चूहा गुर्दे के लिए बायोलॉजिक्स के Intravascular प्रसव

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Summary

गुर्दे समारोह की वसूली के लिए दवाओं के प्रशासन स्थानीयकरण और चिकित्सीय परिसर के वितरण के नियंत्रण की आवश्यकता है। यहाँ, हम चूहों में दवाओं के intrarenal डिलीवरी के लिए एक सरल तकनीक का विस्तार से वर्णन है। इस प्रक्रिया को आसानी से कोई मृत्यु दर और उच्च reproducibility के साथ किया जा सकता है।

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Franchi, F., Zhu, X. Y., Witt, T. A., Lerman, L. O., Rodriguez-Porcel, M. Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney. J. Vis. Exp. (115), e54418, doi:10.3791/54418 (2016).

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Abstract

Protocol

प्रयोगों महिला Sprague-Dawley चूहों पर प्रदर्शन किया गया, 250-300 ग्राम वजन। सभी पशु प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशु का प्रयोग करें (प्रयोगशाला पशु संसाधन संस्थान, नेशनल एकेडमी ऑफ साइंसेज, बेथेस्डा, एमडी, संयुक्त राज्य अमरीका) और के लिए गाइड में कहा गया मानकों के साथ पालन चिकित्सा संस्थागत पशु की देखभाल के मेयो क्लीनिक कॉलेज द्वारा अनुमोदित किया गया और प्रयोग समिति (IACUC)।

1. तैयारी

  1. सर्जरी से पहले सभी सर्जिकल उपकरणों आटोक्लेव। विभिन्न चूहों पर एकाधिक सर्जरी एक ही दिन में नियोजित कर रहे हैं, तो प्रत्येक जानवर प्रक्रिया के बाद उपकरणों कुल्ला और फिर एक गर्म मनका अजीवाणु का उपयोग कर बाँझ।
  2. 1 एल / मिनट हे 2 में 4% isoflurane के साथ चूहे anesthetize।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए एक नियंत्रित हीटिंग पैड को चूहे स्थानांतरण। 1 एल / मिनट हे 2 में 1-2% isoflurane के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें।
  4. एनाल्जेसिक दवा (Buprenorphine निरंतर जारी 0.6 मिलीग्राम / किग्रा) सु प्रशासनbcutaneously।
  5. आंखों को मरहम लागू प्रक्रिया के दौरान सुखाने को रोकने के लिए।
  6. आदेश laparotomy के कारण शरीर के तरल पदार्थ के नुकसान की भरपाई के लिए, यह preoperatively 10 मिलीग्राम / 0.9% सामान्य नमक subcutaneously किलो प्रशासन के लिए महत्वपूर्ण है।
  7. पेट क्षेत्र दाढ़ी और povidone आयोडीन और 70% इथेनॉल पैड के साथ त्वचा को साफ।

2. सर्जिकल प्रक्रिया

  1. सुनिश्चित करें कि बेहोश करने की क्रिया की गहराई में इस तरह के पैर की अंगुली चुटकी से वापसी, नेत्रच्छद पलटा, जबड़े टोन, और श्वसन दर / पैटर्न के रूप में शारीरिक सजगता, निगरानी के द्वारा पर्याप्त है।
  2. एक छोटा सा चीरा midline के माध्यम से एक laparotomy (लंबाई में 2-2.5 सेमी) एक सर्जिकल ब्लेड छुरी नं 10 का उपयोग कर प्रदर्शन करना।
  3. कपास swabs का उपयोग करके पेट के दाहिने हिस्से को आंत और पेट खींच और उन्हें अंगों नम बनाए रखने के लिए 0.9% सामान्य नमक करने में भिगो बाँझ धुंध के साथ कवर किया।
  4. धीरे ऊपर की ओर तिल्ली, जिगर, पेट और अग्न्याशय वापस लेना AOR बेनकाब करने के लिएप्रादेशिक सेना और बाएं गुर्दे धमनी।
  5. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप की मदद से, ध्यान से उदर महाधमनी ऊपर और बाएं गुर्दे और नसों, वसा से बाएं गुर्दे धमनी और कुंद विदारक घुमावदार संदंश और बाँझ कपास swabs के साथ आसपास के संयोजी ऊतक के नीचे अलग।
    1. वसा को हटाने के लिए एक पार्श्व रोलिंग गति के साथ संयोजी ऊतक और कपास swabs दूर करने के लिए जहाजों की लंबाई के साथ एक बार खुले करीब मोशन (कुंद विच्छेदन) के साथ संदंश का प्रयोग करें।
      नोट: पेरी महाधमनी क्षेत्र के विच्छेदन नसों और लसीका वाहिकाओं के रूप में एक बहुत ही नाजुक कदम क्षतिग्रस्त हो सकता है। विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान नमक के साथ नम धमनियों रखने के लिए सुनिश्चित करें।
  6. महाधमनी के नीचे 4-0 रेशम सीवन रखें।
  7. microvascular क्लिप का उपयोग करना, महाधमनी ऊपर दबाना (सिर्फ बेहतर mesenteric धमनी के नीचे) और गुर्दे धमनी विभाजन के नीचे।
  8. बाएं kidn के स्तर पर महाधमनी पंचरएक 24 जी नसों में कैथेटर के साथ ey धमनी विभाजन और गुर्दे की धमनी में कैथेटर अग्रिम।
    नोट: इस वृक्क धमनी के माध्यम से पंचर के रूप में एक महत्वपूर्ण कदम हो सकती है।
  9. कैथेटर के लिए एक सिरिंज दवा समाधान या खारा (500 μl अप करने के लिए) के साथ भरा कनेक्ट और गुर्दे छिड़कना।
  10. इसके तत्काल बाद छिड़काव के बाद छोड़ दिया है, गुर्दे की नस और एक microvascular क्लिप के साथ छोड़ दिया मूत्रवाहिनी दबाना और कैथेटर को हटा दें। फिर, absorbable hemostat जिलेटिन स्पंज का एक टुकड़ा जगह, ऊतक चिपकने की एक छोटी सी बूंद के साथ, महाधमनी की हवा निकाल क्षेत्र पर और धीरे से एक कपास झाड़ू के साथ दबाव लागू होते हैं।
  11. इसी समय, उदर महाधमनी से दबाना जारी, बाएं गुर्दे धमनी विभाजन के नीचे। 5 मिनट के बाद, गुर्दे की नस और मूत्रवाहिनी से दबाना जारी।
  12. ध्यान से, महाधमनी से दबाना रिलीज बाएं गुर्दे धमनी विभाजन ऊपर, और गुर्दे की reperfusion के लिए अनुमति देते हैं। कुल गुर्दे ischemia 7 मिनट से अधिक समय नहीं पिछले चाहिए।
  13. दो परतों (मांसपेशियों और त्वचा) में पेट चीरा बंद, 4-0 absorbable sutures और एक सतत पैटर्न का उपयोग संक्रमण को रोकने के लिए। सतत पैटर्न सिवनी तकनीक के अलावा, एक और विकल्प स्फुटन को रोकने के लिए विशेष रूप से शरीर दीवार बंद करने के लिए एक सरल, बाधित तकनीक का उपयोग करने के लिए, हो जाएगा।
  14. चीरा क्षेत्र के संक्रमण को रोकने के लिए खत्म सामयिक एंटीबायोटिक मलहम लागू करें।
  15. एक तापमान रेंज 35-37 डिग्री सेल्सियस पर सेट के साथ पूरी तरह ठीक होने तक एक गर्म पैड पर एक बिस्तर मुक्त अवलोकन पिंजरे में चूहे स्थानांतरण। ढीला बिस्तर कवर किया जाना चाहिए (एक कपड़ा या कागज तौलिया के साथ उदाहरण के लिए) या ​​जब तक पूरी तरह से जानवरों घुटन या बिस्तर की आकांक्षा को रोकने के लिए बरामद कर रहे हैं पिंजरे से निकाल दिया।
  16. सर्जरी के बाद, कुछ घंटों के लिए प्रति घंटा अनायास श्वास, तब तक लगातार जानवरों निरीक्षण करते हैं। पुन खुराक एनाल्जेसिक Buprenorphine एसआर 72 घंटाबाद में तकलीफ के लक्षण ऐसे सुस्ती, hunched और scruffy, मुंह बनाना, सामान्य गतिविधियों शुरू करने के रूप में नहीं, मनाया जाता है।
  17. सभी अध्ययन के पूरा होने के बाद, सीओ 2 की अधिक मात्रा की साँस लेना के साथ जानवरों euthanize और फसल के पूर्व vivo के लिए गुर्दे के ऊतकों ऐसे ऊतक विज्ञान और पश्चिमी सोख्ता के रूप में 5 विश्लेषण करती है।

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Representative Results

हम पुनः संयोजक चूहे वीईजीएफ़ (rrVEGF, 0.17 माइक्रोग्राम / किलो और 5 माइक्रोग्राम / किग्रा) या पीबीएस के दो अलग-अलग खुराक इंजेक्शन। जानवरों वीईजीएफ़ मार्ग की सक्रियता को जांच करने के लिए 8 घंटे के बाद सर्जरी euthanized थे। शल्य प्रक्रिया भरकर रखा गुर्दा (चित्रा 1 ए) की आकृति विज्ञान को प्रभावित नहीं किया के रूप में एच एंड ई धुंधला द्वारा दिखाया गया है जब, नियंत्रण (चित्रा 1 बी) की तुलना में। सीरियस लाल धुंधला इस्कीमिक समय और rrVEGF (चित्रा 1 सी) के अर्क के जवाब में बाह्य मैट्रिक्स बयान में कोई वृद्धि नहीं दिखा था, वहीं जब नियंत्रण (चित्रा -1) की तुलना में। वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण करके, हम इस तरह के वीईजीएफ़, FLK1, Pakt / AKT, पर्क / ERK (चित्रा 2) के रूप में वीईजीएफ़ मार्ग में शामिल प्रोटीन की अभिव्यक्ति में एक छोटी लेकिन महत्वपूर्ण वृद्धि मनाया।

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चित्रा 1:। गुर्दे ऊतक Hematoxilin के histological धुंधला और Eosin की छवियों प्रतिनिधि (एच एंड ई) गुर्दे वर्गों का धुंधला चूहों कि वीईजीएफ़ प्राप्त (5 माइक्रोग्राम / किलो, बी) intrarenal इंजेक्शन के माध्यम से नकली पशुओं (ए) की तुलना में कोई संरचनात्मक परिवर्तन दिखाता है। जबकि, सीरियस लाल धुंधला चूहों कि वीईजीएफ़ प्राप्त (5 माइक्रोग्राम / किलो, डी) नकली पशुओं (सी) की तुलना में कोलेजन बयान में कोई महत्वपूर्ण मतभेद से पता चलता है। स्केल बार 1 मिमी प्रतिनिधित्व करता है और बढ़ाया छवियों 400 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। वीईजीएफ़ मार्ग के एक्टिवेशन वीईजीएफ़ के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, FLK1, phosphoAKटी / AKT और phosphoERK / ERK गुर्दे में rrVEGF निषेचन के बाद वीईजीएफ़ मार्ग के अपरेगुलेशन दिखा (एन = 4)। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। * पी <0.05 बनाम पीबीएस। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Disclosures

इस काम आंशिक रूप से एस्ट्रा Zeneca से एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Microscope Leica M125
Isoflurane 100 ml Cardinal Healthcare PI23238 Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml ZooPharm Pharmacy Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment Dechra NDC17033-211-38 Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container Baxter Healthcare Corp. NDC0338-0117-02 For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'  Cardinal Heatlhcare 23405-010B
Sterile cotton tipped applicators Kendall 8884541300
4-0 silk suture (without needle)  Cardinal Heatlhcare A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw World Precision Instruments  501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer Jelco 4053
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge Cardinal Healthcare 179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER Ethicon VCP304H For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING Ethicon VCP845G For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment Actavis NDC0472-0179-56 For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein R&D Sytems 564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA Abcam ab46154
Rabbit monoclonal FLK1 Cell Signaling 9698
Rabbit monoclonal AKT Cell Signaling 4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) Cell Signaling 4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) Cell Signaling 4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) Cell Signaling 4370

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References

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