Die intravaskuläre Lieferung von Biologics zur Rattenniere

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Summary

Die Verabreichung von Medikamenten für die Wiederherstellung der Nierenfunktion erfordert die Kontrolle der Lokalisierung und Verteilung der therapeutischen Verbindung. Hier beschreiben wir im Detail eine einfache Technik für intrarenalen Abgabe von Arzneimitteln in Ratten. Dieses Verfahren kann ohne Mortalität und hoher Reproduzierbarkeit leicht durchgeführt werden.

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Franchi, F., Zhu, X. Y., Witt, T. A., Lerman, L. O., Rodriguez-Porcel, M. Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney. J. Vis. Exp. (115), e54418, doi:10.3791/54418 (2016).

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Abstract

Protocol

Die Versuche wurden an weiblichen Sprague-Dawley Ratten, mit einem Gewicht von 250-300 g. Alle Tierverfahren mit den Normen im Leitfaden angegebenen halten für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Institut für Labortier Ressourcen, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) und wurden von der Mayo Clinic College of Medicine Institutional Animal Care genehmigt und Use Committee (IACUC).

1. Vorbereitung

  1. Autoklav alle chirurgischen Instrumente vor der Operation. Wenn mehrere Operationen auf verschiedenen Ratten am selben Tag geplant sind, spülen Instrumente nach jedem Tier Verfahren und dann sterilisieren eine heiße Perle Sterilisator verwenden.
  2. Anästhesieren die Ratte mit 4% Isofluran in 1 l / min O 2.
  3. Übertragung der Ratte zu einer kontrollierten Heizkissen die Körpertemperatur bei 37 ° C zu bewahren. Aufrechterhaltung einer Anästhesie mit 1-2% Isofluran in 1 l / min O 2.
  4. Verwalten des Analgetikum (Buprenorphin Retard 0,6 mg / kg) subcutaneously.
  5. Anwenden Salbe auf die Augen Trocknen während des Verfahrens zu verhindern.
  6. Um den Verlust von Körperflüssigkeiten aufgrund Laparotomie zu kompensieren, ist es wichtig, 10 ml / kg 0,9% normale Kochsalzlösung subkutan präoperativ zu verabreichen.
  7. Rasieren Sie den Bauchbereich und reinigen Sie die Haut mit PVP-Jod und 70% Ethanol-Pads.

2. Chirurgisches Verfahren

  1. Stellen Sie sicher, dass die Tiefe der Sedierung durch die Überwachung der körperlichen Reflexe angemessen ist, wie Rückzug aus dem Zeh Prise, Augenlidreflexe, Kiefer- Ton und Atemfrequenz / Muster.
  2. Durchführen einer Laparotomie durch einen kleinen Mittellinienschnitt (2-2,5 cm in der Länge), ein chirurgisches Skalpell-Klinge No. unter Verwendung von 10.
  3. Ziehen Sie den Darm und Doppelpunkt an der rechten Seite des Bauches von Wattestäbchen und bedecken sie mit steriler Gaze getränkt in 0,9% physiologischer Kochsalzlösung die Organe feucht zu halten.
  4. einfahren vorsichtig nach oben, die Milz, Leber, Magen und Bauchspeicheldrüse die AOR aussetzenta und die linke Nierenarterie.
  5. Mit Hilfe eines Operationsmikroskops, trennen Sie vorsichtig die Bauchaorta oberhalb und unterhalb der linken Niere und der linken Nierenarterie aus den Venen, das Fett und das umgebende Bindegewebe mit stumpfen Sezieren einer gebogenen Pinzette und sterile Wattestäbchen.
    1. Verwenden Sie die Zange mit einer wiederholten Öffnungs- und Schließbewegung (stumpf) entlang der Länge der Schiffe das Bindegewebe und die Wattestäbchen mit einer seitlichen Rollbewegung zu entfernen, um das Fett zu entfernen.
      HINWEIS: Die Präparation der peri-Aorten-Region ist eine sehr heikle Schritt wie Nerven und Lymphgefäße beschädigt werden könnte. Achten Sie darauf, die Arterien feucht mit Kochsalzlösung während der Präparation Verfahren zu halten.
  6. Legen Sie eine 4-0 Seidennaht unter der Aorta.
  7. Mit mikrovaskulären Clips, klemmen die oben Aorta (knapp unterhalb der A. mesenterica superior) und unterhalb der Nierenarterie Bifurkation.
  8. Die Punktion der Aorta auf Höhe des linken kidney Arterie Gabelung mit 24 G intravenösen Katheter und den Katheter in die Nierenarterie gelangen.
    ANMERKUNG: Dies ist ein kritischer Schritt, da Punktion durch die Nierenarterie auftreten.
  9. Eine Spritze mit der Medikamentenlösung oder Kochsalzlösung gefüllt (bis zu 500 & mgr; l) zu dem Katheter und der Niere perfundiert.
  10. Unmittelbar nach der Perfusion, klemmen die linke Nierenvene und die linke Harnleiter mit einem mikrovaskulären Clip und den Katheter zu entfernen. Dann legen Sie ein Stück resorbierbaren hemostat Gelatineschwamm, mit einem kleinen Tropfen Gewebekleber über den punktierten Bereich der Aorta und sanft anwenden Druck mit einem Wattestäbchen.
  11. Zur gleichen Zeit, lassen Sie die Klammer aus der abdominalen Aorta, unterhalb der linken Nierenarterie Bifurkation. Nach 5 Minuten, lassen Sie die Klemme aus Nierenvene und Harnleiter.
  12. vorsichtig loslassen Klemme aus der Aorta, über der linken Gabelung Nierenarterie und für Nieren Reperfusion zu ermöglichen. Die Gesamt sollte renale Ischämie dauern nicht länger als 7 min.
  13. Schließen der Bauchschnitt in zwei Schichten (Muskel und Haut), unter Verwendung von 4-0 resorbierbaren Fäden und ein kontinuierliches Muster Infektion zu verhindern. Neben dem kontinuierlichen Muster Nahttechnik, wäre eine andere Möglichkeit, eine einfache, unterbrochen Technik zu verwenden, insbesondere für die Körperwand Verschluss Dehiszenz zu verhindern.
  14. Anwenden topischen antibiotischen Salbe auf den Schnittbereich Infektionen zu verhindern.
  15. Übertragen Sie die Ratte in eine Einbettung freie Beobachtungskabine an einem warmen Kissen bis zur vollständigen Wiederherstellung mit einem Temperaturbereich eingestellt bei 35-37 ° C. Lose Bettwäsche sollte (zB mit einem Tuch oder einem Papiertuch) oder entfernt aus dem Käfig abgedeckt werden , bis Tiere vollständig wiederhergestellt werden Erstickung oder Aspiration von Betten zu verhindern.
  16. Nach der Operation beobachten die Tiere kontinuierlich, bis spontan atmenden, dann stündlich für ein paar Stunden. Re-Dosis das Analgetikum Buprenorphin SR 72 Stundenspäter, wenn Anzeichen von Beschwerden beobachtet werden, wie Lethargie, krumm und vergammelt, Grimasse, nicht normalen Aktivitäten wieder aufnehmen.
  17. Nach Abschluss aller Studien, einschläfern Tiere mit dem Einatmen von einer Überdosis von CO 2 und ernten die Nierengewebe für ex vivo - Analysen wie Histologie und Western Blotting 5.

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Representative Results

Wir injizierten zwei verschiedenen Dosen von rekombinantem Ratten-VEGF (rrVEGF, 0,17 & mgr; g / kg und 5 & mgr; g / kg) oder PBS. Die Tiere wurden 8 Stunden nach der Operation eingeschläfert die Aktivierung des VEGF-Weg zu untersuchen. Das chirurgische Verfahren beeinflusste nicht die Morphologie der perfundierte Niere (1A) , wenn der Steuerung (1B) verglichen wird , wie durch H & E - Färbung gezeigt. Während Sirius - Rot - Färbung zeigte keine Zunahme der extrazellulären Matrixablagerung in Reaktion auf das ischämische Zeit und der Infusion des rrVEGF (1C) , wenn der Steuerung (Figur 1D) verglichen. Durch Western - Blot - Analyse beobachteten wir eine kleine , aber signifikante Zunahme der Expression von Proteinen in der VEGF - Weg beteiligt sind , wie beispielsweise VEGF, FLK1, pAkt / AKT, pERK / ERK (Abbildung 2).

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Abb . 1: Repräsentative Bilder histologischer Färbung von Nierengewebe Hämatoxilin und Eosin (H & E) Färbung von Nierenschnitten zeigt keine anatomischen Veränderungen bei Ratten , die VEGF erhalten (5 ug / kg, B) im Vergleich zu Schein - Tiere (A) über intrarenalen Injektion. Während Sirius - Rot - Färbung zeigt keine signifikanten Unterschiede in der Kollagenablagerung in Ratten , die VEGF erhielten (5 & mgr; g / kg, D) im Vergleich zu Scheintiere (C). Maßstabsbalken entspricht 1 mm und vergrößert Bilder repräsentieren 400 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abb . 2: Die Aktivierung der VEGF Pathway Western Blot Analyse von VEGF, FLK1, phosphoAKT / AKT und phosphoERK / ERK die Hochregulation von VEGF-Weg nach rrVEGF Infusion in der Niere zeigt (n = 4). Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. * P <0,05 vs. PBS. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Disclosures

Diese Arbeit wird zum Teil durch ein Forschungsstipendium von Astrazeneca unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Microscope Leica M125
Isoflurane 100 ml Cardinal Healthcare PI23238 Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml ZooPharm Pharmacy Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment Dechra NDC17033-211-38 Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container Baxter Healthcare Corp. NDC0338-0117-02 For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'  Cardinal Heatlhcare 23405-010B
Sterile cotton tipped applicators Kendall 8884541300
4-0 silk suture (without needle)  Cardinal Heatlhcare A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw World Precision Instruments  501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer Jelco 4053
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge Cardinal Healthcare 179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER Ethicon VCP304H For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING Ethicon VCP845G For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment Actavis NDC0472-0179-56 For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein R&D Sytems 564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA Abcam ab46154
Rabbit monoclonal FLK1 Cell Signaling 9698
Rabbit monoclonal AKT Cell Signaling 4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) Cell Signaling 4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) Cell Signaling 4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) Cell Signaling 4370

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References

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