Saggio comportamenti alimentari predatori in * These authors contributed equally

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Lightfoot, J. W., Wilecki, M., Okumura, M., Sommer, R. J. Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes. J. Vis. Exp. (115), e54404, doi:10.3791/54404 (2016).

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Abstract

Introduction

I nematodi con le loro piccole ma complessi sistemi nervosi si sono rivelati potenti strumenti per la comprensione di molti aspetti della neurobiologia, tra cui comportamento. Gran parte di questa ricerca si è concentrata sulla organismo modello Caenorhabditis elegans in cui un gran numero di diversi comportamenti sono stati sezionati e analizzati con successo. Questi includono meccanosensoriali 3, 4 chemiotattica, thermotactic 5,6 e 7 magnetotactic influenzare l'accoppiamento 8,9, l'apprendimento e l'alimentazione 10 comportamenti 11. Tuttavia, altre specie di nematodi più distante relativi mostrano comportamenti che non si osservano nel rhabditid C. elegans o in alternativa mostrano ulteriori livelli di complessità, che solleva domande pertinenti per quanto riguarda la loro evoluzione e la regolamentazione. Uno di questi casi di questo può essere osservato nel lontanamente connessi diplogastrid nematode Pristionchus pacificus, che visualizza molto più complessa di alimentazione esserecomporta- e ritmi che si osservano in C. elegans 1. Questo nonostante le due specie condividono neuroni faringei omologhi 12. In concomitanza con questi comportamenti di alimentazione aggiuntivi, P. pacificus mostra anche una gamma alimentare espanso, in quanto sono predatori avidi, in grado di integrare la loro dieta batterica anche nutrendosi di larve di altri nematodi. Fortunatamente, P. pacificus è stato sviluppato come un modello per la biologia evolutiva e comparativa integrativo e quindi molti strumenti molecolari e genetici sono ora disponibili. Questi includono un genoma completamente sequenziato e annotato 13, strumenti molecolari e genetici, tra cui transgeni 14 e CRISPR / Cas9 15,16, nonché una dettagliata e ben annotato filogenesi 17 con oltre 25 specie strettamente correlate tra le sue specie sorelle di recente scoperta. Inoltre, l'ecologia di numerose specie Pristionchus tra cui P. pacificus è noill definito con molte specie essendo ora descritta la condivisione di una associazione Necromenic con scarabei, un host che condividono spesso con altre specie di nematodi 18. P. pacificus fornisce quindi un sistema modello eccellente con cui analizzare l'evoluzione dei comportamenti nuovi e la loro importanza ecologica.

Al fine di analizzare i comportamenti alimentari predatori in specie di nematodi, come P. pacificus abbiamo sviluppato diversi test comportamentali nuovi per una facile osservazione e la quantificazione delle azioni predatorie. Come P. pacificus mostra una struttura bocca dimorphic, che influenza fortemente il comportamento predatorio, identificazione del morfotipo corretta è essenziale 1,2. La stretta bocca metamorfosi stenostomatous contiene un solo dente dorsale smussato e non svolge alcuna alimentazione predatori. In alternativa, l'ampia bocca metamorfosi eurystomatous include una molto più grande a forma di artiglio dente dorsale e un ulteriore oppostesub-ventrale dente, che insieme operano per aprire in modo efficiente la cuticola delle loro prede. Il rapporto tra la eurystomatous predatori alla forma stenostomatous non predatori varia tra le specie Pristionchus e anche all'interno P. pacificus, tuttavia, la percentuale della bocca eurystomatous trasformarsi in P. pacificus ceppo selvatico (PS312) è di solito 70 - 90% 2. Inoltre, i rapporti di forma della bocca può variare a seconda di diversi fattori ambientali (sia a conoscenza, anche fame e qualche piccola molecola di segnalazione così come i fattori sconosciuti), in tal modo la corretta identificazione e l'isolamento della forma bocca eurystomatous predatori è essenziale per le analisi predatori di successo.

Accanto alla descrizione della forma della bocca predatori abbiamo sviluppato un "saggio morso" per l'osservazione diretta e la quantificazione dei comportamenti predatori, tra cui mordere, uccidendo e alimentando eventi. Qui nematodi prede sono isolati attraverso il filtroing delle culture di recente fame ed esposti a predatori adulti P. pacificus, che si osservano insieme in un breve lasso di tempo. Inoltre, abbiamo anche sviluppato un elevato throughput "saggio cadavere" per facilitare una rapida proiezione di comportamenti predatori attraverso l'osservazione indiretta di eventi predatori. Questo si avvale della presenza di cadaveri larvali come strumento per lo screening per predazione. Entrambi i test forniscono metodi semplici e altamente ripetibili per l'osservazione e la misurazione comportamenti predatori di specie di nematodi, come P. pacificus.

Protocol

1. Bocca modulo Fenotipizzazione

  1. Bocca di identificazione Modulo su Agarose Pads
    Nota: Per visualizzare i morph bocca nematodi, immobilizzare i vermi con un trattamento anestetico delicato sul pad agarosio e osservare quanto segue.
    1. Crescere e mantenere le culture di nematodi, come P. pacificus su 6 cm di media crescita nematode di serie (NGM) piatti ed alimenti su un prato batterica di E. coli OP50 19.
    2. Rendere pastiglie agarosio aggiungendo prima 0,06 g di agarosio al 3 ml H 2 O in una provetta da 15 ml a fare 3 ml 2% di soluzione di agarosio. Questo può essere conservato fino ad un anno a 4 ° C.
    3. Mescolare e sciogliere l'agarosio a fondo in un forno a microonde o in alternativa utilizzare un blocco di calore impostato a> 88 ° C.
    4. Una volta completamente sciolto, aggiungere 10 ml di una soluzione di sodio azide 10% al agarosio e miscelare accuratamente. ATTENZIONE: sodio azide Secco è reattivo e tutte le forme sono tossici.
    5. Utilizzando un 1 mlmicropipetta, una goccia di non meno di 300 microlitri della miscela azide agarosio liquido sul mezzo di un vetrino per microscopio standard.
    6. Prima della agar raffredda, inserire rapidamente un secondo vetrino da microscopio in cima della goccia per appiattire la agarosio che forma un rilievo sul raffreddamento. Ripetere l'operazione per il maggior numero di pastiglie come richiesto.
    7. Appena prima di usare, buccia a parte i vetrini per microscopio facendole scorrere l'un l'altro. Nota: Se pastiglie agarosio sono preparati troppo in anticipo possono essere eccessivamente secca e possono danneggiare i nematodi.
    8. Per trasferire i vermi ai pad agarosio anestetici, una goccia di M9 tampone (2 - 3 microlitri) sul centro del pad. Scegli 2-3 giovane P. adulti pacificus nella goccia di M9 prima di posizionare accuratamente un vetrino sopra il pad. Il P. nematodi pacificus saranno immobilizzati nella agarosio e pronto a visualizzare.
    9. Trasferire il vetrino da microscopio che contiene il worm anestetizzato di un microscopio del caso, unaND osservare sotto l'ottica 63X Nomarski. Categorizzare identità morph base alle seguenti caratteristiche: la presenza di un ulteriore dente sub-ventrale, ingrandita dente dorsale e apertura della bocca larga è indicativo di una bocca morph animale eurystomatous, mentre la presenza di un solo dente dorsale e stretta apertura della bocca indica un stenostomatous animale (Figura 1).
      Nota: Al fine di mantenere la salute degli animali, vermi devono essere mantenuti sul pad agar per non più di 5 min.
    10. Dopo l'identificazione bocca morph, recuperare i nematodi sia eurystomatous o stenostomatous come richiesto rimuovendo il vetrino facendo scorrere delicatamente fuori il pad agarosio. Scegliere con cura gli animali selezionati dalla pad agarosio (E. coli OP50 può essere utilizzato sul pick per contribuire a rendere vischiosi) su piastre NGM fresca. Consentire il recupero dall'anestesia fino comportamento motilità normale ha ripreso su cui gli animali sono pronti per ulteriori analisi predatori.
  2. <li> Rapid Bocca Fenotipizzazione
    Nota: in alternativa, con più esperienza, la bocca tipo modulo può essere saggiata senza necessità di alcun trattamento anestetico tramite uno stereomicroscopio con ingrandimento (150X).
    1. Luogo nematodi su piastre standard NGM con un prato batterica di E. coli OP50 sulla zona di visualizzazione al microscopio.
    2. Rilevare le differenze di dimensioni della bocca e larghezza. Nota: A questo ingrandimento senza denti come le strutture sono osservabili quindi identificazione bocca metamorfosi si basa esclusivamente su ampi bocche contro bocche strette.

2. Bite Assay

Nota: saggi Mordere permettono una dettagliata analisi del comportamento predatorio.

  1. Crescere e mantenere le culture nematodi su piastre NGM standard (6 cm) e si nutrono di un prato batterica di E. coli OP50 19.
  2. Fai piastre test facendo crescere una grande quantità di scelta prede delle larve di nematodi, come C. elegans o alternativa un adeguato preda ecologicamente rilevanti. Nota: Adulto C. elegans sono troppo grandi per essere adatto preda per cui è importante utilizzare lo stadio larvale.
    1. Mantenere C. elegans o altre prede potenziali su piastre standard NGM e si nutrono di un prato batterica di E. coli OP50 fino a quando la popolazione è appena morto di fame, con conseguente abbondanza di giovani larve L1.
      Nota: Tempo per fame dipende da numerosi fattori ambientali e sperimentali, incluso il numero di nematodi utilizzati per avviare la coltura, la quantità di E. coli OP50 aggiunto, e la temperatura ambiente.
  3. Lavare quattro o più lastre di prede appena fame con M9 e passare la soluzione verme attraverso due 20 micron filtri per rimuovere tutti gli animali di grandi dimensioni e le rimanenti uova prima raccolta in un tubo da 15 ml. Solo piccole larve dovrebbe rimanere nella soluzione.
  4. Per formare un pellet larvale centrifugare la preda filtrata a 377 g per 1 min.
  5. E. coli OP50 presente e attendere almeno 30 minuti per le larve a diffondersi in misura sufficiente a generare un piatto di test.
    Nota: 3 ml di puro pellet verme sulle piastre test standard contengono> 3.000 preda larve. Questo è sufficiente per generare frequente contatto tra predatori e prede.
  6. Schermo nematodi predatori per la morph bocca richiesta (protocollo 1).
  7. Utilizzando vite senza fine raccogliendo le tecniche standard e uno stereomicroscopio luce 19, trasferire i predatori correttamente classificati sulla piastra di dosaggio. Fare attenzione a trasferire come batteri poco OP50 possibile alla piastra di test durante il trasferimento di predatori per minimizzare la contaminazione batterica. Attendere 15 minuti per permettere al verme di recuperare dallo stress di essere trasferiti e verificare la presenza di wild-type comportamento motile per garantire i vermi non sono stati danneggiati dal trasferimento.
    Nota: Non c'è bisogno di morire di fame P. pacificus, in quanto sono altamente efficienti predatori di altre larve di nematodi anche mentre ben nutriti su di batteri.
  8. Dopo il recupero, osservare il predatore utilizzando uno stereomicroscopio luce per 10 minuti. Con questa apparecchiatura, osservare e caratterizzare eventi alimentazione distinti come mordere, caratterizzato dal predatore limitando il movimento della preda, uccidendo, dove da un'apertura della cuticola preda viene rilevato; e l'alimentazione, classificati per un consumo osservabile delle interiora preda (Figura 2A, B Movie 1).
  9. Ripetere l'analisi con lo screening e osservando un minimo di 10 singoli nematodi predatori per garantire l'accuratezza.

3. Corpse Assay

Nota: saggi Corpse facilitano una più rapida quantificazione di comportamenti predatori.

  1. Crescere e mantenere le culture nematodi su piastre standard NGM e si nutrono di un l battericaAWN di E. coli OP50 19. Generare triplicato delle piastre test citati in precedenza (protocollo 2,1-2,5).
  2. Schermo nematodi predatori per la metamorfosi bocca richiesto come descritto nel protocollo 1. Utilizzando vite senza fine raccogliendo le tecniche standard e un trasferimento stereomicroscopio luce 5 nematodi predatori con la metamorfosi bocca richiesto per ogni piatto saggio. Lasciare i predatori insieme con la preda per 2 ore.
  3. Dopo 2 ore a schermo piatto saggio per la presenza di corpi svuotati (Figura 2B e C). Identificare i cadaveri per l'assenza di motilità con difetti morfologici evidenti tra perdite interiora o mancante frammenti vite senza fine.

4. Analisi di faringeo e dente Movimento

  1. Crescere e mantenere le culture nematodi su piastre standard NGM e si nutrono di un prato batterica di E. coli OP50 19. Generare piastre saggio come accennato in precedenza (protocollo 2,1-2,5). Se standard di 6 cmpiastre NGM non si adattano tra l'obiettivo e il palco microscopio, utilizzare il coperchio di piccoli 35 mm capsule di Petri, contenenti 2 ml NGM come una valida alternativa.
  2. Schermo nematodi predatori per la metamorfosi bocca richiesto come descritto nel protocollo 1. Utilizzando verme standard di raccolta e tecniche di uno stereomicroscopio luce, trasferire un singolo predatore classificato correttamente sulla piastra di dosaggio. Attendere 15 minuti per permettere al verme di recuperare dallo stress di essere trasferiti.
  3. Osservare gli animali predatori su un microscopio a 40 - 63X Normaski, con una telecamera ad alta velocità (Video 2 e 3). Record faringeo pompaggio e il movimento dei denti oltre 15 sec, a 50 Hz in almeno 20 animali per garantire la quantificazione precisa. Replay ha registrato i film alla velocità desiderata per contare le singole pompe ed eventi denti.
    Nota: pompaggio è osservata nel corpus, situata al centro della faringe, mentre il movimento del dente è rilevabile in apertura della bocca ed è solo observito dal dente dorsale.

Representative Results

Dopo l'identificazione di successo del morph bocca appropriata in P. pacificus, chiare differenze tra gli animali eurystomatous e stenostomatous può essere rilevato (Figura 3), con solo gli animali eurystomatous impegnati a uccidere comportamento. Negli animali stenostomatous questo comportamento sembra essere soppressa del tutto. Inoltre, le differenze dell'attività dente e della faringe pompaggio di animali eurystomatous sui batteri e prede (figura 4 e Video 2 e 3) sono anche evidenti. Mentre l'alimentazione predatori, il tasso di pompaggio si riduce al di sotto di quello osservato durante l'allattamento batterica e il movimento dei denti viene rilevato in un rapporto uno a uno con il pompaggio della faringe. Questo è potenzialmente indicativo di meccanismi regolatori chiave che modulano la risposta comportamentale alle diverse dieta.

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Figura 1. P. pacificus ha una bocca Dimorfismo che influenza comportamento alimentare. (A) La forma della bocca eurystomatous è in grado di predazione e ha una vasta apertura della bocca con una grande forma di artiglio dorsale dente (falso-colore rosso) e (B) un grande avversario gancio a forma di dente sub-ventrale (falso-colore blu). (C) La forma della bocca stenostomatous è in grado di nutrirsi di batteri solo e ha una apertura della bocca più stretta con una forma di selce dorsale dente (falso-colore rosso) e (D) senza denti sub-ventrale (*). Immagini Normaski sono 63X e barra della scala rappresenta 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Predazione dosaggi. (A) P. pacificus morde e uccide le larve di altri nematodi come C. elegans. (B) Per i saggi mordere, il numero di bitesby predatori (*) si può osservare utilizzando uno stereomicroscopio luce e l'uccisione di successo e di alimentazione eventi anche registrati. I cadaveri sono anche ben visibili (cerchi). (C) Per i saggi di cadaveri, carcasse larvali (frecce) possono essere facilmente identificati confrontati con larve vive. Barra di scala rappresenta 1 mm in B e 150 micron di C. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Risultati del morso e Corpse saggi su C. elegans Prey. (A) comportamento Mordere è evidente solo in forma bocca eurystomatous con questo comportamento non visualizzate in animali stenostomatous. Barra di errore rappresenta la deviazione standard di 10 replicati. (B) In coincidenza con nessun comportamento mordere evidente da animali stenostomatous, saggi cadavere rivelano anche carcasse solo su lastre test di animali eurystomatous. Barra di errore rappresenta la deviazione standard di 5 replicati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Eurystomatous pompaggio Rate e dente Movimento durante l'allattamento Predatori. Movimento dentale è stata osservata solo mentre gli animali eurystomatous sono impegnati per l'alimentazione degli predatori. Questo coincide anche con una riduzione faringea pompaggio. barra di errore rappresenta la deviazione standard di 10 replicati. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig4large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

film 1
Movie 1. Osservazione del Comportamento Uccidere per Assay Bite utilizzando uno stereomicroscopio luce. (Tasto destro del mouse per scaricare).

Movie 2
Movie Camera Movie 2. Alta velocità di P. pacificus uccidendo C. elegans larve. (Tasto destro del mouse per scaricare).

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Movie 3. ingrandita ad alta velocità della macchina fotografica del dente movimento durante predazione. (Tasto destro del mouse per scaricare).

Discussion

I nematodi forniscono un potente sistema per la comprensione neurobiologia e comportamento con C. elegans finora essere lo strumento principale. Tuttavia, numerose specie di nematodi, tra cui P. comportamenti di visualizzazione pacificus, che sono assenti o variano per complessità dalla organismo modello C. elegans e quindi sollevano questioni interessanti per quanto riguarda l'evoluzione e la regolamentazione di questi comportamenti. Un tale comportamento aggiuntivo trovato in molte altre specie di nematodi inclusi P. pacificus è la capacità di integrare la propria dieta batterica impegnandosi per l'alimentazione degli predatori 1, 20. Per questo motivo abbiamo sviluppato e descritto un protocollo dettagliato per una facile e rapida caratterizzazione di questi comportamenti predatori in precedenza non analizzati in nematodi.

In primo luogo, abbiamo fornito i metodi per lo screening per le variazioni in apparati di alimentazione all'interno della bocca nematode. L'identificazione del tipo corretto bocca è un elemento essenziale prima sTep per le prove di predazione di successo come, almeno all'interno del genere Pristionchus solo gli animali eurystomatous sono in grado di alimentare predatori. E 'meglio identificare bocca si trasforma con il protocollo "rapida bocca fenotipizzazione" descritto nel protocollo 1.2 in quanto questo metodo è molto meno invasivo e quindi è meno probabile che i comportamenti predatori possono essere turbati. Tuttavia, si raccomanda di diventare prima familiarità con le diverse strutture bocca dall'identificazione con animali anestetizzati su pattini di agar (protocollo 1.1).

Dopo l'identificazione del morph bocca desiderato, abbiamo descritto due saggi per quantificare l'alimentazione predatori. Questi sono un rapido, high throughput "assay cadavere" (protocollo 3) ed un altro tempo ma analisi comportamentale più approfondita attraverso il "test morso" (protocollo 2). Entrambi questi protocolli sono altamente flessibile consentendo diverse modifiche al fine di ottimizzare i saggi seconda delle sperirequisiti Tal. Per i saggi morso utilizzando P. predatori pacificus su C. elegans prede, osservazioni delle interazioni comportamentali predatori per una finestra temporale di 10 minuti era sufficiente per quantificare una quantità significativa di punture insieme ad altri eventi alimentazione. Per i "saggi" cadavere ancora una volta utilizzando P. predatori pacificus su C. elegans prede, 5 predatori per 2 ore ha prodotto numeri cadavere facilmente quantificabili e coerenti che consentano una rapida analisi comportamentale. Tuttavia, va notato diverse specie di predatori mossa nematode a velocità diverse, mangiare a velocità diverse e generalmente mostrano una grande diversità in altri comportamenti 1. Inoltre, diverse prede possono essere consumati a velocità diverse per ragioni analoghe. Si raccomanda pertanto di ottimizzare le analisi basate sulle specie di nematodi testati sia come predatori e prede, e anche per le eventuali differenze di condizioni ambientali. Durante entrambi "morso" e "corpie "test è fondamentale che sia prede e predatori sono sani, come sottolineato o predatori feriti non uccideranno in modo efficiente. Inoltre, le piastre test freschi sono essenziali come piatti più anziani possono diventare asciugato che influisce negativamente sulla salute dei nematodi che porta alla erronea saggi. Si spera inoltre che le future iterazioni di questi saggi predatori saranno in grado di sfruttare i recenti progressi nella tecnologia, al fine di automatizzare gran parte delle analisi, come è stato fatto per indagare molti comportamenti osservati in C. elegans 21, 22. Attualmente i problemi possono sorgere nei nematodi, come P. pacificus come appaiono molto più sensibili al contatto, rendendo l'isolamento e l'immobilizzazione in camere microfluidica probabilità di abrogare l'alimentazione predatori. il superamento di questa potrebbe rivelarsi impegnativo, ma faciliterebbe singoli nematodi a essere sottoposti a screening per il sottile predatori comportamenti.

Infine, abbiamo anche fornito metodi FOR esaminando l'apparato di alimentazione nematode stesso facilitando il confronto tra le modalità di alimentazione predatori e batteriche quantificando la cinetica dei denti e della faringe di pompaggio con una macchina fotografica ad alta velocità (protocollo 4). La quantificazione dei tassi faringea di pompaggio in C. elegans è stato utilizzato per monitorare l'alimentazione per molti anni 23, tuttavia, C. elegans è priva di qualsiasi forma di bocca denticle e manca anche comportamenti predatori. Attraverso combinando la quantificazione della faringe pompaggio con quello dell'attività dente, qualsiasi innervazione dei denti specifici predazione può essere anche osservata. A causa l'ingrandimento necessario per osservare il movimento dei denti degli animali muovono spesso fuori del piano focale, quindi è di solito possibile solo osservare il dente per finestre temporali brevi. Inoltre, a differenza C. elegans, la faringe di P. pacificus non continuo della pompa, ma piuttosto si impegna in periodi di pompaggio e l'alimentazione. Pertanto, per un accurato pum faringeacon tempi di risposta mentre l'alimentazione da determinare, è importante registrare 15 secondi di alimentazione continua.

Questi metodi qui presentati forniscono quindi il primo quadro per indagare i comportamenti predatori nei sistemi di nematodi. Inoltre, possono anche essere adattabile per l'impiego nelle indagini altre interazioni all'interno dell'ecosistema nematode tra cui l'influenza di organismi inoltre ecologicamente rilevanti sulla predazione compresi microrganismi, funghi e acari . Così essi forniscono un mezzo per analizzare come questi comportamenti predatori sono regolate, come essi si siano evoluti e anche la loro importanza ecologica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nylon net filters (20 µm) Merck Millipore Ltd NY2004700 Used to filter worms just leaving larvae for use as prey.
PP Funnel for filter (54 mm) Duran 292215003 Used to filter worms just leaving larvae for use as prey.
Small petri dish (35/10 mm) Greiner Bio-One  627102 For imaging on High speed camera
Zeiss SteREO Discovery V12 For mouth form identificaton
Axio-Imager A1 For mouth form identificaton
Glass Slides Roth H869
Cover Slips Roth 657
Motion Scope M3 Highspeed camera IDT High speed camera
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5X to 2.4X Zeis 452984-0000-000 High speed camera zoom
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients:
Agar Roth 5210.2 CAS-Nr. 9002-18-0
Sodium chloride (NaCl) Roth 3957 CAS-Nr. 7647-14-5
Bacto Tryptone BD 211699 Lot 4316614
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich C3306 CAS-Nr. 10035-04-8
Cholesterol from lanolin Sigma-Aldrich F 26732 00050 CAS-Nr. 57-88-5
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) Merck 1,058,861,000 CAS-Nr. 10034-99-8
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) ACROS organics 271080025 CAS-Nr. 7778-77-0
6 cm petri dish Greiner Bio-One 628102
3.5 cm petri dish Greiner Bio-One 627102
M9 ingredients:
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) ACROS organics 271080025 CAS-Nr. 7778-77-0
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) Sigma-Aldrich S9390-500G-D CAS-Nr. 7782-85-6
Sodium chloride (NaCl) Roth 3957 CAS-Nr. 7647-14-5

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References

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