يعاير سلوكيات التغذية المفترسة في * These authors contributed equally

Environment
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lightfoot, J. W., Wilecki, M., Okumura, M., Sommer, R. J. Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes. J. Vis. Exp. (115), e54404, doi:10.3791/54404 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

وقد أثبتت الديدان الخيطية مع الجهاز العصبي صغيرة ولكنها معقدة من أدوات قوية لفهم العديد من جوانب علم الأعصاب بما في ذلك السلوك. وقد ركزت معظم هذه البحوث على الكائن الحي نموذج ايليجانس انواع معينة فيها مجموعة كبيرة من السلوكيات مختلفة تم تشريح بنجاح وتحليلها. وتشمل هذه ميكانيكية حسية 4 الكيميائي، منجذب للحرارة 5،6 وmagnetotactic 7 التأثير على التزاوج 8،9، والتعلم 10 و التغذية السلوكيات 11. ومع ذلك، عرض أنواع النيماتودا الأخرى ذات الصلة أكثر بعيدة السلوكيات التي لا تراعى في rhabditid C. ايليجانس أو بدلا من ذلك تظهر مستويات إضافية من التعقيد، مما يثير التساؤلات ذات الصلة بشأن تطور وتنظيمها. أحد الأمثلة على ذلك يمكن ملاحظتها في الديدان الخيطية diplogastrid بعيدة الصلة Pristionchus pacificus، والذي يعرض أكثر تعقيدا التغذية يكونhaviors والإيقاعات من لوحظ في C. ايليجانس 1. هذا على الرغم من النوعين تقاسم الخلايا العصبية البلعوم المتجانسة (12). وبالتزامن مع هذه السلوكيات تغذية إضافية، P. يعرض pacificus أيضا مجموعة والغذائية الموسعة، كما هي الحيوانات المفترسة متعطشا، قادرة على استكمال نظامهم الغذائي البكتيري عن طريق تغذية أيضا على يرقات الديدان الأخرى. لحسن الحظ، P. وقد تم تطوير pacificus كنموذج لعلم الأحياء التطوري المقارن والتكاملي، وبالتالي العديد من الأدوات الجزيئية والجينية متوفرة الآن. وتشمل هذه التسلسل الكامل والمشروح الجينوم 13، الأدوات الجزيئية والجينية بما في ذلك الجينات المحورة 14 و كريسبر / Cas9 15،16 فضلا عن نسالة مفصلة ومشروحة بشكل جيد 17 مع أكثر من 25 نوعا وثيق الصلة بما في ذلك الأنواع شقيقة اكتشف حديثا. بالإضافة إلى ذلك، علم البيئة من العديد من الأنواع Pristionchus بما في ذلك P. pacificus هو أنناوقد تم الآن وصف ليرة لبنانية محددة مع العديد من الأنواع تقاسم جمعية necromenic مع الخنافس الجعل، مضيفة أنهما يشتركان في كثير من الأحيان مع أنواع النيماتودا أخرى 18. ب. بالتالي يوفر pacificus نظام نموذجا ممتازا التي لتشريح تطور السلوكيات الجديدة وأهميتها البيئية.

من أجل تحليل سلوكيات التغذية المفترسة في أنواع النيماتودا مثل P. pacificus وضعنا عدة فحوصات السلوكية جديدة لمراقبة سهلة وتقدير من الإجراءات المفترسة. كما P. يعرض pacificus بنية الفم ديمبرافيك، الأمر الذي يؤثر بشدة سلوك المفترسة، وتحديد نمط شكلي الصحيح ضروري 1،2. يحتوي ضعهن stenostomatous الفم ضيق واحد الأسنان ظهري حادة ولا تشارك في أي تغذية المفترسة. بدلا من ذلك، يتضمن ضعهن eurystomatous الفم واسعة مخلب شكل أكبر من ذلك بكثير الأسنان ظهري ومبلغ إضافي معارضةالأسنان الفرعية بطني، والتي تعمل معا لفتح بكفاءة إهاب من فرائسها. تختلف نسبة eurystomatous المفترسة إلى النموذج stenostomatous غير المفترسة بين الأنواع Pristionchus وأيضا داخل P. pacificus، ومع ذلك، فإن نسبة من الفم eurystomatous تتحول في في P. pacificus البرية نوع سلالة (PS312) هو عادة 70-90٪ 2. بالإضافة إلى ذلك، نسب شكل الفم يمكن أن تتقلب حسب اختلاف التأثيرات البيئية (وكلاهما معروف، بما في ذلك الموت جوعا وبعض جزيء صغير يشير فضلا عن عوامل غير معروفة)، وتحديد بالتالي الصحيح وعزل شكل الفم eurystomatous المفترسة أمر ضروري لفحوصات المفترسة ناجحة.

جنبا إلى جنب مع وصف لشكل الفم المفترسة وضعنا "فحص لدغة" لالملاحظة المباشرة وتقدير من السلوكيات المفترسة بما في ذلك عض، مما أسفر عن مقتل وتغذية الأحداث. هنا يتم عزل النيماتودا فريسة من خلال فلترجي الثقافات تجويع حديثا ويتعرض إلى الكبار المفترسة P. pacificus، الذي لوحظ معا خلال فترة زمنية قصيرة. وبالإضافة إلى ذلك، وقد وضعنا أيضا عالية الإنتاجية "فحص الجثة" لتسهيل الفحص السريع للسلوك المفترسة من خلال الملاحظة المباشرة للأحداث المفترسة. هذا يستفيد من وجود جثث اليرقات كأداة للكشف عن الافتراس. توفر كل من المقايسات طرق سهلة وقابلة للتكرار للغاية لمراقبة وقياس السلوك المفترسة في أنواع النيماتودا مثل P. pacificus.

Protocol

1. الفم شكل Phenotyping

  1. الفم نموذج تحديد على الاغاروز وسادات
    ملاحظة: من أجل تصور نقرأ الفم الخيطية، لشل حركة الديدان مع العلاج مخدر خفيف على منصات الأغاروس ومراقبة على النحو التالي.
    1. النمو والحفاظ على الثقافات الخيطية مثل P. pacificus في 6 سم وسائط النمو الخيطية القياسية (NGM) لوحات وتتغذى على العشب البكتيرية E. القولونية OP50 19.
    2. جعل منصات الأغاروس بإضافة أولا 0،06 ز الاغاروز إلى 3 مل H 2 O في أنبوب 15 مل لجعل الحل الاغاروز 3 مل 2٪. هذا ويمكن تخزينه لمدة تصل إلى سنة في 4 درجات مئوية.
    3. خلط وإذابة الاغاروز تماما في الميكروويف أو بدلا من ذلك استخدام كتلة الحرارة المتوقع أن> 88 درجة مئوية.
    4. مرة واحدة ذابت تماما، إضافة 10 ميكرولتر من 10٪ محلول أزيد الصوديوم إلى الاغاروز وتخلط جيدا. تنبيه: أزيد الصوديوم الجاف هو رد الفعل وجميع أشكال سامة.
    5. باستخدام 1 ملmicropipette، وضع قطرة من ما لا يقل عن 300 ميكرولتر من مزيج أزيد الاغاروز السائل على منتصف شريحة المجهر والزجاج القياسية.
    6. قبل يبرد أجار، بسرعة وضع شريحة المجهر الثانية على رأس قطرة من أجل لشد الاغاروز التي تشكل وسادة على التبريد. كرر العديد من منصات كما هو مطلوب.
    7. فقط قبل استخدامها، وقشر بعيدا الشرائح الزجاجية المجهر من قبل انزلاق لهم قبالة بعضها البعض. ملاحظة: إذا كنت على استعداد منصات الأغاروس بعيدا جدا مقدما أنها يمكن أن تكون مفرطة الجاف وقد تضر الديدان الخيطية.
    8. لنقل الديدان لمنصات الأغاروس مخدر، ضع قطرة من العازلة M9 (2-3 ميكرولتر) على وسط لوحة. اختيار 2-3 الشباب P. الكبار pacificus في قطرة من M9 قبل وضع زلة غطاء بعناية على لوحة. ف. سيتم يجمد الديدان الخيطية pacificus في الاغاروز وعلى استعداد للتصور.
    9. نقل شريحة المجهر يحتوي على دودة تخدير لالمجهر المناسبالثانية مراقبة تحت البصريات 63X Nomarski. تصنيف هويات ضعهن استنادا إلى الميزات التالية: وجود الأسنان الفرعية بطني إضافية، الموسع الأسنان ظهري وفتح الفم واسعة يدل على eurystomatous الحيوان ضعهن الفم، في حين أن وجود الأسنان ظهري واحد وأضيق فتحة الفم يشير إلى stenostomatous حيوان (الشكل 1).
      ملاحظة: من أجل الحفاظ على صحة الحيوان، وينبغي الحفاظ على الديدان على لوحة أجار لمدة لا تتجاوز 5 دقائق.
    10. بعد تحديد ضعهن الفم، واستعادة الديدان الخيطية إما eurystomatous أو stenostomatous على النحو المطلوب عن طريق إزالة انزلاق الغطاء عن طريق تحريك بلطف قبالة منصة الأغاروس. بعناية اختيار الحيوانات اختيار من لوحة الاغاروز (E. القولونية OP50 يمكن استخدامها على اختيار للمساعدة في جعل ذلك لزوجة) على لوحات NGM الطازجة. السماح التعافي من مخدر حتى استأنفت السلوك متحرك عادي عليها الحيوانات جاهزة للمزيد من فحوصات المفترسة.
  2. <لى> السريع الفم Phenotyping
    ملاحظة: بدلا من ذلك، مع المزيد من الخبرة والفم نوع شكل يمكن يعاير دون الحاجة إلى أي علاج التخدير عن طريق مجهر تشريحي مع التكبير عالية (150X).
    1. مكان الديدان الخيطية على لوحات NGM القياسية مع العشب البكتيرية E. القولونية OP50 على مساحة العرض المجهر.
    2. كشف الفروق في حجم الفم والعرض. ملاحظة: في هذا التكبير لا الأسنان مثل الهياكل يمكن ملاحظتها وبالتالي تحديد ضعهن الفم فقط بناء على أفواه واسعة مقابل أفواه الضيقة.

2. لدغة الفحص

ملاحظة: فحوصات عض تسمح تحليل السلوك المفترسة تفصيلا.

  1. النمو والحفاظ على الثقافات الخيطية على لوحات NGM القياسية (6 سم) وتتغذى على العشب البكتيرية E. القولونية OP50 19.
  2. جعل وحات الفحص من خلال زراعة كمية كبيرة من اختيار فريسة الخيطية اليرقات مثل C. ايليجانس أو الternatively فريسة المناسبة ذات الصلة من الناحية البيئية. ملاحظة: الكبار C. ايليجانس تكون كبيرة جدا ليكون فريسة مناسبة لذلك فمن المهم استخدام مرحلة اليرقات.
    1. الحفاظ على C. ايليجانس أو غيرها من أنواع الفرائس المحتملة على لوحات NGM القياسية وتتغذى على العشب البكتيرية E. القولونية OP50 حتى يتم تجويع السكان حديثا، مما أدى إلى وفرة من اليرقات L1 الشباب.
      ملاحظة: حان الوقت لالجوع يعتمد على العوامل البيئية والتجريبية العديدة، بما في ذلك عدد من الديدان الخيطية المستخدمة لبدء الثقافة، وكمية من E. وأضاف القولونية OP50، ودرجة الحرارة المحيطة.
  3. غسل أربعة أو أكثر من لوحات فريسة تجويع حديثا مع M9 وتمرير حل دودة من خلال اثنين من 20 ميكرون مرشحات لإزالة كل الحيوانات الكبيرة وأي البيض المتبقية قبل جمع في أنبوب 15 مل. فقط يجب أن تبقى اليرقات الصغيرة في الحل.
  4. لتشكيل بيليه اليرقات أجهزة الطرد المركزي الفريسة التي تمت تصفيتها في 377 x ج لمدة 1 دقيقة.
  5. E. القولونية OP50 الحاضر وانتظر 30 دقيقة على الأقل ليرقات إلى انتشرت بشكل كاف لتوليد لوحة الفحص.
    ملاحظة: 3 ميكرولتر من بيليه دودة النقي على لوحات الفحص القياسية تحتوي على> 3000 فريسة اليرقات. وهذا يكفي لتوليد اتصال دائم بين الحيوانات المفترسة والفرائس.
  6. شاشة النيماتودا المفترسة لضعهن الفم المطلوبة (بروتوكول 1).
  7. باستخدام دودة اختيار التقنيات القياسية ومجهر تشريحي الخفيف 19، ونقل الحيوانات المفترسة سرية بشكل صحيح على لوحة فحص. الحرص على نقل البكتيريا OP50 أقل قدر ممكن على لوحة فحص عند نقل الحيوانات المفترسة من أجل تقليل التلوث الجرثومي. انتظر 15 دقيقة للسماح للدودة للتعافي من الإجهاد من نقله وتحقق من البرية من نوع السلوك متحركة لضمان لم تتعرض للضرر الديدان من نقل.
    ملاحظة: ليست هناك حاجة لتجويع P. باكificus، كما هي الحيوانات المفترسة ذات كفاءة عالية من يرقات الدودة الخيطية أخرى حتى في الوقت الذي يتغذى جيدا على البكتيريا.
  8. بعد الشفاء، ومراقبة الحيوانات المفترسة باستخدام مجهر تشريحي خفيفة لمدة 10 دقيقة. مع هذه المعدات، ومراقبة وتوصيف الأحداث تغذية متميزة مثل عض، والتي تتميز المفترس تقييد حركة الفريسة. القتل، حيث قبل افتتاح يتم الكشف عن بشرة فريسة. والتغذية، مصنفة من قبل الاستهلاك يمكن ملاحظتها من أحشاء فريسة (الشكل 2A، B والسينما 1).
  9. تكرار الفحص عن طريق فحص ومراقبة ما لا يقل عن 10 النيماتودا المفترسة الفردية لضمان دقة.

3. الجثة الفحص

ملاحظة: فحوصات الجثة تيسير كمي أكثر سرعة من السلوك المفترسة.

  1. النمو والحفاظ على الثقافات الخيطية على لوحات NGM القياسية وتتغذى على لتر البكتيريةعون من E. القولونية OP50 19. توليد يثلث لوحات الفحص المذكورة سابقا (بروتوكول 2،1-2،5).
  2. شاشة النيماتودا المفترسة لضعهن الفم المطلوبة كما هو موضح في بروتوكول 1. باستخدام دودة اختيار التقنيات القياسية ونقل مجهر تشريحي ضوء 5 النيماتودا المفترسة مع ضعهن الفم المطلوبة لكل لوحة الفحص. ترك الحيوانات المفترسة مع فريسة لمدة 2 ساعة.
  3. بعد 2 ساعة شاشة لوحة فحص لوجود جثث أفرغت (الشكل 2B و C). تحديد الجثث بسبب غياب الحركة جنبا إلى جنب مع العيوب الشكلية واضحة بما في ذلك تسريب أحشاء أو مفقودة أجزاء الدودة.

4. تحليل بلعومي وحركة الأسنان

  1. النمو والحفاظ على الثقافات الخيطية على لوحات NGM القياسية وتتغذى على العشب البكتيرية E. القولونية OP50 19. توليد وحات الفحص كما ذكر سابقا (بروتوكول 2،1-2،5). إذا القياسية 6 سملوحات NGM لا تناسب بين الهدف والمسرح المجهر، واستخدام غطاء الصغيرة 35 مم أطباق بتري تحتوي على 2 مل NGM كبديل مناسب.
  2. شاشة النيماتودا المفترسة لضعهن الفم المطلوبة كما هو موضح في بروتوكول 1. باستخدام دودة القياسية اختيار التقنيات ومجهر تشريحي خفيفة، ونقل احد المفترس تصنف بشكل صحيح على لوحة فحص. انتظر 15 دقيقة للسماح للدودة للتعافي من الإجهاد من نقله.
  3. مراقبة الحيوانات المفترسة على المجهر في 40 - 63X Normaski، مع كاميرا عالية السرعة (أفلام 2 و 3). سجل البلعوم الضخ وحركة الأسنان أكثر من 15 ثانية، في 50 هرتز في لا يقل عن 20 الحيوانات لضمان تقدير دقيق. سجلت اعادتها الأفلام في السرعة المطلوبة من أجل الاعتماد مضخات الفردية وأحداث الأسنان.
    لوحظ الضخ في الإحضار، وتقع في وسط البلعوم، في حين أن حركة الأسنان هي التي يمكن اكتشافها في فتحة الفم وهو الوحيد المكشوف: مذكرةخدم من الأسنان الظهرية.

Representative Results

وبعد تحديد الناجح لضعهن الفم المناسب في P. pacificus، اختلافات واضحة بين الحيوانات eurystomatous وstenostomatous يمكن الكشف عن (الشكل 3) فقط مع الحيوانات eurystomatous الانخراط في قتل السلوك. في الحيوانات stenostomatous يبدو أن هذا السلوك يمكن منعها تماما. وعلاوة على ذلك، فإن الاختلافات في النشاط الأسنان والبلعوم ضخ الحيوانات eurystomatous على البكتيريا وفريسة (الشكل 4 و أفلام 2 و 3) واضح أيضا. في حين التغذية المفترسة، وخفض معدل الضخ أقل من تلك التي لوحظت خلال الكشف عن التغذية البكتيرية وحركة الأسنان في نسبة إلى واحدة مع ضخ البلعوم. هذا ومن المحتمل أن تكون مؤشرا على الآليات التنظيمية الرئيسية تحوير الاستجابة السلوكية لاختلاف النظام الغذائي.

ق / ftp_upload / 54404 / 54404fig1.jpg "/>
الشكل 1. P. pacificus لديه الفم إزدواج الشكل الذي يؤثر في سلوك التغذية. (أ) شكل الفم eurystomatous قادر على الافتراس، ولها فتحة الفم واسعة مع مخلب شكل كبير ظهري الأسنان (كاذبة اللون الأحمر) و (ب) ربط المنافس على شكل الأسنان واسع الفرعية بطني (كاذبة اللون الأزرق). (C) وشكل الفم stenostomatous هو فقط قادرة على تتغذى على البكتيريا، ولها فتحة الفم أضيق مع الصوان على شكل ظهري الأسنان (كاذبة اللون الأحمر) و (D) لا الأسنان الفرعية بطني (*). صور Normaski هي 63X ويمثل شريط مقياس 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الافتراس فحوصات. (A) P. pacificus يعض ويقتل يرقات الديدان الخيطية أخرى مثل C. ايليجانس. (ب) لفحوصات لاذعة، وعدد من bitesby الحيوانات المفترسة (*) يمكن ملاحظتها باستخدام مجهر تشريحي خفيفة وقتل ناجحة وتغذية الأحداث المسجلة أيضا. الجثث هي أيضا واضحة للعيان (الدوائر). (C) لفحوصات الجثة، أطر اليرقات (الأسهم) ويمكن بسهولة تحديدها مقارنة اليرقات الحية. يمثل مقياس شريط 1 مم في B و 150 ميكرومتر في C. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. النتائج من لدغة والجثة فحوصات على C. ايليجانس الجارحة. (A) هو سلوك العض واضحا فقط في شكل الفم eurystomatous مع هذا السلوك لا يتم عرض في الحيوانات stenostomatous. يمثل شريط خطأ الانحراف المعياري من 10 مكررات. (ب) وتزامنا مع أي سلوك العض واضحا من الحيوانات stenostomatous، كما تكشف فحوصات جثة جثث فقط على لوحات فحص الحيوانات eurystomatous. يمثل شريط خطأ الانحراف المعياري من 5 مكررات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
ويلاحظ الشكل 4. Eurystomatous ضخ حركة السعر والأسنان خلال تغذية مفترسة. حركة الأسنان فقط، بينما تشارك الحيوانات eurystomatous في التغذية المفترسة. ويتزامن ذلك أيضا مع انخفاض في ضخ البلعوم. يمثل شريط خطأ الانحراف المعياري من 10 مكررات. أ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig4large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1
الفيلم 1. مراقبة من قتل السلوك لفحص دغة باستخدام مجهر تشريحي الخفيفة. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

فيلم 2
فيلم فيلم الكاميرا 2. عالية السرعة من P. pacificus قتل C. ايليجانس اليرقات. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

إعلان / 54404 / 54404movie3.jpg "/>
فيلم 3. التكبير كاميرا عالية السرعة من حركة الأسنان أثناء الافتراس. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

Discussion

توفر الديدان الخيطية نظام قوي لفهم بيولوجيا الأعصاب والسلوك مع C. ايليجانس يجري حتى الآن الأداة الرئيسية. ومع ذلك، أنواع النيماتودا عديدة من بينها P. السلوكيات عرض pacificus، والتي هي غائبة أو تختلف في تعقيدات من نموذج حي C. ايليجانس وبالتالي تثير تساؤلات مثيرة حول تطور وتنظيم هذه السلوكيات. واحد مثل هذا السلوك إضافية وجدت في العديد من أنواع الديدان الأخرى بما في ذلك P. pacificus هو القدرة على تكملة نظامهم الغذائي البكتيري من خلال الانخراط في التغذية المفترسة 1، 20. لقد ولذا وضعت ووصف بروتوكول مفصلة لتوصيف السهل والسريع لهذه السلوكيات المفترسة unanalyzed سابقا في الديدان الخيطية.

أولا، قدمنا ​​طرق للكشف عن تغيرات في تغذية الجهاز داخل الفم الخيطية. تحديد نوع الفم الصحيح هو أول أساسيتيب لفحوصات الافتراس ناجحة، على الأقل داخل جنس Pristionchus فقط الحيوانات eurystomatous قادرة على تغذية المفترسة. فمن الأفضل لتحديد الفم تأخذ أشكالا مختلفة مع بروتوكول "السريع phenotyping الفم" وصفت في بروتوكول 1.2 لأن هذا الأسلوب هو أقل الغازية من ذلك بكثير، وبالتالي فإنه من غير المحتمل أن السلوكيات المفترسة قد أقلقت. ومع ذلك، فمن المستحسن أن تصبح أول مألوفة مع هياكل الفم مختلفة من التماهي مع الحيوانات تخدير على منصات أجار (بروتوكول 1.1).

وبعد التعرف على ضعهن الفم المطلوبة، التي وصفناها تحليلين لقياس التغذية المفترسة. هذه هي السريع، وإنتاجية عالية "فحص الجثة" (بروتوكول 3) والمزيد من الوقت طويلا ولكن أكثر تعمقا التحليل السلوكي من خلال "فحص لدغة" (بروتوكول 2). كل من هذه البروتوكولات هي درجة عالية من المرونة مما يسمح لعدة تعديلات من أجل تحسين فحوصات اعتمادا على التجربهمتطلبات التل. لفحوصات دغة باستخدام P. الحيوانات المفترسة pacificus على C. ايليجانس فريسة، وكانت الملاحظات من التفاعلات السلوكية المفترسة لنافذة زمنية من 10 دقيقة كافية لتحديد كمية كبيرة من لدغات جنبا إلى جنب مع الأحداث التغذية الأخرى. ل "فحوصات جثة" مرة أخرى باستخدام P. الحيوانات المفترسة pacificus على C. ايليجانس فريسة، 5 الحيوانات المفترسة لمدة 2 ساعة أنتجت أرقام جثة قابلة للقياس بسهولة ومتسق يتيح للالتحليل السلوكي السريع. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنواع مختلفة من الخطوة النيماتودا المفترسة بسرعات مختلفة، وتناول الطعام بمعدلات مختلفة وعموما يبرهن على وجود تنوع كبير في السلوكيات الأخرى 1. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تؤكل أنواع الفرائس المختلفة بمعدلات مختلفة لأسباب مشابهة. لذا فمن المستحسن لتحسين فحوصات استنادا إلى أنواع النيماتودا اختبارها على حد سواء والحيوانات المفترسة والفرائس، وأيضا عن أي اختلافات في الظروف البيئية. خلال كل من "لدغة" و "فيلقه "المقايسات فمن الأهمية بمكان أن كلا فريسة الحيوانات المفترسة ويتمتعون بصحة جيدة، كما أكد أو والحيوانات المفترسة جرح لا تقتل بكفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، لوحات فحص جديدة ضرورية لوحات كبار السن يمكن أن تصبح جفت الذي يؤثر سلبا على صحة النيماتودا مما يؤدي إلى خاطئ المقايسات. ومن المأمول أيضا أن التكرار في المستقبل من هذه المقايسات المفترسة سوف تكون قادرة على الاستفادة من التطورات الحديثة في مجال التكنولوجيا من أجل أتمتة الكثير من التحليلات كما تم انجازه لتحقيق العديد من السلوكيات التي لوحظت في C. ايليجانس 21 و 22. وفي الوقت الراهن ومن المحتمل أن تنشأ في الديدان الخيطية مثل P. pacificus المشاكل كما تظهر أكثر حساسية في الاتصال، مما يجعل العزلة والشلل في غرف ميكروفلويديك المرجح أن تلغي التغذية المفترسة. التغلب على هذا قد يكون صعبا ولكن من شأنه أن يسهل الديدان الخيطية الفردية ليتم عرضه للدهاء المفترسة السلوكيات.

وأخيرا، قدمنا ​​أيضا طرق FOص فحص جهاز التغذية الخيطية نفسه تسهيل المقارنات بين أوضاع التغذية المفترسة والبكتيرية عن طريق قياس الأسنان وضخ البلعوم حركية باستخدام كاميرا عالية السرعة (بروتوكول 4). القياس الكمي لمعدلات البلعوم الضخ في C. وقد استخدمت ايليجانس لمراقبة التغذية لسنوات عديدة 23، ومع ذلك، C. ايليجانس تفتقر إلى أي شكل من أشكال سنينة الفم وأيضا تفتقر إلى السلوكيات المفترسة. من خلال الجمع بين تقدير من بلعومي ضخ مع أن النشاط الأسنان، أي تعصيب للأسنان محددة لالافتراس يمكن ملاحظتها أيضا. ويرجع ذلك إلى التكبير المطلوبة لمراقبة حركة الأسنان الحيوانات في كثير من الأحيان الخروج من الطائرة الاتصال، وبالتالي من الممكن عادة فقط لمراقبة الأسنان للنوافذ زمنية قصيرة. بالإضافة إلى ذلك، على عكس C. ايليجانس، البلعوم من P. pacificus لا تضخ بشكل مستمر، بل يشارك في فترات الضخ والتغذية. لذلك، لدقيق الم البلعوممعدلات بينغ في حين تغذية يحدد لاحقا، فمن المهم لتسجيل 15 ثانية من تغذية مستمرة.

وبالتالي، توفر هذه الأساليب المقدمة هنا في الإطار الأول للتحقيق في السلوكيات المفترسة في أنظمة الخيطية. وعلاوة على ذلك، فإنها قد تكون أيضا قابلة للتكيف لاستخدامها في التحقيق في التفاعلات الأخرى داخل النظام الإيكولوجي الخيطية بما في ذلك تأثير الكائنات الحية بالإضافة إلى ذلك ذات الصلة من الناحية البيئية على الافتراس بما في ذلك الكائنات الحية الدقيقة والفطريات والعث . وبالتالي فإنها توفر وسيلة لتشريح كيف يتم تنظيم هذه السلوكيات المفترسة، وكيف أنها قد تطورت وأيضا أهمية البيئية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nylon net filters (20 µm) Merck Millipore Ltd NY2004700 Used to filter worms just leaving larvae for use as prey.
PP Funnel for filter (54 mm) Duran 292215003 Used to filter worms just leaving larvae for use as prey.
Small petri dish (35/10 mm) Greiner Bio-One  627102 For imaging on High speed camera
Zeiss SteREO Discovery V12 For mouth form identificaton
Axio-Imager A1 For mouth form identificaton
Glass Slides Roth H869
Cover Slips Roth 657
Motion Scope M3 Highspeed camera IDT High speed camera
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5X to 2.4X Zeis 452984-0000-000 High speed camera zoom
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients:
Agar Roth 5210.2 CAS-Nr. 9002-18-0
Sodium chloride (NaCl) Roth 3957 CAS-Nr. 7647-14-5
Bacto Tryptone BD 211699 Lot 4316614
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich C3306 CAS-Nr. 10035-04-8
Cholesterol from lanolin Sigma-Aldrich F 26732 00050 CAS-Nr. 57-88-5
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) Merck 1,058,861,000 CAS-Nr. 10034-99-8
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) ACROS organics 271080025 CAS-Nr. 7778-77-0
6 cm petri dish Greiner Bio-One 628102
3.5 cm petri dish Greiner Bio-One 627102
M9 ingredients:
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) ACROS organics 271080025 CAS-Nr. 7778-77-0
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) Sigma-Aldrich S9390-500G-D CAS-Nr. 7782-85-6
Sodium chloride (NaCl) Roth 3957 CAS-Nr. 7647-14-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilecki, M., Lightfoot, J. W., Susoy, V., Sommer, R. J. Predatory feeding behaviour in Pristionchus nematodes is dependent on phenotypic plasticity and induced by serotonin. J Exp Biol. 218, (Pt 9), 1306-1313 (2015).
  2. Ragsdale, E. J., Muller, M. R., Rodelsperger, C., Sommer, R. J. A Developmental Switch Coupled to the Evolution of Plasticity Acts through a Sulfatase. Cell. 155, (4), 922-933 (2013).
  3. Goodman, M. B. Mechanosensation. WormBook. 1-14 (2006).
  4. Rankin, C. H. Nematode behavior: the taste of success, the smell of danger! Curr Biol. 16, (3), R89-R91 (2006).
  5. Beverly, M., Anbil, S., Sengupta, P. Degeneracy and neuromodulation among thermosensory neurons contribute to robust thermosensory behaviors in Caenorhabditis elegans. J Neurosci. 31, (32), 11718-11727 (2011).
  6. Kimata, T., Sasakura, H., Ohnishi, N., Nishio, N., Mori, I. Thermotaxis of C. elegans as a model for temperature perception, neural information processing and neural plasticity. Worm. 1, (1), 31-41 (2012).
  7. Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. Elife. 4, (2015).
  8. Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
  9. Sherlekar, A. L., Lints, R. Nematode Tango Milonguero - the C. elegans male's search for the hermaphrodite vulva. Semin Cell Dev Biol. 33, 34-41 (2014).
  10. Sasakura, H., Mori, I. Behavioral plasticity, learning, and memory in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 23, (1), 92-99 (2013).
  11. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. 1-23 (2012).
  12. Bumbarger, D. J., Riebesell, M., Rodelsperger, C., Sommer, R. J. System-wide Rewiring Underlies Behavioral Differences in Predatory and Bacterial-Feeding Nematodes. Cell. 152, (1-2), 109-119 (2013).
  13. Dieterich, C., et al. The Pristionchus pacificus genome provides a unique perspective on nematode lifestyle and parasitism. Nature Genetics. 40, (10), 1193-1198 (2008).
  14. Schlager, B., Wang, X. Y., Braach, G., Sommer, R. J. Molecular Cloning of a Dominant Roller Mutant and Establishment of DNA-Mediated Transformation in the Nematode Pristionchus pacificus. Genesis. 47, (5), 300-304 (2009).
  15. Witte, H., et al. Gene inactivation using the CRISPR/Cas9 system in the nematode Pristionchus pacificus. Dev Genes Evol. 225, (1), 55-62 (2015).
  16. Lo, T. W., et al. Precise and Heritable Genome Editing in Evolutionarily Diverse Nematodes Using TALENs and CRISPR/Cas9 to Engineer Insertions and Deletions. Genetics. 195, (2), 331-348 (2013).
  17. Sommer, R. J., McGaughran, A. The nematode Pristionchus pacificus as a model system for integrative studies in evolutionary biology. Molecular Ecology. 22, (9), 2380-2393 (2013).
  18. Herrmann, M., et al. The nematode Pristionchus pacificus (Nematoda : Diplogastridae) is associated with the oriental beetle Exomala orientalis (Coleoptera:Scarabaeidae) in Japan. Zoological Science. 24, (9), 883-889 (2007).
  19. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
  20. Serobyan, V., Ragsdale, E. J., Sommer, R. J. Adaptive value of a predatory mouth-form in a dimorphic nematode. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 281, 20141334 (2014).
  21. Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat Methods. 8, (7), 599-605 (2011).
  22. Yeminin, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nat Methods. 9, (10), 877-879 (2013).
  23. Raizen, D. M., Lee, R. Y. N., Avery, L. Interacting Genes Required for Pharyngeal Excitation by Motor Neuron MC in Caenorhabditis elegans. Genetics. 141, (4), 1365-1382 (1995).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics