La síntesis de hidrogeles funcionalizado-RGD como una herramienta para aplicaciones terapéuticas

1Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering "Giulio Natta", Politecnico di Milano
Published 10/07/2016
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Bioengineering

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Mauri, E., Sacchetti, A., Rossi, F. The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications. J. Vis. Exp. (116), e54445, doi:10.3791/54445 (2016).

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Abstract

Introduction

Los hidrogeles son redes tridimensionales formadas por polímeros reticulados hidrófilos, que son naturales o sintéticos, y caracterizado por una estructura tridimensional distintivo. Estos aparatos son cada vez más atractivo en los campos de la biomedicina de la administración de fármacos, la ingeniería de tejidos, los portadores del gen y sensores inteligentes 1,2. De hecho, su alto contenido de agua, así como sus propiedades reológicas y mecánicas los hacen candidatos adecuados para imitar microambientes de tejidos blandos y hacerlos herramientas eficaces para citoquina soluble en agua o entrega del factor de crecimiento. Uno de los más prometedores es el uso como un biomaterial inyectable que lleva células y compuestos bioactivos. Los hidrogeles pueden mejorar la supervivencia celular y destino de la célula de control de potencia colocando y entregar con precisión las señales de regulación de células madre de una manera relevante fisiológico, como se observa en in vitro e in vivo en experimentos de 3,4. La ventaja principal de esto es la posibilidadpara mantener las células inyectadas dentro de la zona de inoculación (in situ), minimizando la cantidad de células que sale de la zona y se extravasa en el torrente circulatorio, migrando por todo el cuerpo y perder el objetivo de destino 5. La estabilidad de las redes de hidrogel tridimensionales se debe a sus sitios de reticulación, formados por enlaces covalentes o fuerzas de cohesión entre las cadenas de polímero 6.

En este marco, la química selectiva ortogonal aplicado a cadenas de polímero es una herramienta versátil capaz de mejorar el rendimiento de hidrogel 7. En efecto, la modificación de polímeros con grupos químicos adecuados podría ayudar a proporcionar químico apropiado, física y las propiedades mecánicas para mejorar la viabilidad celular y su uso en la formación de tejido. De la misma manera, entre las técnicas para cargar las células o factores de crecimiento dentro de la matriz de gel, el uso del péptido RGD permite mejoras en la adhesión celular y la supervivencia. RGD es un tripéptido compuestode arginina, glicina y ácido aspártico, que es con mucho el más eficaz y a menudo empleado tripéptido debido a su capacidad para hacer frente a más de un receptor de adhesión celular y su impacto biológico en anclaje de células, el comportamiento y la supervivencia 8,9. En este trabajo, la síntesis de hidrogeles RGD-funcionalizado se estudió con el objetivo de diseñar redes caracterizadas por propiedades bioquímicas suficientes para un microambiente celular hospitalario.

El uso de radiación de microondas en la síntesis de hidrogel ofrece un procedimiento sencillo para minimizar las reacciones secundarias y obtener mayores velocidades de reacción y los rendimientos en un periodo de tiempo más corto en comparación con los procesos térmicos convencionales 10. Este método no requiere etapas de purificación y los rendimientos de hidrogeles estériles debido a las interacciones de los polímeros y la ausencia de disolvente orgánico en el sistema de reacción 11. Por lo tanto, se asegura un alto porcentaje de RGD vinculados a la red polimérica, porque no modespecifica- se requiere que los grupos químicos de polímeros que intervienen en la formación de gel. Los grupos carboxilo, de PAA y carbómero, y grupos hidroxilo, de PEG y de agarosa, dan lugar a la estructura tridimensional de hidrogel a través de una reacción de policondensación. Los polímeros mencionados se utilizan para la síntesis de hidrogeles en los tratamientos de reparación de lesiones de médula espinal 12. Estos dispositivos, como se informó en trabajos anteriores 13,14, muestran una alta biocompatibilidad, así como propiedades mecánicas y fisicoquímicas que se asemejan a los de muchos tejidos vivos y en la naturaleza tixotrópica. Por otra parte, permanecen localizados in situ, en la zona de la inyección.

En este trabajo, los grupos carboxilo de PAA se modifican con un resto alquino (Figura 1), y un compuesto RGD-azida se sintetiza la explotación de la reactividad del grupo terminal tripéptido -NH 2 con un compuesto químico preparado con la estructura (CH 2) n - N 3 (<strong> Figura 2). Posteriormente, el PAA modificado reacciona con el derivado de RGD-azida a través de CuAAC reacción clic 15-17 (Figura 3). El uso de un catalizador de cobre (I) conduce a importantes mejoras tanto en la velocidad de reacción y de la regioselectividad. La reacción CuAAC es ampliamente utilizado en la síntesis orgánica y en la ciencia de polímeros. Combina alta eficiencia y una alta tolerancia a los grupos funcionales, y no se ve afectado por el uso de disolventes orgánicos. Una alta selectividad, un tiempo de reacción rápida y sencilla un procedimiento de purificación permiten la obtención de polímeros estrella, copolímeros de bloques o cadenas de injerto restos deseados 18. Esta estrategia clic hace que sea posible modificar polímeros después de la polimerización para personalizar las propiedades físico-químicas de acuerdo con la aplicación bioquímica final. Las condiciones experimentales CuAAC son fácilmente reproducible (la reacción es insensible al agua, mientras que la oxidación de cobre se puede producir mínimamente), y la naturaleza detriazol formado asegura la estabilidad del producto. El uso de metal de cobre se puede considerar un punto crítico, debido a su potencial efecto tóxico contra las células y en el microambiente biológica, pero la diálisis se utiliza como un método de purificación para permitir la completa eliminación de residuos catalíticos. Finalmente, PAA modificada RGD se utiliza en la síntesis de hidrogel (Figura 4) y las propiedades fisicoquímicas de las redes resultantes son investigados, con el fin de comprobar la funcionalidad potencial de estos sistemas como células o fármacos portadores.

Figura 1
Figura 1: PAA modificó la síntesis de alquino Un esquema de funcionalización PAA con el grupo alquino;. "n" indica los monómeros con grupo carboxilo que reacciona con propargilamina. Haga clic aquí para veruna versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:.. RGD-azida síntesis La síntesis de derivados de RGD-azida Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Haga clic en el Esquema de reacción de la reacción entre el derivado clic RGD-azida y alquino-PAA.. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Hidrogel syntHESIS. RGD funcionalizado procedimiento de síntesis de hidrogel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

Nota: Los productos químicos se usaron como se recibieron. Linear RGD se compra, pero se puede preparar mediante síntesis de péptidos Fmoc en fase sólida estándar de 16,19. Los disolventes son de calidad analítica. La diálisis requiere el uso de membrana con un M w de corte igual a 3.500 Da. Los compuestos sintetizados se caracterizan por espectros de 1 H NMR registrado en un espectrómetro 400 usando cloroformo MHz (CDCl3) u óxido de deuterio (D 2 O) como disolventes, y los desplazamientos químicos se informan como valores delta en partes por millón. Además, los hidrogeles se someten a análisis FT-IR utilizando la técnica de pastilla de KBr y su caracterización física implica estudios de gelificación evaluó mediante el tubo de ensayo invertido a 37 ° C.

1. Síntesis de 4-Azidobutanoyl Cloruro de 1

  1. Disolver 500 mg de 4-azidobutanoic ácido (3,90 mmol) en 10 ml de diclorometano y 0,5 ml de dimetilformamida.
  2. Se enfría la solución a 0 ° C, Utilizando un baño de hielo.
  3. Añadir 505 l de cloruro de oxalilo (5,85 mmol) a 5 ml de diclorometano y se añade lentamente gota a gota al sistema de reacción, mientras se agita.
  4. Después de 1 hora a 0 ° C utilizando un baño de hielo, vuelva a la temperatura ambiente.
  5. Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio.
  6. Caracterizar el producto obtenido mediante espectroscopia 1H-RMN, disolviendo la muestra en CDCl3 16.

2. Síntesis de RGD-azida derivado de 2

  1. Disolver 50 mg de RGD (0,145 mmol) en 1 ml de NaOH 1 M.
  2. Disolver 24 mg de 1 (0,16 mmol) en 2 ml de tetrahidrofurano.
  3. Añadir toda la solución de RGD a la solución 1 gota a gota a 0 ° C usando un baño de hielo.
  4. Volver a la temperatura ambiente y se agitó durante la noche.
  5. Añadir 1 ml de HCl 1 M.
  6. Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio.
  7. Caracterizar el OBTained producto por espectroscopia 1 H-NMR, la disolución de la muestra en D 2 O 16.

3. Modificación 3 PAA Acetileno

  1. Disolver 200 mg de 35% w / w solución de PAA (2,8 mmol) en 15 ml de agua destilada.
  2. Añadir 15,4 mg de clorhidrato de propargilamina (0,20 mmol).
  3. Disolver 42,8 mg de hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, 0.28 mmol) en 14 ml de una mezcla 1: 1 v / v de acetonitrilo: solución de agua destilada por calentamiento a 50 ° C.
  4. Añadir toda la solución de HOBt a la solución de PAA a temperatura ambiente.
  5. Añadir 53,6 mg de etildimetilaminopropilcarbodiimida (EDC, 0,28 mmol) a la mezcla de reacción.
  6. Utilice M HCl 1 para ajustar el pH a 5,5 y se agita el sistema de reacción durante la noche a temperatura ambiente.
  7. Se dializa la solución. Disolver 11,2 g de cloruro sódico en 2 L de agua destilada y a continuación, añadir 0,2 ml de 37% w / w HCl. Se dializa la solución usando una membrana con un M w de corte de 3,5 kDa.
  8. perform diálisis durante tres días. Cambie la solución de diálisis a diario con 2 L de agua destilada recién preparada que contenga 0,2 ml de 37% w / w HCl.
  9. Almacenar la solución final a -80 ° C. Liofilizar en un liofilizador de acuerdo con los protocolos del fabricante.
  10. Caracterizar el polímero funcionalizado por espectroscopia 1H-RMN, disolviendo la muestra en D2O 16.

4. Síntesis de PAA-RGD de polímero 4

  1. Disolver 78 mg de PAA modificada alquino 3 (1,083 mmol) en 10 ml de agua destilada.
  2. Disolver 25 mg de la RGD derivado de azida 2 (0,0722 mmol) en 5 ml de tetrahidrofurano.
  3. Añadir toda la solución de RGD a la solución polimérica.
  4. Añadir 2,2 mg de yoduro de cobre (0,0116 mmol) y 2,2 mg de ascorbato de sodio (0,0111 mmol).
  5. Se somete a reflujo la mezcla resultante durante la noche a 60 ° C, con agitación.
  6. Enfriar la mezcla a 25 ° C.
  7. Dialyze la solución. Disolver 11,2 g de cloruro sódico en 2 L de agua destilada y a continuación, añadir 0,2 ml de 37% w / w HCl. Se dializa la solución usando una membrana con un M w de corte de 3,5 kDa.
  8. Realizar la diálisis durante tres días. Cambie la solución de diálisis a diario con 2 L de agua destilada recién preparada que contenga 0,2 ml de 37% w / w HCl.
  9. Almacenar la solución final a -80 ° C. Liofilizar en un liofilizador de acuerdo con los protocolos del fabricante.
  10. Caracterizar el producto obtenido mediante espectroscopia 1H-RMN, disolviendo la muestra en D2O 16.

5. RGD-funcionalizado Hidrogel Síntesis

  1. Preparar la PBS. Disolver 645 mg de sal de PBS en 50 ml de agua destilada.
  2. Mezcla de 40 mg de carbómero y 10 mg de PAA funcionalizado 4 en 9 ml de PBS (paso 5.1), a temperatura ambiente, hasta la disolución completa (30 min).
  3. Añadir 400 mg de PEG a la solución y mantener la agitación durante 45 min.
  4. Detener la agitación y dejar que el sistema se estabilice durante 30 minutos.
  5. Utilice NaOH 1 N para ajustar el pH a 7,4.
  6. A 5 ml de la mezcla obtenida, añadir 25 mg de polvo de agarosa.
  7. Irradiar el sistema con radiación de microondas a 500 W hasta que hierva, durante un tiempo por lo general entre 30 segundos y 1 min, y electromagnéticamente calentar hasta 80 ° C.
  8. Dejar reposar la mezcla se expone a temperatura ambiente hasta que su temperatura se reduce a 50 ° C y añadir 5 ml de PBS (paso 5.1), con el fin de obtener una solución en una proporción 1: 1 volumétrica.
  9. Preparar 12 cilindros de acero de la placa que contiene múltiples pocillos con un diámetro de 1,1 cm.
  10. Tomar 500 ml de alícuotas de la solución y colocarlos a cada uno cilindros de acero.
  11. Deja en reposo durante 45 minutos hasta que la gelificación completa del sistema.
  12. Retirar los cilindros utilizando una pinza de acero inoxidable para obtener los hidrogeles.

6. La carga de herramienta terapéutica (medicamentos o células)

  1. Repita steps 05.01 a 05.07.
  2. Cuando la mezcla (ya en estado de sol) alcanza 37 ° C, añadir 5 ml de la solución que contiene la solución de fármaco o de células de cultivo deseada, con el fin de obtener un sistema final en una proporción 1: 1 volumétrica.
  3. Repita los pasos 5.9 a 5.12 para obtener redes poliméricas con biocompuestos físicamente atrapado dentro del gel.

7. Hidrogel Caracterización

  1. El análisis FT-IR
    1. Después de la formación de gel, en remojo uno de los hidrogeles sintetizados en 2,5 ml de agua destilada durante 24 horas.
    2. Retire el medio acuoso en el que se sumerge hidrogel y liofilizar con N2 líquido.
    3. Laminar la muestra de hidrogel de acuerdo con la técnica de pastilla de KBr.
      1. Añadir una espátula llena de KBr en un mortero de ágata. Tomar una pequeña cantidad de muestra de hidrogel (0,1-2% de la cantidad de KBr, o sólo lo suficiente para cubrir la punta de espátula) y se mezcla con el polvo de KBr.
      2. Moler la mezcla hasta que el polvo es fina y homogénea. </ Li>
      3. Utilice el kit de pastilla de KBr para formar el pellet IR. Pulse el polvo usando una prensa de laboratorio Manual: durante 3 min a la capacidad de presión igual a 5 toneladas y luego durante 3 minutos a la capacidad de presión de 10 toneladas.
      4. Liberar la presión para obtener el sedimento final lo más homogénea y transparente en apariencia. Insertar el pellet en el soporte de muestra de IR y ejecutar el espectro 16.
  2. Estudios de gelificación
    1. Llene el tubo de microcentrífuga de 2 ml con 900 l de PBS y se equilibre a 37 ° C.
    2. Añadir 100 l de la solución de polímero preparada para formar el hidrogel y se incuba a 37 ° C.
    3. Invertir el tubo y observe si el gel fluye a 1, 2, 5, 10 y 20 min. Registre el tiempo en el que el gel no fluye como el tiempo de gelificación.

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Representative Results

El derivado de alquino PAA se sintetiza de manera eficiente a partir de ácido poliacrílico y propargilamina, como se muestra en la Figura 1 donde n etiquetas de los monómeros cuyos grupos carboxilo reaccionar con la amina. La identidad del producto se confirmó por espectroscopía de 1 H-NMR. Figura 5 muestra el espectro de 1H-NMR de PAA modificada con triple enlace.

Figura 5
Figura 5: espectro de 1H-RMN de la PAA modificado alquino La señal relacionada con el alquino se resalta.. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las señales de la cadena de polímero se pueden observar en el intervalo de 2,75 a 1,50 ppm; mientras que un pico a 2,8 0 ppm, representante de H de alquino, y un pico a 4,20 ppm, en relación con la 2 H del CH 2, caracterizan el radical propargilo. Esto confirma que el PAA se ha modificado correctamente. La evaluación del grado de funcionalización alquino se ha llevado a cabo mediante la integración del área bajo los picos de PAA (ajustado a 3,00, de acuerdo con el número de hidrógenos por monómero) y resto propargilo, como se ilustra en la Figura 5. El grado de funcionalización f es calculado como:

Ecuación

Ecuación representa el área integral del residuo propargilo, la suma de la superficie H del alquino (etiquetado como Ecuación ) Y la zona -CH 2 (indicado como Ecuación ), Mientrasiones "src =" / files / ftp_upload / 54445 / 54445eq5.jpg "/> se refiere al área integral de las señales de polímero. El grado de funcionalización se calcula en un 10% y es considerar satisfactoria de acuerdo con la síntesis de hidrogel, donde PAA tiene que reaccionar a través de sus grupos carboxilo residuales para formar la red 3D. se obtiene un rendimiento cuantitativo para el polímero modificado 16.

De una manera similar, la Figura 6 muestra el espectro de 1H-RMN del producto después de la reacción de click CuAAC entre el PAA modificada alquino y RGD-azida. El pico del triazol formada en 8,15 ppm confirma que la reacción se produce en un rendimiento cuantitativo y RGD está fuertemente ligado a las cadenas de PAA. La figura 6 muestra todas las señales características de la cadena de PAA y el RGD.

Figura 6
Figura 6:Espectro de 1H-NMR de la RGD vinculada a PAA. La señal de triazol se indica (etiquetado como "A"). Se lleva a cabo la funcionalización de polímeros RGD través de la reacción clic CuAAC. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

hidrogeles funcionalizados-RGD se preparan a través de reticulación química de los cuatro polímeros (PAA, carbómero, agarosa y PEG) por polimerización de radicales libres asistida por microondas. El calentamiento a 80 ° C conduce a una movilidad macrómero superior, y por lo tanto mejora las interconexiones de corto alcance entre los grupos carboxilo e hidroxilo de los polímeros. La reacción de esterificación se lleva a cabo entre estos grupos funcionales y produce redes locales llamados "microgeles".

A medida que avanza de policondensación, la viscosidad del sistema aumenta continuamente, wi bien la probabilidad de interacción entre los sitios reactivos macrómeros disminuye. Sin embargo, los grupos funcionales más cerca todavía interactúan de manera eficiente debido a una movilidad más lenta. La condición fisicoquímica resultante se caracteriza por una "soldadura" entre las superficies de microgel que produce la macroestructura 3D final del hidrogel. La esterificación, enlaces de hidrógeno y carboxilación traer las cadenas de polímero estadísticamente más cerca, creando así una estructura heterogénea estable. El sistema resultante exhibe un comportamiento sol / gel y de que éste pase a un estado de gel dentro de los 5 min. Este intervalo de tiempo se indica como tiempo de gelificación.

La naturaleza química de los hidrogeles funcionalizados-RGD se realizó un análisis de FT-IR. La figura 7 muestra la comparación entre los espectros FT-IR del compuesto RGD-azida (línea verde), el hidrogel sintetizado sin funcionalización RGD (línea de color negro), y el hidrogel con la modificación de péptidos (línea azul). La especificación de hidrogeltra se caracterizan por tanto una señal ancha en los 3,600-3,200 cm -1 gama, representante de la vibración de tensión de los enlaces OH residuales y por un pico alrededor de 2940 cm-1 del tramo CH. La validación de que la esterificación se produce entre los grupos carboxilo e hidroxilo de polímero está dado por los picos de alrededor de 1.600 cm -1 y 1.400 cm-1, que corresponde, respectivamente, a la simétrica y asimétrica de estiramiento de resto de CO 2. Estos picos son más visibles en el espectro del hidrogel no funcionalizado, mientras que en el espectro de RGD-hidrogel que están parcialmente cubiertos por las señales indicadas como bandas de amida I y II.

Figura 7
Figura 7:. Comparación de los espectros FT-IR espectros FT-IR de RGD (línea verde), hidrogel, sin funcionalización RGD (línea de color negro) e hidrogel RGD funcionalizado (línea azul). losseñal relacionada con la amida RGD se indica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El estiramiento de C = O, marcado como banda de amida I ( "amida I" en la Figura 7), presenta un pico a 1.650 cm -1 en el espectro de tripéptido y se desplaza a aproximadamente 1670 cm -1 en la muestra RGD-hidrogel . La flexión de NH, en relación con la banda de amida II ( "Amida II" en la Figura 7), puede ser grabado con la señal de alrededor de 1.550 cm -1 en el espectro de RGD y también es reconocible en la muestra de hidrogel, en alrededor de 1600 cm - 1. Debido a que no hay componentes de amida en la formulación de hidrogel estándar, la presencia de picos de carácter amídico sugiere que la PAA es realmente funcionalizado con el RGD y que es capaz de formar un hidrogel con los sitios de péptidos dentro de la red polimérica.

El espectro de FT-IR de hidrogel también muestra los picos relacionados con la vibración de tensión de COC de enlace glucosídico (900-1.000 cm -1 rango) entre las unidades de monosacárido de la agarosa y los grupos éster.

Para obtener información sobre la estructura 3D y las propiedades físicas y mecánicas de estos hidrogeles, el análisis SEM, la gelificación, la hinchazón y la cinética de estudios reológicos se llevan a cabo, como se ha discutido en los trabajos anteriores 13,20. Resultados de SEM (Figura 8) muestran que los hidrogeles se caracterizan por una estructura microscópica complejo con algunos poros más grandes que contienen pequeños poros y algunas redes fibrilares en las paredes de los poros. Además, la mayoría de los poros están interconectados. La estructura enredada es similar a la red 3D de hidrogeles preparados de la misma manera pero sin funcionalización RGD. Esto demuestra que el RGD no altera la red de polímero. Mediante la prueba de tubo de ensayo invertido, el hidrogel samplias solidifica dentro de 5 min, como se observa en la muestra de hidrogel sin RGD 21 funcionalización. Este tiempo de gelificación corto subraya su idoneidad para aplicaciones biomédicas.

Figura 8
Figura 8:.. El análisis SEM SEM imágenes muestran la morfología de una muestra de RGD-funcionalizado hidrogel (A) y un hidrogel sin funcionalización (B) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La relación de hinchamiento de equilibrio indica la capacidad para absorber y retener una gran cantidad de agua y es una de las principales características de los sistemas de hidrogel 20,22. Las muestras analizadas exhiben hinchazón rápida cinética y alcanzan el equilibrio de hinchamiento dentro de la primera hora. su oleajeing valor de equilibrio Q se informa en nuestro trabajo anterior 16 y es similar al valor obtenido mediante el análisis de hidrogeles sin RGD, lo que confirma que el tripéptido está integrado con la red polimérica y no crea un alto obstáculo para el proceso de gelificación.

Con los estudios reológicos, el módulo de almacenamiento de gel (G ') se encuentra que es aproximadamente un orden de magnitud mayor que el módulo de pérdida (G''), lo que indica un elástico en lugar de material de viscosa 23 y ambos son esencialmente independiente de la frecuencia. Valores similares de G 'y G'' se registran con la muestra de gel sin una modificación del péptido 16. Esto demuestra que la presencia de RGD dentro de la red polimérica no afecta a las propiedades reológicas del material, manteniendo las características peculiares de la competencia con el sistema inyectable para aplicación biomédica.

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Acknowledgements

Los autores desean agradecer al Prof. Maurizio Masi para la discusión fructífera y la señorita Chiara Allegretti para la edición de idioma. la investigación de los autores es apoyado por Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010-2312573).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(acrylic acid) solution average Mw ~100,000, 35 wt% in H2O Sigma Aldrich 523925 CAS 9003-01-4
Poly(ethylene glycol) 2,000 Sigma Aldrich 84797 CAS 25322-68-3
Carbomeer 974P Fagron 1387083
Agarose  Invitrogen Corp. 16500-500 UltraPure Agarose
RGD peptide abcam ab142698
4-azidobutanoic acid Aurum Pharmatech Z-2421  CAS 54447-68-6
Oxalyl chloride Sigma Aldrich O8801 CAS 79-37-8
Propargylamine hydrochloride 95% Sigma Aldrich P50919 CAS 15430-52-1
Copper(I) iodide Sigma Aldrich 3140 CAS 7681-65-4
Sodium ascorbate Sigma Aldrich Y0000039 CAS 134-03-2
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417
Dialysis Membrane Spectrum Laboratories, Inc. 132725 Spectra/Por 3 Dialysis Membrane  Standard RC Tubing
MWCO: 3.5 kD

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References

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