Intravasculaire Levering van Biologics aan de Rat Kidney

JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De toediening van geneesmiddelen voor het herstel van de nierfunctie vereist beheersing van de lokalisatie en verdeling van de therapeutische verbinding. Hier beschrijven we in detail een eenvoudige techniek voor intrarenale toediening van geneesmiddelen bij ratten. Deze procedure kan gemakkelijk worden uitgevoerd zonder sterfte en hoge reproduceerbaarheid.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Franchi, F., Zhu, X. Y., Witt, T. A., Lerman, L. O., Rodriguez-Porcel, M. Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney. J. Vis. Exp. (115), e54418, doi:10.3791/54418 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

De experimenten werden uitgevoerd op vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten, gewicht 250-300 g. Alle dierlijke procedures voldeden aan de normen vermeld in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) en goedgekeurd door de Mayo Clinic College of Medicine Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).

1. Voorbereiding

  1. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten voor de operatie. Als meerdere operaties op verschillende ratten worden gepland op dezelfde dag, spoel instrumenten na elk dier procedure en vervolgens steriliseren met behulp van een hete kraal sterilisator.
  2. Verdoven van de rat met 4% isofluraan in 1 l / min O 2.
  3. Breng de rat een gecontroleerde verwarmingselement om de lichaamstemperatuur op 37 ° C behouden. Handhaving van anesthesie met 1-2% isofluraan in 1 l / min O 2.
  4. Dien de pijnstiller (Buprenorfine langdurige afgifte 0,6 mg / kg) subcutaneously.
  5. Toepassen zalf voor de ogen om uitdroging te voorkomen tijdens de procedure.
  6. Ter compensatie van lichaamsvloeistoffen door laparotomie, is het belangrijk om 10 ml / kg van 0,9% fysiologische zoutoplossing subcutaan preoperatief toedienen.
  7. Scheer de buikstreek en de huid met povidonjood en 70% ethanol pads reinigen.

2. Chirurgische Procedure

  1. Zorg ervoor dat de diepte van de sedatie voldoende is door het bewaken van fysieke reflexen, zoals de terugtrekking uit teen knijpen, ooglidreflex, kaak toon en ademhaling / patroon.
  2. Voer een laparotomie via een kleine incisie (2-2,5 cm lang) met een chirurgische scalpel No. 10.
  3. Trek de darm en dikke darm naar de rechterkant van de buik met wattenstaafjes en bedek ze met steriel gaas gedrenkt in 0,9% fysiologische zoutoplossing om de organen vochtig houden.
  4. Voorzichtig trekken opwaartse de milt, lever, maag en alvleesklier om de AOR blootta en de linker nierslagader.
  5. Met behulp van een chirurgische microscoop voorzichtig scheiden de abdominale aorta boven en onder de linker nier en de linker nierslagader van de aderen, het vet en het omliggende bindweefsel met stompe ontleden gebogen pincet en steriele wattenstaafjes.
    1. Gebruik de tang met een herhaald openen en te sluiten motion (stompe dissectie) langs de lengte van vaartuigen het bindweefsel en de wattenstaafjes verwijderen met een zijdelingse rollende beweging om het vet te verwijderen.
      OPMERKING: De ontleding van de regio peri-aorta is een zeer delicate stap zoals zenuwen en lymfevaten beschadigd raken. Zorg ervoor dat de slagaders tijdens de dissectie procedure vochtig te houden met een zoutoplossing.
  6. Plaats een 4-0 zijden hechtdraad onder de aorta.
  7. Met behulp van microvasculaire klemmen, klem de aorta boven (net onder de mesenterica superior) en onder de nierslagader splitsing.
  8. Doorboord aorta ter hoogte van de linker kidney slagader bifurcatie met een 24 G intraveneuze catheter en vooraf de katheter in de nierslagader.
    LET OP: dit is een cruciale stap als punctie door de nierslagader kan optreden.
  9. Sluit een injectiespuit gevuld met de geneesmiddeloplossing of zoutoplossing (tot 500 pi) aan de katheter en perfuseren van de nier.
  10. Onmiddellijk na perfusie, klem de linker nier-ader en de linker ureter met een microvasculaire clip en verwijder de katheter. Plaats dan een stuk absorbeerbare hemostaat gelatine spons, met een kleine daling van weefsel lijm, over de lekke gebied van de aorta en voorzichtig toe te passen druk met een wattenstaafje.
  11. Op hetzelfde moment laat de klem van de abdominale aorta, onder de linker nierslagader bifurcatie. Na 5 minuten, laat de klem van renale ader en urineleider.
  12. laat voorzichtig de klem van de aorta, boven de linker nierslagader splitsing, en zorgen voor de nieren reperfusie. De totale renale ischemie niet langer duren dan 7 min.
  13. Sluit de abdominale incisie in twee lagen (spier en huid), gebruik 4-0 absorbeerbare hechtingen en een doorlopend patroon om infectie te voorkomen. Naast het continu patroon hechting techniek Een andere mogelijkheid is een simpele, onderbroken techniek, met name voor lichaamswand sluiting openspringen voorkomen.
  14. Solliciteer actuele antibiotische zalf op de incisie gebied om infecties te voorkomen.
  15. Breng de rat in een beddengoed-gratis observatie kooi op een warme pad tot volledig herstel met een temperatuurbereik ingesteld op 35-37 ° C. Losse beddengoed moet worden bedekt (bijvoorbeeld met een laken of een papieren handdoek) of verwijderd uit de kooi totdat de dieren volledig zijn hersteld tot verstikking of aspiratie van strooisel te voorkomen.
  16. Na de operatie, observeren de dieren continu tot spontane ademhaling, daarna elk uur voor een paar uur. Re-dosis van de pijnstiller buprenorfine SR 72 uurlater indien er tekenen van ongemak worden waargenomen, zoals lethargie, ineengedoken en smerig, grimas, niet hervatten normale activiteiten.
  17. Na afronding van alle studies, euthanaseren van dieren met het inademen van een overdosis van CO 2 en de oogst van de renale weefsels voor ex vivo analyses uitgevoerd, zoals histologie en Western Blotting 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Geïnjecteerd twee verschillende doses van recombinant rat VEGF (rrVEGF, 0,17 ug / kg en 5 mg / kg) of PBS. De dieren werden gedood 8 uur na chirurgie om de activering van de VEGF pathway te onderzoeken. De chirurgische procedure had geen invloed op de morfologie van de geperfuseerde nier (figuur 1A) in vergelijking met controle (Figuur 1B), zoals getoond door H & E-kleuring. Terwijl Sirius rood kleuring tot een verhoging van de extracellulaire matrix afzetting in reactie op de ischemische tijd en de infusie van de rrVEGF (figuur 1C) vertoonden in vergelijking met de controle (figuur 1D). Door Western Blot analyse zagen we een kleine maar significante toename in de expressie van eiwitten betrokken bij de VEGF pathway, zoals VEGF, Flk1, pakt / AKT, pERK / ERK (Figuur 2).

d / 54418 / 54418fig1.jpg "/>
Figuur 1:. Vertegenwoordiger Beelden van histologische kleuring van nierweefsel hematoxiline en eosine (H & E) kleuring van niersecties vertoont geen anatomische veranderingen bij ratten die VEGF ontvangen (5 ug / kg, B) in vergelijking met sham dieren (A) via intrarenale injectie. Dat Siriusrood kleuring vertoont geen significante verschillen in collageen in ratten die VEGF ontvangen (5 ug / kg, D) vergeleken met sham dieren (C). Schaal balk vertegenwoordigt 1 mm en vergroot afbeeldingen vertegenwoordigen 400 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2:. Activering van VEGF Pathway Western blotanalyse van VEGF, Flk1, phosphoAKT / AKT en phosphoERK / ERK die de opregulatie van VEGF pathway rrVEGF na infusie in de nier (n = 4). Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± SEM. * P <0,05 versus PBS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dit werk wordt mede ondersteund door een onderzoeksbeurs van Astra Zeneca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Microscope Leica M125
Isoflurane 100 ml Cardinal Healthcare PI23238 Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml ZooPharm Pharmacy Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment Dechra NDC17033-211-38 Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container Baxter Healthcare Corp. NDC0338-0117-02 For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'  Cardinal Heatlhcare 23405-010B
Sterile cotton tipped applicators Kendall 8884541300
4-0 silk suture (without needle)  Cardinal Heatlhcare A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw World Precision Instruments  501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer Jelco 4053
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge Cardinal Healthcare 179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER Ethicon VCP304H For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING Ethicon VCP845G For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment Actavis NDC0472-0179-56 For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein R&D Sytems 564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA Abcam ab46154
Rabbit monoclonal FLK1 Cell Signaling 9698
Rabbit monoclonal AKT Cell Signaling 4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) Cell Signaling 4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) Cell Signaling 4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) Cell Signaling 4370

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dejani, H., Eisen, T. D., Finkelstein, F. O. Revascularization of renal artery stenosis in patients with renal insufficiency. Am. J. Kidney Dis. 36, (4), 752-758 (2000).
  2. Kang, D. H., et al. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: I. Potential role of vascular endothelial growth factor and thrombospondin-1. J. Am. Soc. Nephrol. 12, (7), 1434-1447 (2001).
  3. Kang, D. H., Hughes, J., Mazzali, M., Schreiner, G. F., Johnson, R. J. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: II. Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J. Am. Soc. Nephrol. 12, (7), 1448-1457 (2001).
  4. Kang, D. H., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13, (3), 806-816 (2002).
  5. Chade, A. R., Kelsen, S. Reversal of renal dysfunction by targeted administration of VEGF into the stenotic kidney: a novel potential therapeutic approach. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 302, (10), F1342-F1350 (2012).
  6. Eirin, A., et al. Changes in Glomerular Filtration Rate After Renal Revascularization Correlate With Microvascular Hemodynamics and Inflammation in Swine Renal Artery Stenosis. Circ.-Cardiovasc. Interv. 5, (5), 720-728 (2012).
  7. Chade, A. R. Distinct Renal Injury in Early Atherosclerosis and Renovascular Disease. Circulation. 106, (9), 1165-1171 (2002).
  8. Seddon, M., Saw, J. Atherosclerotic renal artery stenosis: review of pathophysiology, clinical trial evidence, and management strategies. Can. J. Cardiol. 27, (4), 468-480 (2011).
  9. Lao, D., Parasher, P. S., Cho, K. C., Yeghiazarians, Y. Atherosclerotic renal artery stenosis--diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc. 86, (7), 649-657 (2011).
  10. Sharfuddin, A. A., Molitoris, B. A. Pathophysiology of ischemic acute kidney injury. Nat. Rev. Nephrol. 7, 189-200 (2011).
  11. Noiri, E., et al. Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 281, (5), F948-F957 (2001).
  12. Koesters, R., et al. Tubular Overexpression of Transforming Growth Factor-Î1 Induces Autophagy and Fibrosis but Not Mesenchymal Transition of Renal Epithelial Cells. Am. J. Pathol. 177, (2), 632-643 (2010).
  13. Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122, (3), 462-468 (1986).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics