π-πスタッキング相互作用によって安定化されたブロック共重合体ミセルの調製のための両親媒性共重合体のアニオン重合

Chemistry

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Summary

メトキシポリエチレングリコール(MPEG-B -PPheGE)のフェニルグリシジルエーテル(PheGE)のリビングアニオン重合の重要なステップが記載されています。得られたブロック共重合体ミセル(のBCM)は、生理学的に関連する条件が得られた下で4日間にわたってドキソルビシン14%(重量%)と薬物の徐放を装填しました。

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Le Dévédec, F., Houdaihed, L., Allen, C. Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by π-π Stacking Interactions. J. Vis. Exp. (116), e54422, doi:10.3791/54422 (2016).

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Abstract

本研究では、フェニル基を有するコア形成ブロックを含む両親媒性コポリマーは、メトキシポリエチレングリコール(MPEG-Bは-PPheGE)のフェニルグリシジルエーテル(PheGE)のリビングアニオン重合によって合成しました。共重合体の特性は、狭い分子量分布(PDI <1.03)を明らかにしたmPEG 122の重合度確認- B - (PheGE)15。共重合体の臨界ミセル濃度は、動的光散乱法と透過電子顕微鏡により評価凝集挙動を確立蛍光法を用いて評価しました。薬物送達用途における使用のためのコポリマーの電位は、インビトロ 、生体適合性、ロードおよび疎水性の抗癌剤ドキソルビシン(DOX)の放出を含む予備的方法で評価しました。 DOXの安定なミセル製剤は、薬物efficiをロードする、14%(重量%)までの薬物負荷レベルを用いて調製しました。> 60%(w / w)の、および生理学的に関連する条件(酸性および中性pH、アルブミンの存在)下で4日間にわたる薬物の徐放encies。高い薬物負荷レベルおよび持続放出は、DOXおよびミセルのコアを形成するブロック間のπ-π相互作用を安定させることに起因します。

Introduction

水性媒体中で、両親媒性ブロックコポリマーは、親水性シェルまたはコロナによって囲まれた疎水性コアから成るナノサイズのブロック共重合体ミセル(のBCM)を形成するために集合します。ミセルのコアは、疎水性薬物の取り込みのためのリザーバとして役立つことができます。一方、親水性コロナは、コアと外部媒体との間のインタフェースを提供します。ポリ(エチレングリコール)(PEG)およびその誘導体は、ポリマーの最も重要なクラスの一つで最も広く薬物製剤に使用されるのである。1-3のBCMは、これに依存するいくつかの製剤と値する薬物送達プラットフォームであることが証明されています技術現在後期臨床開発4において最も一般的には、共重合体の疎水性ブロックは、ポリカプロラクトン、ポリ(D、L-ラクチド)、ポリ(プロピレンオキシド)またはポリ(β-ベンジル-L-アスパラギン酸)から構成されている。5 -9

片岡さんのグループは、PEO- bから形成された球状ミセルを調査しましたB - 。ドキソルビシンの送達のための(ポリアスパラギン酸抱合ドキソルビシン)(DOX)、それらのレポートでは10,11、それらはポリマー結合薬剤またはPBLA間のπ-π相互作用を提唱しましたそして、自由DOXは、薬物負荷および保持の増加が得られたミセルのコアを安定させるように作用します。薬物およびコア形成ブロックとの間の互換性や相互作用が重要なパフォーマンス関連のパラメータの決定因子であることが確立されている。12 DOXに加えて、癌治療薬の数は、そのコア構造( 例えば 、メトトレキサート、olaparib、SN内に芳香環を含みます-38)。

その結果、それらのコアを形成するブロック中のベンジル環を含む共重合体の合成における重要な関心があります。 PEGおよびその誘導体のアニオン開環重合は、分子量の制御を可能にし、良好な収率で低い多分散性の材料になる。13,14 Ethyleをフェニルグリシジルエーテル(PheGE)またはスチレンオキシドとね酸化物(SO)(共)することができ、疎水性薬物の可溶化のためのミセルを形成するブロック共重合体を形成するために重合。15-18現在のレポートは、フェニルのリビングアニオン重合をするために必要な手順を説明しますマクロ開始剤としてのmPEG-OH上のエーテルモノマーをグリシジル( 図1)。得られたブロック共重合体及びその凝集体は、その後、薬物送達に使用するための関連性の性質の点で特徴づけられます。

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Protocol

図1
MPEG-bは -PPheGE共重合体の製造における9重要なステップを示す図1の回路図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

乾燥条件下で試薬の調製

  1. 試薬の調製。
    1. 使用前に48時間、真空下オーブン中で50℃でのmPEG-5K(M N = 5,400グラム/モル、PDI 1.03)と場所を15gを秤量します。
    2. 乾燥した200 30分間真空下でジメチルスルホキシド、水素化カルシウム上(DMSO)(にCaH 2)(〜1g)を、場所mlの、アルゴン下でパージし、使用前に48時間撹拌します。
    3. 、乾燥した清潔なフラスコ(100ml)にPheGEモノマー50mlのを配置し、アルゴン下で、氷上で15分間、真空下、にCaH 2でパージし、シール1グラム追加使用前にアルゴン下で24時間撹拌したままにします。

カリウムナフタレンの調製

  1. 慎重に、過剰なミネラルオイルを除去し、テトラヒドロフラン(THF)(V = 500 ml)を含有する丸底フラスコに追加し、ヘキサンで乾燥し、ナトリウム(〜1.5g)を小さな塊を切断。
    注:ナトリウムの塊が原因で火災の危険に長い間空気にさらされてはなりません。
  2. ベンゾフェノン(〜5グラム)を追加し、アルゴンでパージし、ガラス栓を丸底フラスコ(2首)を密封します。
  3. 24時間アルゴン下で撹拌した後、蒸留装置( 図2)に丸底フラスコを接続し、還流しながら(約2時間の期間のため、すなわち、還流液が青色に変わった後)をアルゴン下で暗色溶液を蒸留。 (蒸留装置の中央にある)左側のバルブを閉じることによって〜THF 150ml中の所望の容積を収集し始めます。
    注:このソリューションが青点灯しない場合は、蒸留を停止レーションは、室温(RT)で冷却し、より多くのベンゾフェノンまたはナトリウムを追加して、蒸留を再起動します。これは、THFがまだ水を含有することを示します。
  4. 乾燥の三角で、蒸留したTHF(V = 100ミリリットル)を追加し、ナフタレンの3.9グラムを溶解します。
    注:、蒸留を停止し、室温で冷却し、THFの体積を譲渡する権利バルブを開きます。
  5. 点2.1に記載したように、カリウム(1.8 g)を小さな塊を切断し、ナフタレン(最終濃度〜0.3モル/ L)を含む溶液に加えます。上部の隔壁を有する(オン/オフ)フラッシングアダプタ(T)との三角を密封し、アルゴンでパージします。
  6. 24時間アルゴン下で撹拌した後、均質な暗緑色などのカリウムナフタレンベースの得られた溶液を観察します。
  7. 不活性条件下で、シリンジでフラスコからの塩基性溶液の5mLのアリコートを除去し、10mlの蒸留水に加えます。続いて、この溶液にフェノールフタレイン指示薬を1〜2滴を追加その解決策フクシアの色になります。
  8. 溶液が無色になるまで標準塩酸溶液(0.1 N)とカリウムナフタレン溶液を滴定するビュレットを使用してください。

3.材料及び効果的なリビングアニオン重合のために必要な予防措置

  1. システムアルゴン/真空マニホールド。
    注: 図2で説明したように、中空ガラス栓を有する二重ガラスマニホールドはガラス製品にアルゴン送達および真空条件を切り替えるために使用されます。
    1. ドライ乾燥剤カラムに不活性ゴム管を使用して、マニホールドラインに(圧力計付)アルゴンのタンクを接続します。アルゴンラインの他の端では、(鉱物油を含む)バブラーに接続します。
    2. ガラスストップコックに、柔軟な不活性チューブと針を接続します。マニホールドの他のラインに、高真空ポンプに(氷/水または液体窒素を充填)冷たいデュワーフラスコ中に浸漬したガラストラップを接続します。
    3. モノマーおよびDMSOの蒸留のための装置。
      注:(すべて1で、すなわち )の便利な高真空蒸留のための装置は、( 図2)を採用しています。乾燥ガラス器具は、高真空バルブで作られた、および内蔵のコンデンサを内部冷蔵頭とされています。
      1. 冷却ユニット(文字)の入口(A)と出口(B)を介して水の流れを接続します。アルゴン/真空用デュアルマニホールドに他の入口/出口(C)を接続します。追加して配信/抽出ポートでセプタム(金属ワイヤ)を密封し、(トップ/ループで)空気に敏感な液体の移動(D)のためのステンレス鋼カニューレを接続します。
      2. 重合の前に、攪拌しながら真空下で2時間、それぞれ、100℃及び70℃で半球状の加熱マントル上PheGEおよびDMSOを蒸留。 DMSOのための沸点(1気圧)で189°Cであるのに対しPheGEモノマーの沸点は254℃です。
    4. アニオン性polymerizat用ガラス製品イオン。
      1. 蒸留システムに加えて、(製造者により認定)底フラスコラウンドのみを含む高真空耐性ガラス製品を使用し、カニューレ、セプタムおよびセプタムを封止する金属線(溶媒、塩基およびモノマーのボリュームの転送のために)メスシリンダー。
        注:(真空下で)慎重に重合、熱を生活のために、使用前にアルゴン流の下にあるすべてのガラス器具をクールダウン。ガラス製品から〜10センチメートル距離でヒートガンを保管してください。

    図2
    図2.組立およびキー蒸留/転写工程。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    4.リビングアニオン重合の重要なステップの説明:蒸留と転送

    1. 乾燥FでのmPEG-5K(2ミリモル、10グラム)を計量ラスク/シュレンク(オーブン)撹拌棒を含有し、上部に隔壁をフラッシングアダプタ(T)(オン/オフ)を密封します。
    2. マニホールドにフラスコを接続し、アルゴンフラッシュで2-3分間フラスコをパージします。フラスコをパージするために真空位置にバルブを回します。
    3. 手動でフラスコを回転させたmPEG-5Kが溶けるまでブロードライヤー(ヒートガン)と均一に反応容器を乾燥させます。
      注:フラスコから〜の距離で10センチヒートガンを保管してください。
    4. 1分後、いくつかのクイックスナップとアルゴンの位置に向けてマニホールドのバルブを回して、真空を破ります。
      注:連続的なアルゴン流をバブラー内に観察されなければなりません。流れが連続的である時、バルブはアルゴン位置に留まります。水分を完全に除去するために二回加熱と冷却のステップを繰り返します。
    5. 反応が始まる前〜2時間、アルゴン下で真空下でのポリマーマクロ開始剤を保管してください。
    6. マウントフード( の下に2つの高真空蒸留装置URE 2)。 DMSOの蒸留のための1とモノマー(PheGE)の蒸留のための1。
    7. 2装置にDMSOおよびモノマーを含む別のフラスコを接続して半球状の加熱マントル上の各インストール(または油浴中で)。 (イン/アウト)とマニホールド(アルゴン/真空)に装置の上部に冷水を接続します。
    8. 各装置が安全でしっかりと密封されていることを確認してください。バルブを介して真空に係合します。
      注:ステップ3.3で説明したように、水分を完全に除去するために二度の加熱と冷却の手順を繰り返します。
    9. 温度コントローラを介して加熱を設定し、解決策を攪拌開始。 DMSOの循環/蒸留の2時間後、溶液の約20ミリリットル収集する(蒸留装置の中央にある)高真空バルブを閉じて(装置の内部を洗浄します)。 cは、所望の画分の純度を確保するために、その後、フラスコ内に一部を解放し、もう一度操作を繰り返します後でollected。
    10. ポリマー(MPEG-5K)が溶けるまでヒートガンでのmPEG-5K(真空下)を含むフラスコを加熱します。アルゴンで再びパージします。
      注:手順は、DMSOの転送後解散に役立ちます。
    11. 2時間後、高真空バルブを閉じ、溶媒の体積(V DMSO =〜100ミリリットル)を収集。加熱を停止し、マニホールドからの真空を破ります。上記のようにチャンバ内に(スナップによって)アルゴンをリリース。
    12. アルゴンの正圧下で、メスシリンダーに(装置のコックでホールド)カニューレの片側を接続したり、直接のmPEG-5K(蒸留装置がある場合は卒業)とを含有するフラスコに、もう一方の端を浸します慎重に新たに蒸留留分へ。
    13. アルゴン圧を使用して、反応フラスコにカニューレを介してDMSOを駆動します。 (測定のために必要な場合、またはシリンダー)をフラスコに余分なバブラーを接続し、目に接続されたガラス活栓を閉じマニホールドの反対側の電子バブラー。
      注:カニューレの一方の側が転送のために除去されると、正のアルゴン圧力が印加されていることを確認してください。
    14. 、アルゴン圧力に起因する事故を避けるため1-2秒間ガラスコックを開き、完全な転送が完了するまで、DMSO(0.5分ごとに一回繰り返される)の流れを継続するために再投入してください。完了したら、コックを再度開きます。
      注:同じ手順は今モノマーの蒸留および収集のために従わなければなりません。溶媒およびモノマーを同時に収集することができません。
    15. 転送カニューレ挿入(ループ)とのセプタムで封止され、メスシリンダー内挿管を介して、0.3 Mナフタレンカリウムの5ミリリットル。
      メモ:4.13に記載のものと同じ用心。正のアルゴン圧は、空気/水の汚染を避けるために、シリンダにし、次いでシリンダーから反応フラスコに、ナフタレンカリウムフラスコから最初に維持しなければなりません。
    16. manifoから別の針を挿入しますシリンダ(アルゴン)へのld。慎重に蒸留システムに接続されたカニューレを外し、反応フラスコに急速に挿入します。
      注:ベースとモノマーの転送のためにこの技術を使用してください。
    17. 解決策が暗くなるまで降下により、ベースドロップを追加します。暗い色が再び表示されるまで、色の遅い消失に続いて、別の部分を追加し、フル転送されるまで繰り返します。
    18. PPheGE〜のn = 18-20の重合度に到達するためのモノマーの所望の体積(= 5ミリリットルV PheGE)を転送します。
    19. 完全な重合を確実にするために絶えず撹拌しながらアルゴン雰囲気下で80℃で48時間反応を残します。
    20. メタノール中のHCl 1 Nの液滴の添加により反応をクエンチ(リトマス紙(中性pH)を用いて測定)と色消失によって観察しました。
    21. ヘキサン(3×50 ml)でDMSO溶液からのナフタレンを抽出します。 70ミリリットル(同じ装置)〜真空下で蒸留することにより、DMSOを除去します。クースラリー溶液ダウンリットルとTHFの50ミリリットルを追加します。
    22. 10分間、5000×gで遠心分離することによってスラリー溶液から塩を削除します。上清を移し、冷ジエチルエーテル500mlに滴下して加えます。
    23. 24〜48時間(85%収率)を30℃の真空下で濾過または遠心分離(2回繰り返す)し、乾燥することにより沈殿物を収集します。
      注:共重合体は今特徴付けのための準備ができています。

    共重合体の5キャラクタリゼーション

    1. アルミニウム製サンプルパンに(実際の質量を記録)共重合体の5〜10 mgの計量し、アルミ蓋で密封。示差走査熱量計にロード試料皿と基準パン(空)。
    2. プログラムの方法(「熱/クール/ヒート」)サイクル:100°C〜40°Cから1)熱10℃/分で、2)10℃/分で-70℃に冷却し、3)熱10℃/分で100℃まで。繰り返し2)と3)を2回。 融点(T m)を決定し、crystallization(T℃)と、第3のサイクル(該当する場合)からの熱痕跡のガラス転移温度(T g)、および融解熱(ΔHのF)。
    3. THF中のポリマー(2mg / ml)を溶解し、0.2μmのPTFEフィルターでろ過します。ゲル浸透クロマトグラフィーシステム(50μL)に試料を注入し、試料の保持時間を使用し、較正曲線は、ポリマーの分子量を決定するために、ポリスチレン標準の範囲を使用して製造。19
    4. 1 H NMR分光分析のためにD 6 DMSO中の(コ)ポリマー(15 mg / mlで)を溶解する。19
    5. 蛍光プローブとして1,6-ジフェニル-1,3,5-ヘキサトリエン(DPH)を使用して共重合体の臨界ミセル濃度(CMC)を決定します。9
      1. 暗闇の中でTHF中のDPHのストック溶液(2.32 mg / Lで)を調製し、バイアルの一連のそれぞれに、このストック溶液100μlを追加します。
      2. PrepaTHF中の共重合体原液再および0.01〜1000μgの共重合体/ミリリットルの範囲で、最終的な共重合体の濃度で得られた(各DPHのストック溶液のアリコートを含む)バイアルのシリーズに、等量(2ミリリットル)のアリコートを追加します。
      3. 続いて、渦共重合体-DPHソリューションと攪拌棒を備えた二重蒸留水10mlに滴下して加えます。次いで、溶液をTHFのゆっくり蒸発を可能にするために、窒素気流下で48時間、暗所で激しく撹拌されなければなりません。各溶液中のDPHの最終濃度は0.232 mg / Lです。
      4. デュアルスキャンマイクロプレート分光蛍光光度計やプロットの蛍光を用いて430 nmの(λの = 350 nm)におけるサンプルの蛍光発光を測定する対[ポリマー]ログインします。 2つの線形勾配間の切片は、共重合体のためのCMC値を提供します。

    BCMにドキソルビシンをロードするための6.手順

    1. エースの1ミリリットルでDOXの12ミリグラムを溶解させますtonitrileは、2時間、暗所での溶液撹拌をトリエチルアミン10μlのを追加してみましょう。
    2. THFの1ミリリットル中の共重合体(45 mg)を溶解し、同じ時間攪拌します。 DOX溶液に共重合体溶液を添加し、THFの余分な体積(0.5ml)で残留共重合体を含有するバイアルをすすぎます。
    3. 撹拌しながら生理食塩水15mlの0.9%塩化ナトリウム(NaCl)を含むバイアル(20ml)中に滴下共重合体 - 薬物混合物(2.5 ml)を加えます。
    4. 透析バッグ(3.5 kDaのカットオフ)に対する解決策を移し、生理食塩水に対して0.9%(500ミリリットル)を透析。
      注:6時間後に外部の生理食塩水を変更し、透析を室温で暗所で撹拌しながら24時間継続させます。
    5. 15分間、5000×gで50ミリリットルチューブと遠心分離機に透析液を移します。
    6. 透析膜が含まれています(10ミリリットルの容量を有する)限外濾過システム(10kDaのを遮断)に上清を移します。 、限外濾過システムに攪拌アダプタを入れて蓋を閉じて、などに開放窒素のtream。
    7. 4ミリリットルの体積にBCMの溶液を濃縮し、新鮮な生理食塩水の6ミリリットルを追加し、操作を2回繰り返します。
    8. 4ミリリットルのBCMソリューションを集中する、生理食塩水0.5mlでチャンバーを洗浄し、この溶液に追加します。前さらに使用するまで暗所で室温で茶色のバイアルに保管してください。

    7.ドキソルビシンの評価は、DOX-のBCMにロード

    1. ミセルを破壊し(900μlの0.1NのHClで100μl)を評価の前に塩酸水溶液(0.1 N)で希釈し、ジメチルホルムアミド中のDOX-BCM(400μlの100μl)を溶解させます。
    2. 卓上型マイクロプレート分光光度計システムを使用して490 nmで薬物負荷を測定します。薬物負荷容量(DLC)および薬物負荷効率(DLE)を決定するために以下の式を使用します。
      DLC(重量%)=(のBCMの薬物ロード/総重量の重量)×100%
      DLE(%)=(薬物の重量飼料中の薬物の重量/ロード)×100%

    8.評価DOX-のBCMからのDOXのin vitro放出の

    1. PBSのpHに対して0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)中7.4 0.1%の37℃でのBCMからのDOXの放出を調べる(w / v)のTween 80をPBSに対して、のBCM + BSA(50 mg / mlで) pHが7.4と0.1 MのpH = 5.5での酢酸バッファー。20,21
    2. 透析バッグ中のDOXの≈0.6〜0.7ミリグラムの総量をもたらすように選択されたバッファ(2.3ミリリットル)でBCM-DOX製剤(700μl)を希釈します。
    3. 、透析バッグ内の溶液を置き、クリップで密封し、それぞれの外部メディアの200ml中にバッグを浸します。
    4. 所定の時点で透析バッグの外側の溶液2mlを削除し、新鮮な緩衝液の同量と交換してください。
    5. 紫外可視分光光度計(ABS 490 nm)とすることにより、分析前に-20℃で削除アリコートを保管してください。放出された薬物(E r)この累積百分率は、以下の式を用いて計算することができます。
      "Equation1":M DOXはのBCM中のDOXの量を表し、V 0は 、V tが置き換え媒体(Vさt = 2ml)中の容積放出培地(200ml)中の全体積である、Ciは濃度であります補正前、及びC nは 、サンプル中のDOXの濃度を表します。

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Representative Results

図3
ドキソルビシンのローディングのためのブロック共重合体ミセルの調製のために (PheGE)15図は、ナフタレンカリウムを用いたmPEGのヒドロキシル基の脱プロトン化を示す図であるMPEG - マクロ開始剤のフェニルグリシジルエーテルのアニオン重合の 図3 図は 、MPEG-B 生成します フェニルグリシジルエーテル(PheGE)モノマーの重合に続いてラジカルアニオン、など。動的光散乱(DLS)によって決定されるように酢酸ウラニル(1%w / vの)およびミセルのサイズ分布で染色のBCMの代表的な透過電子顕微鏡像(TEM)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

(PhGE)15 図3に示すようキープtogether.within-ページ= "1">に、MPEGマクロ開始剤のフェニルグリシジルエーテルのアニオン重合は、ブロック共重合体ミセル(DOX-MPEG-bを調製しましたドキソルビシンMPEG-bの狭い分子量分布- (PhGE)15共重合体は、GPC(= 1.03 PDI)によって確認された重合度は1 H NMR分析( 図4)σ= 7.2のppm(mで測定しました、2Hメタ、フェニル2(= CH - ))、σ= 6.8 ppm以下の(d、3H、2オルトおよび1パラ( - CH - )、σ= 3.95 ppmの(メートル、2H、O- CH 2 -CH-) 】基準ピーク(σ= 3.22 ppmの(S、3H)として使用するのmPEGのメチル末端基を有します。

図4
4.特性評価および分析図。 A)のGPCのmPEGの分析及びTHF。B中の共重合体)1 HmPEG5K(上のスペクトル)およびMPEG-bのNMRスペクトル- 。D 6 -DMSO中(PheGE)15(下のスペクトル) この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

表1
表共重合体の1特徴。

水性媒体中で、例えば、MPEG-bと両親媒性ブロック共重合体- (PheGE)15は、親水性シェルによって囲まれた疎水性コアから成るミセルを形成するために組み立てます。共重合体のCMCは、確立された蛍光法を用いて測定しました。 MPEG-bのCMC - (PheGE)15は 〜9 / mlの( 図5Aの挿入図 )であると決定されました。透過型電子顕微鏡は、共重合体の集合体のための球状の形態を確認したため、動的光散乱( 図3および表2)が流体力学的直径(D hの〜25 nm)を評価するために使用しました。 図6-Aに示すように、L929マウス線維芽細胞を、MPEG-bに曝露された- (PhGE)15のBCMと細胞毒性は、24時間のインキュベーション期間の後に観察されませんでした。

図5
図5. 蛍光 強度 とCMCの特性評価。 (Pheの)15ブロック共重合体- MPEG-Bの濃度の関数としてのDPHの蛍光強度のA)のプロット。挿入図は、0.1 / mlの。B)コア形成ブロックのペンダントフェニル基を有する共重合体の範囲についての文献から得られたCMC値のプロットでは、ブロック共重合体の凝集の初期段階を示しています。赤色の四角は、マウスのギブズエネルギーのための計算値を表します対応する共重合体のllization。22,25-28(0.5 kJの/モル±) この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

表2
透析法により調製のBCMの表2キャラクタリゼーション。

BCM中の薬物の可溶化は、薬剤の水溶解度と同様に、薬剤自体および/またはミセルのコア形成ブロックの間の相互作用の傾向に影響されます。その塩の形態で、DOXを水(〜10 mg / mlで)比較的可溶性です。こうしてのBCMにロードするために、DOXをアセトニトリルに溶解し、遊離塩基(3当量)を得るためにTEAで中和しました。 8.5のpKaでは、DOXはstabiliでのBCMにカプセル化を駆動する基本的な条件下で比較的不溶性になりますπ-πスタッキング相互作用によって化(MPEG-bの- (PhGE)15)。文献に記載されているように、DOX-MPEG-bにおけるDOXのための同様の負荷容量- (PhGE)15(w / w)の14%の平均値が報告されている限外濾過した後21〜24は、その共重合体の濃度が見出されました10 mgのような低い/正常に1.6ミリグラムのDOX / mlまで可溶化mLです。 (PhGE)15のBCM( 表2) -薬物負荷効率はMPEG-bのために(w / w)の最大52%でした。異なるメディアでのBCMからのDOXの放出プロファイル( 図6c)を調査しました。

図6
図6.細胞毒性および薬物放出動態。A)EvaluaMPEG-bのL929マウス線維芽細胞における細胞傷害性化- 24時間のインキュベーション期間後、MTSアッセイを用いて決定した(PheGE)15コポリマーミセル(N = 3の独立した実験、SD <10%)、B)、正規化発光スペクトル無料DOXおよび10μg/ mlのDOX濃度でPBS、pH7.4中DOX-ロードミセルの。励起波長は480nmであり、発光スペクトルは、ブロックMPEG-BからのDOXの500-700 nmのC)の放出プロフィールから収集される- 0.1 M pHが7.4、(丸)PBS中(PhGE)15コポリマーミセル(四角)。酢酸のNa +バッファー0.1 MのpHは5.5でPBS 0.1のM(袋に)BSAを50mg / mlを含有するpHが7.4と(三角形)およびpH7.4のPBS中の遊離DOX(N = 2)(三角ダウン)。 (nは、各条件= 3個々の実験、SD <10%)。 このfigurの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。電子。

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Discussion

アニオン重合は、分子量の上に提供し、良好なコントロールには、オキシラン単量体(PEG及びPPG)をベースとするポリマーを製造するための、業界で最も適用されたプロセスの一つです。最適かつストリンジェントな条件を達成することに成功し、重合のた​​めに使用されなければなりません。すべての試薬および適切な装置の厳密な精製は、合成のリビング特性のために不可欠です。現在のセットアップの制限事項は、主にカニュレーションに依存している転送技術に関連しています。適切な圧力を使用して、カニュレーションは、学術設定のための安全な実験室規模の技術です。これらの注意事項を適用すると、重合プロセス(低PDI)の間に優れた再現性と制御を提供します。また、これらの転写及び精製手順は、-PCl B MPEG-、MPEG-Bは-PLLA、およびMPEG-Bは-PAGE等の共重合体の製造に使用することができる。19,29が、この便利PROCedureは、より厳しい条件( 例えば 、スチレン)を必要とするいくつかのモノマーの重合のために適切でないかもしれません。あるいは、ブレークシール技術は、通常、アニオン重合のために好適である。30業界ではこれらのステップを制御するために、同様のシステム(ステンレス/ガラス)気密バルブを介して互いに接続されています。

オキシラン単量体の場合、一般的なメカニズムは、開環重合につながるオキシラン環上のオキシアニオン(遊離イオンまたはイオン対)の求核攻撃です。しかし、置換オキシラン単量体の性質に依存する、いくつかのモノマーが重合していないか、またはそれらは、高分子量に重合されない場合があります。このタイプの重合は、モノマー自体、溶剤または停止反応および/または培地中の連鎖移動(反応の制御の喪失)につながる他の種を含む酸性または塩基性成分を、容認しません。 PEG化されたブロック共重合体担持フェニルを製造するためにアニオン重合による基は、フェニルグリシジルエーテルモノマーの代替を見つけることができる:ベンジルメルカプタンのラジカルマイケル反応、続いてスチレン、スチレンオキシド、アリルグリシジルエーテルは、オプションです。 mPEGは、エチレンオキシドモノマーの縮合により調製し、次いでヒドロキシル開始剤( 例えば 、メタノール)を使用して、本書で説明したのと同じ条件下で重合させることができます。しかしながら、低PDIを有する分子量を変化させるのmPEGは、商業的に入手可能です。

水の残留物を回避するために、マクロ開始剤( 例えば MPEG-OH)は、熱銃乾燥手順に続いて、ウェルオーブン内で予備乾燥によって乾燥される必要があります。反応は、またはバルクでの溶媒の調整、極性非プロトン性溶媒中で行うことができます。重合はこのような高温などの特定の条件を必要とするとき、THFよりも強い極性の溶媒は、DMSO、ジグライムまたはHMPAとして、使用する必要があります。プロトコールに記載されているように( セクション4 2でモノマー()の効率的な蒸留が必要です。 DMSOは吸湿性であり、蒸留がうまく行われない場合には、微量の水は活性種を不活性化することができます。他の溶媒を使用することもできるが、DMSOは、陰イオンのための陽イオンのための高い溶媒和能力、低溶媒和能を有し、かつ高い温度は重合。31,32 DMSOは、ベースのための優れた溶媒は強い電子吸引性置換基とエポキシドとオレフィンの重合触媒であることができます。重合の開始は、カリウムナフタレンの希薄溶液でのmPEG-OHの滴定を介してカリウムアルコキシド開始剤のその場生成することによって達成することができる。33注意深くカリウムナフタレンの溶液を調製する前に、酸で溶液を滴定することが重要ですその使用。カリウムナフタレンの濃度は下または過大評価であれば確かに、マクロ開始剤は、凝集体を形成するか、または完全に活性化するために失敗することがありますイニシエータと順番に重合が損なわれる可能性があります。カリウムナフタレンを滴下するとき、色の遅い消失は、イニシエータによってベースの消費量以上の視覚的なコントロールを提供します。これらの条件下では、ヒドロキシル基(休眠)およびアルコキシド(アクティブ)との間の迅速なプロトン交換は、モノマーの制御重合を確実にする。13

B - - (PhGE)15 1から10μgの範囲の報告されたCMC値を持ついくつかのグループにより研究されてきた/ mlの25,27,28,34-36 CMC値用のMPEG 122と同様の組成物のブロックコポリマーの凝集挙動具体的なコポリマーは、決意するために使用される特定の方法に依存して変化し得ます。本研究では、蛍光ベースの方法は、それが一度だけのBCM( 図5Aの挿入図 )に組み込まれた蛍光シグナルをもたらすことを考えると、プローブとして選ばれたDPHを用いて使用した。 図5(b)ペンダントフェニル基を有する種々のブロック共重合体について得られたCMC値を含みます。示されているように、共重合体のCMC値は、フェニル基、および重合度を有するポリマー主鎖の性質に応じて変化する。25,27,28,34-36ミセルと外部媒体との間の共重合鎖の交換に依存しますミセルコアの状態だけでなく、二つのブロックと溶媒とのフローリー・ハギンズ相互作用パラメータ。バルクPPheGEホモポリマーのガラス転移温度(T g)は 、バルクPSよりも低いことが知られている。37によりPSのガラス状の性質のために、PSの重合(N> 35)度の高い共重合体は、ガラス質のコアを有します室温で(T g〜80°C)。38

熱力学的に、二つの主なアプローチ、すなわち、ミセル化プロセスを説明するために前方に相分離モデル(CMCにおける相分離)、および質量作用のモデル(お尻を入れていますociation解離平衡ミセル/ユニマー)。39両方のアプローチによると、標準ギブスエネルギー ミセル相への溶液からの両親媒性物質の1モルの転送のための変化(ΔG◦)が示すように、ΔG◦= RTのLN(CMC)。39で与えられる、静電相互作用の非存在下では、(ΔGは、ミセル化の自由エネルギーを◦します ) (PhGE) - 図5(b)に、CMCおよびΔG◦の値は、bは MPEG-する(全コポリマーM Wと親水性ブロック長に疎水性の比で)組成が類似している共重合体について得られた値と一致しています15. 表1に示すよう 、MPEG-BのDSC分析- (PhGE)15共重合体バルク材料は、親水性ブロックに起因するとの押下に対してである51℃で単一のT mを確認単独でのmPEG(60°C)。溶液中で、MPEG-bのコアはMPEG-でPhGEと同様の長さのポリスチレンブロックと、コポリマーミセルを-PSと推定されるB - (PhGE)15、生理的温度( すなわち 、37℃で、移動になることを始めますC)38,40は、したがって、MPEG-bの- 。(PhGE)15のBCMは、おそらく部屋と生理的温度で地元の移動を可能にする、比較的モバイルコアを有しています。

この研究では、透析、限外濾過、遊離薬物を除去し、 インビボでの用途におけるその後のための薬物/共重合体の濃度を増加させるために便利な手段として使用しました。あるいは、凍結乾燥処方物を濃縮するために用いることができます。しかしながら、これは、再構成のための濡れ性を向上させるために安定化の可能性のある付加を含む最適化を必要とする( 例えば、PEG、デキストロース)。その結果DOX-MPEG-bの- (PhGE)15のBCMは、同様のを示しました。片岡および共同研究者によって開発されたBCMシステムにustained放出プロファイル(PBS 7.4)。pH7.4のPBSで21遊離DOXの95%以上が、透析から放出され、一方、全薬物の10%未満が6時間以内に放出されました時間と同じ期間内袋。中性pHでの持続放出は、4日間にわたって製剤の良好な安定性を示しています。

ヒト血清は、アルブミンである三分の二うち約7%のタンパク質から構成されている41のため、 インビボ条件の薬物放出をシミュレートするためには、一般的に、このタンパク質の生理学的に適切な濃度を含有する緩衝液中で評価されます。本研究では、BSAを50mg / mlの濃度で透析バッグに含まれていました。アルブミンの存在下でのBCMからのDOXの放出は、37℃でのインキュベーションの4日後に約30%に上昇しました。 pH5.5で緩衝液中でのBCMからのDOXの放出はprotonatことを確認しました72時間後の薬物放出の増加で、これらの条件の結果の下でDOXのイオンと、これは4日後に60%まで増加します。全体として、得られたDOX-のBCMは、文献に提示さDOXの他のBCMの製剤と類似または同等の、 インビトロで有望な結果を示しており、従って、 インビボでのさらなる評価を促します。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/HAMF12 Gibco, Life Technologies 12500 Supplemented with 10% FBS. Warm in 37 °C water bath.
Trypsin-EDTA (0.25%) Sigma-Aldrich T4049 Warm in 37 °C water bath
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F1051 Canada origin
MDA-MB-468 cell line ATCC HTB-132
MTS tetrazolium reagent PROMEGA G111B
Phenazine ethosulfate (PES) Sigma-Aldrich P4544 >95%
mPEG5K (Mn 5,400 g/mol) Sigma-Aldrich 81323 PDI=1.02
Dimethylsolfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540 >99.5%
Naphthalene Sigma-Aldrich 147141 >99%
Phenyl glycidyl ether Sigma-Aldrich A32608 >85%
Benzophenone Sigma-Aldrich 427551 >99%
Potassium Sigma-Aldrich 451096 >98%
Tetrahydrofuran Caledon Laboratory Chemicals 8900 1 ACS
Hexane Caledon Laboratory Chemicals 5500 1 ACS
Calcium hydride (CaH2) ACP C-0460 >99.5%
Diethyl Ether Caledon Laboratory Chemicals 1/10/4800 ACS
Microplate reader BioTek Instruments
Differential scanning calorimetry (DSC) TA Instruments Inc DSC Q100
Gel permeation chromatography (GPC) Waters 2695 separation moldule / 2414 detector  2 Columns: Agilent Plgel 5 µm Mixed-D
NMR spectroscopy Varian Mercury 400MHz
Chloroform-d Sigma-Aldrich 151858 99.96%
DMSO-d Sigma-Aldrich 156914 99.96%
Vaccum pump Gardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc. Ultimate pressure 1x10-4 torr
Drierit with indicator, 8 mesh Sigma-Aldrich 238988 Regenerated at 230 °C for 2 hr

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References

  1. Dickerson, T. J., Reed, N. N., Janda, K. D. Soluble Polymers as Scaffolds for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102, 3325-3344 (2002).
  2. van Heerbeek, R., Kamer, P. C. J., van Leeuwen, P. W. N. M., Reek, J. N. H. Dendrimers as Support for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102, (10), 3717-3756 (2002).
  3. Knop, K., Hoogenboom, R., Fischer, D., Schubert, U. S. Poly(ethylene glycol) in Drug Delivery: Pros and Cons as Well as Potential Alternatives. Angewandte Chemie International Edition. 49, (36), 6288-6308 (2010).
  4. Eetezadi, S., Ekdawi, S. N., Allen, C. The challenges facing block copolymer micelles for cancer therapy: In vivo barriers and clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 91, 7-22 (2015).
  5. Attwood, D., Booth, C., Yeates, S. G., Chaibundit, C., Ricardo, N. Block copolymers for drug solubilisation: Relative hydrophobicities of polyether and polyester micelle-core-forming blocks. International Journal of Pharmaceutics. 345, (1-2), 35-41 (2007).
  6. Matsumura, Y., Kataoka, K. Preclinical and clinical studies of anticancer agent-incorporating polymer micelles. Cancer Science. 100, (4), 572-579 (2009).
  7. Chan, A. S., Chen, C. H., Huang, C. M., Hsieh, M. F. Regulation of particle morphology of pH-dependent poly(epsilon-caprolactone)-poly(gamma-glutamic acid) micellar nanoparticles to combat breast cancer cells. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 10, (10), 6283-6297 (2010).
  8. Diao, Y. Y., et al. Doxorubicin-loaded PEG-PCL copolymer micelles enhance cytotoxicity and intracellular accumulation of doxorubicin in adriamycin-resistant tumor cells. International Journal of Nanomedicine. 6, 1955-1962 (2011).
  9. Mikhail, A. S., Allen, C. Poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) Micelles Containing Chemically Conjugated and Physically Entrapped Docetaxel: Synthesis, Characterization, and the Influence of the Drug on Micelle Morphology. Biomacromolecules. 11, (5), 1273-1280 (2010).
  10. Kataoka, K., Harada, A., Nagasaki, Y. Block copolymer micelles for drug delivery: design, characterization and biological significance. Advanced Drug Delivery Reviews. 47, (1), 113-131 (2001).
  11. Nakanishi, T., et al. Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. Journal of Controlled Release. 74, (1-3), 295-302 (2001).
  12. Liu, J., Xiao, Y., Allen, C. Polymer-drug compatibility: A guide to the development of delivery systems for the anticancer agent, ellipticine. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93, (1), 132-143 (2004).
  13. Flory, P. J. Molecular Size Distribution in Ethylene Oxide Polymers. Journal of the American Chemical Society. 62, (6), 1561-1565 (1940).
  14. Kazanskii, K. S., Solovyanov, A. A., Entelis, S. G. Polymerization of ethylene oxide by alkali metal-naphthalene complexes in tetrahydrofuran. European Polymer Journal. 7, (10), 1421-1433 (1971).
  15. Crothers, M., et al. Micellization and Gelation of Diblock Copolymers of Ethylene Oxide and Styrene Oxide in Aqueous Solution. Langmuir. 18, (22), 8685-8691 (2002).
  16. Taboada, P., et al. Block Copolymers of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether: Micellization, Gelation, and Drug Solubilization. Langmuir. 21, (12), 5263-5271 (2005).
  17. Taboada, P., et al. Micellization and Drug Solubilization in Aqueous Solutions of a Diblock Copolymer of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether. Langmuir. 22, (18), 7465-7470 (2006).
  18. Attwood, D., Booth, C. Colloid Stability. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 61-78 (2010).
  19. Le Devedec, F., et al. Postalkylation of a Common mPEG-b-PAGE Precursor to Produce Tunable Morphologies of Spheres, Filomicelles, Disks, and Polymersomes. ACS Macro Letters. 5, (1), 128-133 (2016).
  20. Chtryt, V., Ulbrich, K. Conjugate of Doxorubicin with a Thermosensitive Polymer Drug Carrier. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 16, (6), 427-440 (2001).
  21. Kataoka, K., et al. Doxorubicin-loaded poly(ethylene glycol)-poly(β-benzyl-l-aspartate) copolymer micelles: their pharmaceutical characteristics and biological significance. Journal of Controlled Release. 64, (1-3), 143-153 (2000).
  22. Cammas, S., Matsumoto, T., Okano, T., Sakurai, Y., Kataoka, K. Design of functional polymeric micelles as site-specific drug vehicles based on poly (α-hydroxy ethylene oxide-co-β-benzyl l-aspartate) block copolymers. Materials Science and Engineering: C. 4, (4), 241-247 (1997).
  23. Lv, S., et al. Doxorubicin-loaded amphiphilic polypeptide-based nanoparticles as an efficient drug delivery system for cancer therapy. Acta Biomaterialia. 9, (12), 9330-9342 (2013).
  24. Kim, J. O., Oberoi, H. S., Desale, S., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Polypeptide nanogels with hydrophobic moieties in the cross-linked ionic cores: synthesis, characterization and implications for anticancer drug delivery. Journal of Drug Targeting. 21, (10), 981-993 (2013).
  25. Zhao, C. L., Winnik, M. A., Riess, G., Croucher, M. D. Fluorescence probe techniques used to study micelle formation in water-soluble block copolymers. Langmuir. 6, (2), 514-516 (1990).
  26. Wilhelm, M., et al. Poly(styrene-ethylene oxide) block copolymer micelle formation in water: a fluorescence probe study. Macromolecules. 24, (5), 1033-1040 (1991).
  27. Cammas, S., Kataoka, K. Functional poly[(ethylene oxide)-co-(β-benzyl-L-aspartate)] polymeric micelles: block copolymer synthesis and micelles formation. Macromolecular Chemistry and Physics. 196, (6), 1899-1905 (1995).
  28. Kwon, G., et al. Micelles based on AB block copolymers of poly(ethylene oxide) and poly(.beta.-benzyl L-aspartate). Langmuir. 9, (4), 945-949 (1993).
  29. Ahmed, F., Discher, D. E. Self-porating polymersomes of PEG-PLA and PEG-PCL: hydrolysis-triggered controlled release vesicles. Journal of Controlled Release. 96, (1), 37-53 (2004).
  30. Uhrig, D., Mays, J. W. Experimental techniques in high-vacuum anionic polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 43, (24), 6179-6222 (2005).
  31. Parker, A. J. The effects of solvation on the properties of anions in dipolar aprotic solvents. Quarterly Reviews, Chemical Society. 16, (2), 163-187 (1962).
  32. Cram, D. J. Fundamentals o] Carbanion Chemistry. (1965).
  33. Szwarc, M. ACS Symposium Series. 166, American chemistry society. 1-15 (1981).
  34. Cho, Y. W., Lee, J., Lee, S. C., Huh, K. M., Park, K. Hydrotropic agents for study of in vitro paclitaxel release from polymeric micelles. Journal of Controlled Release. 97, 249-257 (2004).
  35. Dewhurst, P. F., Lovell, M. R., Jones, J. L., Richards, R. W., Webster, J. R. P. Organization of Dispersions of a Linear Diblock Copolymer of Polystyrene and Poly(ethylene oxide) at the Air−Water Interface. Macromolecules. 31, (22), 7851-7864 (1998).
  36. Opanasopit, P., et al. Block Copolymer Design for Camptothecin Incorporation into Polymeric Micelles for Passive Tumor Targeting. Pharmaceutical Research. 21, (11), 2001-2008 (2004).
  37. Allen, G., Booth, C., Price, C. VI-The physical properties of poly(epoxides). Polymer. 8, 414-418 (1967).
  38. Jada, A., Hurtrez, G., Siffert, B., Riess, G. Structure of polystyrene-block-poly(ethylene oxide) diblock copolymer micelles in water. Macromolecular Chemistry and Physics. 197, (11), 3697-3710 (1996).
  39. Attwood, D., Florence, A. T. Surfactant systems : their chemistry, pharmacy, and biology. Chapman and Hall. (1983).
  40. Rekatas, C. J., et al. The effect of hydrophobe chemical structure and chain length on the solubilization of griseofulvin in aqueous micellar solutions of block copoly(oxyalkylene)s. Physical Chemistry Chemical Physics. 3, (21), 4769-4773 (2001).
  41. Encyclopædia Britannica Online. http://www.britannica.com/EBchecked/topic/479680/protein/72559/Proteins-of-the-blood-serum (2015).

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