Préparation des échantillons MALDI homogènes pour les applications quantitatives

Biochemistry

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Summary

Un protocole pour réduire les hétérogénéités spatiales des signaux d'ions en spectrométrie de masse MALDI en régulant la température du substrat au cours des processus de séchage de l'échantillon est démontrée.

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Ou, Y. M., Tsao, C. W., Lai, Y. H., Lee, H., Chang, H. T., Wang, Y. S. Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications. J. Vis. Exp. (116), e54409, doi:10.3791/54409 (2016).

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Abstract

Protocol

NOTE: Ce protocole est développé pour réduire l'hétérogénéité spatiale du fragment maltotriose et la bradykinine (1-7) préparé avec la méthode sèche-gouttelettes. Le protocole consiste en trois étapes principales, y compris la préparation et le préconditionnement, le dépôt de l'échantillon et le séchage, et la masse analyse des données de spectrométrie. Les procédures sont décrites et sont décrits plus en détail ci-dessous:

1. Préparation et préconditionnement

  1. Nettoyage de la plaque échantillon
    1. Porter des gants en nitrile et de la main-laver la plaque d'échantillon doucement avec du détergent et désionisée eau distillée (DDW).
    2. Rincer la plaque échantillon avec du méthanol (MeOH) et DDW.
    3. Insérez la plaque d'échantillon dans un bécher de 600 ml et remplir avec DDW.
    4. Soniquer la plaque d'échantillon dans DDW pendant 15 min dans un bain à ultrasons (200 W, 40 kHz).
    5. Retirer DDW du bêcher et remplir le bécher avec MeOH.
    6. Soniquer la plaque d'échantillon dans du MeOH pendant 15 min dans un bain à ultrasons (200 W, 40 kHz).
    7. Souffler les gouttes de solvant sur la plaque avec de l'azote gazeux et de garder la plaque d'échantillon sec avant le dépôt de l'échantillon.
  2. Réglementer Chambre de séchage Température
    NOTE:. La chambre de séchage est un 35 x 20 x 45 cm 3 (L x P x H) chambre acrylique La figure 1 montre l'image de ce système de séchage. La chambre est purgée avec de l'azote gazeux à température ambiante par l'intermédiaire d'un débitmètre de gaz à un débit constant pour maintenir une condition de faible humidité relative contrôlée par un hygromètre calibré installé à l'intérieur de la chambre de séchage. Un bloc à base de cuivre dans la chambre de séchage équipée d'un circulateur d'eau à température constante programmée est utilisée pour recevoir des plaques d'échantillons en acier inoxydable. Le bloc de base de cuivre est capable de réguler la température de la plaque échantillon 5-25 ° C. Les températures de l'air, le bloc de base de cuivre, et la plaque d'échantillon sont surveillées par des thermocouples de type K.
    1. Ouvrez la porte et mettre rapidement la plaque d'échantillon sur le cuivrebloc de base puis fermez la porte.
    2. ajuster manuellement le débitmètre de gaz pour régler le débit d'azote de 10 pieds cubes standard par heure (SCFH).
    3. Surveiller l'humidité relative dans la chambre de séchage par l'hygromètre et un réglage fin du débitmètre de gaz pour assurer l'humidité relative est toujours inférieure à 25%.
    4. Surveiller la température de la plaque d'échantillons par des thermocouples de type K et régler la température de circulation d'eau manuellement jusqu'à ce que la plaque d'échantillon atteint 5 ° C pendant une expérimentation ou la température ambiante (25 ° C) pour le contrôle.
      Remarque: Afin de stabiliser la plaque d'échantillon à une température conçue, la température de circulation d'eau est généralement réglé entre 0 et 5 ° C inférieure à celle de l'échantillon prévu. Par exemple, pour maintenir 5 ° C à la plaque d'échantillons, le réglage de la température de la circulation d'eau est dans la plage de 0 à 2 ° C; pour maintenir la plaque d'échantillon à 25 ° C, la température de consigne du thermostat d'eau est comprise dans l'intervalle de 23 à 25 ° C.
    5. Vérifiez que les températures requises et l'humidité relative sont atteints (tableau 1) avant le dépôt de l' échantillon.
      Remarque: Tous les paramètres, ainsi que leurs valeurs de réglage pour les procédés de séchage à différentes températures de la plaque d'échantillon sont indiqués dans le tableau 1.
      REMARQUE: à une faible température de plaque d'échantillons, la condensation de l'eau sur la plaque d'échantillon peut se produire si la porte de la chambre est ouverte pendant une longue période. Si la condensation de l' eau se produit, fermez la porte et NE PAS déposer un échantillon sur elle jusqu'à ce que la condensation de l' eau est séché.
  3. Préparation de la matrice et Analyte Solutions
    1. Préparation des solutions de matrice
      1. Préparer une solution 0,1 M THAP avec 50% d'acétonitrile (ACN): 50% de solution aqueuse DDW.
    2. Préparation des analytes
      1. Préparer 10 -4 M solution maltotriose avec DDW.
      2. Préparer 10 -5 M fragment de la bradykinine (1-7) dans une solution à 50% d' acétonitrile(ACN): 50% de solution aqueuse DDW.

2. Le dépôt de l'échantillon et de séchage

  1. Prémélange 0,25 ul de solution THAP 0,1 M et 0,25 pi de 10 -4 M ou maltotriose 10 -5 M fragment de la bradykinine (1-7) des solutions dans un microtube.
  2. Vortex la solution mélangée pendant 3 sec.
  3. Centrifuger la solution mélangée pendant 2 secondes (2000 x g) pour recueillir la solution au fond du tube de centrifugation.
  4. Ouvrez la porte de la chambre de séchage, soigneusement déposer 0,1 ul de la solution sur la plaque d'échantillon à la pipette et fermer la porte immédiatement.
  5. Attendez que l'échantillon gouttelette de sécher.
    . NOTE: Les temps de séchage habituellement observées avec des températures différentes de la plaque d'échantillon sont énumérés dans le tableau 1 pour la température de la plaque d'échantillon de 5 ° C, le temps de séchage moyen est de 800 à 1.000 sec; pour la température de la plaque d'échantillon de 25 ° C, le temps de séchage moyenne est de 100 à 150 sec.
  6. Après séchage, ouvrir la porte de la chambre de séchage.
  7. Régler la température de circulation d'eau à température ambiante (25 ° C).
    REMARQUE: Passer cette étape si la plaque d'échantillon est maintenu en permanence à la température ambiante (25 ° C) pendant le processus de séchage.
  8. Après les échantillons de température de la plaque revient à la température ambiante (25 ° C), retirer la plaque d'échantillon de la chambre de séchage.
  9. Examiner l'échantillon morphologie sous un stéréomicroscope 5X et prendre une image instantanée champ lumineux.
    NOTE: Si les morphologies de cristal ne sont pas comme prévu, il est nécessaire de préparer un nouvel échantillon à la même procédure. Morphologies cristallines typiques sont présentés dans les panneaux supérieurs de la figure 2.
    REMARQUE: Dans les cas où la température basse de la plaque d'échantillons, tels que 5 ° C, il est important de chauffer la plaque à la température ambiante avant de le sortir de la chambre de séchage de l'échantillon. Lors du dépôt des échantillons, NE PAS garder le solutio prémélangéen dans la pointe de la pipette en 10 sec. NE PAS utiliser à nouveau la solution prémélangée après le dépôt des échantillons. Les panneaux supérieurs de la figure 2 montrent des images lumineuses champ d'échantillons préparés avec des températures différentes de la plaque d'échantillon.

3. Analyse des données de spectrométrie de masse

  1. Spectrométrie de masse d'acquisition de données
    NOTE: Après la préparation, l'échantillon peut être analysé par spectrométrie de masse d'imagerie. Dans l'étude actuelle, les imagerie expériences MS sont réalisées à l' aide d' un synchronisé TOF double polarité de laboratoire intégré (DP-TOF) spectromètre de masse d'imagerie. 15 Commercial MALDI-TOF spectromètres de masse avec capacité d'imagerie sont également appropriés pour de telles expériences. Le spectromètre de masse est utilisé dans l'extraction linéaire et modes d'ions positifs avec des retards d'extraction optimisés. L'énergie cinétique des ions est de 20 kV. La taille du faisceau laser est de 35 um de diamètre sur la surface de l'échantillon, et le spectre de chaque endroit est le average de 5 tirs laser.
    1. Insérez la plaque d'échantillon dans le spectromètre de masse MALDI.
    2. Effectuer l'imagerie de masse analyse par spectrométrie à l'échantillon préparé dans les étapes 2.1-2.9.
    3. Sélectionnez un pic de masse caractéristique de la liste de masse affichée dans la fenêtre de résultat et cliquez sur "2D" pour tracer une image d'ions à deux dimensions.
      NOTE: Pour maltotriose mélangé avec THAP, les pics caractéristiques sont sodiated maltotriose, THAP protonée et sodiated THAP. Pour fragment de bradykinine (1-7) mélangé avec THAP, les pics caractéristiques comprennent protonés fragment de bradykinine (1-7), protonée THAP et sodiated THAP.
    4. Cliquez sur les boutons de réglage dans la fenêtre pour déterminer les limites supérieure et inférieure de l'intensité du signal et cliquez sur "enregistrer une image". Ce paramètre définit le contraste des images d'ions.
      NOTE: Dans chaque jeu individuel des données, les zones fissurées et les taches nulles montrant faible luminosité sont éliminés.
    5. Observer et comparer l'ionimage avec l'image lumineuse de champ qui a été prise à l'étape 2.9.
      NOTE: L'imagerie par spectrométrie de masse et la construction d'images d'ions particuliers peut être réalisé avec des instruments commerciaux. En raison de la variété de l'acquisition de données et de logiciels d'analyse, les utilisateurs doivent suivre les instructions logicielles fournies par le vendeur de l'appareil pour obtenir des images de haute qualité.
  2. L'analyse des données
    NOTE: L'hétérogénéité des échantillons est analysé quantitativement. Dans cette démonstration, chaque échantillon est divisé en plusieurs zones concentriques par des logiciels développés en interne pour analyser la distribution spatiale des ions. L'analyse peut également être effectuée en utilisant un logiciel d'analyse de données autonome.
    1. Cliquez sur les points nuls et les zones fissurées dans l'image ionique indiqué dans la fenêtre de résultat pour éliminer les zones sans importance.
      NOTE: Cette procédure définit la zone essentielle image ionique.
    2. Cliquez sur "trouver bord" bouton pour trouver la couche outmost de l'image d'ions.
    3. Cliquez sur "déduire" pour enregistrer les informations de l'abondance d'ions de la couche outmost dans une base de données et enlever cette couche de l'image d'ions simultanément. Une case à cocher représentant cette couche outmost apparaîtra dans la liste des "données de sortie" de la fenêtre de résultat.
    4. Répéter les étapes 3.2.2 et 3.2.3 jusqu'à ce que le centre de l'image d'ions est définie.
    5. Cliquez sur et sélectionnez toutes les cases à cocher dans la liste des "données de sortie" et cliquez sur "export" pour exporter les données.
    6. Ouvrez les données exportées en utilisant le logiciel de feuille de calcul pour calculer l'abondance d'ions moyenne de chaque couche pour obtenir les informations de distribution spatiale des ions.

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Representative Results

Les images champ clair, ainsi que les images du fragment maltotriose et la bradykinine (1-7) préparé avec la température de la plaque d'échantillon de 5 et 25 ° C MS sont représentés sur la figure 1. Dans le cas du maltotriose sodiated, le signal d'ions principalement Remplit à la périphérie de la zone d'échantillon lorsqu'il est préparé avec une température de la plaque d'échantillon de 25 ° C. En diminuant la température de la plaque d'échantillon à 5 ° C, le signal se remplit de manière homogène sur toute la surface de l'échantillon. Le seul inconvénient notable lors de la préparation des échantillons de moins de 5 ° C est qu'il ya plus de fissures que les échantillons préparés sous 25 ° C. L'image d'ions du fragment de bradykinine protonée (1-7) montre une tendance similaire à celles des maltotriose sodiated. Les résultats de l'imagerie MS suggèrent que la préparation des échantillons à une température de plaque d'échantillon inférieure peut redistribuer de manière significative les molécules et de réduire l'hétérogénéité.

figure 3 montre les résultats des analyses statistiques pour un fragment du maltotriose et de la bradykinine (1-7) préparés à des températures de la plaque d'échantillons de 5 et 25 ° C. Pour chaque échantillon, l'intensité moyenne est normalisée. Dans le cas du maltotriose sodiated avec une température de la plaque d'échantillon de 25 ° C, les intensités des signaux dans les centres sont nettement inférieurs à ceux de la température de la plaque d'échantillon de 5 ° C. Le résultat d'un fragment de la bradykinine protonée (1-7) montre aussi une moindre variation lors de la diminution de la température de la plaque d'échantillon 25-5 ° C.

Figure 1
Figure 1: Image du système de séchage de l' échantillon.La chambre de séchage est réalisée en acrylique. La chambre est purgée avec de l'azote gazeux à la température ambiante pour maintenir un état faible humidité relative. Un bloc de base en cuivre équipé d'un circulateur d'eau à température constante programmée est utilisée pour réguler la température des plaques d'échantillons en acier inoxydable. Les thermomètres surveillent l' air, bloc de base de cuivre, et la plaque échantillon. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:. L' abaissement de l' échantillon des résultats de la température de la plaque dans une meilleure homogénéité du signal Les images de champ lumineux (images supérieures), ainsi que les images MALDI (images inférieures) de maltotriose (a) et le fragment de la bradykinine (1-7) (b) préparé avec THAP sous des températures différentes de la plaque d'échantillon. MALDI les images ont été obtenues par extraction du maltotriose sodiated (m / z: 527) et un fragment de la bradykinine protonée (1-7) (m / z: 757) à partir du spectre total. La taille des pixels des images d'ions est de 35 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Variation du signal diminue à mesure que la température de la plaque d'échantillon décroît au cours du processus de séchage MALDI Les images sont obtenues avec le maltotriose (a) et un fragment de la bradykinine (1-7) (b) préparés avec THAP sous des températures différentes de la plaque d'échantillon.. données rouges et bleues indiquent l'échantillon préparé à la température de la plaque d'échantillon de 25 et 5 ° C, respectivement.g "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Plaque échantillon Température (° C) Échantillon Température de l' air (° C) Humidité relative (HR%) Temps de séchage (sec)
5 maltotriose avec THAP 20 ± 3 <25 800 - 1000
fragment de bradykinine (1-7) avec THAP
25 maltotriose avec THAP 25 ± 3 100-150
fragment de bradykinine (1-7) avec THAP

Tableau 1: paramètres expérimentaux et les conditions de séchage sous différentes températures de la plaque d'échantillon.

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Discussion

Sur la base des prédictions théoriques précédentes, les flux hydrodynamiques induites par la température à l'intérieur des gouttelettes peuvent surmonter l'extérieur des flux capillaires induits par évaporation du solvant. L'efficacité d'une telle recirculation interne des molécules est accrue lorsque la température des gradients dans une augmentation des gouttelettes. D'après les résultats prévus, en maintenant la température de la plaque d'échantillon à 5 ° C tout en maintenant son environnement à température ambiante, la vitesse moyenne du flux de recirculation à l'intérieur de la gouttelette est d'environ 4 fois plus rapide que celle des écoulements capillaires vers l'extérieur. Si la température de la plaque d'échantillon est le même que l'environnement, la vitesse moyenne du flux de recirculation est de 1800 fois plus lent que le flux capillaire vers l'extérieur. Les résultats de ces calculs indiquent que la diminution de température de la plaque échantillon pendant la préparation de l'échantillon est avantageuse. Les observations expérimentales sont d'accord avec cette prédiction.

Le caractère de la plaque d'échantillonature doit être contrôlée avec précision tout au long de l'échantillon procédé de préparation. Le tableau 1 présente la caractéristique de temps de séchage des gouttelettes de 0,1 ul d'échantillon sous des températures différentes de la plaque d'échantillon. Avant le dépôt de la solution d'échantillon sur la plaque, il est important de veiller à ce que la surface de la plaque d'échantillon est sec. Si la condensation de l'eau se produit lors de la préparation des échantillons sous des températures basses, le dépôt de la solution d'échantillon est pas recommandé parce que l'eau condensée agrandit les zones d'échantillonnage et dilue les solutions. Par conséquent, il est important de maintenir l'humidité relative de la chambre de séchage inférieure à 25%. En outre, lors de la préparation des échantillons à basse température, la plaque d'échantillons doit être chaud jusqu'à la température ambiante avant de le sortir de la chambre de séchage. Bien que la condensation mineure de l'eau après l'achèvement de l'échantillon de cristallisation ne modifie pas la population de l'échantillon, la condensation importante doit être évitée.

L'utilisation de solutions prémélangées fraîchement est recomréparé. Une fois que les solutions prémélangées sont exposées à l'air, pré-cristallisations de la solution échantillon se produisent et la taille des cristaux et de la morphologie finale peut varier. Par conséquent, la procédure de pipetage doit être réalisée avec une efficacité raisonnable, typiquement moins de 10 secondes, afin d'empêcher l'échantillon de gouttelettes de la pré-cristallisation à l'intérieur de l'embout de pipette. Il est recommandé d'observer morphologies des échantillons au microscope pour assurer morphologies appropriés en cristal sont produits avant l'analyse par spectrométrie de masse. Si les morphologies cristallines ne sont pas aussi bien que prévu, en répétant le procédé de dépôt selon les besoins.

D'après nos études théoriques et expérimentales, en préparant des échantillons avec une plaque d'échantillons à basse température installé dans des conditions ambiantes améliore considérablement la reproductibilité des données et de la qualité MALDI-MS. Des expériences ultérieures montrent également une amélioration significative de l'intensité du signal avec cette méthode de préparation des échantillons. Les données expérimentales obtenues par tsa méthode d'améliorer considérablement la fiabilité des spectres de masse MALDI pour des analyses quantitatives. En comparaison avec d' autres procédés impliquant la composition de la solution ou des changements de propriétés de surface, 8,16-18 conditions de séchage de changement est plus simple et plus généralement applicable pour les échantillons classiques. Ainsi, la plupart des utilisateurs de spectrométrie de masse peuvent en bénéficier dans des applications régulières.

Améliorer MALDI le signal d'homogénéité avec la diminution de la température de la plaque d'échantillon est également efficace pour d'autres matrices populaires. Par exemple, l' amélioration de α-cyclodextrine (α-CD) d'homogénéité de signal avec THAP et α-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA) en tant que matrice dans des conditions de séchage à basse température des échantillons ont été rapportés récemment. 14 L'inconvénient de changement de plaque d'échantillon la température est que la méthode est actuellement inadapté pour une analyse à haut débit en raison du long temps de séchage de l'échantillon dans des conditions de basse température.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Detergent powder Alconox 242985
Methanol Merck 106009
Acetonitrile Merck 100003
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) Sigma-Aldrich T64602 
Bradykinin fragment (1-7) Sigma-Aldrich B1651
Maltotriose Sigma-Aldrich 47884
Pipette tips Mettler Toledo 17005091
Microcentrifuge tube Axygen MCT-150-C
Equipment
Milli-Q water purification system Millipore ZMQS6VFT1
Powder-free nitrile gloves Microflex SU-690
600 ml beaker Duran 2110648
Ultrasonic cleaner Delta DC300H
Hygrometer Wisewind 5330
Nitrogen gas flowmeter Dwyer RMA-6-SSV
K-type thermocouples Digitron 311-1670
Centrifuge Select BioProducts Force Mini 
Pipette Rainin pipet-lite XLS
Stereomicroscope Olympus SZX16
Temperature controllable drying chamber this lab
Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS) this lab
MALDI-TOF stainless steel sample target this lab

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References

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