Consegna intravascolare di Biologics al rene di ratto

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Summary

La somministrazione di farmaci per il recupero della funzione renale richiede il controllo della localizzazione e distribuzione del composto terapeutico. Qui, descriviamo in dettaglio una semplice tecnica per la consegna intrarenale di farmaci nei ratti. Questa procedura può essere eseguita facilmente senza mortalità ed elevata riproducibilità.

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Franchi, F., Zhu, X. Y., Witt, T. A., Lerman, L. O., Rodriguez-Porcel, M. Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney. J. Vis. Exp. (115), e54418, doi:10.3791/54418 (2016).

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Abstract

Protocol

Gli esperimenti sono stati condotti su ratti femmina Sprague-Dawley, del peso di 250-300 g. Tutte le procedure sugli animali rispettate le norme indicate nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (Istituto di laboratorio risorse animali, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) e sono stati approvati dal Mayo Clinic College of Medicine Istituzionale Animal Care e Comitato Usa (IACUC).

1. Preparazione

  1. Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico. Se interventi chirurgici multipli su diversi ratti sono in programma nella stessa giornata, lavare gli strumenti dopo ogni procedura di animale e poi sterilizzare utilizzando uno sterilizzatore a caldo tallone.
  2. Anestetizzare il topo con il 4% isoflurano in 1 L / min O 2.
  3. Trasferire il ratto ad una piastra elettrica controllata per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C. Mantenere l'anestesia con il 1-2% isoflurano in 1 L / min O 2.
  4. Somministrare il farmaco analgesico (buprenorfina sostenuta di uscita 0,6 mg / kg) subcutaneously.
  5. Applicare una pomata per gli occhi per evitare l'essiccazione durante la procedura.
  6. Al fine di compensare la perdita di fluidi corporei causa laparotomia, è importante somministrare 10 ml / kg di 0,9% sottocutanea soluzione fisiologica prima dell'intervento.
  7. Radere la zona addominale e pulire la pelle con i rilievi etanolo povidone-iodio e il 70%.

2. Procedura chirurgica

  1. Assicurarsi che la profondità di sedazione è adeguato per il monitoraggio riflessi fisici, quali il recesso dal pizzico punta, riflesso palpebrale, il tono della mascella, e la respirazione tasso / modello.
  2. Eseguire una laparotomia attraverso una piccola incisione mediana (2-2,5 cm di lunghezza) con un bisturi chirurgico lama No. 10.
  3. Estrarre l'intestino e colon al lato destro dell'addome utilizzando tamponi di cotone e coprire con garza sterile imbevuta di 0,9% soluzione salina per mantenere gli organi umido.
  4. Delicatamente rientrare verso l'alto la milza, fegato, stomaco e del pancreas per esporre la aorta e l'arteria renale sinistra.
  5. Con l'aiuto di un microscopio operatorio, separare con attenzione l'aorta addominale sopra e sotto il rene sinistro e l'arteria renale sinistra dalle vene, il grasso e il tessuto connettivo circostante con dissezione curvo forcipe smussato e tamponi di cotone sterili.
    1. Utilizzare le pinze con un moto (scollamento) open-close ripetuto lungo la lunghezza delle navi per rimuovere il tessuto connettivo e le tamponi di cotone con un moto di rollio laterale per rimuovere il grasso.
      NOTA: La dissezione della regione peri-aortica è un passo molto delicato come nervi e vasi linfatici potrebbe essere danneggiata. Assicurarsi di mantenere le arterie umido con soluzione salina durante la procedura di dissezione.
  6. Collocare una sutura 4-0 seta sotto l'aorta.
  7. Utilizzando clip microvascolari, bloccare l'aorta sopra (appena sotto l'arteria mesenterica superiore) e al di sotto della biforcazione dell'arteria renale.
  8. Puntura dell'aorta a livello della kidn sinistrabiforcazione dell'arteria ey con un catetere endovenoso G 24 e far avanzare il catetere nell'arteria renale.
    NOTA: questo è un passo fondamentale, come la puntura attraverso l'arteria renale può verificarsi.
  9. Collegare una siringa riempita con la soluzione farmaco o salina (fino a 500 microlitri) al catetere e profumato rene.
  10. Subito dopo perfusione, bloccare la vena renale sinistra e dell'uretere sinistro con una clip microvascolare e rimuovere il catetere. Poi, posizionare un pezzo di spugna assorbibile emostatico gelatina, con una piccola goccia di tessuto adesivo, sopra la zona forata dell'aorta e applicare delicatamente pressione con un tampone di cotone.
  11. Allo stesso tempo, rilasciare il morsetto dall'aorta addominale, sotto fianco biforcazione dell'arteria renale. Dopo 5 minuti, rilasciare il morsetto dalla vena renale e dell'uretere.
  12. rilasciare con cautela il morsetto dall'aorta, sopra a sinistra biforcazione dell'arteria renale, e consentire la riperfusione renale. L'ischemia renale totale dovrebbe durare non più di 7 minuti.
  13. Chiudere l'incisione addominale in due strati (muscoli e la pelle), con 4-0 punti di sutura assorbibili e un modello continuo per prevenire l'infezione. Oltre alla tecnica modello sutura continua, un'altra opzione potrebbe essere quella di utilizzare una tecnica semplice ed interrotta, particolarmente per la chiusura parete del corpo per evitare deiscenza.
  14. Applicare topico pomata antibiotica sopra l'area di incisione per prevenire le infezioni.
  15. Trasferire il ratto in una gabbia di osservazione libera assestamento su un rilievo caldo fino al recupero completo con una gamma di temperatura impostata a 35-37 ° C. Assestamento allentato dovrebbe essere coperto (ad esempio con un asciugamano drappo o carta) o rimosso dalla gabbia fino a quando gli animali sono completamente recuperati per impedire il soffocamento o aspirazione di biancheria da letto.
  16. Dopo l'intervento chirurgico, osservare gli animali continuamente fino a quando la respirazione spontanea, poi ogni ora per un paio d'ore. Re-dosare l'analgesico buprenorfina SR 72 orein seguito, se si osservano segni di disagio, come la letargia, curvo e trasandato, smorfia, non riprendere le normali attività.
  17. Dopo il completamento di tutti gli studi, eutanasia degli animali con l'inalazione di una dose eccessiva di CO 2 e di raccogliere i tessuti renali di analisi ex vivo come istologia e Western Blotting 5.

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Representative Results

Abbiamo iniettato due diverse dosi di VEGF ricombinante di ratto (rrVEGF, 0,17 mg / kg e 5 mg / kg) o PBS. Gli animali sono stati sacrificati post-chirurgico 8 ore per esaminare l'attivazione della via VEGF. La procedura chirurgica non ha influenzato la morfologia del rene perfuso (Figura 1A) rispetto al controllo (Figura 1B), come mostrato da H & E colorazione. Mentre Sirius colorazione rossa non ha mostrato alcun aumento nella deposizione matrice extracellulare in risposta al tempo ischemico e l'infusione della rrVEGF (Figura 1C) rispetto al controllo (Figura 1D). Con analisi Western Blot, abbiamo osservato un piccolo ma significativo aumento dell'espressione delle proteine ​​coinvolte nel pathway VEGF, come VEGF, Flk1, pAKT / AKT, pERK / ERK (Figura 2).

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Figura 1:. Rappresentativi Immagini di istologica colorazione di renale Tissue ematossilina e eosina (H & E) La colorazione di sezioni di rene non mostra cambiamenti anatomici in ratti che hanno ricevuto VEGF (5 mg / kg, B) rispetto agli animali sham (A) tramite iniezione intrarenale. Considerando che, sirius colorazione rossa mostra differenze significative nella deposizione di collagene in ratti che hanno ricevuto VEGF (5 mg / kg, D) rispetto agli animali sham (C). Barra di scala rappresenta 1 mm e immagini ingrandite rappresentano 400 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2:. L'attivazione di VEGF Pathway analisi Western Blot di VEGF, Flk1, phosphoAKT / AKT e phosphoERK / ERK mostra la sovraregolazione di VEGF percorso dopo l'infusione rrVEGF nel rene (n = 4). I dati sono presentati come media ± SEM. * P <0.05 vs PBS. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Disclosures

Questo lavoro è in parte sostenuto da un assegno di ricerca da Astra Zeneca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Microscope Leica M125
Isoflurane 100 ml Cardinal Healthcare PI23238 Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml ZooPharm Pharmacy Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment Dechra NDC17033-211-38 Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container Baxter Healthcare Corp. NDC0338-0117-02 For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'  Cardinal Heatlhcare 23405-010B
Sterile cotton tipped applicators Kendall 8884541300
4-0 silk suture (without needle)  Cardinal Heatlhcare A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw World Precision Instruments  501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer Jelco 4053
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge Cardinal Healthcare 179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER Ethicon VCP304H For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING Ethicon VCP845G For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment Actavis NDC0472-0179-56 For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein R&D Sytems 564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA Abcam ab46154
Rabbit monoclonal FLK1 Cell Signaling 9698
Rabbit monoclonal AKT Cell Signaling 4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) Cell Signaling 4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) Cell Signaling 4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) Cell Signaling 4370

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References

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