Внутрисосудистая Поставка биопрепаратов в крысиной почки

JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Введение препаратов для восстановления функции почек требует контроля локализации и распределения терапевтического соединения. Здесь мы опишем подробно простую технику для внутрипочечной доставки лекарственных средств у крыс. Эта процедура может быть легко выполнена без каких-либо смертности и высокой воспроизводимостью.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Franchi, F., Zhu, X. Y., Witt, T. A., Lerman, L. O., Rodriguez-Porcel, M. Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney. J. Vis. Exp. (115), e54418, doi:10.3791/54418 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Эксперименты проводились на самках крыс Sprague-Dawley, весом 250-300 г. Все процедуры на животных соответствуют стандартам, изложенным в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных (Институт лабораторных животных ресурсов, Национальной академии наук, Bethesda, MD, США) и были одобрены Mayo Clinic Медицинского колледжа Уходу за животными и использование комитета (IACUC).

1. Подготовка

  1. Автоклав все хирургические инструменты, перед хирургическим вмешательством. Если несколько операций на различных крыс планируются в тот же день, промойте инструменты после каждой процедуры животного, а затем стерилизовать с помощью горячего шарика стерилизатор.
  2. Обезболить крыса с 4% изофлуран в 1 л / мин O 2.
  3. Передача крысе контролируемой грелку, чтобы сохранить температуру тела при 37 ° C. Поддержание анестезии с 1-2% изофлуран в 1 л / мин O 2.
  4. Администрирование анальгетик (бупренорфин с пролонгированным высвобождением 0,6 мг / кг) суbcutaneously.
  5. Нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить высыхание во время процедуры.
  6. Для того, чтобы компенсировать потерю жидкости в организме из-за лапаротомии, важно вводить 10 мл / кг 0,9% нормального солевого раствора подкожно перед операцией.
  7. Бритье области живота и очистить кожу с повидон-йода и 70% этанола колодками.

2. Хирургические процедуры

  1. Убедитесь, что глубина седации адекватна путем мониторинга физических рефлексов, таких, как выход из пальца пинч, пальпебрального рефлекса, челюсть тон, и частота дыхания / схеме.
  2. Выполните лапаротомии через небольшой разрез (срединный 2-2,5 см в длину) с помощью хирургического скальпеля лезвия № 10.
  3. Извлеките кишечник и толстый кишечник с правой стороны живота с помощью ватного тампона и накрыть их стерильной марлей, смоченной в 0,9% физиологического раствора, чтобы поддерживать органы во влажном состоянии.
  4. Аккуратно убирается вверх селезенки, печени, желудка и поджелудочной железы подвергать AORта и левая артерии почки.
  5. С помощью хирургического микроскопа, тщательно отделить брюшную аорту выше и ниже левой почки и левой почечной артерии из вен, жир и окружающей соединительной ткани с тупыми Препарировальный изогнутый пинцет и стерильным ватным тампоном.
    1. С помощью пинцета с повторным открываемого-закрываемого движения (отслаивания) вдоль длины сосудов для удаления соединительной ткани и ватные тампоны с движением боковой прокатки, чтобы удалить жир.
      ПРИМЕЧАНИЕ: рассечение пери-аортального области является очень деликатным шагом, как нервы и лимфатические сосуды могут быть повреждены. Убедитесь в том, чтобы держать артерии влажным физиологическим раствором во время процедуры вскрытия.
  6. Поместите 4-0 шелковый шов под аортой.
  7. Используя микрососудистых зажимы, зажим аорту выше (чуть ниже верхней брыжеечной артерии) и ниже раздвоения почечной артерии.
  8. Прокол аорты на уровне левого kidnEY бифуркация артерии с 24 G внутривенный катетер и продвигать катетер в почечную артерию.
    Примечание: это очень важный шаг, как прокол через почечной артерии может произойти.
  9. Подключение шприц, заполненный лекарственным раствором или физиологическим раствором (до 500 мкл) в катетер и перфузии почек.
  10. Сразу после перфузии, зажать левой почечной вены и левого мочеточника с микрососудистой клипа и удалить катетер. Затем поместите кусок рассасывающиеся кровоостанавливающего желатиновой губки, с небольшим капли клея ткани, над проколотой области аорты и осторожно применять давление с помощью ватного тампона.
  11. В то же время, освободить зажим из брюшной аорты, ниже развилки левой почечной артерии. Через 5 минут, снимите зажим с почечной вены и мочеточника.
  12. Осторожно снимите зажим с аорты, над бифуркацией левой почечной артерии, а также позволяют почечной реперфузии. нет Общая почечная ишемия должна длиться не более 7 мин.
  13. Закройте брюшной разрез в два слоя (мышц и кожи), используя 4-0 рассасывающиеся нити и непрерывный рисунок, чтобы предотвратить инфекцию. В дополнение к непрерывной технике картины шовного, другой вариант должен был бы использовать простой, прерванный метод, особенно для закрытия стенки тела, чтобы предотвратить расхождение краев.
  14. Применяют мази с антибиотиком по области надреза для предотвращения инфекции.
  15. Перенесите крысу в постельных свободной клетке наблюдения на теплом площадку до полного выздоровления с диапазоном температур, установленной при 35-37 ° С. Сыпучие постельные принадлежности должны быть покрыты (например , с помощью драпировки или бумажным полотенцем) или удалены из клетки , пока животные не будут полностью восстановлены , чтобы предотвратить удушье или аспирации постельных принадлежностей.
  16. После операции, не наблюдать за животными непрерывно до тех пор, дышать спонтанно, а затем ежечасно в течение нескольких часов. Повторная доза Обезболивающее Бупренорфин SR 72 чпозже, если признаки дискомфорта наблюдаются, такие как вялость, сгорбленной и неряшливой, гримасы, не возобновлением нормальной деятельности.
  17. После завершения всех исследований, эвтаназии животных с вдыханием передозировки CO 2 и урожай почечные ткани для ех естественных анализов , таких как гистологии и Вестерн - блоттинга 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы вводили две различные дозы рекомбинантного VEGF у крыс (rrVEGF, 0,17 мкг / кг и 5 мкг / кг) или PBS. Животных умерщвляли 8 ч после операции, чтобы исследовать активации пути VEGF. Хирургическая процедура не влияет на морфологию перфузией почки (рис 1А) по сравнению с контролем (рис 1 , б), как это показано с помощью H & E окрашивания. В то время как Сириус красный окрашивание не показывали какого - либо увеличения внеклеточным отложением матрицы в ответ на ишемическую времени и вливанием rrVEGF (рис 1C) по сравнению с контролем (рис 1D). По вестерн - блот анализа, мы наблюдали небольшое , но значимое увеличение экспрессии белков , вовлеченных в пути VEGF, такие как VEGF, Flk1, PAKT / Akt, Perk / ERK (рисунок 2).

d / 54418 / 54418fig1.jpg "/>
Рисунок 1:. Типичные изображения гистологических Окрашивание ткани почек гематоксилином и эозином (Н & Е) окрашивание срезов почек не показывает никаких анатомических изменений у крыс, получавших VEGF (5 мкг / кг, В) по сравнению с мнимым животных (А) через интраренальной инъекции. Принимая во внимание, Sirius красное окрашивание не показывает никаких существенных различий в отложение коллагена у крыс, получавших VEGF (5 мкг / кг, D) по сравнению с имитацией животных (C). Шкала бар составляет 1 мм и увеличенные изображения представляют 400 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2:. Активация СЭФР Pathway Вестерн - блот - анализ СЭФР, Flk1, phosphoAKТ / Akt и phosphoERK / ЭРК, показывающая повышающую регуляцию VEGF пути после rrVEGF инфузии в почках (п = 4). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. * Р <0,05 по сравнению с PBS. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Эта работа выполнена при частичной поддержке исследовательского гранта от Astra Zeneca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Microscope Leica M125
Isoflurane 100 ml Cardinal Healthcare PI23238 Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml ZooPharm Pharmacy Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment Dechra NDC17033-211-38 Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container Baxter Healthcare Corp. NDC0338-0117-02 For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'  Cardinal Heatlhcare 23405-010B
Sterile cotton tipped applicators Kendall 8884541300
4-0 silk suture (without needle)  Cardinal Heatlhcare A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw World Precision Instruments  501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer Jelco 4053
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge Cardinal Healthcare 179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER Ethicon VCP304H For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING Ethicon VCP845G For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment Actavis NDC0472-0179-56 For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein R&D Sytems 564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA Abcam ab46154
Rabbit monoclonal FLK1 Cell Signaling 9698
Rabbit monoclonal AKT Cell Signaling 4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) Cell Signaling 4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) Cell Signaling 4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) Cell Signaling 4370

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dejani, H., Eisen, T. D., Finkelstein, F. O. Revascularization of renal artery stenosis in patients with renal insufficiency. Am. J. Kidney Dis. 36, (4), 752-758 (2000).
  2. Kang, D. H., et al. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: I. Potential role of vascular endothelial growth factor and thrombospondin-1. J. Am. Soc. Nephrol. 12, (7), 1434-1447 (2001).
  3. Kang, D. H., Hughes, J., Mazzali, M., Schreiner, G. F., Johnson, R. J. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: II. Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J. Am. Soc. Nephrol. 12, (7), 1448-1457 (2001).
  4. Kang, D. H., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13, (3), 806-816 (2002).
  5. Chade, A. R., Kelsen, S. Reversal of renal dysfunction by targeted administration of VEGF into the stenotic kidney: a novel potential therapeutic approach. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 302, (10), F1342-F1350 (2012).
  6. Eirin, A., et al. Changes in Glomerular Filtration Rate After Renal Revascularization Correlate With Microvascular Hemodynamics and Inflammation in Swine Renal Artery Stenosis. Circ.-Cardiovasc. Interv. 5, (5), 720-728 (2012).
  7. Chade, A. R. Distinct Renal Injury in Early Atherosclerosis and Renovascular Disease. Circulation. 106, (9), 1165-1171 (2002).
  8. Seddon, M., Saw, J. Atherosclerotic renal artery stenosis: review of pathophysiology, clinical trial evidence, and management strategies. Can. J. Cardiol. 27, (4), 468-480 (2011).
  9. Lao, D., Parasher, P. S., Cho, K. C., Yeghiazarians, Y. Atherosclerotic renal artery stenosis--diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc. 86, (7), 649-657 (2011).
  10. Sharfuddin, A. A., Molitoris, B. A. Pathophysiology of ischemic acute kidney injury. Nat. Rev. Nephrol. 7, 189-200 (2011).
  11. Noiri, E., et al. Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 281, (5), F948-F957 (2001).
  12. Koesters, R., et al. Tubular Overexpression of Transforming Growth Factor-Î1 Induces Autophagy and Fibrosis but Not Mesenchymal Transition of Renal Epithelial Cells. Am. J. Pathol. 177, (2), 632-643 (2010).
  13. Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122, (3), 462-468 (1986).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics