Anioniske polymerisering av en amfifil copolymer for forberedelse av blokk-kopolymer Miceller stabilisert av π-rc stabling Interactions

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De viktigste trinn i levende anionisk polymerisering av fenylglycidyleter (PheGE) på metoksy-polyetylenglykol (MPEG-b -PPheGE) er beskrevet. De resulterende blokk-kopolymer miceller (BCMS) ble lastet med doksorubicin 14% (vekt%) og forlenget frigivelse av medikament i løpet av 4 døgn under fysiologiske relevante betingelser ble oppnådd.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Le Dévédec, F., Houdaihed, L., Allen, C. Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by π-π Stacking Interactions. J. Vis. Exp. (116), e54422, doi:10.3791/54422 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I denne studien ble en amfifil kopolymer som inkluderer et kjernedannende blokk med fenylgrupper syntetisert ved hjelp av levende anionisk polymerisasjon av fenylglycidyleter (PheGE) på metoksy-polyetylenglykol (MPEG-b -PPheGE). Karakterisering av kopolymeren viste en snever molekylvektfordeling (PDI <1,03) og bekreftet graden av polymerisering av mPEG 122 - b - (PheGE) 15. Den kritiske micellekonsentrasjonen av kopolymeren ble evaluert ved anvendelse av en etablert metode for fluorescens med aggregeringen oppførsel evaluert ved dynamisk lysspredning, og overføring elektronisk mikroskopi. Potensialet av copolymer for bruk i stoffet levering søknader ble evaluert i en foreløpig måte inkludert in vitro biokompatibilitet, lasting og frigjøring av den hydrofobe anti-kreft narkotika doxorubicin (DOX). En stabil micelle formulering av DOX ble utarbeidet med narkotika lasting nivåer opp til 14% (vekt%), legemiddelmengden efficiencies> 60% (vekt / vekt) og forlenget frigivelse av medikament i løpet av 4 døgn under fysiologiske relevante betingelser (sur og nøytral pH-verdi, tilstedeværelse av albumin). Den høye medikamentbelastning nivå og forsinket frigjøring skyldes stabilisere n-π interaksjoner mellom DOX og den kjernedannende blokk av micellene.

Introduction

I vandige media, amfifile blokk-kopolymerer sammen for å danne nanostørrelse blokk-kopolymer miceller (BCMS) som består av en hydrofob kjerne omgitt av et hydrofilt skall eller korona. Micellen kjerne kan tjene som et reservoar for inkorporering av hydrofobe medikamenter; mens, gir den hydrofile korona et grensesnitt mellom kjernen og det ytre medium. Poly (etylenglykol) (PEG) og dets derivater er en av de viktigste klasser av polymerer, og en av de mest utbredt i legemiddelformulering. 1-3 BCMS har vist seg å være en verdig medikamenttilførselsplattform med flere formuleringer avhengig av denne teknologi nå i sent stadium klinisk utvikling. 4 hyppigst, den hydrofobe blokk av kopolymeren består av polykaprolakton, poly (D, L-laktid), poly (propylenoksyd) eller poly (β-benzyl-L-aspartat). 5 -9

Kataoka gruppe undersøkt sfæriske miceller dannet fra PEO- b b -. (Polyasparginsyre-konjugert doxorubicin) for levering av doxorubicin (DOX) 10.11 I sine rapporter, de legger frem at π-rc samspillet mellom polymer-konjugert narkotika eller PBLA og gratis DOX handle for å stabilisere micelle kjernen resulterer i en økning i narkotika lasting og oppbevaring. Det er fastslått at kompatibilitet eller interaksjoner mellom et stoff og kjernedannende blokk er faktorer som bestemmer sentrale ytelsesrelaterte parametere. 12 I tillegg til DOX, en rekke kreftbehandling inkluderer aromatiske ringer innenfor sitt kjernestruktur (for eksempel metotreksat, olaparib, SN -38).

Som et resultat er det en betydelig interesse for fremstilling av kopolymerer som inkluderer benzyl- ringer i sine kjernedannende blokker. Anionisk ringåpningspolymerisering av PEG og dets derivater muliggjøre kontroll over molekylvekten og resulterer i materialer med lav polydispersitet i godt utbytte. 13,14 Ethylene oksyd med fenylglycidyleter (PheGE) eller styrenoksyd (SO) kan (ko) polymeriseres for å danne blokk-kopolymerer som danner miceller for solubilisering av hydrofobe legemidler. 15-18 Denne rapporten beskriver de nødvendige skritt for å leve anionisk polymerisasjon av fenyl- glysidyleteren monomer på mPEG-OH som macroinitiator (figur 1). Den resulterende blokk-kopolymer og dets aggregater blir så preget i form av egenskaper som er relevante å bruke i levering av legemidler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Figur 1
Figur 1. Skjematisk viser de ni viktigste trinnene i utarbeidelsen av MPEG-b -PPheGE copolymer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1. Utarbeidelse av reagenser tørr veibane

  1. Fremstilling av reagensene.
    1. Vei opp 15 g av mPEG-5K (Mn = 5400 g / mol, 1,03 PDI) og sted ved 50 ° C i en ovn under vakuum i 48 timer før bruk.
    2. Tørr 200 ml dimetylsulfoksyd (DMSO) over kalsiumhydrid (CaH 2) (~ 1 g), sted under vakuum i 30 min, spyling under argon og omrørt i 48 timer før bruk.
    3. Plassere 50 ml av PheGE monomer i en tørr og ren kolbe (100 ml), tilsett 1 g CaH 2, forsegling under vakuum i 15 minutter på is, spyle under argonog la den omrøres i 24 timer under argon før bruk.

2. Fremstilling av kalium Naftalen

  1. Nøye, skjære små biter av natrium (~ 1,5 g) ble tørket med heksan for å fjerne overskudd av mineralolje og legge til den rundkolbe inneholdende tetrahydrofuran (THF) (v = 500 ml).
    MERK: biter av natrium må ikke utsettes for luft for lenge på grunn av brannfare.
  2. Legg benzophenone (~ 5 g), utrenskning med argon og forsegle rundkolbe (2 halsen) med glasspropper.
  3. Etter røring under argon i 24 timer, kobler rundbunnet kolbe til et destillasjonsapparat (figur 2), destillere den mørke løsning under argon under tilbakeløpsbehandling (dvs. tilbakeløp i omtrent en to timers periode etter at løsningen blir blå). Begynne å samle inn det ønskede volum ~ 150 ml THF ved å lukke den venstre ventil (funnet i midten av destillasjonsapparatet).
    MERK: Hvis denne løsningen ikke blir blå, stoppe Distilning, avkjøles i romtemperatur (RT) og tilsett mer benzofenon eller natrium og start destillasjon. Dette er en indikasjon på at THF fremdeles inneholder vann.
  4. I en erlenmeyerkolbe tørr, destillert THF (v = 100 ml) og oppløse 3,9 g naftalen.
    MERK: Stopp destillasjon, avkjøles i romtemperatur og åpne høyre ventilen til å overføre volumet av THF.
  5. Som beskrevet i punkt 2.1, skjære små biter av kalium (1,1 g) og tilsett til oppløsningen inneholdende det naftalen (sluttkonsentrasjon ~ 0,3 mol / l). Tett erlenmeyerkolbe med en spyle adapter (T) (av / på) med en skillevegg på toppen og rense med argon.
  6. Etter røring under argon i 24 timer, observere den resulterende løsning av kalium naftalen basen som en homogen mørkegrønn farge.
  7. Under inerte betingelser, fjerne en 5 ml mengde av den basiske oppløsning fra kolben med en sprøyte og tilsett til 10 ml destillert vann. Deretter å tilsette 1-2 dråper fenolftalein-indikator til denne løsningensom slår oppløsningen en fuchsia farge.
  8. Bruke en byrette for å titrere kaliumnaftalen oppløsningen med en standard saltsyreløsning (0,1 N) inntil oppløsningen fikk fargeløse.

3. Materialer og nødvendige forholdsregler for Effektiv Stue anionisk polymerisering

  1. System argon / vakuum manifold.
    MERK: Som beskrevet i figur 2, er et dobbelt glass manifold med hule glassstoppekraner brukes til å veksle mellom argon levering og vakuum i glass.
    1. Koble tank av argon (med manometer) i en tørr kolonne tørkemiddel og til manifolden linje ved hjelp av inert gummislanger. I den andre ende av argon linjen, kobler en bobler (inneholdende mineralolje).
    2. Til glassstoppekraner, koble fleksible inerte rør og nåler. Til den andre linje av manifolden, kobler et glass felle neddykket i et kaldt Dewar kolbe (fylt med is / vann eller flytende nitrogen) til en høy vakuumpumpe.
    3. Apparater for destillering av monomer og DMSO.
      MERK: En praktisk (dvs., alt i ett) anordning for høyvakuum-destillasjon anvendes (figur 2). Den tørre glass er laget med høye vakuumventiler, og innebygd kondensatorer med en indre nedkjølt hodet.
      1. Treffe vannstrøm gjennom innløpet (A) og utløpet (B) av kjøleenheten (bokstav). Koble den andre innløp / utløp (C) til den doble manifold for argon / vakuum. Legg til og forsegle en septum (metalltråder) ved levering / uttak port og koble til en rustfritt stål kanyle for overføring av luft sensitive væsker (D) (øverst / loop).
      2. Før polymerisasjon destillere PheGE og DMSO på halvkuleformede varme mantles ved 100 ° C og 70 ° C, respektivt, i 2 timer under vakuum med omrøring. Den PheGE monomer s kokepunkt er 254 ° C, mens kokepunktet for DMSO er 189 ° C ved (1 atm).
    4. Glass for anioniske ferrion.
      1. I tillegg til destillasjon system, bruker bare høyt vakuum bestandig glass inkludert Rundkolber (sertifisert av produsent), uteksaminert sylindere (for overføring av volumer av løsemiddel, base og monomerer), kanyler, septa og metall ledninger for å forsegle septa.
        MERK: For å leve polymerisering, varme forsiktig (under vakuum) og kjøle ned alle glass under argon flyt før bruk. Hold varmepistol i en avstand ~ 10 cm fra glass.

    Figur 2
    Figur 2. Montering og nøkkel destillasjon / overføring trinn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    4. Beskrivelse av de viktigste trinnene fra Living Anionisk polymerisering: Destillasjon og Transfer

    1. Veie mPEG-5K (2 mmol, 10 g) i en tørr fLask / Schlenk (ovn) med en rørestav og forsegle spyle adapter (T) (av / på) med en skillevegg på toppen.
    2. Koble kolben til manifolden og spyle kolben i 2-3 min med argon-spylinger. Drei ventilen til vakuum posisjon for å spyle kolben.
    3. Roter flasken manuelt og tørk reaksjonsbeholderen homogent med en hårføner (varmepistol) til MPEG-5K smelter.
      MERK: Hold varmepistol i en avstand ~ 10 cm fra kolben.
    4. Etter 1 min, bryte vakuumet ved å slå ventilen på manifolden mot argon stilling med flere raske trykknapper.
      MERK: En kontinuerlig argonstrøm overholdes i boble. Når strømningen er kontinuerlig, forblir ventilen på argon stilling. Gjentatte oppvarmings- og kjølesystemene to ganger for å fjerne alle spor av fuktighet.
    5. Hold polymere macroinitiator under vakuum i ~ 2 timer og under argon før reaksjonen begynner.
    6. Mount to høy vakuumdestillasjon apparater under panseret (figure 2); en for destillasjon av DMSO og en for destillasjon av monomeren (PheGE).
    7. Koble de separate kolber inneholdende DMSO og monomeren til de to apparater og installere hver på en halvkuleformet varmekappe (eller i et oljebad). Koble kaldt vann til toppen av apparatet (inn / ut) og til manifolden (argon / vakuum).
    8. Pass på at hvert apparat er sikker og godt forseglet. Kople vakuum via ventilen.
      MERK:. Som beskrevet i trinn 3.3, gjentar oppvarmings- og kjølesystemene to ganger for å fjerne alle spor av fuktighet.
    9. Sett oppvarming via en temperaturregulator og begynne å røre løsningene. Etter 2 timer av sirkulasjons- / destillasjon av DMSO, lukk høyvakuum ventilen (funnet i midten av destillasjonsapparatet) til å samle omtrent 20 ml av oppløsning (for å vaske innsiden av apparaturen). Deretter slipper fraksjonen inn i kolben og gjenta operasjonen gang til for å sikre renheten av den ønskede fraksjon som er collected senere.
    10. Oppvarme kolben inneholdende den mPEG-5K (under vakuum) ved varmepistol inntil polymeren (mPEG-5K) smelter. Spyl igjen med argon.
      MERK: Fremgangsmåten vil bidra til oppløsningen etter overføring av DMSO.
    11. Etter 2 timer, lukker høyvakuum ventilen og samle volum av løsningsmiddel (DMSO V = ~ 100 ml). Stopp oppvarming og bryte vakuumet fra manifolden. Slipp argon (med fester) inn i kammeret som beskrevet ovenfor.
    12. Under et positivt trykk av argon, koble den ene side av kanylen (hold ved stoppekranen av apparatet) til en gradert sylinder eller direkte til kolben inneholdende den mPEG-5K (hvis destillasjonsapparatet har gradering) og, dyppe den andre enden forsiktig inn i nylig destillert fraksjon.
    13. Ved hjelp av argontrykk, drive DMSO gjennom kanylen inn i reaksjonskolben. Koble en ekstra boble til kolben (eller sylinder hvis nødvendig for måling), og lukk glass stoppekranen koblet til the bobleren på den motsatte side av fordeleren.
      MERK: Når den ene siden av en kanyle fjernes for overføring, sørg for at positiv argon trykket er brukt.
    14. For å unngå eventuelle ulykker forårsaket av argon press, åpne glass stoppekranen for 1-2 sek og reclose å fortsette flyten av DMSO (gjentatt gang per 0,5 min) før full overføringen er fullført. Gjenåpne stoppekranen når du er ferdig.
      MERK: Den samme prosedyren må nå følges for destillasjon og innsamling av monomeren. Oppløsningsmidlet og monomeren ikke kan samles samtidig.
    15. Overfør 5 ml 0,3 M naftalen kalium via kanylering i en målesylinder forseglet av et septum med kanyle inn (loop).
      MERK: Samme forholdsregler som beskrevet i note 4.13. Positivt argontrykk må opprettholdes først fra naftalen kalium kolben til sylinderen og deretter fra sylinderen til reaksjonskolben for å unngå luft / vann forurensning.
    16. Sett inn en annen nål fra manifoLD inn i sylinderen (argon). Fjerne kanylen koblet til destillasjonssystemet forsiktig og sette inn raskt inn i reaksjonskolben.
      MERK: Bruk denne teknikken for overføring av base og monomer.
    17. Tilsett basen dråpevis inntil oppløsningen blir mørk. Etter den langsomme forsvinningen av farger, legge til en annen del til den mørke fargen vises igjen, og gjenta til full overføring.
    18. Overfør det ønskede volum av monomer (V PheGE = 5 ml) for å nå en polymerisasjonsgrad på PPheGE ~ n = 18-20.
    19. La reaksjonsblandingen i 48 timer ved 80 ° C under argonatmosfære med konstant omrøring for å sikre fullstendig polymerisering.
    20. Stans reaksjonen ved tilsetning av dråper av HCl 1 N i metanol (målt ved hjelp av lakmuspapir (nøytral pH)) og observert av en farge forsvant.
    21. Ekstraher den naftalen fra DMSO-oppløsning med heksan (3 x 50 ml). Ta ut DMSO ved destillasjon under vakuum ~ 70 ml (samme apparat). Cool ned oppslemmingen løsning og tilsett 50 ml THF.
    22. Fjerne saltet fra slammet oppløsningen ved sentrifugering ved 5000 xg i 10 min. Overfør supernatanten, og tilsett dråpevis til 500 ml kald dietyleter.
    23. Oppsamle bunnfallet ved filtrering eller sentrifugering (gjentas to ganger) og tørk under vakuum ved 30 ° C i 24-48 timer (utbytte 85%).
      MERK: Kopolymeren er nå klar for karakterisering.

    5. Karakterisering av kopolymerene

    1. Vei 5-10 mg copolymer (rekord selve massen) i en aluminiumsprøve panne og forsegle hermetisk med aluminium lokk. Belastning prøveskål og referanse pan (tom) inn i kalorimeter.
    2. Program en metode ( "varme / kjøle / varme") syklus: 1) varme fra 40 ° C til 100 ° C ved 10 ° C / min, 2) avkjøles til -70 ° C ved 10 ° C / min, 3) varme til 100 ° C ved 10 ° C / min. Gjenta 2) og 3) to ganger. Bestem smeltepunkt (T m), krystallization (T c) og glassovergangstemperatur (T g), og smeltevarme (AH f) fra term spor fra den tredje syklus (hvis aktuelt).
    3. Oppløse polymerene i THF (2 mg / ml) og filtrer gjennom et 0,2 um filter PTFE. Injiser prøve inn i en gelpermeasjonskromatografi system (50 ul), og bruk oppholdstiden for prøven og en kalibreringskurve fremstilt ved å bruke et utvalg av polystyren-standarder for å bestemme molekylvekten av polymeren. 19
    4. Oppløse (ko) polymerer (15 mg / ml) i d6-DMSO for 1H NMR-spektroskopi-analyse. 19
    5. Bestemme den kritiske micellekonsentrasjon (CMC) av kopolymeren ved hjelp av 1,6-difenyl-1,3,5-heksatrien (DPH) som en fluorescerende probe. 9
      1. Fremstille en DPH stamløsning i THF (2,32 mg / l) i mørket, og tilsett 100 ul av denne lagerløsning til hver av en rekke ampuller.
      2. behandling anleggre en kopolymer stamløsning i THF og tilsett porsjoner av samme volum (2 ml) til rekken av flasker (som hver inneholder en delmengde av DPH stamløsning) som resulterer i endelige kopolymer-konsentrasjoner som varierer fra 0,01 til 1000 ug kopolymer / ml.
      3. Deretter ble vortex kopolymer-DPH løsninger og tilsett dråpevis til 10 ml med dobbeltdestillert vann med rørestav. Løsningene må deretter kraftig omrørt i mørke i 48 timer under en strøm av nitrogen for å tillate langsom fordamping av THF. Den endelige konsentrasjonen av DPH i hver løsning er 0,232 mg / l.
      4. Mål fluorescens utslipp av prøvene ved 430 nm (λ ex = 350 nm) ved hjelp av en dual-skanning mikro spektrofluorometer og tomten fluorescens versus log [polymer]. Skjæringspunktet mellom de to lineære bakkene gir CMC verdi for copolymer.

    6. Prosedyre for Legge Doxorubicin inn BCMS

    1. Løs opp 12 mg av DOX i 1 ml esstonitrile, tilsett 10 mL av trietylamin og la løsningen røre i mørket i 2 timer.
    2. Oppløs copolymer (45 mg) i 1 ml THF og røre for samme periode. Tilsett kopolymeroppløsningen til DOX og skyll hetteglasset rest kopolymer med et ekstra volum av THF (0,5 ml).
    3. Tilsett-kopolymer-medikamentblanding (2,5 ml) dråpevis til en ampulle (20 ml) inneholdende 15 ml saltvann 0,9% (NaCl) med omrøring.
    4. Overfør løsningen til en dialysepose (3,5 kDa avskåret) og dialyser mot saltvann 0,9% (500 ml).
      MERK: Endre eksterne saltvann etter 6 timer og la dialyse fortsette i 24 timer under omrøring i mørket ved RT.
    5. Overfør dialysatet til et 50 ml rør og sentrifuger ved 5000 xg i 15 min.
    6. Overfør supernatanten til en ultrafiltreringssystem (med en kapasitet på 10 ml) som inneholder en dialysemembran (størrelsesgrense 10 kDa). Sett røring adapteren i ultrafiltreringssystem, lukke lokket og åpne for såtream av nitrogen.
    7. Konsentrer BCM løsningen til et volum på 4 ml og tilsett 6 ml frisk saltvann og gjenta prosedyren to ganger.
    8. Konsentrer BCM løsning til 4 ml, skyll kammeret med 0,5 ml saltvann og legge til løsningen. Lagres i brune ampuller ved RT i mørke før videre bruk.

    7. Evaluering av doxorubicin Lasting i DOX-BCMS

    1. Oppløs DOX-BCM i dimetylformamid (100 ul i 400 ul) for å forstyrre micellene og fortynnet i vandig HCl-oppløsning (0,1 N) før bedømmelse (100 ul i 900 ul HCl 0,1 N).
    2. Mål medikamentbelastning på 490 nm ved hjelp av en benkeplate Bøk mikro spektrofotometrisk system. Bruk følgende ligninger for å bestemme stoffet lastekapasitet (DLC) og narkotika lasteeffektivitet (DLE):
      DLC (vekt%) = (vekt av medikament lastet / totalvekt BCMS) x 100%
      DLE (%) = (vekt av medikament lastet / vekt av medikament i mate) x 100%

    8. Evalueringav In Vitro Offentliggjøring av DOX fra DOX-BCMS

    1. Teste frigjøring av DOX fra BCMS ved 37 ° C i 0,1 M fosfat-bufret saltløsning (PBS, pH 7,4) mot PBS pH 7,4 inneholdende 0,1% (w / v) Tween 80, BCMS + BSA (50 mg / ml) mot PBS pH 7,4 og 0,1 M acetat-buffer ved pH = 5,5. 20,21
    2. Fortynn BCM-DOX preparatet (700 ul) i den valgte buffer (2,3 ml) for å resultere i en total mengde på ≈ 0,6-0,7 mg DOX i dialyseposen.
    3. Plasser løsningen i dialyse bag, forsegle med klipp og senk posen i 200 ml de respektive eksterne medier.
    4. Fjern 2 ml av oppløsningen utsiden av dialyseposen på forutbestemte tidspunkter og erstatte med det samme volum av frisk buffer.
    5. Lagre alikvotene ble fjernet ved -20 ° C før analyse ved UV-Vis-spektrofotometri (ABS 490 nm). Den kumulative prosentandelen av medikament frigjort (E r) kan beregnes ved hjelp av følgende ligning:
      "Equation1" MERK: hvor m DOX representerer mengden av DOX i BCMS, V 0 er det totale volumet av frigjøringsmediet (200 ml), V t er volumet av de utskiftede media (V t = 2 ml), er Ci konsentrasjonen før korreksjon, og C n representerer konsentrasjonen av DOX i prøven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3
Figur 3. Illustrasjon av den anioniske polymerisasjon av fenylglycidyleter med mPEG macroinitiator for å produsere MPEG-b - (PheGE) 15 for fremstilling av blokk-kopolymer miceller for lasting av doksorubicin Den skjematisk illustrerer deprotonering av hydroksylgruppen av mPEG ved hjelp av naftalen kalium. som en radikal-anion, etterfulgt av polymerisering av fenylglycidyleter (PheGE) monomer. Representant transmisjonselektronmikroskopi bilde (TEM) av BCMS farget med uranylacetat (1% w / v) og størrelsesfordeling av miceller som bestemmes av dynamisk lysspredning (DLS). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

figur 3, ble anionisk polymerisasjon av fenylglycidyleter med mPEG macroinitiator anvendes for å fremstille blokk-kopolymer miceller (DOX-MPEG-b - (pHGE) 15 for innfanging av doxorubicin En smal molekylvektfordeling for MPEG-b -. (pHGE) 15 kopolymer ble bekreftet ved hjelp av GPC (PDI = 1,03) og graden av polymerisering ble bestemt ved 1H-NMR-analyse (figur 4) [σ = 7,2 ppm (m , 2 H meta, fenyl 2 (= CH -)), σ = 6,8 ppm (d, 3H, to orto- og para 1 (- CH -), σ = 3,95 ppm (m, 2H, O- CH2-CH-) ] med metyl-endegruppe av mPEG brukt som en referansetopp (σ = 3,22 ppm (s, 3H).

Figur 4
Figur 4. Karakterisering og analyse. A) GPC-analyse av mPEG og kopolymeren i THF. B) en H-NMR spektra av mPEG5K (øvre spekteret) og MPEG-b -. (PheGE) 15 (nedre spekteret) i d6-DMSO Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1. Egenskaper av kopolymeren.

I vandige media, amfifile blokk-kopolymerer slik som MPEG-b - (PheGE) 15 sammen for å danne miceller som består av en hydrofob kjerne omgitt av et hydrofilt skall. CMC av kopolymeren ble målt ved anvendelse av en etablert metode fluorescens. CMC av MPEG-b - (PheGE) 15 var fast bestemt på å være ~ 9 mikrogram / ml (Figur 5A innfelt). Overføring elektronisk mikroskopi bekreftet en sfærisk morfologi for copolymer aggregater og dermed dynamisklysspredning (figur 3 og tabell 2) ble anvendt for å vurdere den hydrodynamiske diameter (D h ~ 25 nm). Som vist i figur 6-en, ble L929 muse-fibroblastceller utsatt for MPEG-b - (pHGE) 15 BCMS og ingen cytotoksisitet ble observert etter 24 timers inkubasjonstid.

Figur 5
Figur 5. fluorescens intensitet og CMC karakterisering. A) Plot av fluorescensintensiteten av DPH som en funksjon av konsentrasjon av MPEG-b - (Phe) 15 blokk-kopolymer. Innfelt viser tidlig stadium av aggregering av blokk-kopolymeren på 0,1-10 ug / ml. B) Plot av CMC verdier hentet fra litteraturen for en rekke kopolymerer med pendant fenylgrupper på den kjernedannende blokk. Røde firkanter representerer de beregnede verdier for Gibbs energi av musllization av de tilsvarende kopolymerer (± 0,5 kJ / mol). 22,25-28 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 2
Tabell 2. Karakterisering av de BCMS fremstilt ved dialysefremgangsmåten.

Solubilisering av medikament i BCMS påvirkes av den vandige løseligheten av medikamentet, så vel som den tilbøyelighet for interaksjonen mellom medikamentet og i seg selv og / eller kjernedannende blokk av micellene. I sin saltform, er DOX relativt oppløselig (~ 10 mg / ml) i vann. Således kan for lasting inn i BCMS, ble DOX oppløst i acetonitril og nøytralisert med TEA for å oppnå den frie base (3 ekv.). Med en pKa på 8,5, blir DOX relativt uløselig under basiske betingelser kjøre innkapsling i BCMS med stabiliseringsjonen av π-rc stabling interaksjoner (MPEG-b - (pHGE) 15). Som beskrevet i litteraturen, tilsvarende lastekapasitet for DOX i DOX-MPEG b -. (PHGE) 15 er rapportert med en gjennomsnittsverdi på 14% (w / w) 21-24 Etter ultrafiltrering, ble det funnet at copolymer konsentrasjoner så lav som 10 mg / ml med hell oppløst opp til 1,6 mg DOX / ml. Stoffet lasteeffektivitet var opp til 52% (vekt / vekt) for den MPEG-b - (pHGE) 15 BCMS (tabell 2). Frigjøringsprofilene av DOX fra BCMS i ulike medier ble undersøkt (figur 6c).

Figur 6
Figur 6. cytotoksisitet og medikamentfrigjøringskinetikk. A) Evaluasjon av cytotoksisitet i L929-mus-fibroblastceller av MPEG-f -. (PheGE) 15 copolymer miceller som bestemmes ved bruk av MTS-analysen etter en 24-timers inkuberingsperiode (n = 3 individuelle eksperimenter, SD <10%) b) Normalisert emisjonsspektra fri DOX og DOX-lastet miceller i PBS, pH 7,4 ved 10 ug / ml DOX konsentrasjon. Eksitasjonsbølgelengden er 480 nm og emisjonsspektrumet blir samlet fra 500-700 nm C) Produkt profiler av DOX fra blokken MPEG b -. (PHGE) 15 copolymer miceller (firkanter) i PBS 0,1 M pH 7,4 (sirkler) i PBS 0,1 M pH 7,4 inneholdende BSA 50 mg / ml (i posen) og (triangler) i acetat-Na + buffer 0,1 M pH 5,5 og (ned trekanter) fritt DOX (n = 2) i PBS pH 7,4. (for hver tilstand, n = 3 individuelle eksperimenter, SD <10%). Klikk her for å se en større versjon av denne figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På grunn av den gode kontroll som anionisk polymerisering gir over molekylvekt er det en av de mest anvendte prosesser i industrien for fremstilling av polymerer basert på oksiran monomerer (PEG og PPG). Optimale og strenge vilkår må brukes for vellykket polymerisasjon skal oppnås. Streng rensing av alle reagenser og passende apparat er avgjørende for den levende karakter av syntesen. Begrensninger av dagens oppsett er for det meste knyttet til overføringsteknikk som er avhengig av kanylering. Ved hjelp av riktig trykk, er cannulation en trygg laboratorieskala teknikk for den faglige innstillingen. Bruk av disse forholdsreglene vil gi bedre reproduserbarhet og kontroll under polymerisasjonsprosessen (lav PDI). Dessuten kan disse overførings og rensemetoder brukes for fremstilling av kopolymerer som MPEG b -PCL, MPEG b -PLLA, og MPEG-b siders. 19,29 Men denne praktiske procedure kan ikke være tilstrekkelig for polymerisasjon av noen monomerer som krever strengere vilkår (f.eks styren). Alternativt er break-forsegling teknikk vanligvis foretrukket for anioniske polymerisasjon. 30 For å kontrollere disse trinnene i bransjen, er tilsvarende systemer (rustfritt / glass) som er koblet til hverandre via hermetiske ventiler.

For oksiran monomerer, er den generelle mekanisme et nukleofilt angrep av oxyanion (fri ion eller ionepar) i oksiranringen, noe som fører til ringåpningspolymeriseringen. Imidlertid, avhengig av naturen av substituerte oksiran monomerer, enkelte monomerer kan ikke polymerisere eller de kan ikke polymeriseres til høy molekylvekt. Denne type polymerisasjon tolererer ikke sure eller basiske komponenter, inklusive monomeren i seg selv, oppløsningsmidlet eller andre arter som fører til termineringsreaksjoner og / eller kjedeoverførings i mediet (tap av kontroll av reaksjonen). For å fremstille et PEGylert blokk-kopolymer som bærer fenvlgrupper ved anionisk polymerisasjon, kan alternativer til fenylglycidyleter monomer funnet: styren, styrenoksyd eller allylglysidyleter, etterfulgt av en radikal Michael reaksjon av benzylmerkaptan er alternativer. mPEG kan fremstilles ved kondensasjon av etylenoksyd monomer og deretter polymerisert under de samme betingelser som er beskrevet i denne artikkelen, ved hjelp av en hydroksylert initiator (f.eks, metanol). Imidlertid mPEG av varierende molekylvekter med lav PDI er tilgjengelig kommersielt.

For å unngå at vann rest, den macroinitiator (f.eks mPEG-OH) må være godt tørket ved forhåndstørking i en ovn, etterfulgt av varmepistol tørkingsprosedyren. Reaksjonene kan utføres i polare aprotiske løsningsmidler, koordinerende løsningsmidler, eller i bulk. Når polymeriseringen krever spesielle forhold, for eksempel høy temperatur, må løsningsmidler med en sterkere polaritet enn THF anvendes, slik som DMSO, diglym eller HMPA. Som beskrevet i protokollen (seksjon 4 2) kreves. DMSO er hygroskopisk og hvis destillasjon ikke er vel utført, kan spor av vann inaktivere de aktive arter. Andre oppløsningsmidler kan anvendes, men DMSO har en høy solvatiserende evne for kationer, lav solvatiserende evne for anioner og gjør det mulig for høytemperatur-polymerisasjon. 31,32 DMSO er et utmerket oppløsningsmiddel for basekatalysert polymerisasjon av epoksyder og olefiner med sterkt elektrontiltrekkende substituenter. Initiering av polymeriseringen kan oppnås ved in situ dannelse av kalium-alkoksyd-initiatorer ved titrering av mPEG-OH med en fortynnet løsning av kalium-naftalen. 33 er det viktig å nøye fremstille løsning av kalium-naftalen og for å titrere oppløsningen med syre før bruken. Faktisk, dersom konsentrasjonen av kalium-naftalen er under- eller overvurdert, kan macroinitiator danner aggregater eller mislykkes i å fullstendig aktivereinitiator og i sin tur kan være kompromittert polymerisasjonen. Når kaliumnaftalen tilsettes dråpevis, gir den langsomme forsvinning av farge visuell kontroll over forbruk av basen av initiatoren. Under disse betingelser sikrer hurtig protonutvekslingen mellom de hydroksylgrupper (latent) og alkoksyder (aktive) en kontrollert polymerisering av monomeren. 13

Aggregeringen oppførsel av blokk-kopolymerer med lignende sammensetning til MPEG 122 - B -. (PHGE) 15 har blitt undersøkt av flere grupper med rapporterte CMC-verdier varierende fra 1 til 10 ug / ml 25,27,28,34-36 CMC verdier for en spesifikk kopolymer kan variere avhengig av den spesielle metode som anvendes for bestemmelse. I denne studien ble en fluorescens-basert metode som anvendes sammen med DPH valgt som sonden gitt at den kun resulterer i en fluorescens-signal når innarbeidet i BCMS (figur 5A innfelt). Figur 5Binneholder CMC-verdier oppnådd for forskjellige blokk-kopolymerer med pendant fenylgrupper. Som vist, varierer de CMC-verdier av kopolymerene avhengig av naturen av polymerryggraden bærer fenylgruppene og graden av polymerisering. 25,27,28,34-36 Utvekslingen av kopolymerkjedene mellom micellene og det eksterne medium avhenger tilstanden til micellen kjernen så vel som den Flory-Huggins interaksjonsparameter mellom de to blokkene og oppløsningsmidlet. Glassovergangstemperatur (T g) av bulk PPheGE homopolymer er kjent for å være lavere enn den for bulk PS. 37 På grunn av den glassaktige natur av PS, kopolymerer med en høy grad av polymerisering av PS (n> 35) har en glassaktig kjerne ved RT (T g ~ 80 ° C). 38

Termodynamisk er to hovedmetoder blitt lagt frem for å beskrive micellization prosessen, nemlig faseseparasjon modellen (faseseparasjon ved CMC), og den masse-handling-modellen (association-dissosiasjon likevekt micelle / unimers). 39 I henhold til begge metoder, standard Gibbs energi endring (ΔG ◦) for overføring av ett mol av amfifilt stoff fra oppløsningen til den micellære fase (ΔG fri energi av micellization), i fravær av elektrostatiske interaksjoner, er gitt ved ΔG = RT ln (CMC). 39 Som vist i figur 5B, verdiene for CMC og ΔG er i overensstemmelse med verdiene oppnådd for kopolymerer som er like i sammensetning (i form av total kopolymer M W og forholdet mellom hydrofobe å hydrofil blokklengde) til MPEG-b - (pHGE) 15. som vist i tabell 1, DSC-analyse av den MPEG-b - (pHGE) 15 kopolymer bulkmateriale bekreftet et enkelt T m ved 51 ° C, noe som skyldes den hydrofile blokken og er trykket ned i forhold tilmPEG alene (60 ° C). I oppløsning, er det antatt at kjernene i MPEG-b -ps kopolymer-miceller, med polystyren-blokker av lik lengde som i pHGE i MPEG-b - (pHGE) 15, begynner å bli mobil ved fysiologisk temperatur (dvs, 37 ° . C) 38,40 Derfor er MPEG-b - (pHGE) 15 BCMS sannsynlig ha en relativt mobil kjerne som muliggjør lokal bevegelse i rom og fysiologiske temperaturer.

I denne studien dialyse og ultrafiltrering ble brukt som en praktisk måte for å fjerne fritt medikament og for å øke konsentrasjonen av medikament / polymer for etterfølgende in vivo-anvendelser. Alternativt kan frysetørking anvendes for å konsentrere formuleringen; Men dette krever optimalisering inkludert eventuell tilsetning av stabilisatorer (f.eks PEG, druesukker) for å bedre fukting for tilberedning. Den resulterende DOX-MPEG b - (pHGE) 15 BCMS viste lignende sustained frigjøringsprofiler (PBS 7,4) til BCM systemer utviklet av Kataoka og medarbeidere. 21 i PBS ved pH 7,4, ble mindre enn 10% av det totale medikament frigjort i løpet av seks timer, mens mer enn 95% av fritt DOX frigjøres fra dialyse bag innenfor samme tidsperiode. Vedvarende frigivelse ved nøytral pH-verdi indikerer god stabilitet av formuleringen i løpet av den fire dagers periode.

Humant blodserum består av ca. 7% protein, to tredjedeler av disse er albumin. 41 Derfor, for å simulere in vivo betingelser medikamentfrigjøring er vanligvis evaluert i bufferløsninger inneholdende fysiologisk relevante konsentrasjoner av dette proteinet. I den foreliggende undersøkelse, ble BSA innbefattet i dialyseposen ved en konsentrasjon på 50 mg / ml. I nærvær av albumin, frigjøring av DOX fra BCMS økes til ca. 30% etter 4 dagers inkubering ved 37 ° C. Offentliggjøring av DOX fra BCMS i buffer ved pH 5,5 bekreftet at protonation av DOX under disse betingelser resulterer i en økning i medikamentfrigjøring etter 72 timer, og dette øker opp til 60% etter 4 dager. Alt i alt, de resulterende DOX-BCMS har vist lovende resultater in vitro, lignende eller tilsvarende andre BCM formuleringer av DOX som er presentert i litteraturen, og således fremme ytterligere vurdering in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/HAMF12 Gibco, Life Technologies 12500 Supplemented with 10% FBS. Warm in 37 °C water bath.
Trypsin-EDTA (0.25%) Sigma-Aldrich T4049 Warm in 37 °C water bath
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F1051 Canada origin
MDA-MB-468 cell line ATCC HTB-132
MTS tetrazolium reagent PROMEGA G111B
Phenazine ethosulfate (PES) Sigma-Aldrich P4544 >95%
mPEG5K (Mn 5,400 g/mol) Sigma-Aldrich 81323 PDI=1.02
Dimethylsolfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540 >99.5%
Naphthalene Sigma-Aldrich 147141 >99%
Phenyl glycidyl ether Sigma-Aldrich A32608 >85%
Benzophenone Sigma-Aldrich 427551 >99%
Potassium Sigma-Aldrich 451096 >98%
Tetrahydrofuran Caledon Laboratory Chemicals 8900 1 ACS
Hexane Caledon Laboratory Chemicals 5500 1 ACS
Calcium hydride (CaH2) ACP C-0460 >99.5%
Diethyl Ether Caledon Laboratory Chemicals 1/10/4800 ACS
Microplate reader BioTek Instruments
Differential scanning calorimetry (DSC) TA Instruments Inc DSC Q100
Gel permeation chromatography (GPC) Waters 2695 separation moldule / 2414 detector  2 Columns: Agilent Plgel 5 µm Mixed-D
NMR spectroscopy Varian Mercury 400MHz
Chloroform-d Sigma-Aldrich 151858 99.96%
DMSO-d Sigma-Aldrich 156914 99.96%
Vaccum pump Gardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc. Ultimate pressure 1x10-4 torr
Drierit with indicator, 8 mesh Sigma-Aldrich 238988 Regenerated at 230 °C for 2 hr

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dickerson, T. J., Reed, N. N., Janda, K. D. Soluble Polymers as Scaffolds for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102, 3325-3344 (2002).
  2. van Heerbeek, R., Kamer, P. C. J., van Leeuwen, P. W. N. M., Reek, J. N. H. Dendrimers as Support for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102, (10), 3717-3756 (2002).
  3. Knop, K., Hoogenboom, R., Fischer, D., Schubert, U. S. Poly(ethylene glycol) in Drug Delivery: Pros and Cons as Well as Potential Alternatives. Angewandte Chemie International Edition. 49, (36), 6288-6308 (2010).
  4. Eetezadi, S., Ekdawi, S. N., Allen, C. The challenges facing block copolymer micelles for cancer therapy: In vivo barriers and clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 91, 7-22 (2015).
  5. Attwood, D., Booth, C., Yeates, S. G., Chaibundit, C., Ricardo, N. Block copolymers for drug solubilisation: Relative hydrophobicities of polyether and polyester micelle-core-forming blocks. International Journal of Pharmaceutics. 345, (1-2), 35-41 (2007).
  6. Matsumura, Y., Kataoka, K. Preclinical and clinical studies of anticancer agent-incorporating polymer micelles. Cancer Science. 100, (4), 572-579 (2009).
  7. Chan, A. S., Chen, C. H., Huang, C. M., Hsieh, M. F. Regulation of particle morphology of pH-dependent poly(epsilon-caprolactone)-poly(gamma-glutamic acid) micellar nanoparticles to combat breast cancer cells. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 10, (10), 6283-6297 (2010).
  8. Diao, Y. Y., et al. Doxorubicin-loaded PEG-PCL copolymer micelles enhance cytotoxicity and intracellular accumulation of doxorubicin in adriamycin-resistant tumor cells. International Journal of Nanomedicine. 6, 1955-1962 (2011).
  9. Mikhail, A. S., Allen, C. Poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) Micelles Containing Chemically Conjugated and Physically Entrapped Docetaxel: Synthesis, Characterization, and the Influence of the Drug on Micelle Morphology. Biomacromolecules. 11, (5), 1273-1280 (2010).
  10. Kataoka, K., Harada, A., Nagasaki, Y. Block copolymer micelles for drug delivery: design, characterization and biological significance. Advanced Drug Delivery Reviews. 47, (1), 113-131 (2001).
  11. Nakanishi, T., et al. Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. Journal of Controlled Release. 74, (1-3), 295-302 (2001).
  12. Liu, J., Xiao, Y., Allen, C. Polymer-drug compatibility: A guide to the development of delivery systems for the anticancer agent, ellipticine. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93, (1), 132-143 (2004).
  13. Flory, P. J. Molecular Size Distribution in Ethylene Oxide Polymers. Journal of the American Chemical Society. 62, (6), 1561-1565 (1940).
  14. Kazanskii, K. S., Solovyanov, A. A., Entelis, S. G. Polymerization of ethylene oxide by alkali metal-naphthalene complexes in tetrahydrofuran. European Polymer Journal. 7, (10), 1421-1433 (1971).
  15. Crothers, M., et al. Micellization and Gelation of Diblock Copolymers of Ethylene Oxide and Styrene Oxide in Aqueous Solution. Langmuir. 18, (22), 8685-8691 (2002).
  16. Taboada, P., et al. Block Copolymers of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether: Micellization, Gelation, and Drug Solubilization. Langmuir. 21, (12), 5263-5271 (2005).
  17. Taboada, P., et al. Micellization and Drug Solubilization in Aqueous Solutions of a Diblock Copolymer of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether. Langmuir. 22, (18), 7465-7470 (2006).
  18. Attwood, D., Booth, C. Colloid Stability. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 61-78 (2010).
  19. Le Devedec, F., et al. Postalkylation of a Common mPEG-b-PAGE Precursor to Produce Tunable Morphologies of Spheres, Filomicelles, Disks, and Polymersomes. ACS Macro Letters. 5, (1), 128-133 (2016).
  20. Chtryt, V., Ulbrich, K. Conjugate of Doxorubicin with a Thermosensitive Polymer Drug Carrier. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 16, (6), 427-440 (2001).
  21. Kataoka, K., et al. Doxorubicin-loaded poly(ethylene glycol)-poly(β-benzyl-l-aspartate) copolymer micelles: their pharmaceutical characteristics and biological significance. Journal of Controlled Release. 64, (1-3), 143-153 (2000).
  22. Cammas, S., Matsumoto, T., Okano, T., Sakurai, Y., Kataoka, K. Design of functional polymeric micelles as site-specific drug vehicles based on poly (α-hydroxy ethylene oxide-co-β-benzyl l-aspartate) block copolymers. Materials Science and Engineering: C. 4, (4), 241-247 (1997).
  23. Lv, S., et al. Doxorubicin-loaded amphiphilic polypeptide-based nanoparticles as an efficient drug delivery system for cancer therapy. Acta Biomaterialia. 9, (12), 9330-9342 (2013).
  24. Kim, J. O., Oberoi, H. S., Desale, S., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Polypeptide nanogels with hydrophobic moieties in the cross-linked ionic cores: synthesis, characterization and implications for anticancer drug delivery. Journal of Drug Targeting. 21, (10), 981-993 (2013).
  25. Zhao, C. L., Winnik, M. A., Riess, G., Croucher, M. D. Fluorescence probe techniques used to study micelle formation in water-soluble block copolymers. Langmuir. 6, (2), 514-516 (1990).
  26. Wilhelm, M., et al. Poly(styrene-ethylene oxide) block copolymer micelle formation in water: a fluorescence probe study. Macromolecules. 24, (5), 1033-1040 (1991).
  27. Cammas, S., Kataoka, K. Functional poly[(ethylene oxide)-co-(β-benzyl-L-aspartate)] polymeric micelles: block copolymer synthesis and micelles formation. Macromolecular Chemistry and Physics. 196, (6), 1899-1905 (1995).
  28. Kwon, G., et al. Micelles based on AB block copolymers of poly(ethylene oxide) and poly(.beta.-benzyl L-aspartate). Langmuir. 9, (4), 945-949 (1993).
  29. Ahmed, F., Discher, D. E. Self-porating polymersomes of PEG-PLA and PEG-PCL: hydrolysis-triggered controlled release vesicles. Journal of Controlled Release. 96, (1), 37-53 (2004).
  30. Uhrig, D., Mays, J. W. Experimental techniques in high-vacuum anionic polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 43, (24), 6179-6222 (2005).
  31. Parker, A. J. The effects of solvation on the properties of anions in dipolar aprotic solvents. Quarterly Reviews, Chemical Society. 16, (2), 163-187 (1962).
  32. Cram, D. J. Fundamentals o] Carbanion Chemistry. (1965).
  33. Szwarc, M. ACS Symposium Series. 166, American chemistry society. 1-15 (1981).
  34. Cho, Y. W., Lee, J., Lee, S. C., Huh, K. M., Park, K. Hydrotropic agents for study of in vitro paclitaxel release from polymeric micelles. Journal of Controlled Release. 97, 249-257 (2004).
  35. Dewhurst, P. F., Lovell, M. R., Jones, J. L., Richards, R. W., Webster, J. R. P. Organization of Dispersions of a Linear Diblock Copolymer of Polystyrene and Poly(ethylene oxide) at the Air−Water Interface. Macromolecules. 31, (22), 7851-7864 (1998).
  36. Opanasopit, P., et al. Block Copolymer Design for Camptothecin Incorporation into Polymeric Micelles for Passive Tumor Targeting. Pharmaceutical Research. 21, (11), 2001-2008 (2004).
  37. Allen, G., Booth, C., Price, C. VI-The physical properties of poly(epoxides). Polymer. 8, 414-418 (1967).
  38. Jada, A., Hurtrez, G., Siffert, B., Riess, G. Structure of polystyrene-block-poly(ethylene oxide) diblock copolymer micelles in water. Macromolecular Chemistry and Physics. 197, (11), 3697-3710 (1996).
  39. Attwood, D., Florence, A. T. Surfactant systems : their chemistry, pharmacy, and biology. Chapman and Hall. (1983).
  40. Rekatas, C. J., et al. The effect of hydrophobe chemical structure and chain length on the solubilization of griseofulvin in aqueous micellar solutions of block copoly(oxyalkylene)s. Physical Chemistry Chemical Physics. 3, (21), 4769-4773 (2001).
  41. Encyclopædia Britannica Online. http://www.britannica.com/EBchecked/topic/479680/protein/72559/Proteins-of-the-blood-serum (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics