Zebrafish의 배아에서 내인성 수용체의 친화력 레이블 검출

1Cell and Developmental Biology, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
Developmental Biology

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Molina-Villa, T., Mendoza, V., López-Casillas, F. Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (114), e54405, doi:10.3791/54405 (2016).

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Abstract

Protocol

동물에서 수행 모든 실험은 CICUAL 프로토콜 번호로, 실험 동물 관리 및 멕시코의 자치 대학교 (UNAM)의 사용을위한위원회의 승인을했다 : FLC40-14. (CICUAL "Comité Institucional 파라 엘 Cuidado y를 USO 드 로스 짐승 같은 드하기 Laboratorio 델 연구소의 드 Fisiologìa Celular, 대학교 나시 오날 자치시 드 멕시코").

배아 단백질 추출물 1. 준비

  1. 각 조건은 예를 들어 72 시간 포스트 수정 (HPF)를 위해, 원하는 단계에서 (morphants 대 야생형)을 비교하기 위해 200 배아 - (100)를 수집합니다.
  2. 물고기의 물을 함유하는 배양 접시에 장소 배아는 (표 1 참조) 수동 뾰족한 집게를 사용하여 배아를 dechorionate. 이 대상 수용체을 소화 수 있으므로이 단계 (또는 프로토콜을 통해 다른 단백질 분해 효소) 동안 프로 나제​​를 사용하지 마십시오.
  3. 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 넣어 배아 및 배아 TW 씻어1X 인산 완충 용액 (PBS)와 얼음 (표 1 참조).
  4. deyolk 버퍼 500 μL를 추가 (표 1 참조).
  5. (- 40 배 30) 용액에 배아를 부드럽게 아래로 피펫 팅에 의해 노른자의 대부분을 놓습니다. 72 HPF, 48 HPF의 배아를 들어 각각 파란색과 노란색 피펫 팁을 사용합니다. 노란색 끝은 약간 배아를 파괴하지 않도록 절단해야 할 수도 있습니다. 성공적인 노른자 자료는 현미경으로 배아를 관찰하여 확인할 수 있습니다.
  6. 15 초 동안 600 XG에서 원심 분리하여 배아를 수집합니다.
  7. 피펫을 사용하여 조심스럽게 상층 액을 버린다.
  8. 워시 배아 회 500 ㎕의 세척 완충액으로 부드럽게 최저 속도 텍싱하여 (표 1 참조).
  9. 15 초 동안 600 XG에서 원심 분리하여 배아를 수집합니다.
  10. 여기에서 시작, 4 ° C에서 절차를 계속합니다.
  11. 피펫을 사용하여 조심스럽게 상층 액을 버린다.
  12. 용해 완충액 350 μL에 재현 탁 배아 (표 1 참조)과 플라스틱 유봉을 사용하여 균질화한다.
  13. 4 ° C에서 테스트 튜브 로커에 용해 배아를 교반하면서 30 분을 품어.
  14. 원심 분리하여 불용성 잔사를 제거하기 위해 15 분 동안 11,000 XG에서 배아를 용해.
  15. 전송 신선한 튜브에 피펫을 이용하여 상층 액을 깨끗이 밀어 냈습니다.
  16. 브래드 포드 (Bradford) 단백질 분석 (4), 또는 다른 적절한 방법에 의해 전체 단백질을 결정한다. 브래드 포드 분석법이 사용되는 경우가 4 표준 단백질의 과소 원인으로, 용해 버퍼에 세제 선물 동등한 농도의 존재 검량선을 수행한다.

2. 감지 내인성 수용체 단백질의

  1. 선호도 라벨링 및 면역 침전 (모든 단계 4 O를 C에서)
    1. 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 총 배아 단백질의 500 μg의 버퍼 1 (표 1 참조) 1 μg의 / μL로 희석 - (400)를 배치합니다.
      주 : 약 100 배의 총 단백질 500 μg의 획득하기 위해서 - 200 배아 초기 처리되어야한다. 72 HPF 배아는 정기적으로 betaglycan 검출을위한 충분한 총 배아 단백질의 ~ 5 μg의를 얻을.
    2. 150 오후 최종 농도에 도달하고 4 ° C에서 테스트 튜브 로커 2 시간에 교반 배양 표시 TGF-β2 주식의 충분한 볼륨을 추가합니다. AFLIP이 시작되기 전에 Cheifetz 등. (5)에 의해 설명 된 바와 같이 TGF-β2는 클로라민 T 법에 의해 125 I로 표시해야합니다.
      주의 : 내가 리간드 레이블 (125)를 처리하는 동안 노출을 최소화하기 위해 차폐.
    3. (100) 희석 (배양이 O / N 수있다) 4 ° C에서 또 다른 2 시간 동안 배양을 계속 : 1에 도달하기 위해 관심있는 수용체에 대한 희석 항체의 충분한 볼륨을 추가합니다. 따라서 본 연구에서 사용하고 다른 3을 설명하지만,의 품질에 따라, 항혈청 번호 (31)의 최적의 희석이고tibody, 큰 또는 작은 희석 최적 일 수있다.
    4. 적절한 면역 글로불린 결합 구슬의 50 μl를 추가합니다 (예를 들어, 이전에 TNTE에서 평형 1 재현 탁 G 단백질 세 파로스, : TNTE에서 원래 볼륨의 5)를 4 °에서 테스트 튜브 로커에 교반과 함께 50 분 동안 품어 기음.
    5. 20 초 동안 11,000 XG에서 microcentrifugation으로 구슬을 복구 할 수 있습니다.
    6. 적절한 방사성 쓰레기 용기에 상층 액을 버린다.
    7. 20 초 때마다 11,000 XG에, 텍싱 및 microcentrifugation에 의해 IP 세척 버퍼 (표 1 참조) 1 ㎖로 IP-구슬 세 번 씻으십시오.
    8. 재현 탁 IP-구슬 IP 세척 버퍼 250 μL있다.
    9. (10 ㎎ / ㎖에서 DMSO에 용해 DSS) 숙신 이미 딜 수베의 1.5 μl를 추가합니다. 바로이 단계에서의 사용 전에 DSS 솔루션을 준비합니다.
    10. 교반 4 ° C에서 15 분 동안 품어.
    11. 가교 반응을 종결하기 위해, 500 ㎕의 O를 추가충분히 트리스 - CL pH 7.4의 재고 보충 F IP 세척 버퍼는 25 mM 트리스 - (CL)에 도달한다. 트리스의 유리 아미노산 그룹은 미 반응 DSS를 캡처합니다.
    12. 20 초 동안 11,000 XG에 원심 분리기는 IP-구슬을 수집하고 뜨는을 폐기합니다.
    13. 재현 탁 IP 비드 램리 완충액 30 μL 감소한다.
    14. 삶아 샘플 94 ° C에서 5 분.
    15. 선택적으로, 제조업 자의 프로토콜을 사용하여 감마 계수기에서 샘플을 분석한다.
  2. 샘플 분석
    1. SDS-PAGE를 변성에 따라 샘플. 수용체의 질량에 해당하는 비율로 폴리 아크릴 아미드를 사용하여 표준 절차에 따라 젤을 실행합니다.
    2. 고정 제 용액에서 겔을 담그고 실온에서 30 분 동안 (표 1 참조).
    3. 15 분 동안 증류수로 젤을 씻으십시오.
    4. 이전에 수화 필터 종이에 젤을 놓고 사란 랩 필름 커버.
    5. 1 시간 동안 80 ° C에서 건조 젤.
    6. 흰색은 phosphorimager의 scre에 젤을 노출RT O / N에서 엉.
    7. 제조 업체의 프로토콜을 사용하여은 phosphorimager를 사용하여 노출 된 화면을 검색합니다.

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Representative Results

그림 1은 AFLIP 얻은 대표적인 결과를 보여줍니다. 125 I-리간드에서 온 레인 1 신호는 공유 (150 kDa의 마커 아래 BG 코어) 제브라 피쉬 betaglycan 핵심 단백질 또는 글리코 사 미노 글리 칸의 첨부 파일 (GAG, 도말하여 프로테오글리칸 형태로 처리 된 BG 코어 중 하나에 연결된 ) 170 kDa 내지 겔의 상단까지. 마이그레이션이 패턴 날카로운 코어 단백질 플러스 (GAG 때문에 사슬의 길이 이질성)를 도말 프로테오글리칸은 TGFBR3이 특징이다. DSS에 공유 결합 매 리간드 - 수용체 복합체 형성에 연결되지 않기 때문에, 겔 (125 I-TGF-β2)의 이동 앞에 나타나는 125 I-리간드 무연있다. 이 유리 리간드가 수용체에 결합하고, 결합 된 면역 중에 남아 있지만 공유 결합 부착되지 때문에, SDS-PAGE 과정에서 분리. 아니netheless으로, 그 신호의 세기가 여전히 표지 수용체에 의해 주어진 하나로 상관. 이것은 강도에 대응 GAG 및 BG 코어에서 약한 신호에 의해 알 수있는 72 HPF 배아 3보다 BG 낮은 양, 제브라 피쉬 배아 HPF (48)에서, 레인 2 및 3과 비교하여 나타내 알 수 겔의 전면에 나타나는 유리 리간드에 의해 주어진 신호 (레인 2). AFLIP 사용할 때 쥐에 대한 항체가 BG 6 ZF BG와 교차 반응하지 않는 점을 감안, 항체는 음성 대조군 (레인 3) 역할을, 따라서 아무런 신호도주지 않았다. 유사 부정적인 결과를 방지 ZF BG 항체 (3)의 전 면역 혈청을 얻었다.

도 2는 AFLIP에 의한 모르으로,이 경우, 실험 조작을 실시 배아 betaglycan의 감소는 주어진 수용체의 발현 수준을 측정하는 방법을 보여주는이 켜졌 3. 레인 2는 ZF BG 차 전 사체의 exon2-intron2 경계에 관한 모르 폴리 7 NG 투여의 효과를 나타내고있다 레인 (1)는, HPF (72) 야생형 배아 TGFBR3의 수준을 나타낸다. 이 모르 폴리 노 얻은 BG 다운 규제는 그 잘못 일치 제어 (레인 3)에 의해 재생되지 않습니다. 이 결과는 이전에 기재 한 바와 같이 얻은 모르 표현형이 TGFBR3의 최저 특정 것을 확인 하였다.

그림 1
Zebrafish의 태아에 BG의 그림 1. AFLIP 탐지. 72 시간 포스트 수정 (HPF)에서 배아에서 총 단백질 추출물 (레인 1, 3) 48 HPF (레인 2) 다음에 125 I-TGF-β2 친 화성 라벨링을 실시 하였다 BG (레인 3 RBG 토끼 항 제브라 BG (레인 1 및 2 zBG) 또는 토끼 항 - 래트와 IP에 의해) 제어 등. 자가 방사선에 BG는 GAG (BG 코어)없이 검출 할 수 또는 글리코 사 미노 글리 칸 수정 BG (GAG)로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. BG 모르 폴리 노 최저입니다. AFLIP에 의해 감지 된 특정 BG 모르 폴리 노 (레인 2) 또는 불일치 제어 (레인 3)과 미세 주입 치료 WT 배아 (lane1)에서 BG의 125 I-TGF-β2 친 화성 라벨. 만 (CPM) 당 카운트는 면역 및 가교 단계가 표시됩니다 후. 회복 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

완충기 구성
버퍼 1 pH가 7.5의 50 mM 트리스 -HCl, 150 mM의 염화나트륨, 0.1 % 트리톤 X-100
Deyolk 버퍼 55 mM의 염화나트륨, 1.8 밀리미터의 KCl, 1.25 밀리미터의 NaHCO3
물고기 물 자료 표를 참조하십시오
정착액 솔루션 50 % CH 3 OH, 12 % CH 3 COOH, 0.185 %의 HCHO
IP 세척 버퍼 10 mM의 나트륨 2 HPO 4, 2 mM의 KH 2 PO 4, 137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCl을 0.1 % 트리톤 X-100, 0.02 % SDS, pH 7.4의
램 믈리 버퍼 2 % SDS, 10 % 글리세롤, 100 mM의 DTT, 60 mM 트리스 (산도 6.8), 0.001 %의 브로 모 페놀 블루.
용해 완충액 50mM 트리스 - 염산 pH 7.4로 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 1mM의 PMSF, 0.5 % 트리톤 X-100, 0.1 % SDS, 0.5 % 나트륨 Deoxych올 레이트
PBS HPO 4 137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCl을 10 mM의 나트륨 2, 2 mM의 KH 2 PO 4 pH 7.4로
TNTE 50mM 트리스 - 염산 pH 7.4로 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 0.1 % 트리톤 X-100
세척 버퍼 110 mM의 염화나트륨, 3.5 밀리미터의 KCl, 2.7 mM의 염화칼슘 2, 10 mM 트리스 - 염산 pH가 8.5

표 1 : 버퍼 조성물

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Discussion

관심의 단백질에 대한 특이 항체와 서양 말의 사용은 배아 발생 동안 발현 7을 연구하는 유용한 도구입니다. 그러나, 높은 당화 단백질의 면역 인해 자신의 비효율적 인 전송 및 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 막 8,9 약한 결합을 매우 성공적으로되지 않았습니다.

프로테오글리칸 때문에 음전하를하고 폴리스티렌 표면 또는 소수성 블로 팅 막 중 하나에 잘 결합하지 않는 자신의 공유 부착 글리코 사 미노 글리 칸 체인 (GAG)으로, 이러한 단점의 좋은 예이다. 또한, GAG 사슬의 크기 이질성 효과적으로 오의 면적당의 양을 감소 겔의 섹터에 걸쳐 단백질을 "확산". 관심의 단백질 발현 수준이 낮은 경우뿐만 아니라, 정기적 인 웨스턴 블랏에 의해 그 검출은 어려운 작업이다. 수용체 (TGFBR3) 또는 betaglycan β 유형 III 형질 전환 성장 인자(BG), 제브라 피쉬 3 개의 GAG의 부착 포유 동물 1 사이트와 하나 막 수용체는 이러한 특성을 모두 가지고있다. 이러한 장애물을 극복하는 프로토콜이 고안되었습니다 만, 아비딘 - 비오틴 복합체 (ABC) 시스템 10, 11 또는 양으로 대전 된 막 (12)에 프로테오글리칸의 immunobloting에 의해 검출처럼, 그들은 같은 프로토콜에서 두 문제를 해결할 수 없습니다. 자연 리간드 TGFβ2 대한 특정 항체의 가용성 BG의 높은 친 화성을 활용 AFLIP, 친화 라벨링 및 면역 침전의 이점을 결합하는 기술들은, 위에서 웨스턴 블롯 검출 한계는 극복 될 수 논의.

자신의 방사성 표지 된 리간드와 막 결합 수용체의 선호도 표시는 몇 가지 중요한 성장의 식별 및 특성에 대한 쓸모 배양 된 세포 13-16에서 수용체 요인했습니다 잘 사용하는 도구입니다.세포 단층을 라벨링 종래 친 화성 조직 배양 접시에 리간드 라벨 ​​공유 결합을 실시하고 용해되지만, AFLIP에서 리간드 - 수용체 복합체는 제 배아 용해질 다음, 면역 침전에 의해 정제하여 최종적으로 공유 가교 결합을 형성한다. 왜냐하면 방사성 리간드의 사용으로, AFLIP 다른 성장 인자 또는 표지 된 리간드와 함께 좋은 항체를 사용할 수있는 사이토 카인 수용체에 적용 할 수있는 매우 중요한 원칙이다. AFLIP이 가능성이 낮은 풍부하지만 생리 관련 분자의 검출을 도움이 될 것이다.

이 때문에 친 화성 라벨의 가교 공정에서의 고유의 변동, AFLIP 정량적 측정 수용체​​의 수준을 결정하기 위해 사용될 수 없다. 적절한 제어 병렬로 수행하는 경우에는, 그들의 발현의 상대 수준의 매우 정확한 계측을 제공 할 수있다. AFLIP 총 단백질 추출물을 사용하여, 그것은 restri되지해부 성인 표본에 적용하는 경우, 수용체의 하나의 특정한 셀룰러 위치 cted, 그것은 전체 개인 또는 기관에서의 발현을 보여준다. 필요한 AFLIP 다른 생화학 프로토콜에 링크 될 수 있다면 마지막 탄수화물 효소 digestions 같이, 상기 관심의 수용체를 특성화한다.

기존의 친 화성 라벨링과 유사하게, 갓 (125) 내가 표지 리간드는 것이 좋습니다. 125 I의 짧은 반감기를 고려할 때, 리간드 신선한 동위 원소로 라벨링 후 처음 2 주 이내에 사용해야합니다. 프로토콜의주의 사항의 대부분이 해당 단계에서 언급되었지만, 하나의 특별한 언급은 가능한 한 완전하고 균일해야 노른자의주의 제거에 제공해야한다. 노른자의 불균일 한 금액을두면 해물에서 선의의 배아 단백질의 잘못된 정량 될 것입니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disuccinimidyl suberate (DSS) ThermoFisher Scientific 21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0618-01
Gel Dryer Model 583  BIO-RAD 1651745
Typhoon 9400 GE Healthcare Life Sciences 63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter Packard
Exposure Cassette Molecular Dynamics 63-0035-44
NaCl J.T. Baker 3624
KCl J.T. Baker 3040
Na2HPO4 J.T. Baker 3828
K2HPO4 J.T. Baker 3246
CH3OH J.T. Baker 9070
CH3COOH J.T. Baker 9508
HCHO J.T. Baker 2106
SDS Sigma-Aldrich L4509
EDTA Sigma-Aldrich ED
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
CaCl2 Sigma-Aldrich C3306
NaHCO3 Fisher Scientific S233
PMSF Sigma-Aldrich P7626
Crystal Sea Marine Mix Marine Enterprises International http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix

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References

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