تقارب كشف وسمها الذاتية المستقبلات من الزرد الأجنة

1Cell and Developmental Biology, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Molina-Villa, T., Mendoza, V., López-Casillas, F. Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (114), e54405, doi:10.3791/54405 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب التي أجريت على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان المعملية واستخدام الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك (UNAM)، تحت رقم CICUAL-البروتوكول: FLC40-14. (CICUAL: "COMITE Institucional الفقرة شرم CUIDADO ذ الالتزام بتعميم الخدمات دي لوس Animales دي ابوراتوريو ديل معهد Fisiologìa متنقل، الجامعة الوطنية المستقلة للمكسيك").

1. إعداد استخراج الجنين البروتين

  1. جمع 100-200 الأجنة لكل حالة للمقارنة (morphants مقابل النوع البري) في المرحلة المطلوبة، على سبيل المثال 72 ساعة بعد الإخصاب (HPF).
  2. مكان الأجنة في أطباق بتري تحتوي على أسماك المياه (انظر الجدول 1) وdechorionate أجنة باستخدام ملقط غرامة الرؤوس يدويا. تجنب استخدام pronase خلال هذه الخطوة (أو أي البروتيني الآخرين في جميع أنحاء بروتوكول) لأنها قد هضم مستقبلات المستهدفة.
  3. مكان الأجنة في أنبوب 1.5 مل microfuge وغسل الأجنة TWالجليد مع حل العازلة 1X الفوسفات (PBS) (انظر الجدول 1).
  4. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة deyolk (انظر الجدول 1).
  5. إطلاق سراح أكثر من صفار قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا (حوالي 30 - 40 مرة) الأجنة في الحل. لمدة 72 HPF و 48 الأجنة HPF استخدام الأزرق والأصفر نصائح ماصة، على التوالي. قد تحتاج إلى خفض قليلا لتجنب تدمير الأجنة نصائح الصفراء. الإفراج صفار ناجحة يمكن التحقق من خلال مراقبة الأجنة تحت المجهر.
  6. جمع الأجنة عن طريق الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 15 ثانية.
  7. تجاهل طاف بعناية باستخدام الماصة.
  8. غسل الأجنة مرتين مع 500 العازلة غسل ميكرولتر (انظر الجدول 1) قبل vortexing بلطف على أقل سرعة.
  9. جمع الأجنة عن طريق الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 15 ثانية.
  10. بدءا من هنا، ومواصلة الإجراء في 4 درجات مئوية.
  11. تجاهل طاف بعناية باستخدام الماصة.
  12. الأجنة resuspend في 350 ميكرولتر من تحلل العازلة (انظر الجدول 1) والتجانس باستخدام مدقة البلاستيكية.
  13. احتضان الأجنة هي lysed 30 دقيقة مع التحريض على الكرسي الهزاز أنبوب اختبار في 4 درجات مئوية.
  14. هي lysed الطرد المركزي الأجنة في 11000 x ج لمدة 15 دقيقة من أجل إزالة الحطام غير قابلة للذوبان.
  15. نقل مسح طاف باستخدام الماصة لأنبوب جديد.
  16. تحديد البروتين الكلي من قبل برادفورد البروتين فحص أو غيرها من الإجراءات المناسبة. إذا تم استخدام برادفورد مقايسة، نفذ منحنى المعايرة في وجود تركيزات ما يعادل المنظفات يعرض في المخزن المؤقت تحلل، لأنها تتسبب في التقليل من البروتين القياسية 4.

2. الكشف عن البروتين الذاتية مستقبلات

  1. تقارب وصفها ومناعي (كل هذه الخطوات في 4 درجة مئوية)
    1. ضع 400-500 ميكروغرام من البروتين الكلي الجنين في أنبوب 1.5 مل microfuge وتمييع إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر مع العازلة 1 (انظر الجدول 1).
      ملاحظة: من أجل الحصول على 500 ميكروغرام من البروتين الكلي جنين، حوالي 100-200 الأجنة يجب أن تتم معالجتها في البداية. 72 HPF الأجنة تسفر بشكل روتيني ~ 5 ميكروغرام من البروتين الكلي الجنين، وهو ما يكفي لكشف betaglycan.
    2. إضافة إلى حجم ما يكفي من المسمى الأسهم TGF-β2 للوصول إلى تركيز النهائي من 150 م واحتضان مع الإثارة في أنبوب اختبار الروك 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. يجب أن يكون المسمى TGF-β2 قبل بدء AFLIP، مع 125 أنا من طريقة تي الكلورامين كما وصفها Cheifetz وآخرون. 5.
      تنبيه: استخدام وقائية للحد من التعرض أثناء التعامل مع 125 أنا المسمى يجند.
    3. إضافة إلى حجم ما يكفي من الأجسام المضادة غير مخفف ضد مستقبلات الفائدة من أجل التوصل إلى التخفيف 1: 100 وتستمر الحضانة لمدة 2 ساعة أخرى في 4 درجات مئوية (قد تكون حضانة O / N). هذا هو تخفيف الأمثل للمصل رقم 31، وتستخدم في هذه الدراسة، ووصف أماكن أخرى ولكن هذا يتوقف على نوعية علىtibody، قد يكون تخفيف أكبر أو أصغر الأمثل.
    4. إضافة 50 ميكرولتر من الخرز ملزمة المناعي مناسب (على سبيل المثال، G-البروتين سيفاروز، الذي سبق معايرتها في TNTE ومعلق 1: 5 من حجمه الأصلي في TNTE)، واحتضان لمدة 50 دقيقة مع التحريض على الكرسي الهزاز أنبوب اختبار في 4 درجات C.
    5. استرداد الخرز التي microcentrifugation في 11000 x ج لمدة 20 ثانية.
    6. تجاهل طاف في حاوية القمامة المشعة المناسبة.
    7. غسل حبات IP ثلاث مرات مع 1 مل من غسل العازلة IP (انظر الجدول 1)، قبل vortexing وmicrocentrifugation في 11000 x ج لمدة 20 ثانية في كل مرة.
    8. و resuspend IP-الخرز في 250 ميكرولتر من غسل العازلة IP.
    9. إضافة 1.5 ميكرولتر من disuccinimidyl suberate (مفاجآت صيف دبي، وحلت في DMSO في 10 ملغ / مل). إعداد الحل مفاجآت صيف دبي قبل استخدامه في هذه الخطوة.
    10. احتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الإثارة.
    11. من أجل إخماد رد فعل يشابك، إضافة 500 ميكرولتر سغسل العازلة و IP، على أن تستكمل مع ما يكفي من الأسهم تريس الكلورين ودرجة الحموضة 7.4 لتصل إلى 25 ملي تريس الكلورين. المجموعات الأمينية الحرة في تريس التقاط DSS غير المتفاعل.
    12. أجهزة الطرد المركزي في 11000 x ج لمدة 20 ثانية لجمع IP-الخرز وتجاهل طاف.
    13. و resuspend IP-الخرز في 30 ميكرولتر من الحد عازلة Laemmli.
    14. عينات يغلي مدة 5 دقائق في 94 درجة مئوية.
    15. اختياريا، تحليل العينات في عداد جاما باستخدام بروتوكول الشركة الصانعة.
  2. تحليل عينة
    1. العينات تخضع لتغيير طبيعة SDS-PAGE. استخدام بولي أكريلاميد في نسبة ملائمة لكتلة المستقبل وتشغيل هلام تحت الإجراء العادي.
    2. تزج جل في حل تثبيتي (انظر الجدول 1) لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. غسل هلام مع المياه المقطرة لمدة 15 دقيقة.
    4. وضع الجل في ورق الترشيح رطب سابقا، وتغطي مع فيلم ساران التفاف.
    5. هلام الجافة في 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. فضح الجل على أفلام ا phosphorimager الأبيضأون في RT O / N.
    7. مسح الشاشة يتعرض باستخدام phosphorimager باستخدام بروتوكول الشركة الصانعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 نتيجة ممثل حصلت مع AFLIP. إشارات في حارة 1 تأتي من 125 I-يجند مرتبطة تساهميا إما إلى الزرد البروتين betaglycan الأساسية (BG الأساسية، تحت علامة كيلو دالتون 150) أو جوهر BG التي تم تجهيزها لشكله بروتيوغليكان عن طريق الحجز من الجليكوسامينوجليكان (GAG، لطخة تتراوح بين 170 كيلو دالتون إلى الجزء العلوي من هلام). هذا النمط من الهجرة، وهو بروتين الأساسية حاد بالإضافة إلى بروتيوغليكان طخت (بسبب عدم التجانس في طول السلاسل GAG)، هو سمة من TGFBR3 2. منذ مفاجآت صيف دبي لا ربط تساهمي كل واحد مجمع يجند مستقبلات تشكيل، هناك حرة 125 I-يجند تظهر في الجبهة الهجرة من هلام (125 I-TGF-β2). وكان من شأن ذلك يجند مجانا لمستقبلات، وبقي ملتزما خلال مناعي، ولكن منذ ولم تعلق تساهمي، فصل أثناء إجراء SDS-PAGE. لاnetheless، وقوة إشارة ما زال يرتبط إلى احد نظرا لمستقبلات المسمى. وهذا يمكن أن يكون موضع تقدير من خلال مقارنة الممرات 2 و 3. في 48 HPF الأجنة الزرد يحمل كميات أقل من BG من 72 الأجنة HPF وهو ما يمكن ملاحظته من خلال إشارات باهتة في GAG وBG الأساسية، التي تتوافق مع شدة الإشارات التي قدمها يجند الحرة التي تظهر في الجزء الأمامي من هلام (حارة 2). وبالنظر إلى أن الأجسام المضادة ضد الفئران BG 6 لا عبر تتفاعل مع ZF BG، الأجسام المضادة عند استخدامها في AFLIP لم يعط إشارة لذلك، بمثابة سيطرة سلبية (حارة 3). وتم الحصول على نتائج سلبية مماثلة مع المصل قبل المناعي للأجسام المضادة لمكافحة ZF BG 3.

ويبين الشكل 2 كيف AFLIP يمكن استخدامها لقياس مستويات التعبير عن مستقبلات معينة في الأجنة يتعرضون للتلاعب التجريبية، في هذه الحالة، انخفاض betaglycan بسبب morpholino فيjection 3. لين 1 يبين مستوى TGFBR3 في 72 HPF نوع الجنين البرية، في حين لين 2 يبين تأثير إدارة 7 نانوغرام من morpholino توجه إلى الحدود-exon2 intron2 من النسخة الأولية ZF BG. لاحظ أن BG أسفل اللائحة التي تم الحصول عليها مع هذا morpholino لا تتكرر من قبل لمراقبة سوء يقابل (حارة 3). وأكدت هذه النتائج أن النمط الظاهري تم الحصول عليها مع هذا morpholino كان محددا لضربة قاضية للTGFBR3 كما هو موضح قبل 3.

شكل 1
تعرضوا الشكل 1. كشف AFLIP من BG في الزرد الأجنة. مجموع استخراج البروتين من أجنة في 72 ساعة بعد الإخصاب (HPF) (حارات 1 و 3) و 48 HPF (حارة 2) إلى وضع العلامات تقارب 125 I-TGF-β2 يتبع بواسطة IP مع الأرنب مكافحة الزرد BG (حارات 1 و 2، ZBG) أو أرنب مكافحة الفئران BG (لين 3، RBG ) كمجموعة تحكم. في تصوير الإشعاع الذاتي يمكن أن يتم الكشف عن BG دون GAG (BG الأساسية) أو في شكل BG جلايكان المعدلة (GAG). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. BG Morpholino ضربة قاضية التي كشفتها AFLIP 125 I-TGF-β2 تقارب وسم BG من الأجنة غير المعالجة WT (lane1)، microinjected مع BG محدد morpholino (حارة 2) أو عنصر تحكم فمنها (حارة 3). التهم لكل مليون (CPM) تعافت بعد أشار مناعي وخطوة عبر ربط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إيث-next.within صفحة = "دائما">
عازلة تركيب
عازلة 1 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.1٪ تريتون X-100
عازلة Deyolk 55 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1.8 ملي بوكل، 1.25 ملم NaHCO 3
أسماك المياه انظر المواد الجدول
حل تثبيتي 50٪ CH 3 OH، 12٪ CH 3 COOH، 0.185٪ HCHO
غسل العازلة IP 10 ملي نا 2 هبو 2 مم KH 2 PO 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 0.1٪ تريتون X-100، 0.02٪ SDS، ودرجة الحموضة 7.4
عازلة Laemmli 2٪ SDS، 10٪ الجلسرين، و 100 ملي DTT و 60 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 6.8)، 0.001٪ برومفينول الأزرق.
تحلل العازلة 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك pH7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 1 ملم PMSF، 0.5٪ تريتون X-100، 0.1٪ SDS، و 0.5٪ صوديوم Deoxycholate
برنامج تلفزيوني 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 2 مم KH 2 PO pH7.4
TNTE 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك pH7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 0.1٪ تريتون X-100
غسل العازلة 110 مم كلوريد الصوديوم، 3.5 ملي بوكل، 2.7 ملي CaCl 2 و 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.5

الجدول 1: المخزن المؤقت التراكيب

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

استخدام البقع الغربية مع الأجسام المضادة المحددة ضد بروتين من الفائدة هو أداة قيمة لدراسة التعبير عنها 7 خلال مرحلة التطور الجنيني. ومع ذلك، لم يكن immunoblotting من البروتينات عالية الغليكوزيلاتي ناجحة للغاية نظرا لنقلهم عدم الكفاءة وضعف ملزم لالنيتروسليلوز أو PVDF الأغشية 8،9.

البروتيوغليكان هي مثال جيد على هذا القصور، بسبب قيودهم تعلق تساهمي جلايكان (GAG) التي يتم سالبة الشحنة ولا تربط جيدا إما السطوح البوليسترين أو الأغشية النشاف مسعور. أيضا، حجم تجانس السلاسل GAG "ينتشر" البروتين أكثر من قطاع من هلام، والحد بشكل فعال مبلغها في منطقة وصمة عار. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان البروتين من الفائدة لديها مستويات منخفضة من التعبير، وكشف من خلال البقع الغربية العادية هي مهمة صعبة. عامل النمو التحويلي النوع الثالث β مستقبلات (TGFBR3) أو betaglycan(BG)، ومستقبلات الغشاء مع موقعين مرفق GAG في الثدييات (1) واحد في الزرد لديه كل هذه الخصائص. وعلى الرغم من بروتوكولات للتغلب على هذه العقبات وقد وضعت، مثل الكشف عن طريق معقد (ABC) نظام أفيدين البيوتين 10،11 أو immunobloting بروتيوغليكان على الأغشية موجبة 12، فإنها لا يمكن حل المشاكل على حد سواء في نفس البروتوكول. الاستفادة من قابلية عالية للBG لليجند الطبيعي TGFβ2 وتوافر الأجسام المضادة المحددة، AFLIP، وهي تقنية تجمع بين مزايا وضع العلامات تقارب ومناعي، والتي نوقشت أعلاه يمكن التغلب على القيود المفروضة على الكشف عن لطخة غربية.

وضع العلامات تقارب مستقبلات غشاء محدد مع بروابط بهم رديولبلد هو أداة تستخدم جيدا أن قامت بدور فعال لتحديد وتوصيف العديد من نمو المهم العوامل المستقبلات في الخلايا المستزرعة 13-16.في حين تقارب التقليدية وصفها أحادي الطبقة من الخلايا تخضع لالتساهمية وضع العلامات يجند على طبق زراعة الأنسجة ومن ثم هي lysed، في AFLIP تتشكل المجمعات يجند مستقبلات لأول مرة في لست] الجنين، ثم تنقيته بواسطة مناعي وأخيرا، تساهميا عبر ربط. بسبب استخدامها للبروابط رديولبلد، AFLIP حساس جدا ومن حيث المبدأ يمكن تكييفها لعوامل النمو الأخرى أو السيتوكينات مستقبلات الذي يجند وصفت والأجسام المضادة جيدة متوفرة. وهذا من شأنه إمكانات AFLIP تساعد في الكشف عن هذه الجزيئات ذات الصلة المنخفضة وفيرة ولكن الفسيولوجية.

بسبب التنوع الكامن في خطوة عبر ربط لوضع العلامات تقارب، AFLIP لا يمكن أن تستخدم لتحديد كمي لمستويات المستقبلات قياسها. ومع ذلك، إذا أجريت مع وجود ضوابط موازية كافية، فإنه يمكن توفير المقايسة دقيقة جدا من المستويات النسبية للتعبيرها. كما AFLIP استخدام مجموع مقتطفات من البروتين، فإنه لا restriالمديرية إلى موقع خلوي واحد محدد للمستقبل، فإنه يكشف عن التعبير عنها في الفرد كله أو الجهاز، إذا ما طبق على عينة الكبار تشريح. وأخيرا، إذا كان من الممكن ربط AFLIP اللازمة لبروتوكولات الحيوية الأخرى، مثل الهضم الأنزيمية من الكربوهيدرات، لمزيد من تميز مستقبلات المصالح.

على غرار وضع العلامات تقارب التقليدي، يوصى بشدة ليجند حديثا 125 I المسمى. ونظرا لنصف عمر قصير من 125 الأول، يجب استخدام يجند في غضون الأسابيع الأولى 2 بعد وضع العلامات مع النظائر جديدة. على الرغم من أن معظم التحذيرات من بروتوكول تم ذكرها في الخطوات المقابلة، يجب أن تعطى اهتماما خاصا واحدة لإزالة متأنية للصفار، والتي يجب أن تكون كاملة وموحدة ممكن. ان ترك كميات متفاوتة من صفار البيض يؤدي إلى الكميات غير صحيحة النية بروتين الجنين النية في لست].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disuccinimidyl suberate (DSS) ThermoFisher Scientific 21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0618-01
Gel Dryer Model 583  BIO-RAD 1651745
Typhoon 9400 GE Healthcare Life Sciences 63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter Packard
Exposure Cassette Molecular Dynamics 63-0035-44
NaCl J.T. Baker 3624
KCl J.T. Baker 3040
Na2HPO4 J.T. Baker 3828
K2HPO4 J.T. Baker 3246
CH3OH J.T. Baker 9070
CH3COOH J.T. Baker 9508
HCHO J.T. Baker 2106
SDS Sigma-Aldrich L4509
EDTA Sigma-Aldrich ED
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
CaCl2 Sigma-Aldrich C3306
NaHCO3 Fisher Scientific S233
PMSF Sigma-Aldrich P7626
Crystal Sea Marine Mix Marine Enterprises International http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67, (4), 785-795 (1991).
  2. Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor. J. Biol. Chem. 263, (32), 16984-16991 (1988).
  3. Kamaid, A., et al. Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish. Genesis. 53, 583-603 (2015).
  4. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  5. Cheifetz, S., et al. Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms. J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).
  6. López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor. Cell. 73, (7), 1435-1444 (1993).
  7. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS USA. 76, (9), 4350-4354 (1979).
  8. Maccari, F., Volpi, N. Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 24, (9), 1347-1352 (2003).
  9. Volpi, N., Maccari, F. Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).
  10. Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem. 27, (8), 1131-1139 (1979).
  11. Bratthauer, G. L. The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).
  12. Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66. Anal. Biochem. 165, (2), 448-455 (1987).
  13. Das, M., et al. Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor. PNAS USA. 74, (7), 2790-2794 (1977).
  14. Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling. J. Biol. Chem. 256, (18), 9419-9424 (1981).
  15. Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries. PNAS USA. 77, (12), 7137-7141 (1980).
  16. Hoosein, N. M., Gurd, R. S. Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain. PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics