Herstellung von homogenen MALDI Proben für die quantitative Anwendungen

Biochemistry

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Summary

Ein Protokoll für die räumliche Heterogenitäten der Ionensignale in der MALDI-Massenspektrometrie Reduzierung von Substrattemperatur während der Probentrocknungsprozesse regulieren demonstriert.

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Ou, Y. M., Tsao, C. W., Lai, Y. H., Lee, H., Chang, H. T., Wang, Y. S. Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications. J. Vis. Exp. (116), e54409, doi:10.3791/54409 (2016).

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Abstract

Protocol

Hinweis: Dieses Protokoll zur Reduzierung der räumlichen Heterogenität Maltotriose und Bradykinin-Fragment (1-7) hergestellt, mit dem getrockneten Tröpfchen Verfahren entwickelt wird. Das Protokoll besteht aus drei Hauptschritte, einschließlich der Vorbereitung und Präkonditionierung, Probenablage und Trocknung und Massenspektrometrie Datenanalyse. Die Verfahren werden beschrieben und im Folgenden näher beschrieben:

1. Vorbereitung und Präkonditionierung

  1. Reinigen der Probenplatte
    1. Tragen Sie Handschuhe aus Nitril und Hand waschen Sie die Probenplatte vorsichtig mit Reinigungsmittel und destilliertem entionisiertem Wasser (DDW).
    2. Spülen Sie die Probenplatte mit Methanol (MeOH) und DDW.
    3. Legen Sie die Probenplatte in einem 600-ml-Becher und füllen mit DDW.
    4. Beschallen die Probenplatte in DDW für 15 min in einem Ultraschallbad (200 W, 40 kHz).
    5. Entfernen DDW aus dem Becher und füllen Sie den Becher mit MeOH.
    6. Beschallen die Probenplatte in MeOH für 15 min im Ultraschallbad (200 W, 40 kHz).
    7. Brennen Sie die Lösungsmitteltropfen auf der Platte mit Stickstoffgas ab und halten Sie die Probenplatte trocken vor der Probenabscheidung.
  2. Die Regulierung Trockenkammer Temperatur
    . HINWEIS: Die Trockenkammer ist ein 35 x 20 x 45 cm 3 (B x T x H) Acryl-Kammer Abbildung 1 zeigt das Bild dieses Trocknungssystems. Die Kammer wird mit Raumtemperatur Stickstoffgas durch einen Gasdurchflussmesser bei einer konstanten Strömungsgeschwindigkeit gespült eine niedrige relative Feuchtigkeitsbedingung durch eine geeichte Hygrometer innerhalb der Trocknungskammer eingebaut überwacht aufrechtzuerhalten. Ein Kupferbasisblock in der Trocknungskammer mit einer programmierten konstanten Temperatur Wasser Zirkulator ausgestattet wird verwendet Edelstahlprobenplatten aufzunehmen. Die Kupferbasisblock kann die Probenplatte Temperatur 5-25 ° C zu regulieren. Die Temperaturen der Luft, Kupferbasisblock und der Probenplatte werden durch K-Typ-Thermoelemente überwacht.
    1. Öffnen Sie die Tür und legte schnell die Probenplatte auf dem KupferBasisblock schließen Sie die Tür.
    2. Manuelle Einstellung der Gasdurchflussmesser der Stickstoffvolumenstrom bis 10 Standard-Kubikfuß pro Stunde (SCFH) einzustellen.
    3. Überwachung der relativen Feuchtigkeit in der Trockenkammer durch das Hygrometer und Feinabstimmung der Gasdurchflussmesser die relative Feuchtigkeit ist immer unter 25% zu gewährleisten.
    4. Überwachen Sie die Temperatur der Probenplatte durch K-Typ-Thermoelemente und stellen Sie die Wasser Zirkulator Temperatur manuell, bis die Probenplatte erreicht 5 ° C für das Experiment oder Raumtemperatur (25 ° C) für die Steuerung.
      HINWEIS: Um die Probenplatte bei einer Temperatur ausgelegt, die Wassertemperatur Zirkulator wird typischerweise 0 bis 5 ° C niedriger als die vorgesehene Probe eingestellt zu stabilisieren. Beispielsweise 5 ° C an der Probenplatte zu erhalten, ist die Temperatureinstellung des Wassers Zirkulators im Bereich von 0 bis 2 ° C; der Probenplatte bei 25 ° C, die Temperatureinstellung des Wassers Zirkulator liegt im Bereich von 23 bis 25 ° C zu halten.
    5. Achten Sie darauf , die erforderlichen Temperaturen und die relative Luftfeuchtigkeit erreicht werden (Tabelle 1) vor der Probenabscheidung.
      HINWEIS: Alle Parameter sowie deren Einstellwerte für die Trocknungsverfahren mit unterschiedlichen Probenplattentemperaturen sind in Tabelle 1 gezeigt.
      HINWEIS: Bei einer niedrigen Probenplattentemperatur, Wasserkondensation auf der Probenplatte auftreten können, wenn die Kammertür für eine lange Zeit offen ist. Wenn Wasserkondensation auftritt, schließen Sie die Tür und DO Anzahlung nicht jede Probe auf, bis Kondensation von Wasser ausgetrocknet ist.
  3. Herstellung von Matrix und Analytlösungen
    1. Herstellung von Matrixlösungen
      1. Bereiten 0,1 M THAP-Lösung mit 50% Acetonitril (ACN): 50% wässrige Lösung DDW.
    2. Präparation von Analyten
      1. Bereiten 10 -4 M Maltotriose Lösung mit DDW.
      2. Bereiten Sie 10 -5 M Bradykinin - Fragment (1-7) Lösung in 50% Acetonitril(ACN): 50% wässrige Lösung DDW.

2. Probenabscheidung und Trocknung

  1. Premix 0,25 ul 0,1 M THAP Lösung und 0,25 ul 10 -4 M Maltotriose oder 10 -5 M Bradykinin - Fragment (1-7) Lösungen in einem Reaktionsgefäß.
  2. Vortex die gemischte Lösung für 3 Sekunden.
  3. Zentrifugieren der gemischten Lösung für 2 sec (2,000 xg), um die Lösung am Boden des Zentrifugenröhrchens zu sammeln.
  4. Öffnen Sie die Tür der Trocknungskammer, deponieren sorgfältig 0,1 ul der Lösung auf der Probenplatte mit Pipette und schließen Sie sofort die Tür.
  5. Warten Sie auf die Probe Tröpfchen zu trocknen.
    . HINWEIS: Die typischerweise beobachtet Trocknungszeiten mit unterschiedlichen Probenplattentemperaturen in aufgeführt sind Tabelle 1 Für die Probenplattentemperatur von 5 ° C, die durchschnittliche Trocknungszeit beträgt 800 bis 1000 sec; für die Probenplattentemperatur von 25 ° C beträgt die durchschnittliche Trocknungszeit 100 bis 150 sec.
  6. Nach dem Trocknen die Tür öffnen, der Trocknungskammer.
  7. Stellen Sie den Wasser Zirkulator Temperatur auf Raumtemperatur (25 ° C).
    HINWEIS: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn die Probenplatte ständig bei Raumtemperatur (25 ° C) während des Trocknungsprozesses gehalten wird.
  8. Nach der Probenplatte Temperatur wieder auf Raumtemperatur (25 ° C), Entfernen von der Trocknungskammer, um die Probenplatte.
  9. Untersuchen Sie die Probenmorphologie unter einem 5fach-Stereomikroskop und einen Schnappschuss Hellfeldbild.
    HINWEIS: Wenn die Kristallmorphologien nicht erwartet werden, ist es notwendig, eine neue Probe mit dem gleichen Verfahren herzustellen. Typische Kristallmorphologien sind in den oberen Platten der Figur 2 gezeigt.
    HINWEIS: In den Fällen mit geringen Probenplattentemperaturen, wie 5 ° C, es ist wichtig, die Probenplatte auf Raumtemperatur aufwärmen, bevor es aus der Trocknungskammer nehmen. Wenn die Proben Ablagerung, halten Sie nicht die vorgemischten solution in der Spitze der Pipette über 10 sec. Sie nicht die vorgemischten Lösung wieder verwenden , nachdem die Proben abgeschieden werden . Die oberen Platten von 2 zeigen Hellfeld - Bilder von Proben hergestellt mit unterschiedlichen Probenplattentemperaturen.

3. Mass Spectrometry Datenanalyse

  1. Mass Spectrometry Datenerfassung
    HINWEIS: Nach der Zubereitung kann die Probe mit bildgebenden Massenspektrometrie analysiert werden. In der aktuellen Studie werden die Imaging - MS - Experimente durchgeführt , ein Labor gebauten Synchronized Dual-Polarität TOF mit (DP-TOF) Imaging - Massenspektrometer. 15 Handels MALDI-TOF - Massenspektrometer mit Imaging - Fähigkeit eignen sich auch für solche Experimente. Das Massenspektrometer wird in linearer Extraktion und positive Ionen-Modi mit optimierter Extraktions Verzögerungen betrieben. Die kinetische Energie der Ionen beträgt 20 kV. Der Laserstrahl Größe beträgt 35 & mgr; m im Durchmesser auf der Probenoberfläche, und das Spektrum von jedem Spot ist der aveWut von 5 Laserschüssen.
    1. Legen Sie die Probenplatte in das MALDI-Massenspektrometer.
    2. Führen Sie die Abbildung Massenspektrometrie-Analyse der Probe in Schritten hergestellt 2,1-2,9.
    3. Wählen Sie eine charakteristische Massenspitze aus der Massenliste im Ergebnisfenster angezeigt und klicken Sie auf "2D", um ein zweidimensionales Ionenbild zeichnen.
      HINWEIS: Bei Maltotriose gemischt mit THAP die charakteristischen Spitzen sind sodiated Maltotriose, protonierten THAP und sodiated THAP. Für Bradykinin-Fragment (1-7) mit THAP gemischt, umfassen die charakteristischen Peaks Bradykinin Fragment protoniert (1-7), protonierten THAP und sodiated THAP.
    4. Klicken Sie auf die Tasten zur Einstellung der im Popup-Fenster die oberen und unteren Grenzen der Signalintensität zu bestimmen, und klicken Sie auf "Bild speichern". Diese Einstellung definiert den Kontrast von Ionen Bilder.
      HINWEIS: In jedem einzelnen Satz von Daten, die gerissenen Bereiche und die Null-Punkte niedriger Helligkeit eliminiert zeigen.
    5. Bitte beachten und zu vergleichen, das IonBild mit dem Hellfeld-Bild, das in Schritt 2.9 gemacht.
      HINWEIS: Imaging-Massenspektrometrie und Konstruktion von Bildern von bestimmten Ionen können mit kommerziellen Geräten erreicht werden. Aufgrund der Vielzahl der Datenerfassung und Analyse-Software, sollten die Anwender Software-Anweisungen vom Instrument Anbieter bereitgestellten folgen Bilder von hoher Qualität zu erhalten.
  2. Datenanalyse
    HINWEIS: Die Heterogenität der Proben quantitativ analysiert. In dieser Demonstration wird jede Probe von Software im eigenen Haus entwickelt in mehrere konzentrische Bereiche unterteilt, die räumliche Verteilung der Ionen zu analysieren. Die Analyse kann auch eigenständige Datenanalyse-Software durchgeführt werden.
    1. Klicken Sie auf die Nullstellen und die gerissenen Bereiche in dem Ionenbild im Ergebnisfenster angezeigt zu unwichtigen Bereichen zu entfernen.
      Hinweis: Dieses Verfahren definiert die wesentlichen Bereich des Ionenbild.
    2. Klicken Sie die Schaltfläche "Kante finden", um die äußerste Schicht des Ionenbild zu finden.
    3. Klicken Sie auf "abziehen", um den Ionenfluss Informationen der äussersten Schicht in einer Datenbank zu speichern und diese Schicht aus dem Ionen Bild entfernen gleichzeitig. Ein Kontrollkästchen diese äußerste Schicht darstellt, wird in der "Ausgangsdaten" Liste des Ergebnisfensters angezeigt.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.2 und 3.2.3 bis das Zentrum des Ionenbild definiert ist.
    5. Klicken Sie auf und wählen Sie alle Kontrollkästchen in der "Ausgangsdaten" und klicken Sie auf "Export", um die Daten zu exportieren.
    6. Öffnen Sie die exportierten Daten Tabellenkalkulations-Software mit dem durchschnittlichen Ionenhäufigkeit jeder Schicht zu berechnen, die räumliche Verteilung Informationen von Ionen zu erhalten.

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Representative Results

Die Hellfeld - Bilder sowie die MS Bilder von Maltotriose und Bradykinin - Fragment (1-7) hergestellt , mit Probenplattentemperatur von 5 und 25 ° C sind in 1 gezeigt. Im Fall der sodiated Maltotriose, das Ionensignal hauptsächlich bevölkert an der Peripherie des Gebietes Probe, wenn es mit einer Probe Plattentemperatur von 25 ° C hergestellt. die Probenplatte Temperatur auf 5 ° C, füllt das Signal homogen über die gesamte Probenfläche Durch die Verringerung. Der einzige Nachteil bemerkbar, wenn die Proben unter 5 ° C herzustellen, ist, dass es mehr Risse, als die Proben unter 25 ° C hergestellt. Die Ionenbild von protoniertem Bradykinin-Fragment (1-7) zeigt einen ähnlichen Trend wie die von sodiated Maltotriose. Die Ergebnisse der bildgebenden MS deuten darauf hin, dass die Proben unter einer unteren Probenplatte Temperatur Vorbereitung deutlich die Moleküle weiterverteilen und Heterogenität zu reduzieren.

Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse der statistischen Analysen für Maltotriose und Bradykinin - Fragment (1-7) , hergestellt unter Probenplatte Temperaturen von 5 bis 25 ° C. Für jede Probe ist die durchschnittliche Intensität normalisiert. Im Falle von sodiated Maltotriose mit einem Probenplattentemperatur von 25 ° C werden die Signalintensitäten in den Zentren viel niedriger als die mit dem Probenplattentemperatur von 5 ° C. Das Ergebnis der protonierten Bradykinin fragment (1-7) zeigt auch eine geringere Variation bei der Probenplattentemperatur von 25 bis 5 ° C verringert wird.

Abbildung 1
Abbildung 1: Abbildung der Probe Trocknungssystem.Die Trocknungskammer ist aus Acryl. Die Kammer wird mit Raumtemperatur Stickstoffgas gespült eine niedrige relative Feuchtigkeitsbedingungen aufrechtzuerhalten. Ein Kupferbasisblock mit einem programmierten konstanten Temperatur Wasser Zirkulator ausgestattet wird verwendet, um die Temperatur des Edelstahl-Probenplatten zu regulieren. Die Thermometer überwachen Luft, Kupfer Basisblock, und die Probenplatte. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2:. Niedriges Probenplattentemperatur führt zu einer besseren Signal Homogenität Die hellen Feldbilder (obere Bilder) sowie die MALDI Bilder (untere Bilder) von Maltotriose (a) und Bradykinin - Fragment (1-7) (b) , hergestellt mit THAP unter verschiedenen Probenplattentemperaturen. die MALDI und protonierten Bradykinin-Fragment (1-7) (m / z: 757) aus dem Gesamtspektrum jeweils: Bilder wurden durch Extraktion des sodiated Maltotriose (527 m / z) erhalten. Die Pixelgröße der Ionen Bilder beträgt 35 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Signaländerung reduziert als Probenplatte Temperatur sinkt während der Trocknung Die MALDI Bilder mit Maltotriose erhalten (a) und Bradykinin - Fragment (1-7) (b) , hergestellt mit THAP unter verschiedenen Probenplattentemperaturen.. Rote und blaue Daten zeigen, die bei der Probenplatte Temperaturen hergestellte Probe von 25 und 5 ° C.g "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Probenplattentemperatur (° C) Sample Lufttemperatur (° C) Relative Luftfeuchtigkeit (RH%) Trockenzeit (sec)
5 Maltotriose mit THAP 20 ± 3 <25 800 - 1000
Bradykinin-Fragment (1-7) mit THAP
25 Maltotriose mit THAP 25 ± 3 100-150
Bradykinin-Fragment (1-7) mit THAP

Tabelle 1: Versuchsparameter und Trocknungsbedingungen unter verschiedenen Probenplattentemperaturen.

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Discussion

Basierend auf früheren theoretischen Vorhersagen, temperaturbedingten hydrodynamischen Strömungen innerhalb Tröpfchen nach außen Kapillare fließt überwinden durch Verdampfen des Lösungsmittels induziert. Die Effizienz solcher interne Rezirkulation von Molekülen wird erhöht, wenn die Temperatur innerhalb eines Tröpfchens Zunahme Steigungen. Entsprechend den vorhergesagten Ergebnissen, wenn die Probenplatte Temperatur unter 5 ° C gehalten wurde, während seine Umgebung bei Umgebungstemperatur gehalten wird, ist die mittlere Geschwindigkeit der Rückführströme innerhalb des Tröpfchens etwa 4-mal schneller als die der äußeren Kapillare fließt. Wenn die Probenplatte Temperatur die gleiche wie die Umgebung ist, ist die mittlere Geschwindigkeit der Rezirkulationsströmungen 1,800 mal langsamer als die nach außen Kapillarfluß. Die Ergebnisse dieser Berechnung zeigen, daß bei der Probenaufbereitung Probenplatte abnehmender Temperatur vorteilhaft ist. Die experimentellen Beobachtungen stimmen mit dieser Vorhersage.

Die Probenplatte Temperamentature genau während der Probenvorbereitungsprozess. Tabelle gesteuert werden sollte 1 zeigt die typische Tröpfchentrocknungszeit mit 0,1 ul Probe unter verschiedenen Probenplattentemperaturen. Vor dem Ablagern Probenlösung auf der Platte, ist es wichtig, sicherzustellen, daß die Probenplattenoberfläche trocken ist. Wenn Wasserkondensation auftritt, wenn die Proben bei niedrigen Temperaturen, Abscheidung der Probenlösung vorbereitet wird nicht empfohlen, da kondensiert Wasserprobenbereiche vergrößert und verdünnt Lösungen. Somit ist es wichtig, unter 25%, die relative Feuchtigkeit der Trocknungskammer zu halten. Darüber hinaus, wenn die Proben bei niedrigen Temperaturen vorbereiten, sollten die Probenplatte warm bis auf Raumtemperatur, bevor es aus der Trockenkammer nehmen. Obwohl kleinere Wasserkondensation von Proben Kristallisation nach Fertigstellung nicht die Probenpopulation sollten signifikante Kondensation vermieden werden nicht verändert.

Die Verwendung von frisch vorgemischten Lösungen empgeflickt. Nachdem die vorgemischten Lösungen der Luft ausgesetzt werden, treten vorge Kristallisationen der Probenlösungen und die endgültige Kristallgrße und -morphologie verändern kann. Daher sollte der Pipettiervorgang mit hinreichender Effizienz durchgeführt werden, typischerweise innerhalb von 10 Sekunden, die Probe Tröpfchens aus Vorkristallisation in der Pipettenspitze zu verhindern. Es wird empfohlen, Probe Morphologien unter einem Mikroskop zu beobachten geeigneten Kristall-Morphologien, um sicherzustellen, bevor Massenspektrometrie-Analyse hergestellt werden. Wenn die Kristallmorphologien sind nicht so gut wie erwartet, den Abscheidungsprozeß zu wiederholen, falls erforderlich.

Nach unseren theoretischen und experimentellen Studien mit einer niedrigen Temperatur Probenplatte Probenvorbereitung verbessert die Daten Reproduzierbarkeit und Qualität in der MALDI-MS stark unter Umgebungsbedingungen installiert. Nachfolgende Experimente zeigen auch signifikante Erhöhung der Signalintensität mit diesem Probenvorbereitungsmethode. Die experimentellen Daten, die durch t erhaltenseine Methode erheblich die Zuverlässigkeit der MALDI-Massenspektren für quantitative Analysen zu verbessern. Im Vergleich zu anderen Verfahren , die Lösungszusammensetzung oder Oberflächeneigenschaft ändert, ist 8,16-18 ändernden Trocknungsbedingungen einfacher und allgemein anwendbar für konventionelle Proben. So sind die meisten Massenspektrometrie-Benutzer können in regelmäßigen Anwendungen davon profitieren.

MALDI-Signal Homogenität Verbesserung mit Probenplatte abnehmender Temperatur ist auch wirksam für einige andere populäre Matrizen. Zum Beispiel verbessert α-Cyclodextrin (α-CD) -Signal Homogenität mit THAP und α-cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) als Matrix unter Niedertemperaturprobe Trocknungsbedingungen wurde kürzlich berichtet. 14 Nachteilig bei wechselnden Probenplatte Temperatur ist, dass das Verfahren zur Hochdurchsatzanalyse noch nicht geeignet ist aufgrund der langen Trocknungszeit Probe in Niedrigtemperaturbedingungen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Detergent powder Alconox 242985
Methanol Merck 106009
Acetonitrile Merck 100003
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) Sigma-Aldrich T64602 
Bradykinin fragment (1-7) Sigma-Aldrich B1651
Maltotriose Sigma-Aldrich 47884
Pipette tips Mettler Toledo 17005091
Microcentrifuge tube Axygen MCT-150-C
Equipment
Milli-Q water purification system Millipore ZMQS6VFT1
Powder-free nitrile gloves Microflex SU-690
600 ml beaker Duran 2110648
Ultrasonic cleaner Delta DC300H
Hygrometer Wisewind 5330
Nitrogen gas flowmeter Dwyer RMA-6-SSV
K-type thermocouples Digitron 311-1670
Centrifuge Select BioProducts Force Mini 
Pipette Rainin pipet-lite XLS
Stereomicroscope Olympus SZX16
Temperature controllable drying chamber this lab
Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS) this lab
MALDI-TOF stainless steel sample target this lab

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References

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