Intravascular de entrega de los productos biológicos para el riñón de rata

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Summary

La administración de fármacos para la recuperación de la función renal requiere el control de la localización y distribución del compuesto terapéutico. A continuación, describimos en detalle una técnica sencilla para la entrega intrarrenal de drogas en ratas. Este procedimiento se puede realizar fácilmente sin mortalidad y alta reproducibilidad.

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Franchi, F., Zhu, X. Y., Witt, T. A., Lerman, L. O., Rodriguez-Porcel, M. Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney. J. Vis. Exp. (115), e54418, doi:10.3791/54418 (2016).

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Abstract

Protocol

Los experimentos se realizaron en ratas hembra Sprague-Dawley, con un peso de 250-300 g. Todos los procedimientos con animales cumplían con las normas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto de Recursos Animales de Laboratorio, Academia Nacional de Ciencias, Bethesda, MD, EE.UU.) y fueron aprobados por la Mayo Clinic College de Medicina Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC).

1. Preparación

  1. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía. Si se han previsto múltiples cirugías en diferentes ratas en el mismo día, enjuague los instrumentos después de cada procedimiento animal y después esterilizar utilizando un esterilizador de cuentas en caliente.
  2. Anestesiar la rata con 4% de isoflurano en 1 L / min O 2.
  3. La transferencia de la rata para una resistencia de calentamiento controlado para conservar la temperatura corporal a 37 ° C. Mantener la anestesia con isoflurano 1-2% en 1 L / min O 2.
  4. Administrar el fármaco analgésico (buprenorfina liberación sostenida de 0,6 mg / kg) Dobcutaneously.
  5. Aplique un ungüento para los ojos para evitar que se sequen durante el procedimiento.
  6. Con el fin de compensar la pérdida de fluidos corporales debido a la laparotomía, es importante para administrar 10 ml / kg de 0,9% por vía subcutánea solución salina normal antes de la operación.
  7. Afeitar el área abdominal y limpiar la piel con almohadillas de etanol povidona yodada y el 70%.

2. Procedimiento Quirúrgico

  1. Asegúrese de que la profundidad de la sedación es adecuada mediante el control de los reflejos físicos, como la retirada de la pizca dedo del pie, reflejo palpebral, el tono de la mandíbula, y la respiración tasa / patrón.
  2. Realizar una laparotomía a través de una pequeña incisión en la línea media (2-2,5 cm de longitud), utilizando una hoja de bisturí quirúrgico Nº 10.
  3. Tire del delgado y el colon en el lado derecho del abdomen mediante el uso de bastoncillos de algodón y cubrir con una gasa estéril empapada en solución salina normal al 0,9% para mantener los órganos húmedo.
  4. retraer con suavidad hacia arriba el bazo, el hígado, el estómago y el páncreas para exponer el AORta y la arteria renal izquierda.
  5. Con la ayuda de un microscopio quirúrgico, separe con cuidado la aorta abdominal por encima y por debajo del riñón izquierdo y la arteria renal izquierda de las venas, la grasa y el tejido conectivo que rodea con unas pinzas de disección romos curvada e hisopos de algodón estériles.
    1. Use las pinzas con un movimiento (disección roma) de apertura y cierre repetidos a lo largo de la longitud de los vasos para extraer el tejido conectivo y los bastoncillos de algodón con un movimiento de balanceo lateral para eliminar la grasa.
      NOTA: La disección de la región peri-aórtica es una etapa muy delicada ya que los nervios y los vasos linfáticos podrían ser dañados. Asegúrese de mantener las arterias húmedo con solución salina durante el procedimiento de disección.
  6. Colocar una sutura de seda 4-0 por debajo de la aorta.
  7. El uso de clips microvasculares, sujetar la aorta por encima (justo debajo de la arteria mesentérica superior) y por debajo de la bifurcación de la arteria renal.
  8. La punción de la aorta a nivel del kidn izquierdabifurcación de la arteria ey con un catéter intravenoso 24 G y avanzar el catéter en la arteria renal.
    NOTA: Este es un paso crítico como punción a través de la arteria renal puede ocurrir.
  9. Conectar una jeringa llena con la solución de fármaco o solución salina (hasta 500 l) para el catéter y perfundir el riñón.
  10. Inmediatamente después de la perfusión, la abrazadera de la vena renal izquierda y el uréter izquierdo con un clip microvascular y retirar el catéter. A continuación, coloque un trozo de esponja de gelatina absorbible pinza hemostática, con una pequeña gota de adhesivo tisular, sobre el área de punción de la aorta y aplicar una suave presión con un hisopo de algodón.
  11. Al mismo tiempo, liberar la abrazadera de la aorta abdominal, por debajo de la bifurcación de la arteria renal izquierda. Después de 5 min, liberar la pinza de la vena renal y el uréter.
  12. liberar con cuidado la abrazadera de la aorta, por encima de la bifurcación de la arteria renal izquierda, y permitir la reperfusión del riñón. La isquemia renal total debe durar no más de 7 min.
  13. Cerrar la incisión abdominal en dos capas (músculo y piel), utilizando 4-0 suturas absorbibles y un patrón continuo para prevenir la infección. Además de la técnica de patrón de sutura continuo, otra opción sería utilizar una técnica simple, interrumpido, especialmente para el cierre de la pared del cuerpo para evitar la dehiscencia.
  14. Aplique un ungüento antibiótico tópico sobre el área de la incisión para prevenir las infecciones.
  15. La transferencia de la rata en una jaula de observación libre de la ropa de cama sobre una almohadilla caliente hasta la recuperación completa con un rango de temperatura entre 35-37 ° C. Ropa de cama suelta debe ser cubierto (por ejemplo con un paño o toalla de papel) o retirado de la jaula hasta los animales que se recuperan para evitar la asfixia o aspiración de ropa de cama.
  16. Después de la cirugía, observar a los animales de forma continua hasta que respira espontáneamente, después cada hora durante unas horas. Vuelva a la dosis del analgésico Buprenorfina SR 72 hrmás adelante, si se observan signos de malestar, como letargo, encorvados y desaliñado, mueca, no reanudar las actividades normales.
  17. Después de la terminación de todos los estudios, la eutanasia a los animales con la inhalación de una sobredosis de CO2 y obtención de los tejidos renales para ex vivo tales como los análisis de histología y Western Blot 5.

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Representative Results

Hemos inyectado dos dosis diferentes de VEGF recombinante de rata (rrVEGF, 0,17 mg / kg y 5 mg / kg) o PBS. Los animales se sacrificaron 8 horas después de la cirugía para examinar la activación de la vía VEGF. El procedimiento quirúrgico no afectó la morfología del riñón perfundido (Figura 1A) en comparación con el control (Figura 1B), como se muestra por tinción con H & E. Mientras Sirius tinción con rojo no mostró ningún aumento en la deposición de matriz extracelular en respuesta a la tiempo de isquemia y de la infusión de la rrVEGF (Figura 1C), en comparación con el control (Figura 1D). Por análisis de Western Blot, se observó un pequeño pero significativo aumento en la expresión de las proteínas implicadas en la vía de VEGF, tales como VEGF, FLK1, pAKT / AKT, pERK / ERK (Figura 2).

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Figura 1:. Imágenes representativas de histológico La tinción de Renal Tissue Hematoxilina y eosina (H & E) tinción de secciones de riñón no muestra cambios anatómicos en las ratas que recibieron VEGF (5 mg / kg, B) en comparación con animales de simulación (A) a través de inyección intrarrenal. Considerando que, sirius tinción con rojo no muestra diferencias significativas en el depósito de colágeno en las ratas que recibieron VEGF (5 mg / kg, D) en comparación con animales de simulación (C). La barra de escala representa 1 mm y representan imágenes ampliadas 400 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:. La activación de VEGF Camino Western blot de VEGF, FLK1, phosphoAKT / AKT y phosphoERK / ERK que muestra la regulación positiva de la vía de VEGF después de la infusión rrVEGF en el riñón (n = 4). Los datos se presentan como media ± SEM. * P <0,05 frente a PBS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Disclosures

Este trabajo es apoyado en parte por una beca de investigación de Astra Zeneca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Microscope Leica M125
Isoflurane 100 ml Cardinal Healthcare PI23238 Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml ZooPharm Pharmacy Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment Dechra NDC17033-211-38 Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container Baxter Healthcare Corp. NDC0338-0117-02 For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'  Cardinal Heatlhcare 23405-010B
Sterile cotton tipped applicators Kendall 8884541300
4-0 silk suture (without needle)  Cardinal Heatlhcare A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw World Precision Instruments  501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer Jelco 4053
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge Cardinal Healthcare 179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER Ethicon VCP304H For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING Ethicon VCP845G For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment Actavis NDC0472-0179-56 For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein R&D Sytems 564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA Abcam ab46154
Rabbit monoclonal FLK1 Cell Signaling 9698
Rabbit monoclonal AKT Cell Signaling 4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) Cell Signaling 4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) Cell Signaling 4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) Cell Signaling 4370

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References

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