環境病原体に対するヒトの暴露を測定するために唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイの開発

1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati
Published 9/12/2016
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Immunology and Infection

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Summary

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Augustine, S. A., Eason, T. N., Simmons, K. J., Curioso, C. L., Griffin, S. M., Ramudit, M. K., et al. Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens. J. Vis. Exp. (115), e54415, doi:10.3791/54415 (2016).

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Abstract

病因および環境病原体に対するヒトの曝露の影響世界中の主要な関心事であると、このように、効果的なコストを用いて露光し、感染を評価する能力、高スループットのアプローチが不可欠であろう。この原稿は、同時に複数の病原体に対するヒトの唾液中の抗体の存在を測定することができるビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイの開発と分析を記載します。血清より収集するために、非侵襲的に安価かつ容易であるため、唾液は、この用途に特に魅力的です。環境病原体からの抗原は、カルボキシル化ミクロスフェア(ビーズ)に結合され、ビーズに基づく、溶液相アッセイを用いたヒトの唾液サンプルの非常に少量で、抗体を測定するために使用しました。ビーズはカンピロバクター、ヘリコバクター・ピロリ菌、トキソプラズマ、ノロウイルス(G I.1およびG II.4)およびA型肝炎ウイルス由来の抗原と結合させました。抗原が十分に結合させたことを確認するために、ビーズは、結合は、ビオチン化抗種二次検出抗体およびストレプトアビジンR-フィコエリトリンレポーター(SAPE)とのインキュベーション、続いて、種特異的な、動物由来の一次捕捉抗体を用いて確認しました。非特異的結合を測定するための対照として、あるビーズセットは、それが任意の抗原に結合しなかった以外、他に同様に処理しました。抗原結合およびコントロールビーズは、次いで、フローサイトメトリーの原理に基づいて、ハイスループット分析器で測定し、プロスペクティブ・採取したヒト唾液試料と共にインキュベートし、そして各抗原に対する抗体の存在は、蛍光強度中央値の単位(MFI)を測定しました。 。このマルチプレックスイムノアッセイは少ないサンプルでより多くのデータを含む多くの利点を、持っています。コスト削減と労働;関心のある多くのターゲットにアッセイをカスタマイズする機能。結果は、唾液、マルチプレックスイムノアッセイをespeciaあり得る、以前の曝露および感染を識別することが可能であることを示しています大規模な人間の集団を含むサーベイランス研究でLLY有用。

Introduction

下痢関連の病気の85八パーセントは、全世界で約150万人の死亡を引き起こし、汚染された水へのヒトの暴露、危険な食品、および不衛生/衛生状態に関連付けられている、の大半は子供1です 。これは、公衆衛生当局や政策立案者のための懸念の主な原因です。水性およびその他の環境の病原体に関連したエクスポージャーや病気を調査するための努力で、我々は、ヒト試料2-4中の抗体を測定するためのマルチプレックスイムノアッセイを開発しました。この方法は、これらの病原体へのヒトの暴露を決定するために、より良いimmunoprevalence入射感染を定義するために疫学的研究に適用することができます。

唾液は、人間のバイオマーカー研究のための血清の代替としてかなりの可能性を秘めています。唾液を使用する利点の中でも、サンプル収集、低コストの非侵襲性と使いやすさであり、試料を容易に<子供5-7から収集することができます/ SUP>。血清および唾液サンプルは、Hに対する抗体のために広く研究されてきましたピロリ 2,3,8、 熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)9、 赤痢アメーバ 10、クリプトスポリジウム 3,11、 肺炎連鎖球菌 12、肝炎ウイルスAとC 13-14、 ノロウイルス 2-4,15、T.ゴンジ 2-4、デング熱ウイルス16、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)17、および大腸菌 O157:H7 18。

マルチプレックスイムノアッセイは同時に単一のサンプルボリューム内および単一サイクルまたは実行中の複数の検体の分析を可能にします。 C.からの多重化抗原ジェジュニ 、T.ゴンジ、ピロリ菌は、A型肝炎ウイルス、および2つのノロウイルスを使用して、これらの病原体に対するヒト唾液のIgGおよびIgA 2-4 3,4および血漿のIgG 2,3抗体応答を測定するために使用されましたビーズベースの多重化イムノアッセイ。水、土壌、食品中の微生物への曝露の疫学的研究に関連して使用される場合、本研究において記載されるアッセイのタイプは、環境病原体によって引き起こされる感染症の理解を高めるために貴重な情報を提供することができます。また、このような研究から得られた唾液抗体のデータは、リスク評価モデル19-22を改善するために使用することができます。

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Protocol

承認は、米国の一部として、プエルトリコ、ボケロンビーチでbeachgoersから刺激滲出唾液サンプルを収集するための治験審査委員会(IRB#08から1844まで、ノースカロライナ大学チャペルヒル、ノースカロライナ州、米国)から入手しました環境保護庁(USEPA)国立疫学およびレクリエーション(NEEAR)水研究23の環境アセスメントは、水泳関連エクスポージャーや病気を評価しました。被験者は、インフォームドコンセントを提供し、訓練を受けたUSEPA請負業者によって唾液収集装置の使用を指示されました。唾液サンプルを受信すると、それらを遠心分離し、そして4に記載のように-80℃で保存し、氷上で輸送しました。

1.ビーズのアクティベーション

  1. ボルテックスし、20秒間超音波処理し、マイクロ遠心チューブにストックビーズ(400μL)の転送が約5.0×10 6により再懸濁ビーズセットを取り揃えております。
    注:T彼は、12.5×10 6ビーズ/ mlの濃度で供給されているビーズ。
  2. 2分間万×gで遠心分離することにより、在庫ビーズをペレット化。
  3. 20秒間ボルテックスし、超音波処理により蒸留水(のdH 2 O)の上清を除去し、100μlのペレット化したビーズを再懸濁します。繰り返し手順1.2。
  4. 上清を除去し、20秒間ボルテックスし、超音波処理により100mMの一塩基性リン酸ナトリウム、pHが6.2の80μlの洗浄したビーズを再懸濁します。
  5. 使用直前に、10mgのスルホ-NHSのアリコートに200μlののdH 2 Oを添加することにより、50 mg / mlでN -hydroxysulfosuccinimide(スルホ-NHS)ソリューションとなります。ボルテックスで混ぜます。
  6. ビーズに50 mg / mlでスルホ-NHSの10μLを加えます。ボルテックスで混ぜます。
  7. 使用直前に、10 mgのEDCアリコートに200μlの蒸留水(のdH 2 O)を添加することにより、50 mg / mlで1-エチル- [3dimethylaminopropyl]カルボジイミド塩酸塩(EDC)ソリューションとなります。ボルテックスで混ぜます。
  8. 50の10μLを追加ビーズのmg / mlでEDC溶液。ボルテックスで混ぜます。 10分間隔でボルテックスすることによって混合しながら、暗所で、室温で20分間ビーズをインキュベートします。 2分間万×gでマイクロ遠心によって活性化ビーズをペレット。
  9. 上清を除去し、20秒間ボルテックスし、超音波処理により、50mMの2- [N-モルホリノ]エタンスルホン酸(MES)、pH5.0の250μlの中でビーズを再懸濁します。
  10. 2分間万×gでマイクロ遠心によって活性化ビーズをペレット。
  11. 繰り返しは、1.9と1.10を繰り返します。
    注:これはの50mM MES、pHが5.0で2回の洗浄の合計を提供します。
  12. 20秒間ボルテックスし、超音波処理によっての50mM MES、pH5.0の100μlの中のビーズを再懸濁します。

2.ビーズカップリング

  1. を表1に示す濃度を用いてビーズセットの抗原。
  2. 活性化ビーズに各抗原を追加し、50mMのMES、pHを5.0に500μlの総容積をもたらします。抗原をミックスAN渦により、Dビーズ。
  3. 暗所で室温で回転(〜15回転)で混合しながら2時間のための抗原とビーズをインキュベートします。 2分間万×gでマイクロ遠心によって結合されたビーズをペレット化。
  4. 上清を除去し、リン酸緩衝生理食塩水500μlのビーズを再懸濁(PBS)-bovine血清アルブミン(BSA)-polyoxyethylenesorbitanラウレート(ツイーン20) - ナトリウムアジド(PBS-TBN)ボルテックスし、超音波処理することによりpHを7.4。 2分間万×gで微量遠心によりビーズをペレット化し、上清を除去します。
    注意:アジ化ナトリウムは急性毒性化学物質です。飲み込んだり皮膚に接触して取得する場合には致命的です。粉じん/煙/ガス/ミスト/蒸気やスプレーを吸入しないこと。取り扱う際は、適切な個人用保護具(P​​PEの)を着用し、適切な法律に従って処分します。
  5. 20秒間ボルテックスし、超音波処理によりPBS-TBNの1ミリリットル中のビーズを再懸濁します。
  6. 2分間万×gで微量遠心によりビーズをペレット。
  7. 繰り返しは、2.5と2.6を繰り返します。
    注:これは、PBS-TBNで2回洗浄の合計を提供します。
  8. 1mlのPBS、1%BSA、0.05%アジド、pH​​7.4中で結合し、洗浄したビーズを再懸濁します。暗所で2〜8℃の冷蔵庫に結合されたビーズを保管してください。

3.ビーズカウント

  1. 水またはPBS緩衝液中で結合されたビーズの1:10希釈液を準備します。
  2. 試料導入点での血球計数器への負荷のビーズ希釈液10μLを。
  3. 4×4コーナーグリッドの1に見られるビーズを数えます。以下の式を用いて結合されたビーズの総数を計算する:数(4×4のグリッドの1角)×(1×10 4)×(希釈係数)はミリリットルに再懸濁体積をxは。

抗原結合の4確認

  1. 20秒間ボルテックスし、超音波処理により、目的の抗原に結合されたビーズの原料混合物を再懸濁します。
  2. 最終的に結合されたビーズストックを希釈することにより、作業ビーズ混合物を準備します100ビーズ/ PBS-1%BSA緩衝液(PBS-1%BSA、pH7.4)中で設定された各固有のビーズμlの濃度。
  3. PBS-1%BSA緩衝液を用いて丸底プレートの96ウェルで、製造業者の推奨に従って抗種IgGを一次抗体の少なくとも7 2倍連続希釈液を調製します。
  4. 洗浄バッファー100μlの各抗原結合確認試験のための96ウェルフィルター底プレートの別々の8ウェル列(8列)をプリウェット及び真空により上清を除去します。プリウェットウェルに取り組んビーズ混合物(抗原結合ビーズ)の50μLを加えます。
  5. バックグラウンドウェルとして機能するように希釈した抗体の代わりに 8行するために、96ウェルフィルタープレートの各列の列1-7とPBS-1%BSA緩衝液の50μlに抗体希釈液50μlを加えます。ピペッティングによって、および5回上下マルチチ​​ャンネルピペッターで混ぜます。確認するように設定し、すべての抗原結合ビーズと同じ手順を実行します。
  6. 覆い、室温の暗所でインキュベートすることを可能にします500 rpmでマイクロプレートシェーカー上で1時間erature。真空により上清を取り除きます。
  7. 洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。 1倍を繰り返します。マルチチャンネルピペッターを用いてPBS-1%BSA50μlのビーズを再懸濁します。
  8. PBS-1%BSA中の16μg/ mlにビオチン化抗種に特異的なIgG二次検出抗体を希釈します。
  9. ダウン5回ピペッティングにより各ウェルに希釈した二次抗体を50μl加えます。
  10. フィルタープレートを覆い、プレートシェーカー上で30分間室温で暗所でインキュベートすることを可能にします。真空により上清を取り除きます。洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。洗浄1Xを繰り返します。
  11. マルチチャンネルピペッターを用いてPBS-1%BSA50μlのビーズを再懸濁します。
  12. PBS-1%BSA中24 / mlのにストレプトアビジンR-フィコエリトリンレポーター(SAPE)を希釈します。
  13. 各ウェルにレポーターの50μLを加え、ピペッティングによって、および5回上下混ぜます。
  14. C言語フィルタープレート上、プレートシェーカー上で30分間室温で暗所でインキュベートすることを可能にします。真空により上清を取り除きます。洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。洗浄1Xを繰り返します。
  15. PBS-1%BSAの100μl中に再懸濁ビーズおよびアナライザ29を使用して50μLを分析します。
    注:ビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイの結果は、中央値蛍光強度(MFI)で測定されます。エラーを回避するために利用可能な場合は常に、ソフトウェアのマニュアルの最新版を参照してください。

5.唾液マルチプレックスイムノアッセイ

  1. -80°Cフリーザーから唾液を外し、室温で解凍することができます。
  2. 再懸濁抗原は、20秒間ボルテックスし、超音波処理により、ビーズストックを結合さ。
  3. 100ビーズ/ PBS-1%BSA緩衝液で設定した各ユニークなビーズのμlの最終濃度に結合されたビーズストックを希釈することにより、作業ビーズ混合物を準備します。
  4. 唾液の4希釈ワット:1を準備します96ウェル、ディープウェルプレート中のPBS-1%BSA緩衝液番目。
  5. プリウェットフィルター洗浄緩衝液100μlでプレートと真空により上清を除去します。
  6. 8最終希釈:作業ビーズ混合物および1のための96ウェルフィルタープレートの95ウェルに希釈した唾液の同体​​積の50μLを加えます。マルチチャンネルピペッターとの反応を混ぜます。 1つのウェルコントロールに、50μlの抗原結合ビーズプラス(唾液の代替として)PBS-1%BSA緩衝液50μlを追加します。
  7. 覆い、500rpmで、マイクロプレートシェーカー上で1時間室温で暗所でインキュベートすることを可能にします。真空により上清を取り除きます。洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。洗浄1Xを繰り返します。
  8. マルチチャンネルピペッターを有するPBS-1%BSA50μlに再懸濁ビーズ。
  9. PBS-1%BSAで16 / mlのビオチン化ヤギ抗ヒトIgG二次検出抗体を希釈します。
  10. 各ウェルに二次抗体を希釈した50μlのを追加して内容物を混合マルチチャンネルピペッター。
  11. フィルタープレートを覆い、プレートシェーカー上で30分間室温で暗所でインキュベートすることを可能にします。真空により上清を取り除きます。洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。洗浄1Xを繰り返します。
  12. マルチチャンネルピペッターを有するPBS-1%BSA50μlに再懸濁ビーズ。
  13. PBS-1%BSA中24 / mlのにストレプトアビジンR-フィコエリトリンレポーター(SAPE)を希釈します。
  14. 各ウェルに50μlのレポーターを追加し、マルチチャンネルピペッターで混ぜます。
  15. フィルタープレートを覆い、プレートシェーカー上で30分間室温で暗所でインキュベートすることを可能にします。真空により上清を取り除きます。洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。洗浄1Xを繰り返します。
  16. PBS-1%BSAの100μl中に再懸濁ビーズおよびアナライザ29を使用して50μLを分析します。
    注意:マルチプレックスイムノアッセイの結果は、蛍光強度中央値(MFI)単位で測定されています。常にを参照してください。ソフトウェアマニュアルの最新バージョン、エラーを回避するために利用可能な場合。

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Representative Results

一つのユニークなビーズセットは、変動をサンプリングするために、非特異的な結合とサンプルを測定するための対照として使用しました。これらのビーズは、それらがカップリング工程の任意の抗原と共にインキュベートされなかったことを除いて、抗原結合ビーズと同じように処理しました。全唾液試料とインキュベートコントロールビーズから得られた> 500 MFI値は、血清からの原因が疑われる汚染をさらなる分析から除去し、残りの応答は、分散ログました。歯茎が収集装置に、または研究の参加者が歯周病を持っている場合は添付のスポンジであまりにも激しくこすっている場合、唾液、血清で汚染することができます。対数変換されたMFIのデータは、平均プラスログMFI値の3標準偏差に基づいて、505 MFIの免疫カットオフポイントを計算するために使用しました。さらに、抗原結合ビーズを希除くすべての方法で試験ウェルのように処理した特定のウェルに添加しました。uted唾液は、バックグラウンド蛍光との交差反応性を評価するためにPBS-1%BSAで置換しました。これらのバックグラウンドウェルで得られたMFI値は、各唾液サンプルに設定された各抗原結合ビーズのMFI値から差し引きました。

ビーズ結合は、各抗原に対して特異的な動物由来の種特異的一次検出抗体を用いて確認しました。 2を説明するように、抗原結合されたビーズは、アッセイのダイナミックレンジに近づくことができたことを確認するために、我々はMFI≥18,000、用量反応および一次抗体および<10%の非ターゲット間の交差反応の観察として適切な結合を定義しました。 C.のための代表的なカップリングの確認ジェジュニT.アッセイにおける抗原の原虫は、 図1に示されています。

(505 MFI)を設立したカットオフ点に基づいて、immunoprevalence率サンプル(N = 2078)のためのsが約2%(N = 41)からT.のための範囲でしたゴンジノロウイルスGI.1( 図2)のためのほぼ50%(N = 1009)へ。データはimmunoprevalence率はノロウイルスの最高は、A型肝炎ウイルスおよびHが続いたことを示していますピロリ菌

試料の32%(N = 672)は、アッセイにおける病原体の全てに対して免疫陰性であったが、68%(N = 1,406)は、 図3を 1つまたは複数の病原体に対する免疫た一つ以上に免疫陽性の内訳を示しています病原体。

図1
図1:カップリングの確認は、マルチプレックスイムノアッセイにおける生物の2のための分析カップリング確認が抗原の全ておよびCのグラフを行いました ジェジュニT.この図のゴンジは repreされていますマルチプレックスイムノアッセイにおける抗原に対する結合確認のsentative。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
2:マルチプレックスイムノアッセイにおける特定の病原体に特異的病原体に対するImmunoprevalence Immunoprevalenceは約2%からT.のための範囲でしたゴンジノロウイルスGI.1のための約50%です。ノロウイルス抗原に対する抗体は、より一般的にHAV(A型肝炎ウイルス)およびH.続いて観察されましたピロリ菌。トキソプラズマC.ジェジュニ抗体は、分析の唾液サンプルにあまり頻繁に登場しました。 目の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図です。

図3
図3:同時に複数の病原体に対する免疫陽性の内訳マルチプレックスイムノアッセイは、50μlのサンプル容量で同時に複数の病原体に対する免疫陽性の分析を可能にします。唾液サンプルのほぼ3分の1は、マルチプレックス内の抗原の全てに対する抗体のための免疫陰性であったアッセイしました。四半期は、2つの抗原に対して陽性であったサンプルの約31%が1抗原に対する免疫陽性でした。 9.4%は、3つの抗原に対する免疫陽性でした。 3%は、同時に4以上の抗原に陽性であった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

抗原 ビーズセット カップリングバッファー Ag濃度(μgの) 1コーナーでのビーズの# ビーズ/μlに# 巻。 4ミリリットルのための100のB / UL(μL)のために
C.ジェジュニ 8 MES 5.0 50 64 6400 94
ヘリコバクター・ピロリ 33 MES 5.0 25 71 7100 85
A型肝炎 42 MES 5.0 100 91 9100 66
トキソプラズマ 30 MES 5.0 25 85 8500 71
ノロウイルスGII.4 55 MES 5.0 5 72 7200 83
ノロウイルスGI.1 67 MES 5.0 5 63 6300 95
非結合 80 MES 5.0 60 6000 100
ビーズの総容量(μL) 594
必要なバッファの総容量(μL) 3406

表1:カップリングおよび確認が完了した後に示すように、マルチプレックスイムノアッセイのためのビーズミックス作業は 、各ビーズセットからなるマスター混合物を調製しました。マスターミックスは、間に分散されました96ウェルプレート中のウェルのLL。すべてのウェルだけビーズとPBS-1%BSA緩衝液に含まれる1つのバックグラウンドコントロールウェルを除いて、唾液とともにインキュベートしました。

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Discussion

これらの結果は、マルチプレックスイムノアッセイ法は、免疫または免疫陰性である唾液サンプルとを区別するために有用であることを示しています。免疫陽性を決定するために、シングルカットオフポイントは、平均+唾液試料のすべてでテスト制御カップリングしていないビーズの対数変換MFI応答の3つの標準偏差を計算することによって開発されました。カットオフポイントは、単一または複数の病原体への曝露とimmunoprevalenceを評価する能力を得ました。この弁別力は、環境および他の病原体への曝露に関連した健康リスクを調査するために集団研究において有用であり得ます。

MFIの分布、非結合対照とどの研究が答えるように設計された質問に応じてカットオフ点を決定するために用いることができる他のいくつかの方法があります。カットオフを決定するためのいくつかの例は、有限混合モデル24-26を含む平均プラス3コントロールへの応答の標準偏差、平均値プラスコントロールへの応答の2標準偏差、および3回のコントロール27,28に対する応答の平均。単純なスクリーニングのために、あまり厳格な基準を使用することができるが、疫学的研究のために、偽陽性報告の確率を減らすために、より厳格な定義を採用することがより適切であり得ます。私たちの最初のアプリケーションは、スイマーと非スイマーの間immunoconversionとimmunoprevalenceを見ることです。この研究では、非結合対照のMFIは、正規分布していないし、その結果を対数変換しました。

ビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイを実行する利点は、非常に低い試料容量の使用、時間と労力の削減および試薬の最小量を必要としながら、同時に最大500の検体のための応答を測定する能力が含まれます。対照的に、露光および/ ​​または感染を示す抗体レベルを評価する従来の方法( 例えば

マルチプレックスイムノアッセイの制限事項は次捕獲および二次検出抗体、抗原およびレポーターの最適な濃度を決定するための厳密な最適化の必要性が含まれます。交差反応はまた、特定の抗原に対する抗体は、他の生物由来の抗原と交差反応することにより、偽陽性の測定値につながる可能性として、イムノアッセイにおける主要な関心事です。最適化は、交差反応性および非特異的結合は、以前2-4対処されました。そのようなアッセイの成功は、高度に免疫原性抗原を得る能力だけでなく、特定のantiboに大きく依存していますビーズ結合と結合確認ステップで使用するために、これらの抗原に死にます。他の制限は、アッセイを検証するための特徴(診断正および負)のサンプルの入手が限られています。

プロトコル内の重要なステップの数があります。これらには、外来タンパク質、アジ、グリシン、トリスまたは任意の第一級アミンを含まないビーズに結合される抗原性を確保します。これらの薬剤のいずれかは、抗原調製物に存在する場合、それらは、透析またはクロマトグラフィーによって除去しなければなりません。 1つが500万ビーズ当たり抗原5μgので開始し、最適濃度を見つけるために滴定することをお勧めします。最高の感度とダイナミックレンジを与える最適な検出抗体濃度を選択してください。信号は、抗原と検出抗体濃度の増加(フック効果)として減少する傾向を覚えておいてください。信号は、抗原濃度が増加するにつれて減少した場合、例えば、次に検出イオン抗体は、限定されてもよいです。逆に、信号は、レポーター(SAPE)を検出抗体が増加するにつれて減少する場合に限定してもよいです。各タンパク質(ウェルあたりの設定各ビーズの5000)のための最適な結合を組み合わせることにより、交差反応性のためのマルチプレックスを確認してください。最適な検出抗体の量と組み合わせることにより、多重化されたビーズセットをテストします。レポーターを最適化し、個別に各抗原をテストすることによって抗原の標準曲線を作成します。

感度を向上させると中央値蛍光シグナルを増加させるために、マルチプレックスイムノアッセイをトラブルシューティング非常に重要です。感度を向上させるために、いずれかのビーズまたは検出抗体濃度に結合された抗原の量を減少させます。捕捉および/または検出のためのより高い親和性抗体の使用は、感度を向上させることができます。ビーズに結合した抗原の量を増やすと、中央値の蛍光シグナルを増加させることができます。ある研究ではpolyvinylalでそのプレインキュベート血清サンプルを実証しましたcoholプラスポリビニルピロリドン(PVX)バッファは、我々がここで記述しているものとしてビーズベースのマルチプレックスアッセイ30を用いて、血清学的ア ​​ッセイで非特異的結合を抑制することができます。しかし、私たちの協力者によって別の研究は、PBS-BSAとPVXバッファ間の有意な効果は認められませんでした。さらに彼らは、理由PVXバッファの高粘度のために、それがマイクロプレートウェル3内アナライザでビード取得及び形成された泡の問題を作成したと結論付けました。

結論として、我々は、同時に、非常に小さなサンプル体積内の複数の病原体に対するヒト唾液のIgG抗体の存在を測定することができる方法を提示しています。将来的に、このアッセイは、水泳関連曝露または感染症に関連した唾液抗体の存在を検出するために、リスク評価モデルを知らせるのを助けるために使用されます。さらに、アッセイは、空中及び食品媒介exposurと関連抗体を測定するために使用することができますエス、入射感染またはimmunoconversionsを決定し、アンケート型集団研究を行う疫学者にとって重要な免疫学的情報を提供します。

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Disclosures

研究開発のその事務所を通じて米国環境保護庁が資金を提供し、ここで説明する研究を管理していました。これは、庁の行政審査を受け、出版が承認されました。商号又は商業製品に関する記述は、使用のための承認または推奨するものではありません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Software
Microcentrifuge Thermo Electron Corporation 75002446 Used to centrifuge samples
Vortex Mixer VWR G560 Used to mix samples
Sonicator (mini) Fisher Scientific 15-337-22 Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. Capp Various
Hemacytometer (Bright Line) Housser Scientific  3200 Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold Millipore MSVMHTS00 Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker VWR 12620-926 Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5 ml and 0.5 ml) (assorted) VWR 30128-346
Weighing Scale Mettler or other Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer Invitrogen 947-01 Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b) The MathWorks, Inc. Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014 Microsoft Corporation Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software Luminex Corporation LX200-XPON3.1 Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus: grade II concentrate from cell culture Meridian Life Sciences 8505 Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori: lysate Meridian Life Sciences R14101 Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1) Meridian Life Sciences R18426 Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni: heat killed whole cells KPL 50-92-93 Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus (CCHMC)* NA Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori KPL 01-93-94 Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii Abcam Ab23507 Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species KPL 01-92-93 Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) Jackson 705-065-149 Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) KPL 16-13-06 Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) KPL 16-18-06 Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L) KPL 176-1506 Used for coupling confirmation
Consumables
1.5 ml copolymer microcentrifuge tubes USA Scientific 1415-2500 Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µl pipette tip refills BioVentures 5030050C
200 µl pipette tip refills BioVentures 5030080C
1,000 µl pipette tip refills BioVentures 5130140C
Aluminum foil Various Vendors Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates VWR 40002-009 Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates Millipore MABVN1250 Used to run assays
Oracol saliva collection system Malvern Medical Developments Limited Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads) Luminex Corporation Dependent on bead set Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) Pierce 77149 or 22980 Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Pierce 24510 Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) Molecular Probes S-866 Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma M-2933 Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) Sigma P-9416 Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, pH 7.4 Sigma P-3813 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA Sigma A-7888 0.1% (w/v)
Tween-20 Sigma P-9416 0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)** Sigma S-8032 **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma S-3139
5 N NaOH Fisher SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)  Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 1% BSA, pH 7.4 Sigma P-3688 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) Filter Sterilize and store at 4 °C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) Sigma S-3139 0.1 M NaH2PO4
5 N NaOH Fisher SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 Sigma P-3563 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN

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References

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