تطوير اللعابية الأجسام المضادة المناعية المتعددة لقياس التعرض البشري للمسببات البيئية

1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati
Published 9/12/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Augustine, S. A., Eason, T. N., Simmons, K. J., Curioso, C. L., Griffin, S. M., Ramudit, M. K., et al. Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens. J. Vis. Exp. (115), e54415, doi:10.3791/54415 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

مسببات وآثار تعرض الإنسان لمسببات الأمراض البيئية يشكل مصدر قلق كبير في جميع أنحاء العالم، وهكذا، فإن القدرة على تقييم فعالية النهج الإنتاجية العالية التعرض والالتهابات باستخدام التكلفة ستكون لا غنى عنه. توضح هذه المخطوطة تطوير وتحليل المناعه تعدد الإرسال القائم على حبة قادرة على قياس وجود الأجسام المضادة في لعاب الإنسان لمسببات الأمراض متعددة في وقت واحد. اللعاب هو جاذبية خاصة في هذا الطلب لأنه موسع، أرخص وأسهل لجمع من المصل. اقترنت مستضدات من مسببات الأمراض البيئية المجهرية carboxylated (الخرز) وتستخدم لقياس الأجسام المضادة في كميات صغيرة جدا من عينات لعاب الإنسان استخدام، حل مرحلة الفحص القائمة على حبة. وإلى جانب الخرز مع مستضدات من العطيفة الصائمية، هيليكوباكتر بيلوري، التوكسوبلازما، noroviruses (G I.1 وG II.4) والتهاب الكبد الوبائي أ. لضمان أن المستضدات واقترنت بما فيه الكفاية لالخرز، تم تأكيد اقتران باستخدام أنواع محددة، والأجسام المضادة القبض الأساسي المشتقة من الحيوانات، تليها الحضانة مع المعقدة البيروكسيديز مكافحة أنواع الأجسام المضادة كشف الثانوية ومراسل streptavidin-R-فيكوإيريترين (SAPE). كوسيلة لمراقبة لقياس غير محددة وملزمة، كان يعالج مجموعة واحدة حبة مطابق للآخرين إلا لم تترافق إلى أي مستضد. وثم حضنت الخرز جانب مستضد والسيطرة مع عينات من اللعاب البشري التي جمعت بأثر رجعي، تقاس على محلل عالية الإنتاجية على أساس مبادئ التدفق الخلوي، وقياس وجود الأجسام المضادة للكل مستضد في وحدات كثافة الوسيط الإسفار (MFI) . هذا المناعية تعدد الإرسال لديها عدد من المزايا، بما في ذلك المزيد من البيانات مع أقل عينة. خفض التكاليف والعمل؛ والقدرة على تخصيص فحص للعديد من الأهداف المثيرة للاهتمام. وتشير النتائج إلى أن المناعية تعدد الإرسال اللعاب قد تكون قادرة على تحديد التعرض والالتهابات السابقة، التي يمكن أن تكون especiaمفيد LLY في دراسات المراقبة التي تنطوي على البشر كبير.

Introduction

ثمانية وثمانين في المئة من الأمراض المرتبطة بالإسهال في جميع أنحاء العالم ويرتبط مع التعرض البشري للمياه الملوثة، الأغذية غير المأمونة، وسوء الصرف الصحي / النظافة، مما تسبب في ما يقرب من 1.5 مليون حالة وفاة، وغالبيتهم من الأطفال 1. وهذا هو السبب الرئيسي للقلق لمسؤولي الصحة العامة وصانعي السياسات. في محاولة لتقصي حالات التعرض والأمراض المرتبطة المنقولة عن طريق المياه ومسببات الأمراض البيئية الأخرى، وضعنا المناعية تعدد الإرسال لقياس الأجسام المضادة في العينات البشرية 2-4. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب لدراسات وبائية لتحديد تعرض الإنسان لهذه الجراثيم، وتحديد أفضل التهابات immunoprevalence وقوع الحادث.

اللعاب يبشر بالخير الكبير كبديل للمصل للأبحاث العلامات البيولوجية البشرية. ومن بين مزايا استخدام اللعاب هي غير الغازية وسهولة جمع العينات، وانخفاض التكلفة، ويمكن بسهولة أن تجمع عينات من الأطفال 5-7 </ سوب>. وقد تم دراسة عينات من مصل الدم واللعاب على نطاق واسع عن الأجسام المضادة ضد ه. بيلوري 2،3،8، المتصورة المنجلية المتحولة الحالة للنسج 10، كريبتوسبوريديم بارفم 3،11، العقدية الالتهاب الرئوي 12 وفيروسات التهاب الكبد A و C 13-14، noroviruses 2-4،15، T. التوكسوبلازما 2-4 وحمى الضنك فيروس 16، وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) 17، والإشريكية القولونية O157: H7 18.

والمناعية تعدد الإرسال يسمح لتحليل التحاليل متعددة في وقت واحد داخل حجم العينة واحد وخلال دورة واحدة أو التشغيل. مستضدات المضاعفة من C. الصائمية، T. التوكسوبلازما، H. pylori واستخدمت التهاب الكبد الوبائي أ، واثنين من noroviruses لقياس البشري اللعاب مفتش 2-4 وايغا 3،4 والبلازما مفتش 2،3 استجابات الأجسام المضادة لهذه الجراثيم باستخدامالقائم على حبة المناعية الإرسال المتعدد. عندما تستخدم بالاقتران مع الدراسات الوبائية من التعرض للميكروبات في الماء والتربة والغذاء، ونوع من الفحص وصفها في هذه الدراسة قد توفر معلومات قيمة لتعزيز فهم الالتهابات التي تسببها الجراثيم البيئية. وعلاوة على ذلك، البيانات الأجسام المضادة اللعابية تم الحصول عليها من هذه الدراسات يمكن استخدامها لتحسين نماذج تقييم المخاطر 19-22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على موافقة من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB # 08-1844، جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل، NC، الولايات المتحدة الأمريكية) لجمع عينات من اللعاب فلعية حفز من مرتادي الشواطئ في بوكيرون بيتش، وبورتوريكو، وذلك كجزء من الولايات المتحدة وكالة حماية البيئة (وكالة حماية البيئة) الوطني للوبائيات والتقييم البيئي للالترفيهية (NEEAR) دراسة المياه 23 لتقييم السباحة يرتبط التعرض والأمراض. موضوعات الدراسة توفر الموافقة المسبقة وصدرت تعليمات حول استخدام الجهاز جمع اللعاب من قبل المقاولين وكالة حماية البيئة المدربين. تم شحن عينات من اللعاب على الجليد، وعند استلام، كانوا طرد وتخزينها في -80 درجة مئوية كما هو موضح 4.

1. تفعيل الخرزة

  1. و resuspend أسهم مجموعة حبة من قبل vortexing وsonicating لمدة 20 ثانية، ونقل ما يقرب من 5.0 × 10 6 حبات الأوراق المالية (400 ميكرولتر) لأنابيب microcentrifuge.
    ملاحظة: Tانه الخرز يتم توفيره بتركيز 12.5 × 10 6 حبات / مل.
  2. بيليه حبات الأسهم عن طريق الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 2 دقيقة.
  3. إزالة طاف و resuspend حبات مكعبات في 100 ميكرولتر الماء المقطر (DH 2 O) من دوامة وصوتنة لمدة 20 ثانية. كرر الخطوة 1.2.
  4. إزالة طاف و resuspend حبات غسلها في 80 ميكرولتر من 100 مم أحادي فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 6.2 من دوامة وصوتنة لمدة 20 ثانية.
  5. مباشرة قبل الاستعمال، وجعل حل 50 ملغ / مل N -hydroxysulfosuccinimide (سلفو NHS) وذلك بإضافة 200 ميكرولتر درهم 2 O إلى 10 ملغ سلفو NHS قسامة. مزيج من قبل دوامة.
  6. إضافة 10 ميكرولتر من 50 ملغ / مل سلفو NHS إلى الخرز. مزيج من قبل دوامة.
  7. مباشرة قبل الاستعمال، وجعل 50 ملغ / مل 1-ethyl- [3dimethylaminopropyl] carbodiimide هيدروكلوريد (EDC) الحل بإضافة 200 ميكرولتر الماء المقطر (DH 2 O) إلى EDC قسامة 10 ملغ. مزيج من قبل دوامة.
  8. إضافة 10 ميكرولتر من 50حل ملغ / مل EDC إلى الخرز. مزيج من قبل دوامة. احتضان حبات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، في الظلام، مع خلط من قبل دوامة في 10 دقيقة فترات. بيليه الخرز تفعيلها من خلال microcentrifugation في 10000 x ج لمدة 2 دقيقة.
  9. إزالة طاف و resuspend الخرز في 250 ميكرولتر من 50 ملي 2- [N -Morpholino] حامض ethanesulfonic (MES)، ودرجة الحموضة 5.0 من دوامة وصوتنة لمدة 20 ثانية.
  10. بيليه الخرز تفعيلها من خلال microcentrifugation في 10000 x ج لمدة 2 دقيقة.
  11. كرر الخطوات من 1.9 و 1.10.
    ملاحظة: هذا يوفر ما مجموعه اثنين من يغسل مع 50 ملي زارة التربية والعلم، ودرجة الحموضة 5.0.
  12. resuspend والخرز في 100 ميكرولتر من 50 ملي زارة التربية والعلم، ودرجة الحموضة 5.0 من دوامة وصوتنة لمدة 20 ثانية.

2. حبة اقتران

  1. زوجان المستضدات إلى مجموعات حبة باستخدام تركيزات هو مبين في الجدول رقم 1.
  2. إضافة كل مستضد إلى الخرز تنشيط وجلب الحجم الإجمالي إلى 500 ميكرولتر في 50 ملي زارة التربية والعلم، ودرجة الحموضة 5.0. مزيج من المضادات لحبات يوميا بحلول دوامة.
  3. احتضان المستضدات والخرز لمدة 2 ساعة مع خلط بالتناوب (~ 15 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بيليه حبات مقرونا microcentrifugation في 10000 x ج لمدة 2 دقيقة.
  4. إزالة طاف و resuspend الخرز في 500 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ألبومين المصل -bovine (BSA) monolaurate -polyoxyethylenesorbitan (توين-20) -sodium أزيد (PBS-TBN) ودرجة الحموضة 7.4 من دوامة وصوتنة. بيليه الخرز التي microcentrifugation في 10000 x ج لمدة 2 دقيقة وإزالة طاف.
    تحذير: أزيد الصوديوم هو مادة كيميائية سامة بحدة. وهو خطير إذا ابتلع أو يحصل على اتصال مع الجلد. لا تتنفس الغبار / الدخان / الغاز / الضباب / الأبخرة أو الرش. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE ل) عند التعامل مع والتخلص منها طبقا للقوانين المناسبة.
  5. resuspend والخرز في 1 مل من برنامج تلفزيوني، وتعمل المنظمة من قبل دوامة وصوتنة لمدة 20 ثانية.
  6. بيليه الخرز التي microcentrifugation في 10000 x ج لمدة 2 دقيقة.
  7. كرر الخطوات من 2.5 و 2.6.
    ملاحظة: هذا يوفر ما مجموعه اثنين من يغسل مع برنامج تلفزيوني TBN.
  8. resuspend والخرز جانب وغسلها في 1 مل من برنامج تلفزيوني، 1٪ BSA، 0.05٪ أزيد، ودرجة الحموضة 7.4. تخزين حبات جانب في C الثلاجة 2-8 درجة في الظلام.

3. عدد الخرزة

  1. إعداد 1:10 التخفيف من الخرز يقترن في الماء أو العازلة في برنامج تلفزيوني.
  2. تحميل 10 ميكرولتر من التخفيف خرزة على عدادة الكريات عند نقطة العينة المقدمة.
  3. عد حبات ينظر في واحدة من 4 × 4 شبكات الزاوية. حساب عدد من الخرز يقترن باستخدام المعادلة التالية: عدد (1 ركن من 4 × 4 الشبكة) س (1 × 10 4) س (عامل تمييع) س إعادة تعليق حجم في مل.

4. التأكيد من Antigen اقتران

  1. resuspend ومزيج الأوراق المالية من الخرز بالإضافة إلى مولدات المضادات من الاهتمام من قبل دوامة وصوتنة لمدة 20 ثانية.
  2. تحضير خليط حبة تعمل عن طريق تمييع الأسهم حبة بالإضافة إلى المباراة النهائيةتركيز 100 الخرز / ميكرولتر من كل حبة فريدة المنصوص عليها في برنامج تلفزيوني-1٪ عازلة BSA (PBS-1٪ BSA، ودرجة الحموضة 7.4).
  3. إعداد لا يقل عن 7 شقين التخفيفات المسلسل مكافحة الأنواع مفتش الأجسام المضادة الأولية وفقا لتوصيات الشركة الصانعة في 96-جيدا لوحة أسفل مستديرة مع العازلة في برنامج تلفزيوني-1٪ BSA.
  4. قبل الرطب عمود 8 جيدا منفصل (8 صفوف) من أسفل لوحة تصفية 96-جيدا لكل مستضد اختبار تأكيد اقتران مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ. إضافة 50 ميكرولتر من العمل خليط حبة (الخرز يقترن مستضد) إلى الآبار قبل الرطب.
  5. إضافة 50 ميكرولتر من التخفيفات الأجسام المضادة للصفوف 1-7 من كل عمود من مرشح لوحة 96-جيدا و50 ميكرولتر من العازلة BSA PBS-1٪ إلى صف 8 بدلا من الأجسام المضادة المخفف لتكون بمثابة آبار الخلفية. الاختلاط مع pipettor متعددة القنوات من pipetting صعودا وهبوطا 5 مرات. تنفيذ نفس الإجراء كل مجموعة حبة جانب مستضد إلى تأكيد.
  6. تغطية والسماح لاحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفةerature لمدة 1 ساعة على شاكر صفيحة ميكروسكوبية 500 دورة في الدقيقة. إزالة طاف بواسطة فراغ.
  7. غسل الآبار مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ. كرر 1X. resuspend والخرز في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-1٪ BSA مع pipettor متعدد القنوات.
  8. تمييع المعقدة البيروكسيديز المضادة للأنواع محددة مفتش الأضداد كشف الثانوي إلى 16 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني-1٪ BSA.
  9. إضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخفف إلى كل بئر بواسطة pipetting صعودا وهبوطا 5 مرات.
  10. تغطية لوحة مرشح والسماح لاحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر لوحة. إزالة طاف بواسطة فراغ. غسل الآبار مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ. تكرار غسل 1X.
  11. resuspend والخرز في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-1٪ BSA مع pipettor متعدد القنوات.
  12. تمييع مراسل streptavidin-R-فيكوإيريترين (SAPE) إلى 24 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني-1٪ BSA.
  13. إضافة 50 ميكرولتر من مراسل إلى كل بئر وتخلط بواسطة pipetting صعودا وهبوطا 5 مرات.
  14. Cعلى لوحة مرشح والسماح لاحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر لوحة. إزالة طاف بواسطة فراغ. غسل الآبار مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ. تكرار غسل 1X.
  15. الخرز resuspend في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-1٪ BSA وتحليل 50 ميكرولتر باستخدام محلل 29.
    ملاحظة: يتم قياس نتائج المناعية تعدد الإرسال القائم على حبة في شدة الإسفار وسيطة (MFI). دائما الرجوع إلى أحدث إصدار من دليل البرنامج، إذا كان متوفرا لتجنب الأخطاء.

5. اللعابية المتعددة المناعية

  1. إزالة اللعاب من الفريزر -80 درجة مئوية، والسماح لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة.
  2. و resuspend مستضد يقترن الأسهم حبة من دوامة وصوتنة لمدة 20 ثانية.
  3. تحضير خليط حبة تعمل عن طريق تمييع الأسهم حبة بالإضافة إلى التركيز النهائي من 100 الخرز / ميكرولتر من كل مجموعة حبة فريدة من نوعها في برنامج تلفزيوني-1 عازلة٪ BSA.
  4. إعداد التخفيف 1: 4 من اللعاب ثإيث PBS-1 العازلة BSA٪ في 96 جيدا، عميقة لوحة جيدا.
  5. قبل الرطب لوحة تصفية مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ.
  6. إضافة 50 ميكرولتر من خليط حبة العمل وحجم مساو من اللعاب المخفف إلى 95 بئرا من 96 لوحات مرشح جيدا ل1: 8 التخفيف النهائي. مزيج ردود الفعل مع pipettor متعدد القنوات. إلى عنصر تحكم واحد أيضا، إضافة 50 حبات يقترن مستضد ميكرولتر بالإضافة إلى 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-1 عازلة٪ BSA (كبديل لعاب).
  7. تغطية والسماح لاحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على شاكر صفيحة ميكروسكوبية 500 دورة في الدقيقة. إزالة طاف بواسطة فراغ. غسل الآبار مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ. تكرار غسل 1X.
  8. حبات Resuspend في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-1٪ BSA مع pipettor متعدد القنوات.
  9. تمييع الماعز المعقدة البيروكسيديز مفتش مكافحة الإنسان الكشف عن الأجسام المضادة الثانوية إلى 16 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني-1٪ BSA.
  10. إضافة 50 ميكرولتر المخفف الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر وتخلط محتويات معوpipettor متعدد القنوات.
  11. تغطية لوحة مرشح والسماح لاحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر لوحة. إزالة طاف بواسطة فراغ. غسل الآبار مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ. تكرار غسل 1X.
  12. حبات Resuspend في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-1٪ BSA مع pipettor متعدد القنوات.
  13. تمييع مراسل streptavidin-R-فيكوإيريترين (SAPE) إلى 24 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني-1٪ BSA.
  14. إضافة المراسل 50 ميكرولتر إلى كل بئر وتخلط مع pipettor متعدد القنوات.
  15. تغطية لوحة مرشح والسماح لاحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر لوحة. إزالة طاف بواسطة فراغ. غسل الآبار مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ. تكرار غسل 1X.
  16. الخرز resuspend في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-1٪ BSA وتحليل 50 ميكرولتر باستخدام محلل 29.
    يتم قياس نتائج المناعية تعدد الإرسال في وحدات الوسيط الإسفار كثافة (MFI): مذكرة. دائما الرجوع إلىأحدث نسخة من دليل البرنامج، إذا كان متوفرا لتجنب الأخطاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام مجموعة واحدة حبة فريد كوسيلة لمراقبة لقياس غير محددة وملزمة وعينة لعينة التباين. تم علاج هذه الخرز بشكل مطابق للمستضد إلى جانب حبات باستثناء أنهم لا حضنت مع أي مستضد في خطوة اقتران. تم إزالة القيم المؤسسة> 500 تم الحصول عليها من الخرز السيطرة حضنت مع كل عينات من اللعاب من تحليلات أخرى بسبب يشتبه التلوث من المصل وتم تسجيل وزعت الردود المتبقية. اللعاب يمكن أن تكون ملوثة المصل إذا يفرك اللثة بقوة أيضا مع الاسفنجة التي تعلق على جهاز جمع أو إذا كان مشارك الدراسة يعاني من مرض اللثة. سجل حولت استخدمت بيانات المؤسسة لحساب النقطة الفاصلة immunopositive من 505 مؤسسات التمويل الأصغر على أساس متوسط ​​زائد 3 الانحرافات المعيارية للقيم المؤسسة السجل. بالإضافة إلى ذلك، تم إضافة الخرز جانب مستضد إلى الآبار المحددة التي تم التعامل معها على أنها اختبار الآبار في كل بطريقة باستثناء ديلتم استبدال اللعاب uted مع برنامج تلفزيوني-1٪ BSA لتقييم مضان الخلفية وعبر التفاعل. تم طرح القيم مؤسسات التمويل الأصغر التي تم الحصول عليها في هذه الآبار خلفية من القيم المؤسسة من كل مجموعة حبة جانب مستضد لكل عينة اللعاب.

وأكد حبة اقتران باستخدام حيوان المستمدة أنواع محددة الأجسام المضادة الكشف الأولي محددة لكل مستضد. للتأكد من أن حبات المستضد إلى جانب كانت قادرة على الاقتراب من النطاق الديناميكي للمقايسة، حددنا اقتران الصحيح باعتبارها مؤسسات التمويل الأصغر ≥18،000، ومراقبة الاستجابة للجرعة وعبر التفاعل بين الأجسام المضادة الأولية وغير الأهداف من <10٪ كما هو موضح 2 . تأكيدات اقتران تمثيلية للC. الصائمية وT. وتظهر التوكسوبلازما من مولدات المضادات في فحص في الشكل 1.

واستنادا إلى النقطة الفاصلة المحددة (505 MFI)، فإن معدل immunoprevalenceتراوحت الصورة لعينات (ن = 2078) من حوالي 2٪ (ن = 41) لT. التوكسوبلازما إلى ما يقرب من 50٪ (ن = 1009) لGI.1 نوروفيروس (الشكل 2). وتشير البيانات إلى أن معدل immunoprevalence كان أعلى مستوى للnoroviruses يليه التهاب الكبد الوبائي أ و ه بيلوري.

في حين كانت 32٪ (ن = 672) من العينات immunonegative لجميع مسببات الأمراض في الفحص، 68٪ (ن = 1406) كان immunopositive إلى واحد أو أكثر من مسببات الأمراض. ويبين الشكل 3 انهيار مناعة إلى واحد أو أكثر من مسببات الأمراض.

شكل 1
يحلل اقتران تأكيدا لاثنين من الكائنات الحية الموجودة في المناعية تعدد الإرسال تم إجراء تأكيد اقتران لجميع مولدات المضادات والرسوم البيانية لجيم: الشكل 1. الصائمية وT. وممثلى أعضاء التوكسوبلازما في هذا الرقمsentative من تأكيدات اقتران لمولدات المضادات في المناعية متعددة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
تراوحت Immunoprevalence لمسببات الأمراض المحددة Immunoprevalence لمسببات الأمراض المحددة في المناعية تعدد الإرسال من حوالي 2٪ للت: الرقم 2. التوكسوبلازما إلى ما يقرب من 50٪ لGI.1 نوروفيروس. كانت أكثر شيوعا نظرن تليها الأجسام المضادة ضد المستضدات نوروفيروس التي كتبها HAV (التهاب الكبد الوبائي أ) و H. بيلوري. T. التوكسوبلازما و C. ظهرت الأجسام المضادة الصائمية أقل كثيرا في عينات من اللعاب تحليلها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من الهو الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: توزيع مناعة لمسببات الأمراض متعددة في نفس الوقت يسمح المناعية تعدد الإرسال لتحليل مناعة لمسببات الأمراض متعددة في وقت واحد في حجم عينة ميكرولتر 50. تقريبا كان ثلث عينات من اللعاب يعاير immunonegative عن الأجسام المضادة ضد كل من المستضدات في متعدد. تقريبا كانت 31٪ من العينات immunopositive للمستضد واحد بينما كان ربع إيجابي لاثنين من مولدات المضادات. كانت 9.4٪ immunopositive إلى ثلاثة مولدات المضادات. وكانت 3٪ إيجابية لأربعة أو أكثر من المضادات في وقت واحد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مولد المضاد حبة مجموعة عازلة اقتران حج تركيز (ميكروغرام) # من الخرز في 1 الزاوية # من الخرز / ميكرولتر المجلد. 100 B / ماي لمدة 4 مل (ميكرولتر)
جيم الصائمية 8 MES 5.0 50 64 6400 94
بكتيريا 33 MES 5.0 25 71 7100 85
إلتهاب الكبد أ 42 MES 5.0 100 91 9100 66
T. التوكسوبلازما 30 MES 5.0 25 85 8500 71
نوروفيروس GII.4 55 MES 5.0 5 72 7200 83
نوروفيروس GI.1 67 MES 5.0 5 63 6300 95
وفكت 80 MES 5.0 60 6000 100
الحجم الكلي من الخرز (ميكرولتر) 594
إجمالي حجم المخزن المؤقت الحاجة (ميكرولتر) 3406

الجدول 1: العمل مزيج حبة لالمناعية تعدد الإرسال بعد أن تم الانتهاء من توصيل وتأكيد، تم إعداد مزيج رئيسية تتكون كل مجموعة حبة كما هو مبين. تم توزيع مزيج الرئيسي بينليرة لبنانية من الآبار في 96 لوحة جيدا. وحضنت كل من الآبار مع اللعاب باستثناء بئر واحدة تحكم الخلفية التي تضمنت الوحيدة الخرز وPBS-1٪ عازلة BSA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتشير هذه النتائج إلى أن الطريقة المناعية تعدد الإرسال مفيد للتمييز بين عينات اللعاب التي immunopositive أو immunonegative. لتحديد مناعة، وضعت النقطة الفاصلة واحدة عن طريق حساب متوسط ​​زائد ثلاثة انحرافات معيارية من سجل حولت الردود مؤسسات التمويل الأصغر من الخرز وفكت السيطرة اختبار مع كل من عينات اللعاب. والنقطة الفاصلة التي أتيحت القدرة على تقييم التعرض وimmunoprevalence إما إلى مسببات الأمراض واحدة أو متعددة. قد تكون هذه القوة التمييزية مفيدة في الدراسات السكانية إلى التحري عن المخاطر الصحية المرتبطة بالتعرض لمسببات الأمراض البيئية وغيرها.

هناك العديد من الطرق الأخرى التي يمكن استخدامها لتحديد النقطة الفاصلة اعتمادا على توزيع مؤسسات التمويل الأصغر، والضوابط وفكت وما السؤال تم تصميم هذه الدراسة إلى الإجابة. وتشمل بعض الأمثلة لتحديد قطع العرضية نماذج مختلطة محدود 24-26، يعني زائد 3الانحرافات المعيارية لاستجابات لضوابط، يعني زائد 2 الانحرافات المعيارية لاستجابات لضوابط، وثلاثة أضعاف متوسط ​​الاستجابات لضوابط 27،28. للعروض بسيطة، ويمكن استخدام معايير أقل صرامة لكن لدراسات وبائية، فإنه قد يكون من الأنسب استخدام تعريف أكثر صرامة للحد من احتمال التقارير المغلوطة. لدينا التطبيق الأولي هو أن ننظر إلى immunoconversion وimmunoprevalence بين السباحين وغير السباحين. في هذه الدراسة، لم توزع عادة في مؤسسات التمويل الأصغر مراقبة وفكت وكانت النتائج سجل تحويل.

وتشمل المزايا لأداء المناعه تعدد الإرسال القائم على حبة استخدام أحجام عينة منخفضة جدا، والحد من الوقت والعمل والقدرة على قياس استجابات لمدة تصل إلى 500 التحاليل في وقت واحد في حين تتطلب الحد الأدنى من الكواشف. على النقيض من ذلك، الأساليب التقليدية لتقييم مستويات الأجسام المضادة تدل على التعرض و / أو عدوى (على سبيل المثال ELISA اختبار) يمكن أن يستغرق عدة ساعات لإكمال، هي عمالة كثيفة، ويمكن استخدامها فقط لقياس تحليلها في وقت واحد. تتطلب هذه الأساليب التقليدية أيضا كميات أكبر من عينات المريض / مشارك. على سبيل المثال، أكثر من ELISA تتطلب لا يقل عن 100 ميكرولتر من العينة في حين المناعه تعدد الإرسال قد يتطلب 50 ميكرولتر أو أقل.

وتشمل القيود المفروضة على المناعه تعدد الإرسال الحاجة إلى تحسين دقيق لتحديد التركيزات المثلى من التقاط الابتدائي والأجسام المضادة كشف الثانوية، مستضدات والمراسل. عبر التفاعل هو أيضا مصدر قلق كبير في المناعية كما أجسام مضادة ضد مستضد معين قد تعبر-تتفاعل مع المستضدات من الكائنات الحية الأخرى، وبالتالي يؤدي إلى قراءات إيجابية كاذبة. الأمثل، وجهت عبر التفاعل وغير محددة وملزمة سابقا 2-4. نجاح مثل هذا الفحص يعتمد إلى حد كبير على القدرة على الحصول على المستضدات المناعية للغاية وكذلك antibo محددوفاة لهذه المستضدات لاستخدامها في اقتران حبة وتأكيدا اقتران الخطوات. الحد الآخر هو قلة توافر العينات تتميز (الإيجابية في التشخيص والسلبية) للتحقق من صحة المقايسات.

وهناك عدد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول. وهذه تشمل: ضمان مولدات المضادات التي ستقترن لحبات لا تحتوي على البروتينات الخارجية، أزيد، الجلايسين، تريس أو أي الأمينات الأولية. إذا كان أي من هذه العوامل موجودة في إعداد المستضد، فإنها يجب أن تحذف من قبل الغسيل الكلوي أو اللوني. فمن المستحسن أن واحدة ينبغي أن تبدأ مع 5 ميكروغرام من مستضد في 5000000 الخرز ويعاير للعثور على تركيز الأمثل. اختيار الأمثل الكشف عن تركيز الأجسام المضادة التي تعطي أفضل حساسية والنطاق الديناميكي. نضع في اعتبارنا أن تميل إشارات إلى الانخفاض مع زيادة تركيزات مستضد والكشف عن الأجسام المضادة (تأثير هوك). على سبيل المثال، إذا يقلل من إشارة كما يزيد من تركيز المستضد ثم كشفأيون الأجسام المضادة يمكن أن تحد. على العكس من ذلك، إذا تقلل الإشارات مع تزايد الكشف عن الأجسام المضادة ثم مراسل (SAPE) قد يكون مقيدا. تحقق من متعدد للتفاعل العرضي من خلال الجمع بين اقتران الأمثل لكل بروتين (5000 من كل حبة وضع لكل بئر). اختبار مجموعات حبة المضاعفة من خلال الجمع بين مع الأمثل كمية الكشف عن الأجسام المضادة. تحسين مراسل وجعل منحنى مستوى مستضد عن طريق اختبار كل مستضد على حدة.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها المناعية تعدد الإرسال لتحسين حساسية وزيادة إشارة الفلورسنت متوسط ​​هي في غاية الأهمية. لتحسين حساسية، والحد إما كمية المستضد إلى جانب لحبات أو تركيز الكشف عن الأجسام المضادة. يجوز للاستخدام أعلى الأجسام المضادة تقارب لالتقاط و / أو كشف أيضا تحسين حساسية. زيادة كمية المستضد إلى جانب لحبات قد يزيد من إشارة الفلورسنت متوسط. أظهرت إحدى الدراسات أن ما قبل احتضان عينات المصل مع polyvinylalcohol بالإضافة إلى بوفيدون عازلة (PVX) قادر على قمع غير محددة ملزمة في فحوصات مصلية باستخدام القائمة على حبة فحص تعدد الإرسال 30 مثل تلك التي نحن تصف هنا. ومع ذلك، وجدت دراسة أخرى من قبل المتعاونين لدينا أي تأثير كبير بين برنامج تلفزيوني BSA وPVX المخازن. وخلصوا أيضا إلى أن بسبب لزوجة أعلى من المخزن المؤقت PVX، خلقت مشاكل مع اكتساب حبة في المحلل والرغوة التي تشكلت في الآبار صفيحة 3.

في الختام، لقد قدم طريقة التي هي قادرة على قياس وجود أجسام مضادة مفتش اللعابية الإنسان لمسببات الأمراض متعددة في وقت واحد في حجم العينة صغير جدا. في المستقبل، وسيتم استخدام هذا الاختبار للكشف عن وجود الأجسام المضادة اللعابية المرتبطة بالتعرض المتعلقة السباحة أو التهابات ويساعد إبلاغ نماذج تقييم المخاطر. بالإضافة إلى ذلك، الفحص يمكن استخدامها لقياس الأجسام المضادة المرتبطة exposur المحمولة جوا وتنتقل عن طريق الأغذيةوفاق، تحديد العدوى الحادث أو immunoconversions وتوفير المعلومات المناعية الهامة لعلم الأوبئة إجراء الدراسات السكانية الاستبيان من نوع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الوكالة الأمريكية لحماية البيئة من خلال مكتبها للبحوث والتنمية بتمويل وإدارة البحوث هو موضح هنا. وقد خضع للمراجعة الإدارية الوكالة وافقت للنشر. لا تشكل ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية تأييد أو توصية للاستخدام.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Software
Microcentrifuge Thermo Electron Corporation 75002446 Used to centrifuge samples
Vortex Mixer VWR G560 Used to mix samples
Sonicator (mini) Fisher Scientific 15-337-22 Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. Capp Various
Hemacytometer (Bright Line) Housser Scientific  3200 Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold Millipore MSVMHTS00 Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker VWR 12620-926 Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5 ml and 0.5 ml) (assorted) VWR 30128-346
Weighing Scale Mettler or other Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer Invitrogen 947-01 Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b) The MathWorks, Inc. Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014 Microsoft Corporation Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software Luminex Corporation LX200-XPON3.1 Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus: grade II concentrate from cell culture Meridian Life Sciences 8505 Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori: lysate Meridian Life Sciences R14101 Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1) Meridian Life Sciences R18426 Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni: heat killed whole cells KPL 50-92-93 Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus (CCHMC)* NA Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori KPL 01-93-94 Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii Abcam Ab23507 Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species KPL 01-92-93 Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) Jackson 705-065-149 Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) KPL 16-13-06 Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) KPL 16-18-06 Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L) KPL 176-1506 Used for coupling confirmation
Consumables
1.5 ml copolymer microcentrifuge tubes USA Scientific 1415-2500 Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µl pipette tip refills BioVentures 5030050C
200 µl pipette tip refills BioVentures 5030080C
1,000 µl pipette tip refills BioVentures 5130140C
Aluminum foil Various Vendors Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates VWR 40002-009 Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates Millipore MABVN1250 Used to run assays
Oracol saliva collection system Malvern Medical Developments Limited Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads) Luminex Corporation Dependent on bead set Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) Pierce 77149 or 22980 Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Pierce 24510 Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) Molecular Probes S-866 Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma M-2933 Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) Sigma P-9416 Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, pH 7.4 Sigma P-3813 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA Sigma A-7888 0.1% (w/v)
Tween-20 Sigma P-9416 0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)** Sigma S-8032 **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma S-3139
5 N NaOH Fisher SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)  Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 1% BSA, pH 7.4 Sigma P-3688 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) Filter Sterilize and store at 4 °C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) Sigma S-3139 0.1 M NaH2PO4
5 N NaOH Fisher SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 Sigma P-3563 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. World Health Organization. Geneva. (2008).
  2. Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
  3. Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
  4. Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364, (1-2), 83-93 (2011).
  5. Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
  6. Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
  7. Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
  8. Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
  9. Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
  10. Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38, (6), 2344-2347 (2000).
  11. Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62, (11), 1231-1234 (2000).
  12. Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182, (4), 1260-1263 (2000).
  13. Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173, (2), 169-174 (2011).
  14. Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26, (4), 327-332 (2008).
  15. Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11, (6), 1028-1034 (2004).
  16. Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5, (5), e1046 (2011).
  17. Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6, (4), 577-580 (1999).
  18. Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52, (Pt 7), 569-572 (2003).
  19. Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1, (3), 125-131 (2003).
  20. Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50, (2), 23-30 (2004).
  21. Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198, (1-3), 229-238 (2004).
  22. Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
  23. Wade, T. J., et al. Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. (2011).
  24. Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
  25. Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26, (34), 4403-4409 (2008).
  26. Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134, (6), 1303-1312 (2006).
  27. Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11, (6), 1045-1053 (2004).
  28. Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74, (3), 373-379 (2011).
  29. Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
  30. Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309, (1-2), 200-204 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats