la concentration des cellules et de l'anticorps. Sans le codage à barres, même si on prend grand soin de contrôler le traitement des échantillons, il est probable que de légères variations de la concentration d'anticorps et la concentration cellulaire seront introduits entre les échantillons. En outre, comme les pourcentages de cellules positives pour des épitopes spécifiques varieront probablement entre les échantillons, le rapport anticorps à l'épitope efficace nécessairement peut varier entre les échantillons, même si la concentration d'anticorps totale est maintenue constante, pouvant conduire à des incohérences dans la coloration des anticorps. Ces variations, tout en étant généralement mineures lors de l'observation d'un seul canal, peut devenir fortement aggravée lors de l'exécution d'une expérience haut de paramètre et peut être interprété à tort comme biologiquement significatif si les soins ne sont pas prises lors de l'analyse des données.

L'analyse des données résultant d'une cytométrie de masse expérience peut prendre plusieurs formes, et un certain nombre de Computaapproches TIONNELLES ont été adaptées spécifiquement pour cette application. Tout en fournissant une étude exhaustive des algorithmes utiles pour la masse cytométrie analyse des données est au - delà de la portée de ce manuscrit, les approches qui ont été utilisées avec succès sont mis en évidence et les lecteurs intéressés peuvent consulter de multiples ressources couvrant ce sujet 21, 22, 23. Deux des plus largement utilisées, approches actuellement disponibles pour l'analyse de la masse cytométrie données sont Spanning Tree Progression de la densité normalisent événements (SPADE) et Visne. SPADE forme grappes de groupes de cellules avec une expression de marqueur similaire et représente chaque groupe comme un noeud. Ces noeuds sont disposés dans un arbre de nœuds où SPADE similaires sont reliés par une ligne (figure 3G). Visne utilise le voisin stochastique distribuée t-enrobage algorithme 24 pour générer une représentation à deux dimensions deles données de grande dimension, tout en préservant la structure d'ensemble de données. Les deux SPADE et Visne sont écrits dans Matlab, le code source est librement disponible et peut être exécuté par les utilisateurs avec Matlab. En outre, une version autonome de SPADE est disponible.

Alors que la cytométrie de masse permet actuellement la collecte du plus grand nombre de paramètres, marqueur fluorescent cytométrie en fonction peut être une meilleure approche pour certaines applications. Cytométrie de flux de fluorescence peut analyser plus de cellules par seconde, jusqu'à 5 x 10 4 par rapport à 500-1000 pour la cytométrie de masse, et est plus disponible anticorps validés 25. D' autres progrès dans cytométrie de flux de fluorescence, comme la cytométrie hyperspectrale 26 et 27 nouveaux fluorophores font de flux de fluorescence cytométrie une alternative viable pour tous , mais des expériences de paramètres très élevés. D' autres techniques telles que la mesure de l' ARN 28 auparavant uniquement possiblepar cytométrie de flux à base de fluorescence ont été récemment adapté à la cytométrie de masse permettant la détection simultanée de la protéine et de l' ARN 29. L'expansion future des isotopes et des réactifs disponibles pour utiliser plus complètement la fenêtre de masse des isotopes mesurables et d'élargir le répertoire des caractéristiques cellulaires mesurables permettra d'élargir la profondeur de profilage cytométrie possible en masse.

Le grand nombre de paramètres qui peuvent être analysés simultanément par cytométrie de masse augmente considérablement les questions expérimentales qui peuvent être étudiés. Nous espérons que cet article et le protocole vidéo d'accompagnement permettront aux chercheurs intéressés d'utiliser plus efficacement cytométrie de masse pour faire avancer leurs recherches.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 medium kit Stem Cell technologies 05850 Warm at room temperature before use
DMEM F-12 ThermoFisher 11330-032 Warm at 37 °C before use
Accutase Stem Cell technologies 07920 Warm at 37 °C before use
Bovine serum albumin Equitech BAH62
phosphate buffered saline Hyclone SH30256.01
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Cell ID Pt194 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt195 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt196 Fluidigm Provided at 1 mM
Cisplatin Enzo Life Sciences ALX-400-040-M250 Soluble to 25 mg/mL in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit Fluidigm 201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich I7125 Soluble to 74 mg/mL in 0.2 N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent Fluidigm 201103A
Methanol Fisher BP1105-4 Chill at -20 °C before use
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
5 mL round bottom tubes Falcon 352058
5 mL 35 μm filter cap tubes Falcon 352235
EQ four element calibration beads Fluidigm 201078
Hyaluronidase Type I-S Sigma-Aldrich H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C9891
Disposable Scalpel #10 Sigma-Aldrich Z69239

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References

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