श्रवण Hei-OC1 कोशिकाओं के साथ काम

Biology

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Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with Auditory HEI-OC1 Cells. J. Vis. Exp. (115), e54425, doi:10.3791/54425 (2016).

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Abstract

Introduction

कोर्टी 1 की सभा कान संस्थान अंग (Hei-OC1) कोशिकाओं एक ट्रांसजेनिक माउस 1,2 के श्रवण अंग से निकाली गई है। 33 डिग्री सेल्सियस / 10% सीओ 2 (अनुमोदक की स्थिति) पर इस ट्रांसजेनिक माउस से किसी भी सेल की ऊष्मायन एक immortalizing जीन है कि चलाता de-भेदभाव और त्वरित प्रसार की अभिव्यक्ति लाती है; 39 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 (गैर अनुमोदक की स्थिति) का नेतृत्व प्रसार, भेदभाव में कमी आई है और कम से कम Hei-OC1, कोशिका मृत्यु 2,3 के मामले में, के लिए कोशिकाओं बढ़ रहा है।

Hei-OC1 कोशिकाओं क्लोन और एक दशक पहले हमारी प्रयोगशाला में विशेषता थे, और प्रारंभिक अध्ययनों से संकेत दिया है कि वे इस तरह के prestin, मायोसिन 7a, Atoh1, BDNF, Calbindin और calmodulin के रूप में कर्णावत बालों की कोशिकाओं, के विशिष्ट मार्कर, लेकिन यह भी समर्थन करने का मार्करों व्यक्त connexin 26 और fibroblast वृद्धि कारक रिसेप्टर (FGF-R) 2 कोशिकाओं की तरह। इसलिए, यह सुझाव दिया गया था कि Hei-OC1 एक commo का प्रतिनिधित्व कर सकताकोर्टी 2 के अंग का संवेदी और समर्थन कोशिकाओं के लिए N पूर्वज। समानांतर पढ़ाई के मजबूत सबूत है कि सिस्पैटिन, जेंटामाइसिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन इन कोशिकाओं में प्रेरित कस्पासे 3 सक्रियण जैसी ototoxic दवाओं ठेठ है, बशर्ते जबकि दवाओं गैर ototoxic माना जाता है, पेनिसिलिन की तरह, 2,3 नहीं किया। इसलिए, इस सेल लाइन इन विट्रो प्रणाली ototoxicity में और संभावित ototoxicity या नए औषधीय दवाओं के otoprotective संपत्तियों की जांच के लिए शामिल सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच करने के रूप में प्रस्तावित किया गया था। यह अनुमान है कि Hei-OC1 कोशिकाओं पिछले दस वर्षों में प्रकाशित एक से अधिक एक सौ और पचास के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है।

जबकि विभिन्न दवाओं के संभावित समर्थक apoptotic प्रभाव पर विचार कर रही इस सेल लाइन को शामिल अध्ययन के सबसे का प्रमुख लक्ष्य था, भोजी और वार्धक्य जैसे अन्य महत्वपूर्ण सेल प्रक्रियाओं सिर्फ Hei-OC1 कोशिकाओं 4-7 में जांच की जा शुरू कर दिया है। मैंna हमारी प्रयोगशाला 8 से हाल के एक अध्ययन में, हम Hei-OC1 कोशिकाओं का इस्तेमाल किया कोशिका मृत्यु, अस्तित्व, प्रसार, वार्धक्य और भोजी विभिन्न औषधीय दवाओं अक्सर क्लिनिक में इस्तेमाल से प्रेरित बारे में डेटा की एक व्यापक सेट इकट्ठा करने के लिए। हम यह भी (मानव उपकला कोशिकाओं) HEK-293 (मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं) और हेला से उन लोगों के लिए समान उपचार प्राप्त करने के साथ Hei-OC1 कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं में से कुछ की तुलना में। हमारे परिणाम संकेत दिया कि Hei-OC1 कोशिकाओं अध्ययन के तहत तंत्र के कम से कम एक के लिए एक विशिष्ट खुराक और समय पर निर्भर संवेदनशीलता के साथ एक विशेषता रास्ते में प्रत्येक दवा का जवाब है,। हम यह भी है कि अध्ययन है कि प्रयोगात्मक परिणामों की सही व्याख्या एक से अधिक तकनीक 8 के साथ समानांतर पढ़ाई के प्रदर्शन की आवश्यकता होगी में बल दिया।

एक अलग अध्ययन में हम Hei-OC1 कोशिकाओं के उपयोग की जांच की prestin के कार्यात्मक प्रतिक्रिया, कर्णावत बाहरी बालों की कोशिकाओं की मोटर प्रोटीन (OHCs) 9 मूल्यांकन करने के लिए + K + ATPase में कमी है, जो कुल सेल अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण परिवर्तन के बिना कोशिका द्रव्य के लिए प्लाज्मा झिल्ली से translocated के साथ सहसंबद्ध एनपी Hei-OC1 कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर prestin स्थानीयकरण में वृद्धि हुई है। इसके अलावा, हम दिखा दिया है कि पी-Hei-OC1 कोशिकाओं को एक मजबूत एनएलसी मोटर समारोह है, जो जब प्लाज्मा झिल्ली में उपस्थित prestin अणुओं के घनत्व में वृद्धि हुई कमी आई है prestin से जुड़े हुए है। कुल मिलाकर, इन परिणामों जोरदार Hei-ओसी की उपयोगिता का समर्थन1 कोशिकाओं श्रवण प्रोटीन की जांच करने के लिए।

इस वीडियो लेख में हम कैसे संस्कृति Hei-OC1 कोशिकाओं, क्यों यह cytotoxicity अध्ययन के लिए (पी-Hei-OC1) अनुमोदक की स्थिति में बढ़ कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है, कैसे दवा प्रेरित cytotoxicity और कैसे की व्यवस्था / एस का मूल्यांकन करने का वर्णन electrophysiological अध्ययन प्रदर्शन करने के लिए (जैसे, पैच दबाना, गैर रेखीय समाई (एनएलसी)) prestin, कर्णावत OHCs की आणविक मोटर के कार्यात्मक गुणों की जांच करने के लिए।

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Protocol

1. सेल संस्कृति

नोट: सभी सेल संवर्धन प्रोटोकॉल उचित सेल कल्चर तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए (: एक प्रयोगशाला हैंडबुक, खंड मैं 10 में संदर्भ के लिए सेल बायोलॉजी के पहले 3 अध्यायों देखें)। Hei-OC1 कोशिकाओं को किसी भी अतिरिक्त कोटिंग या उचित पालन और विकास के लिए सेल संस्कृति व्यंजन के इलाज की आवश्यकता नहीं है। बहुत महत्वपूर्ण: सेल संस्कृति प्रयोजनों के लिए कांच के बने पदार्थ व्यंजन का प्रयोग नहीं करते; phenotype और औषधीय दवाओं के लिए कोशिकाओं के जैविक प्रतिक्रिया (जी Kalinec एंड एफ Kalinec, अप्रकाशित) बदल जाएगा; पारंपरिक प्लास्टिक सेल संस्कृति व्यंजन सिफारिश कर रहे हैं (सामग्री / उपकरण की तालिका देखें)। सड़न रोकनेवाला तकनीक पर विशेष ध्यान देना संदूषण से बचने के लिए, लेकिन Hei-OC1 कोशिकाओं के साथ एंटीबायोटिक दवाओं (जैसे, एम्पीसिलीन या स्ट्रेप्टोमाइसिन) का उपयोग कभी नहीं। यदि आवश्यक हो, amphotericin बी का उपयोग हेला और HEK 293 कोशिकाओं Hei-OC1 8, किसी भी अन्य सेल लाइन सकता है के साथ पिछले अध्ययनों में नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया हैइस उद्देश्य के लिए स्वीकार्य हो।

  1. जमे हुए Hei-OC1 प्रकोष्ठों के पुनर्जीवन
    नोट: इस प्रोटोकॉल भी, इस तरह के OC-K3 के रूप में, हमारी प्रयोगशाला में विकसित कोर्टी 11,12 के अंग से ही ट्रांसजेनिक माउस, और एसवी-K1 से अन्य सेल लाइनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता हलकी लीक vascularis 13,14 से।
    1. तरल एन 2 से cryopreserved Hei-OC1 कोशिकाओं की एक शीशी निकालें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में जगह है। केवल शीशी के निचले आधे डूब, और जब तक ही बर्फ की एक छोटी राशि शीशी में रहता है यह पिघलना करने के लिए अनुमति देते हैं। 70% शराब के साथ शीशी के बाहर साफ कर लें।
    2. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार एक पूर्व गर्म मध्यम विकास के 10 मिलीलीटर युक्त Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम तरह ट्यूब में शीशी से कोशिकाओं पिपेट और पूरी मात्रा (~ 1.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल) धीरे-धीरे, ड्रॉप द्वारा ड्रॉप, उद्धार ( DMEM), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक।
    3. 5 मिनट के लिए 300-500 XG पर ट्यूब centrifuging द्वारा DMSO निकालें, टी discardingवह सतह पर तैरनेवाला और फिर से निलंबित ताजा मध्यम विकास (DMEM + 10% FBS) के 9 मिलीलीटर में कोशिकाओं। प्रवाह और निलंबित कोशिकाओं के भाटा के झुरमुटों या कोशिकाओं की चादरों disaggregate, मध्यम और उपाध्यक्ष विपरीत, पिपेट ट्यूब के नीचे छू की नोक के साथ तीन से चार गुना करने के लिए पिपेट से।
    4. 100 मिमी व्यास अनुपचारित, प्लास्टिक सेल संस्कृति बर्तन में मध्यम विकास में निलंबित कोशिकाओं की कुल मात्रा रखें।
    5. 10% सीओ 2 (अनुमोदक की स्थिति) के साथ 33 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  2. Hei-OC1 प्रकोष्ठों की उपसंस्कृति
    नोट: संगम के लिए प्रायर (~ 80%) कोशिकाओं आदेश संस्कृति मर रोकने के लिए निलंबन और उप-सुसंस्कृत में लाया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल भी अन्य सेल ऐसे OC-K3 के रूप में ही ट्रांसजेनिक माउस से हमारी प्रयोगशाला में विकसित लाइनों, कोर्टी 11,12, और एसवी-K1 के अंग से, के साथ प्रयोग किया जा सकता है, हलकी लीक से 13,14 vascularis।
    1. पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ पुराने मध्यम निकालें और धोने कोशिकाओं। </ Li>
    2. 0.25% trypsin के एक समाधान के साथ सेल monolayer कवर, प्रति सतह क्षेत्र के 25 सेमी 2 1 मिलीलीटर का उपयोग कर। अगले कदम कोशिकाओं के 40% से अधिक अलग किया जाना चाहिए पर स्थानांतरित करने के लिए। एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कोशिकाओं की जांच करने और, यदि आवश्यक हो तो, "थप्पड़ या नल" संस्कृति व्यंजन धीरे किसी भी शेष जुड़ी कोशिकाओं को रिलीज करने के लिए।
      नोट: लंबी अवधि के सेल मौत का कारण बन सकते हैं के लिए trypsinization के रूप में ख्याल रखना; पर्याप्त नहीं है और स्थानांतरित कर कोशिकाओं की योजना बनाई अध्ययन के लिए अपर्याप्त होगा।
    3. कोशिकाओं resuspend, प्रक्रिया 1.1.3 में वर्णित के बाद, और उन्हें एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण।
    4. 300-500 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, मध्यम त्यागने ताजा मध्यम विकास के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उन्हें बीज, कम से कम, चार 100 मिमी व्यास सेल संस्कृति व्यंजन। पकवान प्रति कोशिकाओं की संख्या बरामद कोशिकाओं की मात्रा पर निर्भर करेगा। 10% सीओ 2 (पी-Hei-OC1) के साथ 33 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं और के लिए आवश्यक के रूप में फिर से के रूप में कई बार विभाजितयोजना बनाई प्रयोगों या एक नया स्टॉक पैदा करने के लिए।
    5. शेयर तैयारी के लिए, 250-550 मिलीलीटर सेल संस्कृति बोतल से 100 मिमी व्यास व्यंजन की जगह; प्रयोगों के लिए, छोटे बर्तन या बहु कुओं प्लेटों अधिक पर्याप्त हो सकता है।
    6. भेदभाव के लिए, 80% संगम अनुमोदक की स्थिति में Hei-OC1 कोशिकाओं सेते हैं जब तक वे पहुँच ~; उसके बाद 2 से 3 सप्ताह के लिए 5% सीओ 2 (एनपी Hei-OC1) के साथ 39 डिग्री सेल्सियस के लिए व्यंजन चलते हैं।
      नोट: प्रकोष्ठों उत्तरोत्तर proliferating और मरने के बंद हो जाएगा। हर दूसरे दिन मध्यम बदलें मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए। कोशिकाओं की मूल संख्या पर निर्भर करता है, आम तौर पर ~ 4 ​​हफ्तों के बाद कोई और अधिक कोशिकाओं के प्रयोगों के लिए उपलब्ध हो जाएगा। भेदभाव जैसे ही कोशिकाओं एनपी की स्थिति में रखा जाता है शुरू होता है, लेकिन हर कोशिका में एक ही गति से अलग। महत्वपूर्ण बात है, भेदभाव प्रक्रिया के दौरान अभिव्यक्ति और झिल्ली स्थानीयकरण बढ़ जाती है prestin (प्रतिनिधि परिणाम देखते हैं, चित्रा 4), एक गुणात्मक उपलब्ध करानेऔर भेदभाव के स्तर के मात्रात्मक संकेत है।

2. ड्रग cytotoxicity अध्ययन

नोट: Hei-OC1 कोशिकाओं अनुमोदक की स्थिति (पी-Hei-OC1) से बढ़ी इन अध्ययनों (प्रतिनिधि परिणाम देखते हैं, चित्रा 1) के लिए सिफारिश कर रहे हैं।

  1. सेल व्यवहार्यता (MTT परख)
    1. प्रक्रिया 1.2 में वर्णित का पालन करते हुए पी Hei-OC1 कोशिकाओं को ले लीजिए, और या तो एक स्वचालित सेल काउंटर या hemocytometer साथ उन्हें गिनती। 2.0 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता को समायोजित करें।
    2. , 96 अच्छी तरह से स्पष्ट फ्लैट नीचे प्लेट (अच्छी तरह से प्रति 100 μl) पर कोशिकाओं बीज सब्सट्रेट करने के लिए कुर्की के लिए रातोंरात सेते हैं, और फिर उन्हें ब्याज की दवाओं के साथ व्यवहार करते हैं। कारतूस और गैर इलाज कोशिकाओं (नियंत्रण) को शामिल करने के लिए मत भूलना!
    3. नशीली दवाओं के उपचार के बाद (आमतौर पर 24 या 33 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटा), निर्माता प्रोटोकॉल निम्नलिखित MTT परख करते हैं। सामान्य रूप में, इस परख के लिए प्रोटोकॉल का पालन कदम है:
      1. प्रत्येक अच्छी तरह से MTT अभिकर्मक के 10 μl जोड़ें।
      2. 2 से 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं जब तक बैंगनी रंग दिखाई दे रहा है, और फिर अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए MTT डिटर्जेंट अभिकर्मक के 100 μl जोड़ें। प्लेट हिला नहीं करते।
      3. प्लेट कवर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 से 4 घंटा के लिए अंधेरे में छोड़ दें।
      4. प्रत्येक कुएं में 570 एनएम पर absorbance को मापने के लिए रिक्त स्थान (विकास अकेले मध्यम) सहित, एक microplate प्लेट रीडर का प्रयोग करें। व्यवहार्यता के 100% के रूप में नियंत्रण कक्षों में औसत आयुध डिपो का उपयोग कर डेटा मानक के अनुसार।
  2. कस्पासे 3/7 एक्टिवेशन परख
    नोट: Hei-OC1 कोशिकाओं अनुमोदक की स्थिति (पी-Hei-OC1) से बढ़ी इन अध्ययनों के लिए सिफारिश कर रहे हैं।
    1. प्रक्रिया 1.2 में वर्णित का पालन करके Hei-OC1 कोशिकाओं को ले लीजिए, और या तो एक स्वचालित सेल काउंटर या एक hemocytometer के साथ उन्हें गिनती। 2.0 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता को समायोजित करें।
    2. क पर कोशिकाओं बीज(अच्छी तरह से प्रति 100 μl) ite घिरी 96 अच्छी तरह प्लेटें, सब्सट्रेट करने के लिए कुर्की के लिए रातोंरात सेते हैं, और फिर उन्हें ब्याज की दवाओं के साथ व्यवहार करते हैं। कारतूस और गैर इलाज कोशिकाओं (नियंत्रण) को शामिल करने के लिए मत भूलना!
    3. नशीली दवाओं के उपचार के बाद (आमतौर पर 24 या 33 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटा), संबंधित निर्माता प्रोटोकॉल निम्नलिखित कस्पासे परख करते हैं। सामान्य तौर पर, इस परख के लिए प्रोटोकॉल का पालन कदम है:
      1. , अभिकर्मकों तैयार उन्हें अच्छी तरह मिक्स, और उन्हें कमरे के तापमान को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं।
      2. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटाने और प्लेटों के कमरे के तापमान को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं।
      3. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए अभिकर्मक के संकेत राशि जोड़ें, छू ही पिपेट सुझावों के साथ विभिन्न नमूनों युक्त कुओं नहीं द्वारा पार संक्रमण से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है।
      4. प्लेट कवर और 300-500 rpm पर एक थाली प्रकार के बरतन का उपयोग कर 30 सेकंड के लिए मिश्रण।
      5. की अवधि के लिए कमरे के तापमान पर थाली सेते हैं, कम से कम 30 मिनट। determinइष्टतम ऊष्मायन अवधि के अनुभव से ई। कमरे के तापमान घटता-बढ़ता रहता है तो एक निरंतर तापमान इनक्यूबेटर का उपयोग करें, क्योंकि तापमान के उतार चढ़ाव luminescence पढ़ने को प्रभावित करेगा।
      6. प्रत्येक में luminescence उपाय अच्छी तरह से, और कस्पासे सक्रियण की 100% के रूप में नियंत्रण कक्षों में औसत luminescence का उपयोग कर मूल्यों मानक के अनुसार।
  3. कोशिका विभाजन (प्रसार)
    1. प्रक्रिया 1.2 में वर्णित का पालन करके Hei-OC1 कोशिकाओं को ले लीजिए, और या तो एक स्वचालित सेल काउंटर या एक hemocytometer के साथ उन्हें गिनती। 2.0 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता को समायोजित करें।
    2. , 96 अच्छी तरह से स्पष्ट फ्लैट नीचे प्लेट (अच्छी तरह से प्रति 100 μl) पर कोशिकाओं बीज सब्सट्रेट करने के लिए कुर्की के लिए अनुमोदक की स्थिति पर रातोंरात सेते हैं, और फिर उन्हें ब्याज की दवाओं के साथ व्यवहार करते हैं। कारतूस और गैर इलाज कोशिकाओं (नियंत्रण) को शामिल करने के लिए मत भूलना!
    3. उपचार के बाद एक घंटे, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए तैयार 100x BrdU के 1 μl जोड़ने (5 ब्रोमो 2'- deoxyuriभोजन) समाधान, और 33 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें।
    4. बाद 12, 24 और 48 घंटा, इसी प्लेटों से मौजूदा मध्यम हटाने और पीबीएस के साथ अच्छी तरह से एक बार प्रत्येक धो लें।
    5. निर्माता प्रोटोकॉल निम्नलिखित सेल प्रसार परख प्रदर्शन। सामान्य तौर पर, इस परख के लिए प्रोटोकॉल का पालन कदम है:
      1. अभिकर्मकों denaturing समाधान, धो बफर, प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने के समाधान, माध्यमिक एंटीबॉडी का पता लगाने के समाधान है, और BrdU समाधान निर्माता प्रोटोकॉल में संकेत के रूप में तैयार / फिक्सिंग भी शामिल है।
      2. मात्रा निर्माता प्रोटोकॉल में संकेत में एक अच्छी तरह से फिक्सिंग / अप्राकृतिकरण समाधान जोड़ें, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली रखने के लिए।
      3. फिक्सिंग / denaturing समाधान निकालें और एकाग्रता निर्माता प्रोटोकॉल में संकेत पर प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर थाली रखें।
      4. प्राथमिक चींटी के साथ समाधान निकालेंibody, प्लेट धोने बफर के साथ 3 बार धोने, और फिर एकाग्रता निर्माता प्रोटोकॉल में संकेत पर माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ थाली रखें।
      5. , माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ समाधान निकालें प्लेट धोने धोने बफर के साथ 3 बार, और सब्सट्रेट जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट ऊष्मायन के बाद, बंद करो समाधान जोड़ें। सावधान: रंग में परिवर्तन नियंत्रण; यदि समाधान बहुत अंधेरा हो जाता है, प्रतिक्रिया 10 मिनट के मानक विकास के समय से पहले बंद करो।
      6. स्थान पर समाधान जोड़ने के 30 मिनट के भीतर 450 एनएम पर absorbance पढ़ें।
  4. cytotoxicity
    नोट: Hei-OC1 कोशिकाओं अनुमोदक की स्थिति (पी-Hei-OC1) से बढ़ी इन अध्ययनों के लिए सिफारिश कर रहे हैं।
    1. अकेले सेल संस्कृति के माध्यम से (नियंत्रण) या मध्यम से अधिक ब्याज की दवाओं में 24-48 घंटे के लिए अनुमोदक की स्थिति पर सेते हैं, आम तौर पर, Hei-OC1 कोशिकाओं।
    2. उपचार के अंत मेंपीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोने, और प्रति 3 मिनट के लिए एक गैर enzymatic सेल हदबंदी समाधान की सतह क्षेत्र के 25 सेमी 2 1 मिलीलीटर का उपयोग कर अलग।
    3. detaching के बाद, इकट्ठा करने और 5 मिनट के लिए 3,000 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला हटाने, और अभिकर्मक cytotoxicity परख में शामिल के साथ अंधेरे में 15 मिनट के लिए कोशिकाओं दाग।
    4. प्रवाह से लाइव Hei-OC1 कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण cytometry के रूप में प्रवाह cytometer के निर्माता द्वारा संकेत दिया।
  5. बुढ़ापा
    1. अकेले सेल संस्कृति के माध्यम से (नियंत्रण) या मध्यम से अधिक ब्याज की दवाओं में 24-48 घंटे के लिए अनुमोदक की स्थिति पर सेते हैं, आम तौर पर, Hei-OC1 कोशिकाओं।
    2. प्रोटोकॉल विश्वसनीय परिणाम प्रदान करने के लिए जाना जाता है Debacq-Chainiaux एट अल। 15 या अन्य विधि द्वारा वर्णित के साथ प्रवाह cytometry का उपयोग वार्धक्य जुड़े बीटा galactosidase सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं। से फ्लो के लिए एक संक्षिप्त प्रोटोकॉल निम्नलिखित है:
        <li> प्रयोगात्मक उपचार के अंत में, कोशिकाओं में तीन बार पीबीएस के साथ धोने और फिर अनुमोदक की स्थिति पर 1 घंटे के लिए सेल संस्कृति माध्यम में 100 एनएम Bafilomycin A1 के साथ उन्हें सेते हैं।
      1. C12FDG ~ 33 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें, और 1-2 घंटे के लिए कोशिकाओं incubating जारी है।
      2. पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धो उन्हें फसल प्रति 3 मिनट के लिए एक गैर enzymatic सेल हदबंदी समाधान की सतह क्षेत्र के 25 सेमी 2 1 मिलीलीटर का उपयोग कर, और 5 मिनट के लिए 3,000 XG पर centrifugation द्वारा उन्हें गोली।
      3. ठंडा पीबीएस में कोशिकाओं resuspend और प्रवाह cytometry द्वारा सकारात्मक Hei-OC1 कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण के रूप में प्रवाह के निर्माता द्वारा संकेत दिया।
  6. भोजी
    1. लीजिए Hei-OC1 कोशिकाओं को नियंत्रित करने और भूखे प्रक्रिया 1.2 में वर्णित का पालन करते हुए (48 घंटे के लिए सीरम से वंचित), और मानक प्रोटोकॉल का पालन पश्चिमी धब्बा के लिए उन्हें प्रक्रिया। सामान्य में, पश्चिमी धब्बा के लिए प्रोटोकॉल का पालन सेंट हैईपीएस:
      1. 1.0 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में 6 अच्छी तरह प्लेटों में बीज Hei-OC1 कोशिकाओं। 24 और / या 48 घंटे के बाद, ठंडा पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
      2. TNESV बफर (1% NP40, 50 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.5, 100 मिमी NaCl, 2 मिमी EDTA, 1 मिमी ना 3 वीओ 4) बर्फ पर 5 मिनट के लिए protease अवरोध कॉकटेल के साथ और 1 मिमी PMSF के 200 μl के साथ Lyse।
      3. (प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे scraping द्वारा) कोशिकाओं को ले लीजिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,800 XG पर microcentrifuge ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए स्थानांतरण।
      4. supernatants लीजिए और बीसीए परख का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता यों।
      5. प्रोटीन denature करने के लिए 5 मिनट के लिए 5x लोडिंग बफर और प्रत्येक नमूने के लिए 1 मिमी डीटीटी और फोड़ा जोड़ें।
      6. एक 4-12% जेल पर एसडीएस पृष्ठ का उपयोग कर नमूने चलाएँ, और PVDF झिल्ली को हस्तांतरण।
      7. बीच 20 0.1% के साथ टीबीएस-टी में 5% नोनफेट सूखे दूध के साथ झिल्ली ब्लॉक आरटी पर 60 मिनट के लिए।
      8. प्राथमिक चींटी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर झिल्ली सेतेibodies।
      9. अगले दिन, झिल्ली टीबीएस-टी के साथ बड़े पैमाने पर धो लें, और एक माध्यमिक आईजीजी एंटीबॉडी हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) (1: 1,500) संयुग्मित साथ सेते 1 घंटे के लिए।
      10. एक बढ़ाया chemiluminescence (ईसीएल) का पता लगाने प्रणाली के साथ immunoreactivity का पता लगाने। मानक के रूप में: (10% में नोनफेट सूखे दूध के साथ टीबीएस-टी में 2,000 1) प्रोटीन अभिव्यक्ति GAPDH का उपयोग करते हुए स्तर मानक के अनुसार।
    2. पश्चिमी blots में, अभिव्यक्ति की जांच में कम से कम, इस तरह के Beclin -1 और LC3B के रूप में भोजी की दो अलग अलग मार्कर (आमतौर पर 1 से 2.5% BSA के साथ टीबीएस-टी में 1,000 कमजोर पड़ने)। GAPDH या actin के रूप में प्रोटीन अभिव्यक्ति इस तरह के एक नियंत्रण के लिए देखने के लिए मत भूलना।
    3. इस तरह के सार्वजनिक डोमेन एनआईएच छवि या ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/) के रूप में एक डिजिटल ब्लाट स्कैनर या कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेन्टिसिटोमीटरी द्वारा ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन।

3. Hei-OC1 कोशिकाओं के साथ इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों

  1. कटाई प्रकोष्ठों
    नोट: उपयोग कोशिकाओं को 50% -80% confluency पर 100 मिमी व्यास संस्कृति बर्तन में बढ़ रहा है। Trypsin, Accutase, एंजाइम मुक्त समाधान, या बी एस uffered Aline + E thylene डी iamine टी एक CETIC एसिड (पीबीएस EDTA) etra पी hosphate- संख्या और gigaseals की गुणवत्ता पर महत्वपूर्ण प्रभाव के बिना कोशिकाओं उठाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कुछ मामलों में, हालांकि, trypsin उपचार कोशिकाओं को और अधिक नाजुक बना देता है। इन मामलों में, कोशिकाओं के प्रयोगों के शुरू करने से पहले लगभग 30 मिनट के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं।
    1. कोशिकाओं सीए के बिना 10 मिलीलीटर पीबीएस 2 + और ​​2 मिलीग्राम + के साथ दो बार धोएं।
    2. इस तरह के गैर enzymatic सेल हदबंदी समाधान के रूप में एक एंजाइम मुक्त detacher समाधान के 2 मिलीलीटर, 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए व्यंजन जोड़ें, और सेते हैं।
    3. कोशिकाओं की टुकड़ी की जांच करने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें। यदि आवश्यक हो, सेल को स्थानांतरितएल संस्कृति पकवान अधिक कोशिकाओं को अलग, लेकिन यह धीरे करने के लिए।
      नोट: डिश हिला नहीं करते।
    4. DMEM + 10% FBS की 10 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से ऊपर और एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ पांच बार नीचे कोशिकाओं पिपेट।
    5. एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं को देखो। कोशिकाओं के> 80% पहले से ही अलग कर रहे हैं, (एकल), आगे कोई pipetting की जरूरत है। कोशिकाओं समूहों में अब भी कर रहे हैं, तो धीरे pipetting दोहराएँ जब तक 80% से अधिक कोशिकाओं सिंगल हैं।
    6. 100 XG पर 2 मिनट के लिए एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में निलंबित कोशिकाओं के ~ 10 मिलीलीटर की जगह, अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    7. (लेबोविट्ज़ एल 15 मध्यम 305 करने के लिए समायोजित - आसुत जल के साथ 310 mOsm) बाहरी रिकॉर्डिंग समाधान के ~ 200 μl का उपयोग कोशिकाओं resuspend। कोशिकाओं की एक ऑप्टिकल नियंत्रण चिकनी झिल्ली किनारों के साथ कई एकल, गोल कोशिकाओं को दिखाना चाहिए।
  2. पैच दबाना और एनएलसी माप
    1. पैच दबाना और वोल्टेज पर निर्भर nonlinear समाई की माप (एनएलसी) एक का उपयोग कर प्रदर्शन करनाdequate एम्पलीफायरों और सॉफ्टवेयर, साथ ही मानक electrophysiological तकनीकों। आंतरिक (intrapipette) समाधान उपयोग 150 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 0.1 मिमी EGTA, 2 मिमी एटीपी मिलीग्राम के रूप में, 0.1 मिमी GTP-ना, और 10 मिमी HEPES; Tris के साथ 7.2 पीएच को समायोजित करें।
    2. माइक्रोस्कोप के तहत, एक एकल, स्वस्थ कोशिका झिल्ली गोल और चिकनी किनारों के साथ, का चयन करें। कोशिका की सतह के लिए ग्लास विंदुक टिप देते हैं और झिल्ली प्रतिरोध की जाँच करें। यह चारों ओर 3-6 megaohms होना चाहिए, ~ 2 माइक्रोन की पिपेट की नोक की एक आंतरिक व्यास (आईडी) के लिए इसी।
    3. धीरे सेल प्लाज्मा झिल्ली के खिलाफ micropipette टिप दबाएँ और फिर सक्शन लागू होते हैं। कोशिका झिल्ली का एक हिस्सा पिपेट में suctioned हो जाएगा, 10 के क्रम में एक बिजली के प्रतिरोध पैदा - 100 gigaOhms (gigaseal)।
    4. सक्शन दालों के साथ प्लाज्मा झिल्ली में खलल न डालें से पूरे सेल हालत स्थापित करना।
    5. ऐसे HEK-293 के रूप में कोशिकाओं है कि prestin व्यक्त नहीं करते, प्रयोग, एक नियंत्रण 9 के रूप में
      नोट: वर्तमान प्रतिक्रियाओं 5 kHz पर फ़िल्टर करना चाहिए, और सुधार अवशिष्ट श्रृंखला प्रतिरोध के प्रभाव के लिए बनाया है। सभी डेटा संग्रह और विश्लेषण के सबसे आम तौर पर लॉक-इन एम्पलीफायरों के साथ शामिल सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है। समाई समारोह झिल्ली वोल्टेज से 16 nonlinear प्रभारी संबंधित एक दो राज्य बोल्ट्जमान समारोह के पहले व्युत्पन्न करने के लिए लगाया जा सकता है।

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Representative Results

हाल के प्रकाशनों के एक जोड़े में हम कई आमतौर पर इस्तेमाल औषधीय दवाओं के लिए Hei-OC1 कोशिकाओं की प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के साथ ही prestin समारोह 8,9 की जांच के उद्देश्य से अध्ययन के एक व्यापक सेट की सूचना दी। इन अध्ययनों में हम सभी पिछले वर्गों में वर्णित प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया।

इन पिछले अध्ययनों के परिणामों में से एक था कि Hei-OC1 कोशिकाओं गैर अनुमोदक की स्थिति में सुसंस्कृत (39 डिग्री सेल्सियस / 10% सीओ 2 = एनपी Hei-OC1) सेल व्यवहार्यता में एक अत्यधिक महत्वपूर्ण कमी, और एक समान रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई कोशिका मृत्यु में, अनुमोदक की स्थिति में संवर्धित कोशिकाओं के संबंध में (33 डिग्री सेल्सियस / 10% सीओ 2 = पी-Hei-OC1) (चित्रा 1)। इसलिए, किसी भी cytotoxicity अध्ययन एनपी Hei-OC1 कोशिकाओं पर प्रदर्शन संस्कृति की स्थिति के प्रभाव से भेदभाव दवा के प्रभाव में काफी प्रयास समर्पित होना चाहिए। इसके अलावाn, कोशिकाओं पर दवा प्रभाव पहले से ही मर रहा है या के साथ के बाद से एक कम व्यवहार्यता कि स्वस्थ कोशिकाओं पर एक ही दवा के प्रभाव, हम प्रयोगों है कि विशेष रूप से विभेदित कोशिकाओं की आवश्यकता नहीं है के लिए P-Hei-OC1 कोशिकाओं का उपयोग करना चाहिये अलग हो सकता है।

विभिन्न औषधीय दवाओं के प्रभाव पर हमारा अध्ययनों से यह भी रोचक परिणाम का उत्पादन किया। उदाहरण के लिए, सिस्पैटिन, एक chemotherapeutic एजेंट अक्सर कई मानव कैंसर के उपचार, और एसिटामिनोफेन (APAP = एन एक cetyl- देहात आर ए-अमीनो पी henol) के लिए इस्तेमाल किया, सबसे व्यापक रूप से बेचा संयुक्त राज्य अमेरिका में ओवर-द-काउंटर दर्द निवारक, दोनों Hei-OC1 कोशिकाओं के लिए विषाक्त थे (चित्रा 2)। हालांकि, APAP सेल व्यवहार्यता की कमी हुई और कस्पासे वृद्धि हुई 3/7 सक्रियण है, यह कोशिका मृत्यु के लिए प्रेरित नहीं किया। Cisplatin, इसके विपरीत, काफी तीन प्रतिक्रियाओं (चित्रा 2) में वृद्धि हुई। दिलचस्प बात यह है caspases 3/7 mostl थेY कम सिस्पैटिन सांद्रता में सक्रिय है, सुझाव है कि सेल सिस्पैटिन की कम खुराक से प्रेरित मौत शायद, apoptosis द्वारा मध्यस्थता की थी, जबकि उच्च खुराक घातक प्रभाव oncosis / necroptosis के साथ जुड़ा हो सकता है। Oncosis एक पूर्व घातक मार्ग सेलुलर और organelle सूजन, blebbing, और वृद्धि की झिल्ली पारगम्यता 17,18 के साथ अनियमित कोशिका मृत्यु के लिए अग्रणी के रूप में परिभाषित किया गया है, necroptosis एक विनियमित गैर apoptotic कोशिका मृत्यु तंत्र ही उत्तेजनाओं कि आरंभ से ही सक्रिय है apoptosis लेकिन oncosis 19-22 के उन लोगों के लिए इसी तरह की रूपात्मक सुविधाओं के साथ।

APAP और पी Hei-OC1 कोशिकाओं पर सिस्पैटिन के प्रभाव की जांच करने के उद्देश्य से अतिरिक्त अध्ययन के लिए एक स्पष्ट, खुराक पर निर्भर APAP की सेल प्रसार पर कि पिछले पैराग्राफ में वर्णित कोशिका मृत्यु के बिना सेल व्यवहार्यता में पेचीदा कमी समझा सकता है प्रभाव दिखाया (चित्रा 3 ए)। cisplatin ए एल एस ओ सेल प्रसार में कमी आई है, और इसके प्रभाव और भी छोटी खुराक (चित्रा 3 ए) के लिए जोखिम के समय के साथ संवर्धित, लेकिन इसके अलावा में सभी सांद्रता और समय अंक हमारे अध्ययन (चित्रा 3 बी) में शामिल पर वार्धक्य कमी आई है। सेल वार्धक्य में महत्वपूर्ण कमी सिस्पैटिन से प्रेरित, सेल मौत में वृद्धि से समझाया जा सकता है यह सोचते हैं कि वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं होगा, शायद, प्रवण स्वस्थ कोशिकाओं को 23 से अधिक तेजी से मर जाते हैं।

महत्वपूर्ण बात है, ये प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि Hei-OC1 कोशिकाओं को एक विशिष्ट खुराक और अध्ययन के तहत तंत्र के कम से कम एक समय पर निर्भर संवेदनशीलता के साथ विभिन्न औषधीय दवाओं का जवाब। इसलिए, किसी भी प्रयोगात्मक परिणाम की सही व्याख्या और जांच विशेष सेलुलर प्रक्रियाओं का एक स्पष्ट समझ उन्हें मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक में से हर एक के द्वारा उपलब्ध कराई गई जानकारी की आवश्यकता होगी।

jove_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> confocal और प्रयोगों प्रवाह cytometry, दूसरे हाथ पर, पी-Hei-OC1 और एनपी Hei-OC1 कोशिकाओं में prestin अभिव्यक्ति की पुष्टि की prestin पर ज्यादातर immunolocalizing साथ पी-Hei-OC1 कोशिकाओं (चित्रा -4 ए, तीर) की कोशिका द्रव्य, और एनपी Hei-OC1 कोशिकाओं (चित्रा 4 बी, तीर) में प्लाज्मा झिल्ली पर अधिक ध्यान केंद्रित किया। प्रवाह cytometry अध्ययनों एनपी HEI में prestin अभिव्यक्ति में एक स्पष्ट वृद्धि देखी गई -OC1 कोशिकाओं पी Hei-OC1 कोशिकाओं (आंकड़े 4C और 4D) के लिए सम्मान करते हैं। समय पर निर्भर एनपी Hei-OC1 कोशिकाओं में prestin की अभिव्यक्ति और प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण में वृद्धि का सुझाव है कि translocation अधिक prestin अणुओं के संश्लेषण के साथ गया था। हालांकि, इन प्रयोगों तय करना होगा कि prestin अणुओं मूल रूप से प्लाज्मा झिल्ली और नए अणुओं को कोशिका द्रव्य चाल में स्थित है, उन्हें जगह अगर वे कोशिका द्रव्य पर बने हुए हैं और केवल नव synth सुराग नहीं प्रदान की थीप्लाज्मा झिल्ली, या दोनों प्रक्रियाओं के संयोजन के लिए esized prestin चलता रहता है।

Electrophysiological अध्ययन एक चोटी मूल्य है कि कमी आई है और यह है कि अधिक depolarized मूल्यों के लिए स्थानांतरित कर दिया शिखर समाई पर एक वोल्टेज, जब कोशिकाओं 1 और के लिए गैर-अनुमोदक की स्थिति में ले जाया गया साथ पी Hei-OC1 कोशिकाओं में एक मजबूत एनएलसी (चित्रा 5 ब), पता चला 2 सप्ताह (आंकड़े 5C और 5 डी)। प्लाज्मा झिल्ली कोशिका द्रव्य से prestin के प्रगतिशील स्थानान्तरण के कारण, हम मूल धारणा है कि एनएलसी पी Hei-OC1 कोशिकाओं की तुलना में एनपी Hei-OC1 में अधिक होगा, और यह आगे एनपी पर ऊष्मायन के समय के साथ बढ़ जाएगी कि शर्तेँ। हैरानी की बात है, हमारे अध्ययन के परिणाम बिल्कुल विपरीत प्रतिक्रिया देखी गई। हम अनुमान लगाया है कि प्लाज्मा झिल्ली में prestin अणुओं के घनत्व में वृद्धि उनकी मोटर समारोह को सीमित किया जा सकता है।

हिन-पेज = "1"> चित्रा 5 Hei-OC1 कोशिकाओं में चोटी समाई पर वोल्टेज की विध्रुवण OHCs में और ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं 24 की रिपोर्ट में विशिष्ट मूल्यों के संबंध में नोट; इसके अलावा, कि निरीक्षण depolarizing पारी एनपी की स्थिति में समय के साथ बढ़ जाती है। प्रगतिशील depolarizing पारी माउस और चूहा विकास 25,26 दौरान OHCs में वर्णित है कि इसी तरह की है, और यह सुझाव दिया गया था कि यह OHC के प्लाज्मा झिल्ली 25, या एक परिपक्वता की प्रक्रिया आंतरिक के साथ जुड़े अन्य सेलुलर संरचनाओं के विकास के लिए संबंधित हो सकता है 24 prestin करने के लिए।

हम Hei-OC1 कोशिकाओं के साथ कुछ अध्ययनों के इस संक्षिप्त ब्योरा सेल और आणविक प्रतिक्रियाओं की एक व्यापक स्पेक्ट्रम की जांच के लिए Hei-OC1 कोशिकाओं की क्षमता उपयोगिता के लिए पर्याप्त सबूत उपलब्ध कराने की उम्मीद है।

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चित्रा 1: सेल व्यवहार्यता और पी-Hei-OC1 और एनपी Hei-OC1 कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु। (ए) सेल व्यवहार्यता MTT परख के साथ मूल्यांकन किया है। Absorbance एक प्लेट रीडर के साथ मापा गया था, और नियंत्रण कक्षों में औसत आयुध डिपो व्यवहार्यता की 100% के रूप में लिया गया था। (बी) सेल मौत एक cytotoxicity परख के साथ मूल्यांकन किया है। 530 15 एनएम: सकारात्मक (मृत) कोशिकाओं की संख्या 488 एनएम उत्तेजना (नीले लेजर) और FL1 साथ प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया गया था। नोट अत्यधिक महत्वपूर्ण (पी ≤0.001) सेल व्यवहार्यता में (ए) कोशिका मृत्यु (बी) के गैर-अनुमोदक की स्थिति से प्रेरित में कमी और वृद्धि हुई है। सलाखों के साधन (SEM) के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। संदर्भ 8 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2:। जब MTT, caspases 3/7 और cytotoxicity assays द्वारा विश्लेषण APAP और Cisplatin को उजागर Hei-OC1 प्रकोष्ठों के जवाब (ए) सेल व्यवहार्यता MTT परख के साथ मूल्यांकन, और absorbance एक प्लेट रीडर के साथ मापा जाता है। (बी) जल्लाद caspases 3/7 की सक्रियता। (सी) ड्रग - प्रेरित कोशिका मृत्यु एक cytotoxicity परख के साथ मूल्यांकन; सकारात्मक (मृत) कोशिकाओं की संख्या से फ्लो द्वारा निर्धारित किया गया था। हर प्रयोग में डेटा संबंधित नियंत्रण की शर्तों (नियंत्रण = 1) के लिए सामान्यीकृत था संभव है एक साथ सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए। * = नियंत्रण करने के लिए पी ≤0.05 सम्मान करते हैं। सलाखों के साधन (SEM) के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। संशोधित fromreference 8। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: APAP और Cisplatin के प्रभाव Hei-OC1 प्रकोष्ठों 'mitotic दर और बुढ़ापा पर। (ए) Hei-OC1 कोशिकाओं के विभाजन mitotic, की दर 24 और 48 घंटा पर पर दवा प्रेरित परिवर्तन, एक BrdU परख के साथ मूल्यांकन किया गया था। Hei-OC1 कोशिकाओं में (बी) दवा प्रेरित वार्धक्य फ्लो और senescence- द्वारा मापा गया था जुड़े β-galactosidase (एसए Bgal) तकनीक। हर प्रयोग में डेटा संबंधित नियंत्रण की शर्तों (नियंत्रण = 1) के लिए सामान्यीकृत था संभव है एक साथ सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए। * = नियंत्रण करने के लिए पी ≤0.05 सम्मान करते हैं। सलाखों के साधन (SEM) के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। संशोधित fromreference 8। टी का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंउसका आंकड़ा।

चित्रा 4
चित्रा 4:। पी Hei-OC1 और एनपी Hei-OC1 प्रकोष्ठों में Prestin अभिव्यक्ति - कोशिकाओं विरोधी Prestin एंटीबॉडी के साथ लेबल और confocal माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry द्वारा मनाया गया (ए) पी Hei-OC1 कोशिकाओं में ज्यादातर पर immunolocalized prestin कोशिका द्रव्य (तीर)। (बी) एनपी Hei-OC1 कोशिकाओं में, इसके विपरीत, prestin जेट प्लाज्मा झिल्ली (तीर) पर ध्यान केंद्रित किया गया था। (सी और डी) Hei-OC1 कोशिकाओं एनपी की स्थिति (डी) में 2 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत में अध्ययन के प्रवाह cytometry पी Hei-OC1 कोशिकाओं को prestin अभिव्यक्ति सम्मान (सी) में एक स्पष्ट वृद्धि देखी गई। (सी) इनसेट माध्यमिक है अब केवल (नकारात्मक नियंत्रण)। संदर्भ 9 से संशोधित।यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। पी Hei-OC1 और एनपी Hei-OC1 कोशिकाओं (ए) पैच-clamped Hei-OC1 सेल में एनएलसी अध्ययन करता है। (बी - डी) एनपी Hei-OC1 पी Hei-OC1 में एनएलसी और कोशिकाओं। एनएलसी के शिखर में कमी और घटता अधिक depolarized को एनपी Hei-OC1 कोशिकाओं में मूल्यों के प्रगतिशील पारी ध्यान दें। संदर्भ 9 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस रिपोर्ट में हम कैसे संस्कृति Hei-OC1 कोशिकाओं को वर्णन है और दवा प्रेरित cytotoxicity के तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए उन्हें इस्तेमाल करते हैं और prestin, कर्णावत OHCs की आणविक मोटर के कार्यात्मक गुणों की जांच करने के लिए। तकनीकी प्रक्रियाओं, हालांकि, काफी सामान्य आसानी से विभिन्न अध्ययनों के लिए अनुकूलित किया जाना है।

सभी प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित अच्छी तरह से स्थापित सेल संस्कृति तकनीक 10 के सही उपयोग की आवश्यकता होती है। बस किसी भी अन्य सेल लाइन के साथ की तरह, Hei-OC1 कोशिकाओं के साथ काम कर रहे एक प्रमाणित जैविक सुरक्षा कैबिनेट, एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र, एक पानी के स्नान, और सेल संस्कृतियों की परीक्षा के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ और गिनती कोशिकाओं के लिए एक ठीक से सुसज्जित सेल संस्कृति की सुविधा की आवश्यकता है hemocytometric तकनीक का उपयोग कर सकते हैं। एक अनूठी आवश्यकता है, तथापि, एनपी Hei-OC1 सेल के लिए P-Hei-OC1 कोशिकाओं के लिए 33 डिग्री सेल्सियस / 10% सीओ 2 में दो humidified इन्क्यूबेटरों, एक सेट की उपलब्धता और 39 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में दूसरा नहीं हैएस। योजना बनाई अध्ययनों केवल पी Hei-OC1 कोशिकाओं को शामिल करते हैं, तो दूसरी इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस / 5 अलग अलग assays के लिए% सीओ 2 पर सेट किया जा सकता है।

प्लास्टिक सेल संस्कृति बर्तन के उपयोग Hei-OC1 कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए एक महत्वपूर्ण अतिरिक्त अपेक्षित है। वास्तव में, Hei-OC1 कोशिकाओं को बहुत मजबूत कर रहे हैं और वे विभिन्न सतहों में और बहुत अलग अलग परिस्थितियों में विकास होगा। हालांकि, उनके phenotype और दवाओं और अन्य उत्तेजनाओं के लिए उनकी प्रतिक्रिया जोरदार संस्कृति मानकों (जी Kalinec एंड एफ Kalinec, अप्रकाशित) पर निर्भर करेगा। हम पिछले एक कागज 8 में तर्क के रूप में, Hei-OC1 कोशिकाओं के इस प्लास्टिसिटी हितकर उपन्यास प्रयोगों डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह सर्वविदित है कि कर्णावत perilymph में ऑक्सीजन तनाव काफी कम (~ 2 किलो पास्कल) समुद्र तल (~ 21.3 किलो पास्कल), 27 में एक खास मशीन में से है। कम हे में incubating Hei-OC1 कोशिकाओं 2 सांद्रता अपनी प्रतिक्रिया बदल जाएगा, शायद उन्हें लेखा परीक्षा के लिए एक बेहतर मॉडल बनानेory संवेदी कोशिकाओं।

यह जोर दिया जाना चाहिए कि संस्कृति और Hei-OC1 कोशिकाओं की उपसंस्कृति के लिए वर्णित प्रोटोकॉल भी अन्य श्रवण सेल ऐसे कोर्टी 11,12 और एसवी का अंग से OC-K3 के रूप में ही ट्रांसजेनिक माउस से हमारी प्रयोगशाला में विकसित लाइनों, के साथ इस्तेमाल किया जा सकता -k1 हलकी लीक से 13,14 vascularis। इसके अलावा, इन सेल लाइनों का चयन किया प्रयोगों में Hei-OC1 कोशिकाओं के लिए नियंत्रण के रूप में उपयोगी हो सकता है। उदाहरण के लिए, हम हाल ही में एसवी-K1 कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है कि प्रदर्शन करने के विपरीत आनुपातिक immunoreactivity prestin करने और Hei-OC1 कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर ना + K + ATPase एंटीबॉडी सेल प्रकार पर निर्भर के बजाय प्रतिक्रिया से ट्रांसजेनिक माउस के साथ जुड़े थे जो इन कोशिकाओं 9 प्राप्त किए गए।

Hei-OC1 कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए अन्य महत्वपूर्ण आवश्यकता इस तरह से 70% ई सुरक्षा कैबिनेट के भीतर सभी काम की सतहों की सफाई के रूप में उपयुक्त सड़न रोकनेवाला तकनीक का अभ्यास हैthanol या isopropanol और प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक किसी भी सामग्री का परिशोधन। हालांकि, जबकि अन्य स्तनधारी सेल लाइनों अक्सर पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन या अन्य इसी तरह के संयोजन का उपयोग करके अनजाने में जीवाणु संक्रमण के खिलाफ की रक्षा कर रहे हैं, एंटीबायोटिक दवाओं कभी नहीं Hei-OC1 कोशिकाओं के साथ छोड़कर यदि अध्ययन का उद्देश्य उनके प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। Hei-OC1 कोशिकाओं एंटीबायोटिक मुक्त परिस्थितियों में उत्पन्न किया गया है, और वे एंटीबायोटिक प्रतिरोधी कोशिकाओं के उद्भव को कम करने से परहेज किया जाना चाहिए।

अंत में, हम एक बिंदु पहले ही फिर से जोर इस रिपोर्ट में कई बार उल्लेख करना चाहते हैं: phenotype और दवाओं और अन्य उत्तेजनाओं को Hei-OC1 कोशिकाओं की प्रतिक्रिया जोरदार संस्कृति मापदंडों पर निर्भर करेगा। इसलिए, यह बहुत महत्वपूर्ण है कि Hei-OC1 कोशिकाओं के साथ काम प्रयोगशालाओं क्रम में इसी तरह के प्रोटोकॉल और सेल संस्कृति शर्तों का उपयोग अपने परिणामों को सही मायने में अन्य समूहों द्वारा प्रदान की उन के साथ तुलनीय बनाने के लिए। इसके अलावा, यह हैयाद करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है कि Hei-OC1 सेल लाइन केवल एक मॉडल, सभी सीमाएँ हैं कि एक मॉडल के साथ है। उम्मीद Hei-OC1 कोशिकाओं के साथ है कि इन विट्रो प्रयोगों सही वास्तविक श्रवण संवेदी कोशिकाओं के vivo प्रतिक्रियाओं का प्रतिनिधित्व अवास्तविक है डेटा प्रदान करेगा। हालांकि, हम दृढ़ता से विश्वास Hei-OC1 सेल लाइन श्रवण संवेदी कोशिकाओं के कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं और औषधीय दवाओं के संभावित ototoxicity की स्क्रीनिंग की जांच के लिए एक उपयोगी मॉडल है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEI-OC1 cells ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS 
Class II Biological Safety cabinet The Baker Company Sterilgard III AND COMPANIES INDICATED IN THE
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5810R PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY
Inverted microscope Zeiss Axiovert 25 EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR
Waterbath Stovall HWB115 PRODUCT COULD BE USED.
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto T4
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2 Forma Scientific 3110
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents Greinier Bio-One 664-160
Cell culture dishes , PS,  60 mm x 15 mm with vents  Greiner Bio-One 628160
Cellstar tissue culture flasks  250 ml Greiner Bio-One 658-175
Cellstar tissue cultur  flasks 550 ml Greiner Bio-One 660-175
 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar Greiner Bio-One 657-160
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid Becton Dickinson 353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom Greiner Bio-One 655098
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars Becton Dickinson  352070
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars Greiner Bio-One 188-271
PBS pH 7.4 (1x)  Life Technologies 10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Life Technologies 11965-084
Fetal bovine serum (FBS)  Hyclone SH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco/Invitrogen 21083-027
Trypsin, 0.25%  Life Technologies 25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit Trevigen 4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  kit Promega   G8091 
BrdU Cell Proliferation Assay Kit  Cell Signaling 6813
Non-enzymatic cell dissociation solution  Sigma-Aldrich C5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit Promega   G8741 
FACSAriaIII instrument  BD Biosciences  FACSAriaIII With 488 nm excitation (blue laser)
Digital Blot Scanner LI-COR C-DiGit
Electrophoresis and Blotting Unit Hoefer SE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software Molecular Devices SpectraMax 5
Patch-clamp amplifier HEKA EPC-10
Puller for preparing patch electrodes Sutter Instruments P-97

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References

  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
  3. Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
  4. Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
  5. Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
  6. Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
  7. Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
  8. Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
  9. Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
  10. Celis, J. E. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).
  11. Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
  12. Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
  13. Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
  14. Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  16. Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
  17. Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
  18. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
  19. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
  20. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
  21. Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
  22. Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
  23. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
  24. Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
  25. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  26. Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
  27. Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).

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