चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए एक उपकरण के रूप में RGD-क्रियाशील hydrogels के संश्लेषण

1Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering "Giulio Natta", Politecnico di Milano
Published 10/07/2016
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Bioengineering

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Mauri, E., Sacchetti, A., Rossi, F. The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications. J. Vis. Exp. (116), e54445, doi:10.3791/54445 (2016).

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Abstract

Introduction

हाइड्रोजेल हाइड्रोफिलिक पार से जुड़े पॉलिमर, जो प्राकृतिक या कृत्रिम, और एक विशिष्ट तीन आयामी संरचना की विशेषता रहे हैं द्वारा गठित तीन आयामी नेटवर्क रहे हैं। इन उपकरणों के दवा वितरण, ऊतक इंजीनियरिंग, जीन वाहक और स्मार्ट सेंसर 1,2 के जैव चिकित्सा के क्षेत्र में तेजी से आकर्षक हैं। दरअसल, उनके उच्च पानी सामग्री, साथ ही उनके rheological और यांत्रिक गुणों उन्हें उपयुक्त उम्मीदवारों नरम ऊतक microenvironments की नकल और उन्हें पानी में घुलनशील साइटोकाइन या वृद्धि कारक वितरण के लिए प्रभावी उपकरण बनाने के लिए करते हैं। सबसे होनहार उपयोग की एक कोशिकाओं और bioactive यौगिकों को ले जाने के लिए एक इंजेक्शन biomaterial के रूप में है। हाइड्रोजेल के रूप में इन विट्रो में और vivo प्रयोगों 3,4 में मनाया, पकड़ रहा है और ठीक एक शारीरिक प्रासंगिक फैशन में स्टेम सेल नियामक संकेतों देने से सेल अस्तित्व और नियंत्रण स्टेम सेल भाग्य सुधार हो सकता है। इस का प्रमुख लाभ संभावना हैटीका (सीटू) के क्षेत्र के भीतर इंजेक्शन कोशिकाओं बनाए रखने के लिए, कोशिकाओं की राशि है कि संचार धार में क्षेत्र और extravasates छोड़ देता है, सारे शरीर में पलायन और लक्ष्य लक्ष्य 5 खोने के कम से कम। तीन आयामी हाइड्रोजेल नेटवर्क की स्थिरता इसकी पार से जोड़ने साइटों, सहसंयोजक बांड या बहुलक श्रृंखला 6 के बीच एकजुट बलों द्वारा गठित की वजह से है।

इस ढांचे में, orthogonal चयनात्मक रसायन विज्ञान बहुलक श्रृंखला के लिए लागू एक बहुमुखी उपकरण हाइड्रोजेल प्रदर्शन 7 में सुधार करने में सक्षम है। दरअसल, उपयुक्त रासायनिक समूहों के साथ पॉलिमर के संशोधन के उचित रासायनिक, शारीरिक और यांत्रिक गुणों प्रदान करने के लिए सेल व्यवहार्यता और ऊतक गठन में उनके उपयोग को बढ़ाने के लिए मदद कर सकता है। उसी तरह, तकनीकों के बीच जेल मैट्रिक्स के भीतर कोशिकाओं या वृद्धि कारक लोड करने के लिए, RGD पेप्टाइड का उपयोग कोशिका आसंजन और अस्तित्व के क्षेत्र में सुधार की अनुमति देता है। RGD बना tripeptide हैarginine, ग्लाइसिन और Aspartic एसिड, जो अब तक का का सबसे प्रभावी और अक्सर अपने एक से अधिक सेल आसंजन रिसेप्टर को संबोधित करने और क्षमता सेल प्रस्तोता, व्यवहार और अस्तित्व 8,9 पर अपनी जैविक प्रभाव के कारण tripeptide कार्यरत हैं। इस काम में, RGD-क्रियाशील हाइड्रोजेल के संश्लेषण के एक मेहमाननवाज सेल microenvironment के लिए पर्याप्त जैव रासायनिक गुणों की विशेषता नेटवर्क डिजाइन करने के उद्देश्य से अध्ययन किया है।

हाइड्रोजेल संश्लेषण में माइक्रोवेव विकिरण के उपयोग के पक्ष प्रतिक्रियाओं को कम करने और उच्च प्रतिक्रिया दरों और पैदावार प्राप्त पारंपरिक थर्मल प्रक्रियाओं 10 की तुलना में समय की एक छोटी अवधि में करने के लिए एक सरल प्रक्रिया प्रदान करता है। इस विधि शुद्धि कदम और पॉलिमर की बातचीत और प्रतिक्रिया प्रणाली 11 में कार्बनिक विलायक के अभाव के कारण पैदावार बाँझ हाइड्रोजेल की आवश्यकता नहीं है। इसलिए, यह RGD के उच्च प्रतिशत क्योंकि कोई आधुनिक बहुलक नेटवर्क से जुड़े सुनिश्चित करता हैifications बहुलक रासायनिक जेल गठन में शामिल समूहों के लिए आवश्यक हैं। Carboxyl समूहों, PAA और carbomer, और हाइड्रॉक्सिल समूहों, खूंटी से और agarose से, एक polycondensation प्रतिक्रिया के माध्यम से हाइड्रोजेल तीन आयामी संरचना को जन्म दे। उल्लेख पॉलिमर रीढ़ की हड्डी में चोट की मरम्मत उपचार 12 में हाइड्रोजेल के संश्लेषण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इन उपकरणों के रूप में पिछले की रिपोर्ट में 13,14 काम करता है, उच्च biocompatibility के रूप में अच्छी तरह से यांत्रिक और भौतिक गुणों है कि कई जीवित ऊतकों के उन लोगों और thixotropic प्रकृति में समान दिखा। इसके अलावा, वे बगल में स्थानीय रहते हैं, इंजेक्शन के क्षेत्र में।

इस काम में, PAA carboxyl समूह एक alkyne आधा भाग के साथ संशोधित कर रहे हैं (चित्रा 1), और एक RGD-azide यौगिक संरचना (सीएच 2) एन के साथ एक तैयार रासायनिक यौगिक के साथ tripeptide टर्मिनल समूह राष्ट्रीय राजमार्ग 2 की जेट शोषण संश्लेषित है - एन 3 (<strong> चित्रा 2)। इसके बाद संशोधित PAA CuAAC क्लिक प्रतिक्रिया 15-17 (चित्रा 3) के माध्यम से RGD-azide व्युत्पन्न के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। एक तांबे (आई) उत्प्रेरक का उपयोग दोनों प्रतिक्रिया की दर और regioselectivity में प्रमुख सुधारों की ओर जाता है। CuAAC प्रतिक्रिया व्यापक रूप से कार्बनिक संश्लेषण में और बहुलक विज्ञान के क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है। यह कार्य समूहों के लिए उच्च क्षमता और उच्च सहिष्णुता को जोड़ती है, और यह कार्बनिक सॉल्वैंट्स के उपयोग से अप्रभावित है। एक उच्च चयनात्मकता, एक तेजी से प्रतिक्रिया समय और एक साधारण शोधन प्रक्रिया स्टार पॉलिमर, copolymers ब्लॉक या चेन वांछित moieties 18 ग्राफ्टिंग के ग्रहण अनुमति देते हैं। यह क्लिक रणनीति यह संभव अंतिम जैव रासायनिक आवेदन के अनुसार भौतिक गुणों को अनुकूलित करने polymerization के बाद पॉलिमर संशोधित करने के लिए बनाता है। CuAAC प्रयोगात्मक शर्तों आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य (प्रतिक्रिया, पानी के प्रति असंवेदनशील है जबकि तांबा ऑक्सीकरण न्यूनतम हो सकता है), और प्रकृति के हैंका गठन triazole उत्पाद की स्थिरता को सुनिश्चित करता है। तांबा धातु का उपयोग कोशिकाओं के खिलाफ अपनी क्षमता को विषाक्त प्रभाव के कारण और जैविक microenvironment में एक महत्वपूर्ण बिंदु पर विचार किया जा सकता है, लेकिन डायलिसिस उत्प्रेरक अवशेषों का पूरी तरह हटाने की अनुमति के लिए एक शोधन विधि के रूप में प्रयोग किया जाता है। अंत में, PAA संशोधित RGD हाइड्रोजेल संश्लेषण (चित्रा 4) और जिसके परिणामस्वरूप नेटवर्क के भौतिक गुणों में प्रयोग किया जाता है जांच कर रहे हैं क्रम में के रूप में कोशिकाओं या ड्रग्स वाहक इन प्रणालियों के संभावित कार्यक्षमता की जाँच करने के लिए।

आकृति 1
चित्रा 1: PAA alkyne संश्लेषण संशोधित alkyne समूह के साथ PAA functionalization की एक योजना;। "एन" carboxyl समूह propargylamine के साथ प्रतिक्रिया के साथ monomers इंगित करता है। देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

चित्र 2
चित्रा 2:।। RGD-azide संश्लेषण RGD-azide व्युत्पन्न के संश्लेषण के लिए यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: RGD-azide व्युत्पन्न और alkyne-PAA के बीच क्लिक प्रतिक्रिया की योजना पर क्लिक करें प्रतिक्रिया।। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: हाइड्रोजेल SYNThesis। RGD क्रियाशील हाइड्रोजेल संश्लेषण प्रक्रिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

नोट: रसायनों के रूप में प्राप्त किया जाता है। रैखिक RGD खरीदा जाता है, लेकिन यह मानक Fmoc ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण 16,19 द्वारा तैयार किया जा सकता है। सॉल्वैंट्स विश्लेषणात्मक ग्रेड के हैं। डायलिसिस एक एम डब्ल्यू कट-ऑफ 3,500 के बराबर दा के साथ झिल्ली के उपयोग की आवश्यकता है। संश्लेषित यौगिकों 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा एक क्लोरोफॉर्म का उपयोग कर 400 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर पर दर्ज (CDCl 3) या ड्यूटेरियम ऑक्साइड (डी ओ 2) विलायक के रूप में की विशेषता है, और रासायनिक पारियों मिलियन प्रति भागों में δ मूल्यों के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं। इसके अलावा, हाइड्रोजेल KBR गोली तकनीक का उपयोग फुट आईआर विश्लेषण के अधीन हैं और उनके शारीरिक लक्षण वर्णन 37 डिग्री सेल्सियस पर उल्टे टेस्ट ट्यूब का उपयोग मूल्यांकन जमाना पढ़ाई शामिल है।

1. 4-Azidobutanoyl के संश्लेषण क्लोराइड 1

  1. dimethylformamide के 0.5 मिलीलीटर 10 क्लोराइड की मिलीग्राम और 4-azidobutanoic एसिड (3.90 mmol) के 500 मिलीग्राम भंग।
  2. 0 डिग्री सेल्सियस पर समाधान कूल, एक बर्फ स्नान का उपयोग कर।
  3. क्लोराइड का 5 मिलीलीटर oxalyl क्लोराइड (5.85 mmol) के 505 μl जोड़ें और धीरे धीरे प्रतिक्रिया प्रणाली के लिए dropwise जोड़ने के लिए, जबकि क्रियाशीलता।
  4. 0 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के एक बर्फ स्नान इस्तेमाल करने के बाद, कमरे के तापमान पर लौटने।
  5. कम दबाव के तहत विलायक एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर निकालें।
  6. 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त उत्पाद की विशेषताएँ, CDCl 3 16 में नमूना भंग।

2. RGD-azide व्युत्पन्न 2 के संश्लेषण

  1. 1 एम NaOH के 1 मिलीलीटर में (0.145 mmol) RGD के 50 मिलीग्राम भंग।
  2. Tetrahydrofuran के 2 मिलीलीटर में 1 (0.16 mmol) के 24 मिलीग्राम भंग।
  3. एक बर्फ स्नान का उपयोग 0 डिग्री सेल्सियस पर समाधान 1 dropwise को RGD समाधान के सभी जोड़े।
  4. कमरे के तापमान पर लौटें और रात भर हलचल।
  5. 1 एम एचसीएल के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. कम दबाव के तहत विलायक एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर निकालें।
  7. OBT विशेषताएँained 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा उत्पाद, डी 2 हे 16 में नमूना भंग।

3. PAA alkyne संशोधन 3

  1. डब्ल्यू आसुत जल के 15 एमएल में Paa समाधान (2.8 mmol) w / 35% की 200 मिलीग्राम भंग।
  2. propargylamine हाइड्रोक्लोराइड (0.20 mmol) की 15.4 मिलीग्राम जोड़ें।
  3. 1 वी / वी acetonitrile: एक 1: 14 मिलीलीटर में (HOBt, 0.28 mmol) 1-hydroxybenzotriazole हाइड्रेट का 42.8 मिलीग्राम भंग 50 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने से आसुत जल समाधान।
  4. कमरे के तापमान पर PAA समाधान के लिए HOBt समाधान के सभी जोड़े।
  5. (ईडीसी, 0.28 mmol) ethyldimethylaminopropylcarbodiimide की 53.6 मिलीग्राम प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ें।
  6. 5.5 पीएच को समायोजित करने और कमरे के तापमान पर रात भर प्रतिक्रिया प्रणाली हलचल करने के लिए 1 एम एचसीएल का प्रयोग करें।
  7. समाधान Dialyze। आसुत जल के 2 एल में सोडियम क्लोराइड की 11.2 ग्राम भंग और फिर डब्ल्यू डब्ल्यू एचसीएल / 37% की 0.2 मिलीलीटर जोड़ें। समाधान के लिए एक एम डब्ल्यू 3.5 केडीए की कट-ऑफ के साथ एक झिल्ली का उपयोग कर Dialyze।
  8. perfoतीन दिनों के लिए आरएम डायलिसिस। हौसले से तैयार आसुत जल डब्ल्यू डब्ल्यू एचसीएल / 37% की 0.2 मिलीग्राम से युक्त के 2 एल के साथ दैनिक डायलिसिस समाधान बदलें।
  9. -80 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम समाधान स्टोर। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक lyophilizer में यह Lyophilize।
  10. 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा क्रियाशील बहुलक विशेषताएँ, डी 2 हे 16 में नमूना भंग।

4. PAA-RGD के संश्लेषण पॉलिमर 4

  1. भंग PAA के 78 मिलीग्राम आसुत जल के 10 मिलीलीटर में alkyne 3 (1.083 mmol) को संशोधित किया।
  2. Tetrahydrofuran के 5 मिलीलीटर में RGD azide 2 व्युत्पन्न (0.0722 mmol) के 25 मिलीग्राम भंग।
  3. बहुलक समाधान के लिए RGD समाधान के सभी जोड़े।
  4. तांबे आयोडाइड (0.0116 mmol) और (0.0111 mmol) सोडियम ascorbate के 2.2 मिलीग्राम की 2.2 मिलीग्राम जोड़ें।
  5. सरगर्मी के साथ 60 डिग्री सेल्सियस पर रात भर जिसके परिणामस्वरूप मिश्रण भाटा,।
  6. 25 डिग्री सेल्सियस के लिए मिश्रण ठंडा।
  7. Dialyzसमाधान ई। आसुत जल के 2 एल में सोडियम क्लोराइड की 11.2 ग्राम भंग और फिर डब्ल्यू डब्ल्यू एचसीएल / 37% की 0.2 मिलीलीटर जोड़ें। समाधान के लिए एक एम डब्ल्यू 3.5 केडीए की कट-ऑफ के साथ एक झिल्ली का उपयोग कर Dialyze।
  8. तीन दिनों के लिए डायलिसिस प्रदर्शन करना। हौसले से तैयार आसुत जल डब्ल्यू डब्ल्यू एचसीएल / 37% की 0.2 मिलीग्राम से युक्त के 2 एल के साथ दैनिक डायलिसिस समाधान बदलें।
  9. -80 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम समाधान स्टोर। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक lyophilizer में यह Lyophilize।
  10. 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त उत्पाद की विशेषताएँ, डी 2 हे 16 में नमूना भंग।

5. RGD-क्रियाशील हाइड्रोजेल संश्लेषण

  1. पीबीएस तैयार करें। आसुत जल का 50 मिलीलीटर में पीबीएस नमक की 645 मिलीग्राम भंग।
  2. , Carbomer के 40 मिलीग्राम और पीबीएस (5.1 कदम) के 9 मिलीलीटर में क्रियाशील PAA 4 के 10 मिलीग्राम मिश्रण कमरे के तापमान पर, पूरा विघटन (30 मिनट) तक।
  3. खूंटी के 400 मिलीग्राम समाधान के लिए जोड़ें और 45 मिनट के लिए सरगर्मी रखने के लिए।
  4. सरगर्मी बंद करो और प्रणाली 30 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं।
  5. 7.4 पीएच को समायोजित करने के लिए 1 एन NaOH का प्रयोग करें।
  6. प्राप्त मिश्रण के 5 मिलीलीटर करने के लिए, agarose पाउडर के 25 मिलीग्राम जोड़ें।
  7. उबलते, एक समय 30 सेकंड और 1 मिनट के बीच आम तौर पर जब तक 500 डब्ल्यू पर माइक्रोवेव विकिरण के साथ प्रणाली चमकाना, और electromagnetically 80 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी।
  8. मिश्रण कमरे के तापमान के संपर्क में छोड़ दो, जब तक उसके तापमान 50 डिग्री सेल्सियस तक कम हो जाती है और, पीबीएस (5.1 कदम) के 5 मिलीलीटर जोड़ने के क्रम में एक 1 पर एक समाधान प्राप्त करने के लिए: 1 बड़ा अनुपात।
  9. 1.1 सेमी की एक व्यास के साथ 12 multiwell स्टील सिलेंडर प्लेट युक्त तैयार करें।
  10. समाधान से 500 μl aliquots ले लो और उन्हें एक स्टील सिलेंडर के लिए जगह है।
  11. सिस्टम का पूरा gelification तक 45 मिनट के लिए आराम पर छोड़ दें।
  12. हाइड्रोजेल प्राप्त करने के लिए एक स्टेनलेस स्टील संदंश का उपयोग सिलेंडरों निकालें।

6. चिकित्सीय उपकरण के लोड हो रहा है (ड्रग या कोशिकाओं)

  1. दोहराएँ सेंट5.1-5.7 EPS।
  2. 1 बड़ा अनुपात: जब मिश्रण (पहले से ही सोल राज्य में) तक पहुँचता है 37 डिग्री सेल्सियस, क्रम में एक 1 पर एक अंतिम प्रणाली प्राप्त करने के लिए, समाधान वांछित दवा समाधान या सेल संस्कृति युक्त के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. दोहराएँ कदम 5.9-5.12 biocompounds शारीरिक रूप से जेल के भीतर फँस साथ बहुलक नेटवर्क प्राप्त करने के लिए।

7. हाइड्रोजेल विशेषता

  1. फुट आईआर विश्लेषण
    1. जेल गठन के बाद 24 घंटे के लिए आसुत जल के 2.5 मिलीलीटर में synthetized हाइड्रोजेल से एक लेना।
    2. जलीय मीडिया जहां हाइड्रोजेल डूबे हुए है निकालें और फ्रीज सूखे तरल एन 2 के साथ।
    3. KBR गोली तकनीक के अनुसार हाइड्रोजेल नमूना टुकड़े टुकड़े।
      1. एक रंग के KBR से भरा एक सुलेमानी मोर्टार में जोड़ें। हाइड्रोजेल नमूना की एक छोटी राशि ले लो और KBR पाउडर के साथ मिश्रण (KBR राशि, या बस रंग की नोक को कवर करने के लिए पर्याप्त के बारे में 0.1-2%)।
      2. मिश्रण पीस जब तक पाउडर ठीक है और समरूप है। </ Li>
      3. आईआर गोली फार्म के लिए KBR गोली किट का प्रयोग करें। पाउडर एक मैनुअल प्रयोगशाला प्रेस का उपयोग प्रेस: ​​दबाव क्षमता 10 टन की क्षमता के दबाव में 3 मिनट के लिए 5 टन के बराबर है और फिर से 3 मिनट के लिए।
      4. अंतिम गोली के रूप में सजातीय और दिखने में पारदर्शी प्राप्त करने के लिए दबाव जारी है। आईआर नमूना धारक में गोली डालें और स्पेक्ट्रम 16 रन।
  2. जमाना अध्ययन
    1. पीबीएस के 900 μl के साथ 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब भरें और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए संतुलित करना।
    2. तैयार बहुलक समाधान के 100 μl हाइड्रोजेल के रूप में और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते में जोड़े।
    3. ट्यूब पलटना और निरीक्षण जेल 1, 2, 5, 10 और 20 मिनट में बहती है। जो समय पर जेल जमाना समय के रूप में प्रवाह नहीं है रिकॉर्ड।

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Representative Results

PAA alkyne व्युत्पन्न कुशलता, polyacrylic एसिड और propargylamine से संश्लेषित रूप में चित्रा 1 जहाँ n monomers जिसका carboxyl समूहों अमाइन साथ प्रतिक्रिया लेबल में दिखाया गया है। उत्पाद की पहचान 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की है। चित्रा 5 PAA का 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम ट्रिपल बंधन के साथ संशोधित पता चलता है।

चित्रा 5
चित्रा 5: 1 एच एनएमआर PAA के स्पेक्ट्रम alkyne संशोधित alkyne आधा भाग से संबंधित संकेत प्रकाश डाला है।। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बहुलक श्रृंखला के संकेतों रेंज 2.75-1.50 पीपीएम में मनाया जा सकता है; 2.8 पर एक शिखर जबकि 0 पीपीएम, alkyne के एच के प्रतिनिधि, और 4.20 पीपीएम पर एक शिखर, -ch 2 का 2 एच से संबंधित है, propargyl आधा भाग विशेषताएँ। इस बात की पुष्टि करता है कि PAA ठीक से संशोधित किया गया है। Alkyne functionalization की डिग्री के मूल्यांकन (3.00 करने के लिए सेट मोनोमर प्रति hydrogens की संख्या के अनुसार), के रूप में चित्रा 5 में सचित्र PAA चोटियों के तहत क्षेत्र को एकीकृत करके बाहर किया गया है और propargyl आधा भाग। Functionalization की डिग्री है के रूप में गणना:

समीकरण

समीकरण propargyl अवशेषों का अभिन्न क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है, alkyne के एच क्षेत्र का योग (के रूप में चिह्नित समीकरण ) और -ch 2 क्षेत्र (के रूप में संकेत समीकरण ), जहाँ तकआयन "src =" / files / ftp_upload / 54445 / 54445eq5.jpg "/> संदर्भित करता बहुलक संकेतों के अभिन्न क्षेत्र के लिए। functionalization की डिग्री 10% होने की गणना की जाती है और यह विचार संतोषजनक हाइड्रोजेल संश्लेषण, जहां के अनुसार है PAA 3 डी नेटवर्क के रूप में अपने अवशिष्ट carboxyl समूहों के माध्यम से प्रतिक्रिया करने के लिए है। एक मात्रात्मक उपज संशोधित बहुलक 16 के लिए प्राप्त की है।

एक समान तरीके में, चित्रा 6 alkyne संशोधित PAA और RGD-azide के बीच CuAAC क्लिक प्रतिक्रिया के बाद उत्पाद का 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम से पता चलता है। 8.15 पीपीएम पर गठित triazole के शिखर पुष्टि करता है। कि प्रतिक्रिया एक मात्रात्मक उपज में होता है और RGD जोरदार PAA चेन से जुड़ा हुआ है चित्रा 6 PAA चेन और RGD की विशेषता संकेतों के सभी दिखाता है।

चित्रा 6
चित्रा 6:1 RGD के एच एनएमआर स्पेक्ट्रम PAA से जुड़े। Triazole का संकेत संकेत दिया है ( 'ए' के रूप में चिह्नित)। CuAAC क्लिक प्रतिक्रिया के माध्यम से RGD बहुलक functionalization किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

RGD-क्रियाशील हाइड्रोजेल माइक्रोवेव की सहायता मुफ्त कट्टरपंथी polymerization द्वारा चार पॉलिमर (PAA, carbomer, agarose और खूंटी) की रासायनिक पार से जोड़ने के माध्यम से तैयार कर रहे हैं। 80 डिग्री सेल्सियस के लिए एक उच्च ताप macromer गतिशीलता की ओर जाता है, और इस तरह पॉलिमर के carboxyl और हाइड्रॉक्सिल समूहों के बीच कम दूरी के अंतर सम्बन्ध को बढ़ाता है। esterification प्रतिक्रिया इन कार्य समूहों के बीच जगह लेता है और स्थानीय नेटवर्क "microgels" कहा जाता है पैदा करता है।

polycondensation आय प्रणाली चिपचिपाहट बढ़ जाती लगातार w के रूप मेंHile macromer प्रतिक्रियाशील साइटों के बीच बातचीत की संभावना कम हो जाती है। फिर भी, करीब कार्य समूहों अभी भी एक धीमी गतिशीलता के कारण कुशलता से बातचीत। जिसके परिणामस्वरूप भौतिक हालत microgel सतहों के बीच एक 'वेल्डिंग "कि हाइड्रोजेल के अंतिम 3 डी macrostructure पैदा करता है के द्वारा होती है। एस्टरीफिकेशन, हाइड्रोजन संबंध और carboxylation, सांख्यिकीय करीब बहुलक श्रृंखला लाना इस प्रकार एक स्थिर विषम संरचना का निर्माण। जिसके परिणामस्वरूप प्रणाली सोल / जेल व्यवहार दर्शाती है और यह 5 मिनट के भीतर एक जेल राज्य के लिए संक्रमण। इस समय अंतराल जमाना समय के रूप में सूचना दी है।

RGD-क्रियाशील हाइड्रोजेल की रासायनिक प्रकृति उपयोग कर रहा है अध्ययन फुट आईआर विश्लेषण। चित्रा 7 RGD-azide परिसर के फुट आईआर स्पेक्ट्रा (ग्रीन लाइन), हाइड्रोजेल RGD functionalization (काला लाइन) के बिना संश्लेषित के बीच तुलना से पता चलता है, और पेप्टाइड संशोधन (नीली रेखा) के साथ हाइड्रोजेल। हाइड्रोजेल कल्पनाटीआरए दोनों 3,600-3,200 सेमी में एक व्यापक संकेत -1 रेंज, अवशिष्ट ओह बांड की खींच कंपन के प्रतिनिधि द्वारा और एक चोटी 2,940 के आसपास सेमी -1 सीएच खिंचाव के द्वारा विशेषता है। मान्यता है कि एस्टरीफिकेशन carboxyl और हाइड्रॉक्सिल बहुलक समूहों के बीच होता है, 1600 सेमी -1 और 1400 सेमी -1 के आसपास चोटियों द्वारा दिया जाता है इसी क्रमश: सीओ 2 आधा भाग के सममित और असममित खींच लिए। इन चोटियों, गैर क्रियाशील हाइड्रोजेल के स्पेक्ट्रम में अधिक दिखाई दे रहे हैं, जबकि RGD-हाइड्रोजेल स्पेक्ट्रम में वे आंशिक रूप से संकेतों एमाइड बैंड के रूप में संकेत मैं और द्वितीय द्वारा कवर कर रहे हैं।

चित्रा 7
चित्रा 7:। फुट आईआर स्पेक्ट्रा की तुलना RGD (ग्रीन लाइन) के फुट आईआर स्पेक्ट्रा, RGD functionalization (काला लाइन) और RGD क्रियाशील हाइड्रोजेल (नीली रेखा) के बिना हाइड्रोजेल।एमाइड RGD संकेत दिया है से संबंधित संकेत। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सी की खींच = हे, एमाइड बैंड मैं ( "Amide मैं" चित्रा 7 में) के रूप में लेबल, 1650 सेमी में एक चोटी -1 tripeptide स्पेक्ट्रम में प्रस्तुत करता है और यह 1,670 के बारे में सेमी करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है -1 RGD-हाइड्रोजेल नमूने में । राष्ट्रीय राजमार्ग के झुकने, (चित्रा 7 में "Amide द्वितीय") एमाइड बैंड द्वितीय से संबंधित, 1550 सेमी चारों ओर संकेत के साथ दर्ज किया जा सकता है -1 RGD स्पेक्ट्रम में है और यह भी हाइड्रोजेल नमूने में पहचानने योग्य है, लगभग 1600 सेमी में - 1। क्योंकि वहाँ मानक हाइड्रोजेल तैयार करने में कोई एमाइड घटक हैं, एक amidic प्रकृति की चोटियों की उपस्थिति पता चलता है कि वास्तव में PAA RGD साथ क्रियाशील है और यह बहुलक नेटवर्क के भीतर पेप्टाइड साइटों के साथ एक हाइड्रोजेल बनाने में सक्षम है।

हाइड्रोजेल फुट आईआर स्पेक्ट्रम भी agarose की मोनोसैकराइड इकाइयों और एस्टर समूहों के बीच glycosidic बांड की COC की खींच कंपन से संबंधित चोटियों (900-1,000 सेमी -1 रेंज) से पता चलता है।

3 डी संरचना और इन हाइड्रोजेल की शारीरिक और यांत्रिक गुणों, SEM विश्लेषण, जमाना में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, सूजन कैनेटीक्स और rheological अध्ययनों से प्रदर्शन कर रहे हैं, के रूप में पिछले कार्यों 13,20 में चर्चा की। SEM परिणाम (चित्रा 8) बताते हैं कि हाइड्रोजेल कुछ बड़ा ताकना दीवारों पर और pores छोटे pores युक्त कुछ fibrillar नेटवर्क के साथ एक जटिल सूक्ष्म संरचना की विशेषता है। इसके अलावा, pores के सबसे जुड़े रहे हैं। उलझ संरचना एक ही तरीके से लेकिन RGD functionalization के बिना तैयार हाइड्रोजेल की 3 डी नेटवर्क के समान है। यह दर्शाता है कि RGD बहुलक नेटवर्क में परिवर्तन नहीं करता। उल्टे टेस्ट ट्यूब परीक्षण का उपयोग करना, हाइड्रोजेल रों5 मिनट के भीतर पर्याप्त solidifies, RGD functionalization 21 बिना हाइड्रोजेल नमूने में मनाया जाता है। इस छोटे से जमाना समय जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए अपनी उपयुक्तता रेखांकित करता है।

आंकड़ा 8
8 चित्रा:।। SEM विश्लेषण SEM छवियों को एक RGD-क्रियाशील हाइड्रोजेल नमूना (ए) और बिना functionalization (बी) के एक हाइड्रोजेल की आकृति विज्ञान दिखाने के लिए यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सूजन संतुलन अनुपात को अवशोषित और पानी की एक बड़ी राशि बनाए रखने की क्षमता को इंगित करता है और यह हाइड्रोजेल सिस्टम 20,22 के प्रमुख विशेषताओं में से एक है। विश्लेषण किया नमूने तेजी कैनेटीक्स सूजन प्रदर्शन और वे पहले घंटे के भीतर संतुलन सूजन तक पहुँचने। उनका प्रफुल्लितआईएनजी संतुलन मूल्य क्यू हमारे पिछले काम 16 में सूचना दी है और यह RGD बिना हाइड्रोजेल के विश्लेषण से प्राप्त मूल्य के समान है, इस बात की पुष्टि है कि tripeptide बहुलक नेटवर्क के साथ एकीकृत है और जमाना प्रक्रिया के लिए एक उच्च बाधा पैदा नहीं करता है।

Rheological पढ़ाई के साथ, जेल भंडारण मापांक (G'), नुकसान मापांक (G'') की तुलना में अधिक परिमाण के लगभग एक आदेश हो पाया है एक लोचदार बजाय चिपचिपा पदार्थ 23 का संकेत है और दोनों अनिवार्य आवृत्ति से स्वतंत्र हैं। G'और G'' के समान मूल्यों एक पेप्टाइड संशोधन 16 के बिना जेल नमूने के साथ दर्ज हैं। यह दर्शाता है कि बहुलक नेटवर्क के भीतर RGD की उपस्थिति सामग्री के rheological गुणों को प्रभावित नहीं करता है, जैव चिकित्सा आवेदन के लिए इंजेक्शन प्रणाली के लिए प्रतिस्पर्धा अजीब सुविधाओं को बनाए रखने।

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Acknowledgements

लेखक भाषा संपादन के लिए सार्थक चर्चा के लिए प्रो Maurizio मासी और मिस चियारा Allegretti को धन्यवाद देना चाहूंगा। लेखक 'अनुसंधान Bando जिओवानी Ricercatori 2010 (Ministero डेला सलाम GR-2010- 2312573) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(acrylic acid) solution average Mw ~100,000, 35 wt% in H2O Sigma Aldrich 523925 CAS 9003-01-4
Poly(ethylene glycol) 2,000 Sigma Aldrich 84797 CAS 25322-68-3
Carbomeer 974P Fagron 1387083
Agarose  Invitrogen Corp. 16500-500 UltraPure Agarose
RGD peptide abcam ab142698
4-azidobutanoic acid Aurum Pharmatech Z-2421  CAS 54447-68-6
Oxalyl chloride Sigma Aldrich O8801 CAS 79-37-8
Propargylamine hydrochloride 95% Sigma Aldrich P50919 CAS 15430-52-1
Copper(I) iodide Sigma Aldrich 3140 CAS 7681-65-4
Sodium ascorbate Sigma Aldrich Y0000039 CAS 134-03-2
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417
Dialysis Membrane Spectrum Laboratories, Inc. 132725 Spectra/Por 3 Dialysis Membrane  Standard RC Tubing
MWCO: 3.5 kD

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References

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