Neonatal Cardiac Scaffolds: Matrizes novas para Estudos Regenerativa

Bioengineering

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Summary

Nestes estudos, que fornecem metodologia para novos, neonatal, andaimes cardíacas murinas para uso em estudos de regeneração.

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Garry, M. G., Kren, S. M., Garry, D. J. Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies. J. Vis. Exp. (117), e54459, doi:10.3791/54459 (2016).

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Abstract

Introduction

A insuficiência cardíaca é comum e mortal. É uma doença progressiva que resulta na diminuição da contractilidade do coração, o que prejudica o fluxo sanguíneo para os órgãos e deixa as necessidades metabólicas do corpo não satisfeitas. Estima-se que 5,7 milhões de americanos têm insuficiência cardíaca e é a principal causa de hospitalização nos Estados Unidos 9. O custo coletivo de tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca nos Estados Unidos ultrapassa os US $ 300 bilhões de dólares por ano 9-10. O único tratamento definitivo para a insuficiência cardíaca em fase terminal é o transplante cardíaco ortotópico. Cada ano, estima-se que mais de 100.000 corações transplantados são necessários para os procedimentos de transplante cardíaco nos Estados Unidos 1-2. Devido ao número limitado de doadores, apenas cerca de 2.400 transplantes são realizados a cada ano em os EUA 2. Claramente, esta escassez de órgãos precisa ser tratada como outras estratégias são necessários para produzir órgãos adicionais para transplantação e, idealmente, estes órgãos seriam autóloga, de modo a evitar as complicações associadas com a rejeição e imunossupressão vida.

Cardiomiócitos adultos mamíferos demonstrar uma capacidade de regeneração limitada após lesão, mas evidências recentes sugerem que os corações neonatais mamíferos manter uma notável capacidade de regeneração após lesão 5-8. Especificamente, após a ressecção cirúrgica parcial, uma janela de regeneração foi descoberto entre o dia do nascimento e pós-natal 7. Este período de regeneração é caracterizada por uma falta de cicatriz fibrótica, formação de neo vascularização, libertação de factores angiogénicos a partir do epicárdio, e proliferação de cardiomiócitos 8/5 , 11. Esta janela de tempo regenerativa fornece o potencial para a utilização do coração neonatal como uma nova fonte de material para o desenvolvimento de um coração bioartificial.

A matriz extracelular é conhecida por fornecer pistas importantes para promover cardiomyocyte a proliferação e crescimento. Diferenças distintas na disponibilidade de moléculas nas matrizes neonatais e adultos de 12 e sua capacidade para promover a regeneração foram exploradas 13. matrizes adultos descelularizados têm sido utilizados em vários estudos para fornecer um andaime ECM para repovoamento celular e a geração de um coração bioartificial. Embora esses estudos, e novas descobertas em tecnologias de células-tronco, estão avançando rapidamente, vários obstáculos ainda precisam ser cumpridos. Por exemplo, as limitações em preservando a estrutura nativa da matriz, a integração celular na parede da matriz, e capacidade para suportar a proliferação e crescimento de todos os limites do sucesso desta abordagem. Enquanto atributos regenerativos superiores têm sido atribuídas ao coração neonatal, os aspectos práticos da utilização de um tecido tal têm limitado a sua exploração.

Com base na capacidade regenerativa demonstrada do coração neonatal, desenvolvemos novas matrizes através do desenvolvimento de umtécnica de descelularização para o coração do rato P3. O coração P3 foi escolhido para estes estudos, uma vez que está dentro da janela de regeneração cardíaca como anteriormente determinada 6 mas o coração é suficientemente grande para colheita, decellularize e recellularize. O objetivo deste estudo é demonstrar a viabilidade da criação de uma matriz de um coração neonatal mouse. Os nossos estudos fornecem evidência para a viabilidade de um minuto descelularizante, coração neonatal, mantendo a integridade estrutural e proteinácea do ECM. Nós também demonstrar a capacidade de recellularize este ECM cardíaca com mCherry cardiomiócitos expressam e examinamos esses cardiomiócitos para a expressão de vários marcadores cardíacos seguintes recelularização. Esta tecnologia permitirá que para o ensaio da superioridade de uma matriz neonatal para o desenvolvimento de um coração bioartificial.

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Protocol

Todas as experiências de rato foram realizados de acordo com o Animal Welfare Act dos EUA e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Minnesota.

1. Método para coração mouse Isolamento

  1. Euthanize um rato neonatal por decapitação com uma única lâmina de uso.
  2. Pincelar o tórax com 70% de etanol.
  3. Dissecar a pele do peito, cortando-o afastado da parede torácica com uma tesoura padrão enquanto puxa a pele lateralmente com um par de # 5 fórceps.
  4. Perfurar o abdômen logo abaixo do esterno com a tesoura de corte através da parede abdominal. Agarrando o processo xifóide com # 5 fórceps, retrair o esterno rostral a partir do corpo durante o corte que as nervuras de ambos os lados da caixa com a tesoura. A caixa torácica é refletida superiormente com a pinça para revelar o coração.
  5. Sem rodeios dissecar os dois principais lóbulos do timo puxando lateralmente com # 5 fórceps, expondoo arco da aorta, bem como as veias cavas e pulmonares.
  6. Transecto as principais artérias do arco aórtico e da própria aorta, com a tesoura primavera 10 cm. Reter a aorta entre a base do coração e a artéria inominada. Segure as extremidades dos vasos rompidos com o # 5 fórceps para refletir o coração para a frente, separando-a da traquéia e esôfago.
  7. Transecto a vasculatura pulmonar e outras veias principais, através do corte entre os pulmões e o coração em ambos os lados do coração com a tesoura de mola 10 cm. As veias permanecer aberta para fornecer drenagem.
  8. Tiraram o coração do mediastino com o # 5 fórceps, segurando as extremidades cortadas dos grandes vasos. Colocar o coração num prato de cultura de 60 mm contendo solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) para a cateterização.

2. Método para Decelularização por Langendorff Perfusão

  1. Prepare o conjunto de cateter com antecedência. Desenhar uma secção 4 centímetrosde PE 50 tubos em uma pequena chama de álcool para criar um cateter menores, mais finos. Aparar as extremidades com uma lâmina para satisfazer as dimensões (aprox. OD 300 mm de diâmetro exterior com uma flange de aprox. OD 500 mm) mostrado na Figura 1. Isto irá proporcionar dois cateteres simétricos de ambos os lados do puxar.
  2. O ponto final do corte do tubo para dentro da chama brevemente, para derreter uma flange para a abertura na extremidade mais fina.
  3. Encher a seringa de 12 ml com PBS e montar o cateter, colocando uma torneira de passagem de 3 vias em a seringa. Adicionar um 22 G x 1 agulha para a torneira e conduzir a agulha através do septo. Deslize o tubo do cateter PE arrastado para cima da agulha (fig. 1).
  4. Lavar as peças montadas com PBS, assegurando que todas as bolhas de ar foram removidas.
  5. Insira o cateter, preparado como descrito acima, para a aorta do coração isolado, não se estendendo para além da válvula aórtica e ligar com um empate de 7-0 sutura. Coloque o flange de tele cateter proximal contra o empate, fazendo um selo apertado e impedindo o coração de saindo do cateter.
  6. Observe o cateterismo sob ampliação, enquanto suavemente perfusão do coração utilizando a seringa contendo PBS. Certifique-se de que não há vazamentos no sistema e o tecido homogeneamente empalidece como sangue latente é removido.
  7. Colocar o septo para dentro do gargalo do adaptador para entrada e selá-lo, dobrando os lados sobre o vidro.
  8. Anexar o reservatório cheio com 60 ml de sulfato de dodecilo de sódio a 1% (SDS) em água destilada (dH2O) através de uma linha de comprimento suficiente para produzir uma coluna que gera 20 mmHg de pressão, como mostrado na Fig. 1. Calcula-se a pressão da altura da coluna de líquido com base na relação de 1 mm Hg é igual a 1,3595 centímetros H 2 O.
    Cuidado: SDS é um pó altamente flocculent com propriedades irritantes. O contacto deve ser evitado. Lidar com o pó usando vestuário de protecção adequado.
  9. Perfundir o coração com 1% SDS, durante 14 horas. O coração será translúcido na aparência sem tecido restante observável.
  10. Lave o sistema até a torneira da solução SDS restante e substituí-lo com 10 ml dH 2 O. Perfundir o coração com 10 ml de 1% de Triton X-100 (diluídos em água destilada), seguido de 10 ml de dH 2 O, seguido por 60 ml de PBS contendo 1x penicilina estreptomicina (Pen-Strep).
  11. Armazenar o coração em PBS 1x com Pen-Strep a 4 ° C. Se a aplicação de pós descelularização destina a perfusão requer, então, deve ser mantido o cateter na aorta, de outra forma reduzir o laço de sutura e o remover do cateter.

Determinação 3. DNA

  1. Prepara-se uma digestão de ECM o coração ou o controlo descelularizado utilizando 200 ug / ml de proteinase K em KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, 0,45% de Tween 20 em 10 mM de Tris (pH 8,3).
  2. Incubar o tecido a 55 ° C com agitação até que o tecido é dissolvido,tipicamente 4-5 h.
  3. Quantificar o teor de ADN do homogeneizado com um ADN de ensaio de ligação de 4,11.

4. Fixação e secção de tecido

  1. Fix descelularizados, corações repovoados ou P3 controlo em paraformaldeído a 4% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
  2. Lavar o tecido 3x em PBS.
  3. Colocar o tecido numa solução de 7,5% de sacarose em tampão de fosfato 0,1 M a 4 ° C até que se afunda.
  4. Mudar a solução a 15% de sacarose em tampão de fosfato 0,1 M a 4 ° C, novamente, até que se afunda.
  5. Aquecer o tecido a 37 ° C, substituir metade do volume com solução de gelatina em 15% de sacarose e tampão de fosfato 0,1 M e equilibrar durante a noite. Concentrações de gelatina são aumentadas por passos através de 1%, 2,5%, 5% e, finalmente, 7,5%, duas vezes.
  6. Coloque as amostras em cryomolds usando fresco gelatina 7,5%. Para restaurar o formato das amostras descelularizados, gelatina líquido pode ser perfundida para dentro das câmaras como tele corações são moldados. Congelar, flutuando os cryomolds em nitrogênio líquido. Armazenar a -80 ° C.
  7. Cut (10 mm de espessura) seções com um criostato. Trazer o slide perto da superfície da seção e observe a seção de se mover para fora da faca na superfície devido à carga nos slides eletrostaticamente tratados. Secam-se as lâminas durante a noite e armazenar a -80 ° C para análise futura.
  8. Retirar as lâminas do congelador, equilibrar à temperatura ambiente e, em seguida, colocar num frasco Coplin contendo PBS durante 20 min a 37 ° C para dissolver a gelatina.
  9. Manchar as seções de corte a partir do Passo 4.7 com Hematoxilina e Eosina. Colocar as lâminas em um frasco Coplin. Expor as lâminas hidratados no passo 4.8 a hematoxilina durante 45 segundos, a água da torneira durante 1,5 min, tampão durante 3 min, a água da torneira durante 1 min, agente anil durante 1,5 min, 80% de etanol durante 1 min, alcoólica eosina Y durante 8 segundos, etanol a 80% durante 1 minuto, 100% de etanol durante 1 min 2x, agente de compensação (substituto de xileno) 3x durante 1 min, a lamela com resinameio de montagem com base. Examine os slides microscopicamente.
  10. Para confirmar a retenção de reactividade proteína da MEC do ECM coração, mancha para proteínas estruturais de ECM tais como colagénio IV, colocando os diapositivos hidratadas numa câmara humidif içada e trata-se com 10% de soro de burro normal (NDS) em salino tamponado com fosfato com 0,1% de Triton -X100 (PBST) durante 1 h à temperatura ambiente (TA). Utilizar um volume suficiente para cobrir as secções de tecido.
  11. Substituir a solução com o anticorpo primário de escolha para uma diluição determinada empiricamente em 5% NDS / PBST. Por exemplo, o anticorpo do colagénio IV foi diluído a 1: 150. Incubar durante a noite a 4 ° C.
  12. Lavam-se as lâminas com PBST 3x e aplicar um anticorpo secundário de escolha conjugado com um corante fluorescente. Dilui-se o anticorpo por uma quantidade determinada empiricamente. Incubar durante 1 h à TA. Lavar 3x com PBS.
  13. Corar as lâminas com um corante de ligação a ADN, tais como DAPI para verificar a ausência de núcleos celulares usando uma mounti contendo DAPIng médio quando a tampa deslizando os slides.
  14. Examinar as lâminas com um microscópio de fluorescência a 50 a 400x.

5. P1 Neonatal Murino Ventricular Cardiomyocytes para Recellularization

  1. Spray de cada filhote com 70% de etanol e decapitar com uma única lâmina de uso.
  2. Segure cada filhote entre o polegar eo indicador, enquanto o tórax é dividido na linha média com pequenas tesouras estéreis para expor a cavidade torácica. Aplicar pressão para permitir que o coração se projetam livremente do peito, enquanto ele é cortado livre dos grandes vasos e os átrios deixando apenas o tecido ventricular.
  3. Colocar cada coração directamente para um tubo de 50 ml contendo 20 ml de cálcio arrefecido com gelo, solução salina tamponada de Hank livre de bicarbonato com 4- (2-hidroxietil) 20 mM -1-piperazinoetanossulfónico (CBFHH) até que todos os corações são recolhidos.
  4. Aspirar o CBFHH e adicionar 10-15 ml de CBFHH fresca (gelada) para o tubo. Lavar o tecido por agitação do tecido em tele tubo várias vezes.
  5. Decantar a solução contendo os corações em um 60 milímetros de plástico de Petri.
  6. Dissecar qualquer tecido atrial latente dos corações sob ampliação no gelo aparando-lo longe dos corações com a tesoura primavera. Picar-se os ventrículos em pedaços pequenos tamanho homogéneo. Remover qualquer tecido não-ventricular separado do prato com # 5 fórceps.
  7. Pipetar tanto da solução CBFHH como é necessário para transferir os fragmentos de tecido em um pequeno frasco esterilizado que contém uma barra de agitação micro estéril.
  8. Permitir que o tecido para sedimentar para o fundo do frasco e remover a solução CBFHH.
  9. Perfaz-se 50 ml de uma solução de enzima de 1,75 mg / ml de tripsina, 20 ug / ml de DNase II em CBFHH. Pipetar 5 ml desta solução de enzimas e adicioná-lo para um tubo contendo o tecido ventricular e picada lugar num agitador magnético. Agita-se a uma taxa constante (340 rpm) à temperatura ambiente durante 8 min.
    NOTA: A ação agitação deve ser suave e ainda permitirpara a suspensão da pasta.
  10. Retirar o frasco da placa de agitação e permitir que a pasta fluida a sedimentar durante 3 min. Pipeta e descartar o sobrenadante inicial digerir, pois ele contém principalmente células do sangue e restos de tecido.
  11. Pipetar uma segunda alíquota de 5 ml da solução de enzima e adicioná-lo ao ventrículo digestão. Agita-se durante 8 minutos e permitir que a sedimentar durante mais 3 min. Antes de iniciar as digestões, preparar dois tubos de 50 mL (rotulados 1 e 2), cada um contendo 12 ml de soro fetal de bovino gelada (FBS). Coloque um filtro de células 40 mm no topo de cada tubo. Pipet esse sobrenadante para o filtro no tubo 1.
  12. Repetir o processo de digestão um adicional de 8 vezes, alternando-se a colocação do sobrenadante Digest entre os dois tubos contendo FBS. Dividir o último sobrenadante igualmente entre tubos 1 e 2 para garantir volumes iguais em cada tubo.
    NOTA: Cada tubo de recolha de agora irá conter 32,5 ml volume total de suspensão de células.
  13. Centrifugar os tubos contêmção do sobrenadante a 150 xg durante 6 minutos a 4 ° C.
  14. Durante a recolha das alíquotas de digestão, preparar cinco placas de cultura de tecidos de 100 mm com 6 ml de meio (de Eagle Modificado por Dulbecco meios (DMEM) com 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-glutamina) por placa. Incubar estas alíquotas a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 30 minutos para equilibrar os meios de comunicação.
  15. Aspirar a mistura de enzimas CBFHH e ressuspender as células em 30 ml de meio de cultura preparado acima, combinando as células de ambos os tubos de recolha.
  16. Retorno de 6 ml de suspensão celular a cada uma das placas de 100 mm e incubar durante 45 min a 37 ° C.
  17. No final da incubação, transferir as células não aderentes a 5 novos pratos e re-incubar durante 45 minutos (a fracção de fibroblastos terá começado a aderir aos pratos e podem ser cultivadas separadamente, se desejado).
  18. No final da segunda rodada de pré-chapeamento, recolher os meios de comunicação e as células não aderentes de pratos e girar os meios de comunicação em 150xg durante 6 min.
  19. Colhem-se o excesso de meios para levar as células à concentração desejada aproximada, (4,0 x 10 5 células por construto em 100 ul de perfusato). Retirar uma alíquota para contagem e ou a viabilidade de testes 14.

6. biorreator Recellularization de P3 coração Matrix

  1. Pretreat a matriz de coração isolado com meios de cultura (ver Passo 5,15) durante a noite antes de adicionar as células.
  2. Montar os elementos de um sistema de Langendorff, como mostrado na Fig. 2. Autoclave as peças de vidro e óxido de etileno esterilizar as peças de plástico para garantir a esterilidade. Vários sub-unidades do sistema pode ser montado numa câmara de fluxo laminar antes de ser montado no cavalete de suporte. Circulating banho de água e trajecto de escoamento de água aquecida foi omitida para maior clareza.
  3. Encha o sistema montado com 120 ml de meio de cultura de tecidos (ver passo 5.15).
  4. Colocar a matriz de coração cateterizada do Passo 2,14 em um cul 60 milímetrostura Prato sob ampliação e ligar uma seringa de 1 mL com 22 L x 1 agulha carregada com suspensão de células a partir do Passo 5,20 para o cateter. Certifique-se de que esta montagem é livre de bolhas de ar para evitar embolizante o coração.
  5. Suavemente perfundir os 100 ul de suspensão de células no interior da matriz do coração através das artérias coronárias. Depois de concluído, retire a combinação seringa / agulha.
    NOTA: A perfusão lenta de aprox. 20? L por min é necessária para impedir que as células se escoe para fora das veias, que transitam pelo coração.
  6. Com um topo romba 22g fixada ao encaixe de Luer sobre o lado de baixo da tampa frasco de biorreactor coração, empurrar o cateter para o topo.
  7. Iniciar a bomba peristáltica e observa-se que o fluxo procede conforme descrito na Figura 2. Rendimentos fluir a partir do reservatório através da bomba através do borbulhador para o cateter colocado na aorta no Passo 2.5 (vermelho caminho na Fig. 2). Observar o fluxo da circulação cardíaca fora da veias e gotejamento a partir do vértice, para recirculação do reservatório meios.
    NOTA: A taxa de fluxo de perfusão é dependente de factores individuais, tais como a resistência vascular da construção, e o tamanho do coração, mas uma taxa de 50 a 100 ul / min é um bom ponto de partida. Em pontos de tempo intermédios, avaliação funcional pode ser executado. A escala de tamanho do coração repovoados neonatal limita as avaliações, o que pode ser realizado, mas nós determinamos que os sistemas baseados opticamente pode ser utilizado para quantificar a bater comportamento do mesmo modo que foram usadas em corações de ratos adultos. 4 A construção pode ser perfundido para estendida períodos de tempo (até 23 h).

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Representative Results

decelularização
Em média, o tempo para a descelularização de um coração P3 utilizando este protocolo é de aproximadamente 14 horas. dado um peso médio do coração de 23 mg para o recém-nascido P3.

acelularidade
Figura 3a
mostra um coração neonatal P3 totalmente intacto (conjunto de montagem). Figura 3b mostra o mesmo coração seguinte descelularização. As Figuras 4a e 4b mostram a hematoxilina e eosina de corações intactos e descelularizados, respectivamente. Note-se a ausência de núcleos positivos hematoxilina e na diminuição das estruturas de eosinófilos no coração decelularizado. Além disso, o conteúdo em ADN do coração descelulada é significativamente reduzido de 68,08 ± 2,25 ug no coração intactos (n = 6) a 4,73 ± 2,27 ug no coração descelularizado (n = 5).

Imunoreatividade Collagen
A manutenção da matriz extracelular (ECM) na sequência de descelularização é essencial para o repovoamento com células exógenas e à funcionalidade da matriz. Para avaliar o conteúdo do ECM neonatal em ECM intacta e descelularizados, foi realizada imuno-coloração para o colagénio IV. A Figura 4C e d demonstram que o colagénio IV é robusta expresso tanto no coração intacto e descelularizado e que a localização desta proteína é mantida após a remoção da célula, enquanto que os núcleos DAPI positivas são eficazmente removidos (Figura 4e-h).

teor de ADN
A presença de ADN é utilizada como uma indicação adicional de celularidade. Na Figura 5, o ADN é demonstrado para ser diminuída em 93% em corações neonatais seguinte descelularização com base em detergente. Este grau de redução de ADN é consistente comrelatos na literatura usando descelularização com base detergente em outros tecidos 15-16.

Recellularization
Temos realizada imuno-histoquímica para determinar a expressão de vários marcadores de cardiomiócitos no coração repovoados. A Figura 6 ilustra as células que migraram para a parede do ventrículo esquerdo (Figura 6A e 6B). A Figura 6C demonstra a rotulagem DAPI do coração repovoados. Figura 6D-G ilustra as células que são positivas para NKX 2,5, mCherry, α-actinina e DAPI, respectivamente. Nkx2.5 é conhecido para marcar células progenitoras cardíacos, ao passo que α-actinina é uma proteína que marca sarcomérica cardiomiócitos diferenciadas. Temos observado a maioria das células que expressam todos estes marcadores (rosa; Figura 6H), indicando que estas células continuam a expressar marcadores de cardiomiócitos EVen após 23 dias de perfusão.

figura 1
Figura 1. Esquema de hardware descelularização. Uma. 60 cc reservatório corpo da seringa para solução detergente. B. Montagem de cateter com irrigação seringa tão detalhada. C. Detalhe da ponta do tubo do cateter PE desenhado. D. Câmara de descelularização e do septo com dreno. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Representação esquemática do bioreactor coração. 1. Umidificação do gás carbogênio (linhas verdes representam o fluxo de gás). 2. acionamento da bomba peristáltica para perfusão de mídia eoxigenação (linhas roxas representa o fluxo de mídia através oxigenador). 3. oxigenador de parede fina. 4. oxigenador Folha e reservatório de mídia. câmara 5. Preload e de retenção de bolhas. 6. câmara do coração (linhas vermelhas representa o fluxo de mídia de e para o coração). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. montagem inteira de coração de rato neonatal P3 antes (A) e após a descelularização (B). Este coração é descelularizados usando o método de perfusão Langendorff conforme descrito no método 2. Note que o coração se torna translúcido e ligeiramente ampliada seguinte perfusão (B) . Escala = 2 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 4. Histologia do coração de rato neonatal P3 nativa e decelularizado. Seção Cryostat (10 mm) foram coradas com H & E (A, B), colágeno IV (C, D, G, H) e DAPI (E, F, G, H ). imagens fundidas são representados em G e H. coloração H & E mostra uma ausência de núcleos celulares e citoplasma em tecido descelularizado (B) quando comparados com o coração nativo (A). Embora o conteúdo de colágeno IV permanece seguinte descelularização (D), a coloração DAPI (um marcador de núcleos) é abolida. As imagens fundidas demonstram a co-localização de colagénio IV e DAPI no coração ingénuo (G) e a ausência de co-localização desta no coração descelularizado (H). Estes dados indicam que as células não mais preencher a matriz de colagénio do coração. Escala = 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Avaliação do teor de ADN. Controlo (n = 6) e descelularizados (n = 5) corações testadas quanto ao teor de ADN pelo método Pico-verde. A quantificação expresso em ug de ADN por cardíaca ± desvio padrão. Asterisco indica p <0,01 em relação ao controle. Estes dados indicam que a descelularização reduz o teor de DNA significativamente no coração neonatal P3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6. Histologia do P3 matriz coração 23 dias seguintes recelularização com P1 mCherry expressando cardiomiócitos. Corados com H & E (A, escala = 250 mm, B, escala = 50 mm), DAPI (C, escala = 250 mm), NKX 2.5, mCherry, α-actinina, DAPI, e fundiu (D, e, F, G, H, escala = 50 mm). Nós demonstramos o repovoamento eficaz da matriz de colagénio com cardiomiócitos P1 (AC). Além disso, observou-se que os cardiomiócitos positivos m-cereja expressar Nkx2.5 e-actinina ct 23 dias após introdução da matriz de colágeno. Estes dados indicam que estas células manter sua identidade de cardiomiócitos por longos períodos de tempo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A dependência desta técnica em perfusões repetidas do coração faz a prevenção de uma embolia um componente crítico de um bom resultado. A partir do cateterismo do coração inicial nos Passos 2,2-2,6, para as mudanças de solução entre as etapas 2.8-2.14, existem manipulações que podem permitir a introdução de bolhas de ar que comprometem o fluxo de perfusato no miocárdio. Devido ao tamanho diminuto do coração neonatal, mesmo minúsculas bolhas na vasculatura pode causar um enfarte técnica, tornando assim a descelularização incompleta. Além disso, nas etapas de lavagem posteriores, perfusão incompleta pode resultar em resíduos de detergente que tem um impacto negativo biocompatibilidade. Além disso, as mudanças bruscas de temperatura, tais como durante a remoção da matriz de armazenamento de 4 ° C, como sugerido na Etapa 2.14, deverá ser feita com cuidado como esta também pode ser uma fonte de formação de bolhas de ar quando dissolvido gás se move para fora da solução com a mudança na temperatura. Wprocesso galinha para recelularização, cuidados adicionais devem ser aplicadas, quando se prepara a seringa com a suspensão de células, para garantir a infusão está livre de bolhas (Passo 6.4).

Pode ser necessário para manipular as especificidades deste protocolo para acomodar outros tipos de tecidos. Há um número de protocolos de decelularização 4,9,11 relataram que poderia servir de orientação. O objectivo final (s) de qualquer protocolo de descelularização deve incluir a manutenção da estrutura e bioquímica de proteínas de ECM relacionados, e a remoção adequada de componentes celulares nativas como exemplificado por ADN residual. Neste cenário, a aplicação da pressão de perfusão excessiva leva a perturbação da ultra-estrutura do ECM, que pode ser visualizado histologicamente.

O tamanho do coração do rato P3 coloca algumas limitações em comparação com a administração de células de tecido adulto. Enquanto corações adultos apresentam parede ventricular bastante espessa que faz transmural injectiona modalidade de entrega possível célula, o coração P3 é suficientemente pequeno para que uma agulha, o tamanho dos quais não irá lisar uma suspensão de células, causa danos substanciais para o coração. A perfusão é uma estratégia de entrega viável, mas depende de células de um determinado tamanho e forma para ser entregues eficazmente. miócitos murinos Neonatais funcionar bem neste aspecto. Outras células circulares pequenas também foram mostrados para servir a esta finalidade 11. A escala de tamanho desses corações impede o uso de análise funcional fisiológico convencional, como cateteres de volume pressão. Outras abordagens baseadas na captura de vídeo pode ter que ser considerado.

Estes dados suportam a viabilidade da descelularização e recelularização do coração neonatal de rato. Estudos anteriores demonstraram que o uso de adultos corações para efeitos de estudos descelularização / Recellularization. As matrizes produzidas a partir destes corações adultos foram repovoada com cardiomiócitos neonatais 4 e humanacélulas-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs) 17. No caso de os hiPSCs, os corações repopulated apresentado uma diminuição nos marcadores de pluripotência tais como NANOG, SOX2, e OCT4 e estruturas musculares-formados como; todos sugestivo de maturação. Os sinais extracelulares da ECM, no entanto, ter sido mostrado desempenhar um papel crítico no desenvolvimento das células, tecidos e órgãos, o que nos levou a tentar gerar matrizes de tecidos conhecidos para abrigar capacidade regenerativa. Em nossos estudos, que demonstram que os corações repovoados ainda expressam marcadores de cardiomiócitos, mesmo após cultura prolongada. Estes dados indicam que, utilizando novas matrizes, cardiomiócitos podem ser mantidas por longos períodos de tempo sem perder a sua identidade como cardiomiócitos. Os nossos dados suportam a técnica e viabilidade para descelularizante cardíaca neonatal mouse. As matrizes neonatais têm o potencial para proporcionar novas construções para estudos de repovoamento, bem como para a produção de géis que têm superior capacidade regenerativa. Usando estes ECMs neonatais, que estão actualmente a abordar a superioridade destes andaimes para formar tecidos funcionais com uma variedade de tipos de células, incluindo hiPSCs.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Materials for mouse heart isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) Jackson Laboratories 21577 or equivalent
60 mm Culture dish BD Falcon 353004 or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) Hyclone SH30256.01 or equivalent
Single Use Blade Stanley 28-510 or equivalent
Standard Scissors Moria Bonn (Fine Science Tools) 14381-43 or equivalent
Spring Scissors 10 cm Fine Science Tools 15024-10 or equivalent
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-00 or equivalent
#5 Forceps Dumnot (Fine Science Tools) 11295-00 or equivalent
2. Materials for decellularization
Inlet adaptor Chemglass CG-1013 autoclavable
Septum Chemglass CG-3022-99 autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing Cole-Parmer EW-06422-10 autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor McMaster-Carr 51525K33 autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor McMaster-Carr 51525K26 autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture  Ethicon 8648G or equivalent
Ring stand Fisher Scientific S47807 or equivalent
Clamp Fisher Scientific 05-769-6Q or equivalent
Clamp regular holder Fisher Scientific 05-754Q or equivalent
60 cc syringe barrel  Coviden 1186000777T or equivalent
Beaker Kimble 14000250 or equivalent
22 G x 1 Syringe Needle BD 305155 or equivalent
12 cc syringe Coviden 8881512878 or equivalent
3-way stop cock Smith Medical MX5311L or equivalent
PE50 tubing BD Clay Adams Intramedic 427411 Must be formable by heat. Polyethylene recommended.
1% SDS Invitrogen 15525-017 Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. 
Sterile dH2O Hyclone SH30538.02 Or MilliQ system purified water.
1x Pen/Strep Corning CellGro 30-001-Cl or equivalent
 
3. Materials for DNA quantitation
Proteinase K Fisher BP1700 >30 U/mg activity
KCl Sigma-Aldrich P9333 or equivalent
MgCl2·6H2O Mallinckrodt 5958-04 or equivalent
Tween 20  Sigma-Aldrich P1379 or equivalent
Tris base/hydrochloride Sigma-Aldrich T1503/T5941 or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit Life Technologies  P7589 requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin Sigma-Aldrich G2500 must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5 mm Tissue-Tek 4565 or equivalent
Cryostat Hacker/Bright Model OTF or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm Fisher Scientific 12-550-19 or equivalent
Hematoxylin 560  Surgipath/Leica Selectech  3801570 or equivalent
Ethanol Decon Laboratories 2701 or equivalent
Define Surgipath/Leica Selectech  3803590 or equivalent
Blue buffer  Surgipath/Leica Selectech  3802915 or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515  Surgipath/Leica Selectech  3801615 or equivalent
Formula 83 Xylene substitute  CBG Biotech  CH0104B or equivalent
Permount Mounting Medium  Fisher Chemical  SP15-500 or equivalent
Collagen IV Antibody Rockland 600-401-106.1 or equivalent
α-Actinin Antibody Abcam AB9465 or equivalent
mCherry Antibody Abcam AB205402 or equivalent
NKX2.5 Antibody Santa Cruz Biotechnology SC-8697 or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody Life Technology A21202 or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody Jackson Immunoresearch 703-585-155  or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody Jackson Immunoresearch  705-175-147 or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 Jackson Immunoresearch 111-587-003 or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher P36930 or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating
HBSS (Ca, Mg Free) Hyclone SH30031.02 or equivalent
HEPES (1 M) Corning CellGro 25-060-Cl or equivalent
Cell Strainer BD Falcon 352340 or equivalent
50 ml tube BD Falcon 352070 or equivalent
Primeria 100 mm plates Corning 353803 Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin Difco 215240 or equivalent
DNase II Sigma-Aldrich D8764 or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) Hyclone SH30022.01 or equivalent
Vitamin B12  Sigma-Aldrich V6629 or equivalent
Fibronectin coated plates  BD Bioscience 354501 or equivalent
Fetal bovine serum  Hyclone SH30910.03 or equivalent
Heart bioreactor glassware Radnoti Glass Technology 120101BEZ Must be sterilizable by autoclaving or gas.

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References

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