De synthese van RGD-gefunctionaliseerde Hydrogels als een instrument voor therapeutische toepassingen

1Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering "Giulio Natta", Politecnico di Milano
Published 10/07/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Mauri, E., Sacchetti, A., Rossi, F. The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications. J. Vis. Exp. (116), e54445, doi:10.3791/54445 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Hydrogelen driedimensionale netwerken gevormd door hydrofiele verknoopte polymeren, die natuurlijk of synthetisch, en gekenmerkt door een opvallende driedimensionale structuur. Deze apparaten zijn steeds aantrekkelijker in de biomedische gebied van drug delivery, tissue engineering, gen vervoerders en slimme sensoren 1,2. Inderdaad, het hoge watergehalte, evenals hun reologische en mechanische eigenschappen maken ze geschikte kandidaten zacht weefsel micromilieus nabootsen en ze doeltreffende instrumenten voor in water oplosbare cytokine of groeifactor levering. Een van de meest veelbelovende toepassing is als een injecteerbaar biomateriaal dragende cellen en bioactieve stoffen. Hydrogels kunnen celoverleving en controle stamcellen lot verbeteren door het houden en precies leveren van stamcellen regulerende signalen in een fysiologisch relevante manier, zoals waargenomen in in vitro en in vivo experimenten 3,4. De belangrijkste voordeel hiervan is de mogelijkheidgeïnjecteerde cellen in de zone van inoculatie (in situ) te handhaven, het minimaliseren van de hoeveelheid cellen die de stippellijn extravasates bladeren in de bloedsomloop stroom, migreren over het hele lichaam en verliest de goalmuur 5. De stabiliteit van de hydrogel driedimensionale netwerken vanwege de verknopingsplaatsen, gevormd door covalente bindingen of cohesieve krachten tussen de polymeerketens 6.

In dit kader, orthogonale selectieve chemie toegepast op polymeerketens is een veelzijdige tool in staat om hydrogel voorstellingen 7 verbeteren. Inderdaad, kan de modificatie van polymeren met geschikte chemische groepen leiden tot goede chemische, fysische en mechanische eigenschappen te verschaffen levensvatbaarheid van de cellen en hun gebruik in weefselvorming verbeteren. Op dezelfde wijze, onder de technieken om cellen of groeifactoren laden in de gelmatrix, het gebruik van de RGD peptide maakt verbeteringen in celadhesie en overleving. RGD tripeptide is bestaandevan arginine, glycine en asparaginezuur, die veruit de meest effectieve en vaak werkzaam tripeptide vanwege zijn vermogen om meerdere celadhesie receptoren richten en de biologische gevolgen cel verankering, en de levensvatbaarheid 8,9. In dit werk, is de synthese van RGD-gefunctionaliseerd hydrogels bestudeerd met als doel het ontwerpen netwerken gekenmerkt door voldoende biochemische eigenschappen voor een gastvrije micro cel.

Het gebruik van microgolfstraling in hydrogel synthese biedt een eenvoudige procedure om nevenreacties te minimaliseren en het verkrijgen van hogere reactiesnelheden en opbrengsten in een kortere tijdsperiode in vergelijking met de conventionele thermische processen 10. Deze methode niet zuiveringsstappen en opbrengsten steriele hydrogels vanwege de interactie van de polymeren en de afwezigheid van organisch oplosmiddel in het 11 reactiesysteem vereisen. Daarom verzekert hoge percentages RGD gekoppeld aan het polymeernetwerk, omdat er geen modcaties nodig zijn om het polymeer chemische groepen die deze gelvorming. Carboxylgroepen van PAA en carbomeer en hydroxylgroepen van PEG en agarose, geven aanleiding tot de hydrogel driedimensionale structuur door een polycondensatiereactie. De genoemde polymeren worden toegepast voor de synthese van hydrogelen in het ruggenmergletsel reparatie 12 behandelingen. Deze apparaten, zoals in eerdere werken 13,14, vertonen een hoge biocompatibiliteit en mechanische en fysisch-chemische eigenschappen die die van vele levende weefsels en thixotrope aard lijken. Bovendien blijven zij gelokaliseerd in situ op het gebied van de injectie.

In dit werk worden PAA carboxylgroepen gemodificeerd met een alkynrest (figuur 1), en een RGD-azide verbinding gesynthetiseerd gebruikmakend van de reactiviteit van het tripeptide eindgroep NH2 met een vervaardigde chemische verbinding met de structuur (CH2) n - N 3 (<strong> Figuur 2). Vervolgens worden de gewijzigde PAA reageert met de RGD-azide vorm via CuAAC click reactie 15-17 (figuur 3). Het gebruik van een koper (I) -katalysator leidt tot belangrijke verbeteringen in zowel de reactiesnelheid en de regioselectiviteit. De CuAAC reactie wordt op grote schaal gebruikt in de organische synthese en in Polymer Science. Combineert een hoge efficiëntie en een hoge tolerantie voor de functionele groepen en het is beïnvloed door het gebruik van organische oplosmiddelen. Een hoge selectiviteit, een snelle reactietijd en een eenvoudige zuivering procedure laat het verkrijgen van stervormige polymeren, blokcopolymeren of kettingen enten gewenste delen 18. Deze klik strategie maakt het mogelijk om polymeren te wijzigen na polymerisatie de fysisch-chemische eigenschappen aanpassen aan biochemische uiteindelijke toepassing. De CuAAC experimentele omstandigheden gemakkelijk reproduceerbaar (de reactie is ongevoelig voor water, terwijl koper oxidatie minimaal optreden) en de aard vangevormd triazool zorgt voor stabiliteit van het product. Het gebruik van koper metaal kan worden beschouwd als een kritisch punt, vanwege de mogelijke toxische effect tegen cellen en in de biologische micro-omgeving, maar dialyse wordt gebruikt als een zuiveringswerkwijze om de volledige verwijdering van katalytische residuen mogelijk. Tenslotte PAA gemodificeerde RGD wordt gebruikt in de synthese hydrogel (figuur 4) en de fysisch-chemische eigenschappen van de resulterende netwerken worden onderzocht, teneinde de mogelijke functies van deze systemen cellen of geneesmiddelen dragers controleren.

Figuur 1
Figuur 1: PAA gemodificeerd alkyn synthese van een schema van PAA functionalisering met alkyngroep;. "n" geeft de monomeren met carboxylgroep reageren met propargylamine. Klik hier om te bekijkeneen grotere versie van deze figuur.

Figuur 2
Figuur 2:.. RGD-azide synthese De synthese van RGD-azidederivaat Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Klik reactie Scheme of klik reactie tussen RGD-azide derivaat en alkyn-PAA.. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Hydrogel synthesis. RGD gefunctionaliseerde hydrogel synthese procedure. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: De chemicaliën worden gebruikt zoals ontvangen. Lineair RGD wordt gekocht, maar het kan worden bereid met standaard Fmoc vaste fase peptidesynthese 16,19. Oplosmiddelen zijn van analytische kwaliteit. De dialyse vereist het gebruik van een membraan met Mw cut-off gelijk aan 3500 Da. De gesynthetiseerde verbindingen worden gekenmerkt door 1H NMR-spectra opgenomen op een 400 MHz spectrometer met chloroform (CDCI3) of deuteriumoxide (D2O) als oplosmiddelen en chemische verschuivingen worden weergegeven als δ waarden in ppm. Bovendien zijn hydrogels onderworpen FT-IR analyse met KBr pellet techniek en de fysische karakterisering omvat gelering studies vastgesteld met behulp van omgekeerde reageerbuis bij 37 ° C.

1. Synthese van 4-Azidobutanoyl Chloride 1

  1. Los 500 mg 4-azidobutanoic zuur (3,90 mmol) in 10 ml dichloormethaan en 0,5 ml dimethylformamide.
  2. Koel de oplossing bij 0 ° CMet behulp van een ijsbad.
  3. Voeg 505 ul oxalylchloride (5,85 mmol) tot 5 ml dichloormethaan en voeg langzaam druppelsgewijs aan het reactiesysteem, onder roeren.
  4. Na 1 uur bij 0 ° C met een ijsbad, op kamertemperatuur.
  5. Verwijder het oplosmiddel onder verlaagde druk met een rotatieverdamper.
  6. Karakteriseren het verkregen product door 1H-NMR spectroscopie, oplossen van het monster in CDCl3 16.

2. Synthese van RGD-azidederivaat 2

  1. Los 50 mg van RGD (0,145 mmol) in 1 ml 1 M NaOH.
  2. Los 24 mg van 1 (0,16 mmol) in 2 ml tetrahydrofuran.
  3. Voeg alle RGD oplossing bij oplossing 1 druppelsgewijs bij 0 ° C met een ijsbad.
  4. Keer terug naar kamertemperatuur en roer gedurende de nacht.
  5. Voeg 1 ml 1 M HCl.
  6. Verwijder het oplosmiddel onder verlaagde druk met een rotatieverdamper.
  7. Kenmerkend zijn voor de OBTained product door 1H-NMR spectroscopie, oplossen van het monster in D2O 16.

3. PAA Acetyleenalkoholen Wijziging 3

  1. Oplossen 200 mg 35% w / w PAA-oplossing (2,8 mmol) in 15 ml gedestilleerd water.
  2. Voeg 15,4 mg propargylamine hydrochloride (0,20 mmol).
  3. Oplossen van 42,8 mg 1-hydroxybenzotriazool hydraat (HOBt, 0,28 mmol) in 14 ml van een 1: 1 v / v acetonitril: wateroplossing gedestilleerd door verhitting tot 50 ° C.
  4. Voeg alle HOBt oplossing PAA oplossing bij kamertemperatuur.
  5. Voeg 53,6 mg ethyldimethylaminopropylcarbodiimide (EDC, 0,28 mmol) aan het reactiemengsel.
  6. Met 1 M HCl om de pH op 5,5 en overnacht roeren het reactiesysteem bij kamertemperatuur.
  7. Dialyseer de oplossing. Ontbinden 11,2 g natriumchloride in 2 liter gedestilleerd water en voeg 0,2 ml van 37% w / w HCl. Dialyseren de oplossing met behulp van een membraan met een Mw cut-off van 3,5 kDa.
  8. Perform dialyse gedurende drie dagen. Wijzig de dialyseoplossing daags met 2 liter vers bereide gedestilleerd water dat 0,2 ml van 37% w / w HCl.
  9. Bewaar de uiteindelijke oplossing bij -80 ° C. Lyofiliseren in een vriesdroger volgens de protocollen van de fabrikant.
  10. Karakteriseren het gefunctionaliseerde polymeer met 1H-NMR spectroscopie, oplossen van het monster in D2O 16.

4. Synthese van PAA-RGD Polymer 4

  1. Los op 78 mg PAA gemodificeerde alkyn 3 (1,083 mmol) in 10 ml gedestilleerd water.
  2. Los 25 mg van de RGD azide 2 derivaat (0,0722 mmol) in 5 ml tetrahydrofuran.
  3. Voeg alle RGD oplossing van de polymeeroplossing.
  4. Voeg 2,2 mg koper jodide (0,0116 mmol) en 2,2 mg natriumascorbaat (0,0111 mmol).
  5. Reflux het resulterende mengsel een nacht bij 60 ° C onder roeren.
  6. Koel het mengsel tot 25 ° C.
  7. Dialyze de oplossing. Ontbinden 11,2 g natriumchloride in 2 liter gedestilleerd water en voeg 0,2 ml van 37% w / w HCl. Dialyseren de oplossing met behulp van een membraan met een Mw cut-off van 3,5 kDa.
  8. Uitvoeren dialyse gedurende drie dagen. Wijzig de dialyseoplossing daags met 2 liter vers bereide gedestilleerd water dat 0,2 ml van 37% w / w HCl.
  9. Bewaar de uiteindelijke oplossing bij -80 ° C. Lyofiliseren in een vriesdroger volgens de protocollen van de fabrikant.
  10. Karakteriseren het verkregen product door 1H-NMR spectroscopie, oplossen van het monster in D2O 16.

5. RGD-gefunctionaliseerde Hydrogel Synthesis

  1. Bereid de PBS. Oplossen 645 mg PBS zout in 50 ml gedestilleerd water.
  2. Blend 40 mg carbomeer en 10 mg gefunctionaliseerde PAA 4 in 9 ml PBS (stap 5,1), bij kamertemperatuur tot volledige oplossing (30 min).
  3. Voeg 400 mg van PEG aan de oplossing en blijf roeren gedurende 45 min.
  4. Stop de roeren en laat het systeem te regelen voor 30 min.
  5. Met 1 N NaOH om de pH op 7,4.
  6. Tot 5 ml van het verkregen mengsel, voeg 25 mg agarose poeder.
  7. Bestralen van het systeem met microgolfstraling op 500 W tot het kookpunt, gedurende een tijd gewoonlijk tussen 30 seconden en 1 minuut, en elektromagnetisch verwarmen tot 80 ° C.
  8. Laat het mengsel blootgesteld aan kamertemperatuur tot de temperatuur daalt tot 50 ° C en voeg 5 ml PBS (stap 5,1), om een ​​oplossing met een 1 te verkrijgen: 1 volumetrische verhouding.
  9. Bereid 12 multiwell plaat met stalen cilinders met een diameter van 1,1 cm.
  10. Neem 500 ul aliquots van de oplossing en leg ze aan elke stalen cilinders.
  11. Laat rusten gedurende 45 min tot volledige gelering van het systeem.
  12. Verwijder de cilinders met een roestvrijstalen tang om de hydrogels te verkrijgen.

6. Laden van Therapeutische Tool (Drug of cellen)

  1. Herhaal steps 5,1-5,7.
  2. Wanneer het mengsel (reeds sol state) 37 ° C bereikt, voeg 5 ml van de oplossing die de gewenste geneesmiddeloplossing of celkweek, teneinde een uiteindelijke systeem verkrijgen tegen een 1: 1 volumeverhouding.
  3. Herhaal stap 5,9-5,12 polymere netwerken biocompounds fysiek ingesloten in de gel te verkrijgen.

7. Hydrogel karakterisering

  1. FT-IR analyse
    1. Na gelvorming, geniet een van de gesynthetiseerde hydrogels in 2,5 ml gedestilleerd water gedurende 24 uur.
    2. Verwijder de waterige media waar de hydrogel is ondergedompeld en vries-droog met vloeibare N2.
    3. Laminaat de hydrogel monster volgens KBr pellet techniek.
      1. Voeg een spatel vol KBr in een agaat mortier. Neem een ​​kleine hoeveelheid hydrogel monster (ongeveer 0,1-2% van de KBr bedrag of net genoeg te dekken het uiteinde van spatel) en meng met de KBr poeder.
      2. Maal het mengsel totdat het poeder is fijn en homogeen is. </ Li>
      3. Gebruik de KBr pellet kit om de IR pellet. Druk het poeder met behulp van een handmatige laboratorium pers: gedurende 3 minuten bij een druk gelijk aan 5 ton en vervolgens gedurende 3 minuten bij een druk van 10 ton.
      4. Laat de druk om de uiteindelijke pellet zo homogeen en doorzichtig in uiterlijk verkrijgen. Steek de pellet in de IR-sample houder en start het spectrum 16.
  2. geleren Studies
    1. Vul 2 ml microcentrifugebuis met 900 pl PBS en equilibreren tot 37 ° C.
    2. Voeg 100 ul van de bereide polymeeroplossing de hydrogel en incubeer bij 37 ° C.
    3. Inverteer de buis en waarnemen als de gel bij 1, 2, 5, 10 en 20 min stromen. Noteer het tijdstip waarop de gel niet de geleringstijd doet stromen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De PAA alkyn derivaat efficiënt gesynthetiseerd uit polyacrylzuur en propargylamine, zoals getoond in figuur 1 waarbij n labelt de monomeren waarvan de carboxylgroepen reageren met het amine. De identiteit van het product wordt bevestigd door 1H-NMR spectroscopie. Figuur 5 toont het 1H-NMR spectrum van PAA gemodificeerd met drievoudige binding.

figuur 5
Figuur 5: 1 H-NMR-spectrum van de PAA gemodificeerde alkyn Het signaal met betrekking tot de alkynrest is gemarkeerd.. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De signalen van de polymeerketen kan worden waargenomen in het traject 2,75-1,50 ppm; terwijl een piek op 2,8 0 ppm, representatief alkyn H's en een piek bij 4,20 ppm met betrekking tot de 2 H, -CH 2, kenmerken de propargyl groep. Dit bevestigt dat PAA goed is aangepast. De evaluatie van de mate van alkyn functionalisatie werd uitgevoerd door integratie van het gebied onder de PAA pieken uitgevoerd (ingesteld op 3,00, afhankelijk van het aantal waterstofatomen per monomeer) en propargyl groep, zie figuur 5. De mate van functionalisering f berekend:

Vergelijking

Vergelijking vertegenwoordigt het integrale gebied van de propargyl residu, de som van de specifieke H alkyn's (aangeduid als Vergelijking ) En -CH 2 gebied (aangeduid als Vergelijking ), terwijlion "src =" / files / ftp_upload / 54.445 / 54445eq5.jpg "/> verwijst naar de integraal deel van het polymeer signalen. De mate van functionalisatie berekend 10% te zijn en het is bevredigend acht volgens de hydrogel synthese, waarbij PAA moet hierop reageren door de resterende carboxylgroepen van de 3D netwerk. Een kwantitatieve opbrengst verkregen voor het gemodificeerde polymeer 16.

Op soortgelijke wijze, Figuur 6 toont het 1H-NMR spectrum van het product na de CuAAC click reactie tussen de alkyn gemodificeerde PAA en RGD-azide. De piek van de gevormde triazool bij 8,15 ppm bevestigt dat de reactie plaatsvindt in een kwantitatieve opbrengst en RGD is sterk verbonden met de PAA-ketens. Figuur 6 toont alle kenmerkende signalen van het PAA-keten en de RGD.

figuur 6
Figuur 6:1 H-NMR-spectrum van de RGD verband met PAA. Het signaal van triazool wordt aangegeven (aangeduid als "A"). RGD polymeer functionalisering via CuAAC klik reactie wordt uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

RGD-gefunctionaliseerde hydrogels worden bereid door chemische verknoping van de vier polymeren (PAA, carbomeer, agarose en PEG) door vrije radicaalpolymerisatie van microgolven. Verhitting tot 80 ° C leidt tot een hogere mobiliteit macromeer, en vergroot dus de korte afstand verbindingen tussen de carboxyl- en hydroxylgroepen van de polymeren. De veresteringsreactie vindt plaats tussen deze functionele groepen en produceert lokale netwerken genoemd "microgelen".

Als de polycondensatie opbrengst, de viscositeit systeem continu toeneemt, while de kans op interactie tussen macromeer reactieve plaatsen vermindert. Niettemin hoe dichter functionele groepen nog efficiënt samenwerken door een langzamere mobiliteit. De resulterende fysisch-chemische toestand wordt gekenmerkt door een "las" microgel tussen oppervlakken die het definitieve 3D macrostructuur van de hydrogel veroorzaakt. De verestering, waterstofbinding en carboxylering brengen de polymeerketens statistisch dichterbij, waardoor een stabiele heterogene structuur. Het resulterende systeem vertoont sol / gel gedrag en het overgangen naar een gel staat binnen 5 min. Dit tijdsinterval wordt gerapporteerd als geleringstijd.

De chemische aard van de RGD-gefunctionaliseerde hydrogels wordt bestudeerd met behulp van FT-IR analyse. Figuur 7 toont de vergelijking tussen de FT-IR spectra van de RGD-azide verbinding (groene lijn), de hydrogel bereid zonder RGD functionalisering (zwarte lijn) en de hydrogel met peptide modificatie (blauwe lijn). De hydrogel spectra worden beide gekenmerkt door een breed signaal in het 3,600-3,200 cm -1 bereik vertegenwoordiger van de strekvibratie van de resterende OH bindingen en een piek rond 2940 cm -1 van de CH rek. De validatie verestering optreedt tussen de carboxyl- en hydroxylgroepen polymeergroepen wordt gegeven door de pieken rond 1600 cm -1 en 1400 cm -1, was respectievelijk de symmetrische en asymmetrische uitrekken CO 2 groep. Deze pieken zijn beter zichtbaar in het spectrum van de niet-gefunctionaliseerde hydrogel, terwijl de RGD-hydrogel spectrum zij worden gedeeltelijk onder de aangegeven amide banden I en II signalen.

figuur 7
Figuur 7:. Vergelijking van de FT-IR-spectra FT-IR spectra van RGD (groene lijn), hydrogel zonder RGD functionalisering (zwarte lijn) en de RGD gefunctionaliseerde hydrogel (blauwe lijn). Designaal met betrekking tot de amide RGD wordt aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het strekken van C = O, aangeduid als amide band I ( "Amide I 'in figuur 7), presenteert een piek bij 1650 cm -1 in het tripeptide spectrum en wordt verschoven naar ongeveer 1670 cm -1 in de RGD-hydrogel sample . Het buigen van NH, gerelateerd aan amide II band ( "Amide II 'in figuur 7) kan worden opgenomen met het signaal rond 1550 cm -1 in de RGD spectrum en het is ook herkenbaar in de hydrogel monster op ongeveer 1600 cm - 1. Omdat er geen amide componenten in de standaard hydrogelformulering, de aanwezigheid van pieken van een amide aard suggereert dat de PAA echt gefunctionaliseerd met de RGD en in staat is een hydrogel met peptide sites in het polymere netwerk.

De hydrogel FT-IR-spectrum toont ook de pieken betrekking tot de strekvibratie van COC glycosidische binding (900-1,000 cm -1 bereik) tussen de monosacharide-eenheden van de agarose en estergroepen.

Om inzicht te krijgen in de 3D-structuur en de fysische en mechanische eigenschappen van deze hydrogels, SEM-analyse, geleren, zwelling kinetiek en rheologische studies worden uitgevoerd, zoals besproken in de vorige werkt 13,20. SEM resultaten (Figuur 8) blijkt dat hydrogels worden gekenmerkt door een complexe microscopische structuur met een aantal grotere poriën met kleine poriën en sommige vezelachtige netwerken op de poriewanden. Bovendien zijn de meeste van de poriën zijn verbonden. De verknoopte structuur is vergelijkbaar met het 3D-netwerk van hydrogelen bereid op dezelfde manier, maar zonder RGD functionalisering. Hieruit blijkt dat de RGD het polymeernetwerk niet verandert. Met de omgekeerde reageerbuis test, de hydrogel svoldoende stolt binnen 5 minuten, zoals waargenomen in de hydrogel monster zonder RGD functionalisering 21. Deze korte geleringstijd onderstreept de geschiktheid voor biomedische toepassingen.

Figuur 8
Figuur 8:.. SEM-analyse SEM beelden tonen de morfologie van een RGD-gefunctionaliseerd hydrogel monster (A) en een hydrogel zonder functionalisering (B) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De zwelling evenwichtsverhouding geeft het absorptievermogen en behouden van een grote hoeveelheid water en het is een van de belangrijkste kenmerken van hydrogelenystemen 20,22. De geanalyseerde monsters vertonen snel zwelling kinetiek en ze reach zwelling evenwicht binnen het eerste uur. hun deininging evenwichtswaarde Q vermeld in ons eerder werk 16 en het is vergelijkbaar met de verkregen door analyse van hydrogels zonder RGD waarde bevestigd dat het tripeptide is geïntegreerd met het polymere netwerk en geen grote belemmering voor de gelering proces.

De reologische onderzoeken werd de gel opslagmodulus (G') gevonden ongeveer een orde van grootte hoger dan de verliesmodulus (G''), wat inhoudt een elastisch dan viskeus materiaal 23 en beide zijn niet afhankelijk van de frequentie. Vergelijkbare waarden van G'en G'' worden opgenomen met de gel monster zonder een peptide wijziging 16. Hieruit blijkt dat de aanwezigheid van RGD in het polymere netwerk beïnvloedt de rheologische eigenschappen van het materiaal, het behoud van de bijzondere kenmerken concurreren om injecteerbaar systeem voor biomedische toepassing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Auteurs danken Prof. Maurizio Masi voor een vruchtbare discussie en Miss Chiara Allegretti voor taal bewerken. onderzoek auteurs wordt ondersteund door Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010- 2312573).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(acrylic acid) solution average Mw ~100,000, 35 wt% in H2O Sigma Aldrich 523925 CAS 9003-01-4
Poly(ethylene glycol) 2,000 Sigma Aldrich 84797 CAS 25322-68-3
Carbomeer 974P Fagron 1387083
Agarose  Invitrogen Corp. 16500-500 UltraPure Agarose
RGD peptide abcam ab142698
4-azidobutanoic acid Aurum Pharmatech Z-2421  CAS 54447-68-6
Oxalyl chloride Sigma Aldrich O8801 CAS 79-37-8
Propargylamine hydrochloride 95% Sigma Aldrich P50919 CAS 15430-52-1
Copper(I) iodide Sigma Aldrich 3140 CAS 7681-65-4
Sodium ascorbate Sigma Aldrich Y0000039 CAS 134-03-2
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417
Dialysis Membrane Spectrum Laboratories, Inc. 132725 Spectra/Por 3 Dialysis Membrane  Standard RC Tubing
MWCO: 3.5 kD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A. Hydrogels in Regenerative Medicine. Adv. Mater. 21, (32-33), 3307-3329 (2009).
  2. Rossi, F., Perale, G., Papa, S., Forloni, G., Veglianese, P. Current options for drug delivery to the spinal cord. Expert Opin. Drug Deliv. 10, (3), 385-396 (2013).
  3. Huebsch, N., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9, (6), 518-526 (2010).
  4. Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Repair of the injured spinal cord by transplantation of neural stem cells in a hyaluronan-based hydrogel. Biomaterials. 34, (15), 3775-3783 (2013).
  5. Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat. Mater. 12, (5), 458-465 (2013).
  6. Ashley, G. W., Henise, J., Reid, R., Santi, D. V. Hydrogel drug delivery system with predictable and tunable drug release and degradation rates. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, (6), 2318-2323 (2013).
  7. Rossi, F., van Griensven, M. Polymer Functionalization as a Powerful Tool to Improve Scaffold Performances. Tissue Eng. Part A. 20, (15-16), 2043-2051 (2014).
  8. Gould, S. T., Darling, N. J., Anseth, K. S. Small peptide functionalized thiol-ene hydrogels as culture substrates for understanding valvular interstitial cell activation and de novo tissue deposition. Acta Biomater. 8, (9), 3201-3209 (2012).
  9. Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. Wavelength-Controlled Photocleavage for the Orthogonal and Sequential Release of Multiple Proteins. Angew. Chem. Int. Edit. 52, (51), 13803-13807 (2013).
  10. Larrañeta, E., et al. Microwave-Assisted Preparation of Hydrogel-Forming Microneedle Arrays for Transdermal Drug Delivery Applications. Macromol. Mater. Eng. 300, (6), 586-595 (2015).
  11. Cook, J. P., Goodall, G. W., Khutoryanskaya, O. V., Khutoryanskiy, V. V. Microwave-Assisted Hydrogel Synthesis: A New Method for Crosslinking Polymers in Aqueous Solutions. Macromol. Rapid Comm. 33, (4), 332-336 (2012).
  12. Perale, G., et al. Multiple drug delivery hydrogel system for spinal cord injury repair strategies. J. Control. Release. 159, (2), 271-280 (2012).
  13. Rossi, F., Perale, G., Storti, G., Masi, M. A Library of Tunable Agarose Carbomer-Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications: The Role of Cross-Linkers. J. Appl. Polym. Sci. 123, (4), 2211-2221 (2012).
  14. Frith, J. E., et al. An injectable hydrogel incorporating mesenchymal precursor cells and pentosan polysulphate for intervertebral disc regeneration. Biomaterials. 34, (37), 9430-9440 (2013).
  15. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click chemistry: Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Edit. 40, (11), (2001).
  16. Sacchetti, A., Mauri, E., Sani, M., Masi, M., Rossi, F. Microwave-assisted synthesis and click chemistry as simple and efficient strategy for RGD functionalized hydrogels. Tetrahedron Lett. 55, (50), 6817-6820 (2014).
  17. Ossipov, D. A., Hilborn, J. Poly(vinyl alcohol)-based hydrogels formed by "click chemistry". Macromolecules. 39, (5), 1709-1718 (2006).
  18. Truong, V., Blakey, I., Whittaker, A. K. Hydrophilic and Amphiphilic Polyethylene Glycol-Based Hydrogels with Tunable Degradability Prepared by "Click" Chemistry. Biomacromolecules. 13, (12), 4012-4021 (2012).
  19. Hou, R. Z., et al. New synthetic route for RGD tripeptide. Prep. Biochem. Biotechnol. 36, (3), 243-252 (2006).
  20. Rossi, F., Chatzistavrou, X., Perale, G., Boccaccini, A. R. Synthesis and Degradation of Agar-Carbomer Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications. J. Appl. Polym. Sci. 123, (1), 398-408 (2012).
  21. Mauri, E., Rossi, F., Sacchetti, A. Tunable drug delivery using chemoselective functionalization of hydrogels. Mater. Sci. Eng. C. 61, 851-857 (2016).
  22. Joaquin, A., Peppas, N. A., Zoldan, J. Hydrogel Polymer Library for Developing Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Patches. Tissue Eng. Part A. 20, S55-S55 (2014).
  23. Rossi, F., et al. Tunable hydrogel-Nanoparticles release system for sustained combination therapies in the spinal cord. Colloids Surf. B Biointerfaces. 108, 169-177 (2013).
  24. Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug Discov. Today. 8, (24), 1128-1137 (2003).
  25. Ossipov, D. A., Yang, X., Varghese, O., Kootala, S., Hilborn, J. Modular approach to functional hyaluronic acid hydrogels using orthogonal chemical reactions. Chem. Commun. 46, (44), 8368-8370 (2010).
  26. Anderson, S. B., Lin, C. C., Kuntzler, D. V., Anseth, K. S. The performance of human mesenchymal stem cells encapsulated in cell-degradable polymer-peptide hydrogels. Biomaterials. 32, (14), 3564-3574 (2011).
  27. Caron, I., et al. A new three dimensional biomimetic hydrogel to deliver factors secreted by human mesenchymal stem cells in spinal cord injury. Biomaterials. 75, 135-147 (2016).
  28. Lee, J. W., Kim, H., Lee, K. Y. Effect of spacer arm length between adhesion ligand and alginate hydrogel on stem cell differentiation. Carbohyd. Polym. 139, 82-89 (2016).
  29. Liu, Y., Fan, Z., Wang, Y., Yu, L. Controlled Release of Low Molecular Protein Insulin-like Growth Factor-1 through Self-Assembling Peptide Hydrogel with Biotin Sandwich Approach. J.Biomed. Eng. 32, (2), 387-392 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats