डिजिटल होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी के साथ मल्टीमॉडल मात्रात्मक चरण इमेजिंग सही आकलन आंतों में सूजन और उपकला घाव भरने

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lenz, P., Brückner, M., Ketelhut, S., Heidemann, J., Kemper, B., Bettenworth, D. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54460, doi:10.3791/54460 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

भड़काऊ आंत्र रोग, यानी की घटनाओं, क्रोहन रोग और अल्सरेटिव कोलाइटिस, काफी पिछले एक दशक से अधिक बढ़ गया है। आईबीडी के एटियलजि अज्ञात बना हुआ है और वर्तमान चिकित्सकीय रणनीति प्रतिरक्षा प्रणाली के unspecific दमन पर आधारित हैं। उपचार है कि विशेष रूप से आंतों में सूजन और उपकला घाव भरने लक्ष्य काफी आईबीडी के प्रबंधन में सुधार सकता है के विकास, लेकिन इस भड़काऊ परिवर्तन का सटीक पता लगाने की आवश्यकता है। वर्तमान में, संभावित दवा उम्मीदवारों को आम तौर पर इन विवो में या इन विट्रो में सेल संस्कृति आधारित तकनीक के साथ पशु मॉडल का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाता है। Histological परीक्षा आमतौर पर कोशिकाओं या ब्याज के ऊतकों दाग हो, जो नमूना विशेषताओं को बदल सकता है और इसके अलावा, निष्कर्षों की व्याख्या अन्वेषक विशेषज्ञता से भिन्न हो सकते हैं की आवश्यकता है। डिजिटल होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी (डी एच एम), ऑप्टिकल पथ लंबाई देरी का पता लगाने पर आधारित है, की अनुमति देता हैदाग-मुक्त मात्रात्मक चरण विपरीत इमेजिंग। यह सीधे पूर्ण biophysical मानकों के साथ सहसंबद्ध किया जा करने के लिए परिणामों की अनुमति देता है। हम कैसे डी एच के साथ ऊतक के घनत्व में परिवर्तन की माप, अपवर्तनांक माप के आधार पर, भड़काऊ परिवर्तन यों कर सकते हैं, धुंधला बिना, चूहों और कोलाइटिस के साथ मनुष्य से colonic ऊतक नमूनों की विभिन्न परतों में प्रदर्शित करता है। इसके अतिरिक्त, हम ऐसे शुष्क बड़े पैमाने पर और पलायन कोशिकाओं की परत मोटाई के रूप में इन विट्रो, संभव घायल क्षेत्र और रूपात्मक के मापदंडों के एक साथ दृढ़ संकल्प के सरल स्वचालित दृढ़ संकल्प के माध्यम से डी एच एम का उपयोग करने में उपकला घाव भरने की सतत बहुविध लेबल मुक्त निगरानी प्रदर्शित करता है। अंत में, डी एच एम एक मूल्यवान, संभव मापदंडों के लिए निरपेक्ष मूल्यों के साथ आंतों में सूजन के आकलन के लिए उपन्यास और मात्रात्मक उपकरण, इन विट्रो में उपकला घाव भरने की सरलीकृत मात्रा का ठहराव का प्रतिनिधित्व करता है और इसलिए translational नैदानिक ​​यू के लिए उच्च क्षमता हैएसई।

Introduction

भड़काऊ आंत्र रोग (IBD), यानी, अल्सरेटिव कोलाइटिस (यूसी) और Crohn रोग (सीडी) जठरांत्र पथ 1 की अज्ञातहेतुक भड़काऊ विकारों हैं। आईबीडी की अंतर्निहित pathophysiology और संभावित नई दवाओं या उपन्यास नैदानिक ​​दृष्टिकोण के मूल्यांकन में अनुसंधान विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। दोनों बुनियादी अनुसंधान और आईबीडी रोगियों के नैदानिक ​​प्रबंधन में, आंत्र म्यूकोसा ध्यान 2,3 का ध्यान केंद्रित हो गया है। म्यूकोसा एक संरचनात्मक सीमा, जिस पर खानेवाला बैक्टीरिया, उपकला कोशिकाओं और आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली के विभिन्न सेलुलर घटकों के बीच बातचीत आर्केस्ट्रा पेट homeostasis 4,5 प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, आईबीडी रोगियों में, अनियंत्रित और लगातार आंतों में सूजन क्षति, छालों या एक प्रकार का रोग है, जो अंत में उपकला बाधा समारोह है, जो खुद स्थानीय सूजन 6 aggravates के टूटने में culminate कर सकते हैं के रूप में पहचाने जाने mucosal की ओर जाता है।

7 जठरांत्र अल्सर या anastomotic रिसाव के उपचार के लिए एक कोर की आवश्यकता है। उपकला, घाव भरने चिकित्सा assays और इन विट्रो घाव में प्रेरित किया जा सकता आंतों में सूजन 8,9 की murine मॉडल में। दोनों इन विट्रो और इन विवो में दृष्टिकोण कमियां है, जो प्रायोगिक मूल्यांकन की सटीकता सीमा है। इन विट्रो assays शास्त्रीय खरोंच assays की तरह फ्लोरोसेंट chromophores के साथ लंबी धुंधला प्रक्रियाओं या अभिकर्मक की आवश्यकता होती है। वे अक्सर सेल प्रसार और प्रवास है कि 10 स्वचालित नहीं किया जा सकता है की उनकी असंतत निगरानी द्वारा सीमित हैं। इस तरह के dextran सोडियम सल्फेट (डीएसएस) प्रेरित कोलाइटिस के रूप में vivo मॉडल, अक्सर मजबूत पढ़ें बहिष्कार, भाग में महत्वपूर्ण देखा भिन्नता के कारण की कमी प्रयोगशाला में मार्कर, एमएराजा इस तरह के अनुचित मार्कर कोलाइटिस गंभीरता 11,12 मूल्यांकन करने के लिए। सूजन म्यूकोसा के histological विश्लेषण वर्तमान में अभी भी सबसे अधिक मान्य दृष्टिकोण कोलाइटिस गंभीरता को निर्धारित करने के लिए है, लेकिन यह, इन विट्रो उपकला घाव भरने assays की तरह, धुंधला की आवश्यकता है और अन्वेषक की विशेषज्ञता 13 पर निर्भर है।

हाल ही में डिजिटल होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी (डी एच एम), मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोपी 14 का एक संस्करण, इन विट्रो और इन विवो 15 में उपकला घाव भरने के मूल्यांकन के लिए उपयोगी उपकरण के रूप में पहचान की थी। डी एच ऑप्टिकल पथ लंबाई देरी को मापने के द्वारा ऊतक के घनत्व के आकलन के लिए अनुमति देता है (ओपीडी) है, जो संभावनाओं उपन्यास कैंसर निदान 16-18 और सूजन से संबंधित ऊतक परिवर्तन 19 की मात्रा। इसके अतिरिक्त, डी एच सेल मोटाई, सेल कवर सतह क्षेत्र और intracellular (प्रोटीन) सामग्री की मात्रा के निर्धारण से सेल आकृति विज्ञान गतिशीलता की निगरानी की अनुमति देता इन विट्रो assays में, डी एच एम भी शारीरिक प्रक्रियाओं, जैसे, सेल की मात्रा और मोटाई 21,22 में परिवर्तन का मूल्यांकन द्वारा सेलुलर पानी पारगम्यता के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है। इसके अलावा, डी एच माप स्वचालित किया जा सकता है जो अन्वेषक जुड़े नमूना पूर्वाग्रह से बचाता है।

यहाँ, हम आंतों में सूजन के एक murine मॉडल में डी एच के उपयोग के प्रदर्शन, और यह भी एक लेबल मुक्त इन विट्रो परख के रूप में घाव भरने की मात्रात्मक निगरानी के लिए मानव ऊतकों के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए डी एच लागू होते हैं। सबसे पहले, हम colitic चूहों और आईबीडी के साथ मनुष्य से ऊतक वर्गों में अलग colonic दीवार परतों के भड़काऊ परिवर्तन का मूल्यांकन। डी एच मात्रात्मक चरण इमेजिंग प्रक्रिया का वर्णन करने के बाद, हम हासिल कर ली मात्रात्मक चरण छवियों के मूल्यांकन का वर्णन माइक्रोस्कोप घटकों, ऊतक वर्गों की तैयारी और भी उपयोग के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करते हैं।

अगला, हम बताते हैं कि डी एच यूटीआई हो सकता हैइन विट्रो में उपकला घाव भरने की सतत निगरानी के लिए बहुविध lized, और सेल परत मोटाई, शुष्क जन और सेलुलर मात्रा तरह सेलुलर विशेषताओं के विश्लेषण का वर्णन प्रेरित दवा और शारीरिक परिवर्तन सेल में अंतर्दृष्टि दे।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रयोगों क्षेत्रीय आचार समिति (Landesamt फर प्रकृति, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, जर्मनी) जर्मन पशु संरक्षण कानून के अनुसार द्वारा अनुमोदित किया गया। हैम्बर्ग विश्वविद्यालय के स्थानीय आचार समिति ऊतकीय और माइक्रोस्कोप के विश्लेषण के लिए मानव ऊतकों के उपयोग को मंजूरी दी।

1. पशु और सामग्री

  1. स्थानीय पशु देखभाल कानून के अनुसार महिला या आवश्यक DSS-अतिसंवेदनशील तनाव है कि 20 से 25 ग्राम तक वजन के नर चूहों, और घर का प्रयोग करें। मूषक के लिए विशेष चाउ प्रदान करें और पानी यथेच्छ पीने autoclaved।
  2. 5 दिनों के लिए Autoclaved नल के पानी में: 3% w / v dextran सल्फेट सोडियम (36,000-50,000 दा DSS, आणविक वजन) प्रशासन द्वारा तीव्र DSS कोलाइटिस प्रेरित।
    नोट: DSS की शक्ति निर्माता और बैच के आधार पर अत्यधिक चर रहा है। रोग गतिविधि के शामिल होने के लिए टेस्ट, पहले अपने सप्लायर-प्रदान की DSS जो महंगाई भत्ते के लिएily शरीर के वजन में एक विश्वसनीय और उद्देश्य सूचक है।
  3. Colonic ऊतकों के नमूनों की ऊतकीय मूल्यांकन के लिए, प्रयोग के अंत में सीओ 2 उच्छवाल (या के रूप में राष्ट्रीय और संस्थागत दिशा निर्देशों द्वारा निर्दिष्ट) द्वारा चूहों euthanize।

DSS-कोलाइटिस के लिए 2. प्रयोगात्मक सेटअप और इन विट्रो घाव भरने Assays

  1. सेल संस्कृति और घाव भरने परख की स्थापना।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 95% नमी और 5% सीओ 2 के माहौल में Caco -2 कोशिकाओं को विकसित। 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ RPMI माध्यम का प्रयोग करें।
    2. 35 मिमी उच्च संस्कृति-डालने के साथ पेट्री डिश पर 4 x 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी के घनत्व पर बीज Caco-2 कोशिकाओं (चित्रा -4 ए देखें)।
      नोट: डालने दो सेल कवर क्षेत्रों उस के साथ एक परिभाषित सेल मुक्त अंतरिक्ष घायल क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करने के लिए विश्लेषण किया जा अलग हो रहे हैं उत्पन्न करता है।
    3. दो दिन के बाद seedin मध्यम बदलेंजी। पहले एक स्वचालित पिपेट का उपयोग करके सेल मलबे के साथ अवशिष्ट मध्यम aspirating द्वारा प्रदर्शन करना, (पीबीएस) फॉस्फेट खारा बफर के 100 μl से कुल्ला और ताजा RPMI मध्यम या सीरम वंचित माध्यम जोड़ें।
    4. सीरम वंचित मध्यम (0.1% FBS) घाव भरने के व्यवहार में परिवर्तन का पता लगाने के लिए 20 एनजी EGF / एमएल सीरम या 2 माइक्रोग्राम mitomycin सी / एमएल सीरम के साथ पूरक में 24 घंटे के लिए संस्कृति कोशिकाओं। 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए सामान्य RPMI मध्यम जोड़ें।
    5. संस्कृति के 24 घंटे के बाद, हटाने और 3.4 कदम के रूप में वर्णित संस्कृति सम्मिलित त्यागने और डी एच प्रदर्शन करते हैं।
  2. तीव्र DSS कोलाइटिस की प्रेरण
    1. autoclaved पानी एक 3% (w / v) DSS समाधान पाने के लिए 100 मिलीलीटर में इस के बारे में 3 ग्राम भंग। 7 दिनों के लिए चूहों यथेच्छ के लिए पीने के पानी के स्थान पर इस समाधान प्रदान करें। प्रति माउस / दिन DSS-समाधान के 5 मिलीलीटर की गणना। चूहों पर नियंत्रण यथेच्छ के लिए डीएसएस बिना Autoclaved पानी उपलब्ध कराने के।
  3. murine और मानव पेट के cryostatic वर्गों की तैयारी
    1. प्रयोग के अंत में सीओ 2 उच्छवाल द्वारा चूहों euthanize।
    2. Laparotomy 23 से 'जानवरों के पेट काटना। पूरे पेट के हटाये ध्यान से चिमटी का उपयोग और शल्य कैंची का उपयोग ileal और मलाशय के अंत में कटौती। मलाशय के अंत करने के लिए cecal से longitudinally एक कैंची के साथ पेट के कट और पेट खुला। पीबीएस 24 से धोने के द्वारा पीछा चिमटी का उपयोग नमूना से सभी मल निकालें।
    3. एक कपास म्यूकोसा अंदर की ओर मुड़े के साथ गुदा अंत करने के लिए cecal से longitudinally कली के साथ पूरे पेट के ऊपर रोलिंग द्वारा स्विस रोल तैयार करें। इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) परिसर में colonic नमूने एम्बेड और -80 डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग पर जमे हुए रहते हैं।
    4. इष्टतम काटने तापमान अक्टूबर यौगिक में शल्य नमूना से मानव colonic ऊतक एम्बेड और -80 डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग पर जमे हुए रहते हैं।
    5. एक cryoto की मदद से अक्टूबर यौगिक एम्बेडेड नमूनों में से 7 माइक्रोन मोटाई के वर्गों में कटौतीमुझे सिर्फ परीक्षा से पहले।
      ध्यान दें: इष्टतम नमूना मोटाई दृढ़ता और जांच के तहत ऊतक प्रकार के बिखरने के गुणों पर निर्भर करता है। पेट के ऊतक, टुकड़ा मोटाई> 10 माइक्रोन कारण शोर में उल्लेखनीय वृद्धि का उपयोग वर्णित प्रयोगों मात्रात्मक डी एच चरण विपरीत छवियों में प्रकाश बिखरने की वजह से, के लिए मोटाई के नमूने <5 माइक्रोन क्रायो काटने की प्रक्रिया से कलाकृतियां नुकसान प्रेरित लिए एक उच्च जोखिम दिखाने है।
    6. एक गिलास वस्तु वाहक स्लाइड पर वर्गों स्थानांतरण।

3. तकनीकी उपकरण, सॉफ्टवेयर और अधिग्रहण और डिजिटल होलोग्राम के मूल्यांकन के लिए प्रक्रिया

  1. मात्रात्मक सेल और ऊतक इमेजिंग के लिए डिजिटल माइक्रोस्कोप होलोग्राफिक
    1. चित्र 1 में दिखाया गया है, जीना सेल इमेजिंग 25 के लिए एक बंद अक्ष मच Zehnder डिजिटल होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी प्रणाली का प्रयोग करें। सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप एक साथ सुसज्जित है10X माइक्रोस्कोप के लेंस, 35 मिमी की एक व्यास के साथ कांच वस्तु वाहक स्लाइड और पेट्री डिश के लिए एक धारक के साथ एक खुर्दबीन मंच, एक हीटिंग चैम्बर मात्रात्मक चरण इमेजिंग 25 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर शारीरिक तापमान और सॉफ्टवेयर की रक्षा करने के लिए।
      नोट: उदाहरण के लिए, केम्पर एट अल 26 और Langehanenberg एट अल 27 में वर्णित है।।।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक समान प्रणाली है कि उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी और जीवित कोशिकाओं के मात्रात्मक चरण इमेजिंग और विच्छेदित ऊतक स्लाइड प्रदर्शन करने में सक्षम है का उपयोग करें।
    2. स्वच्छ माइक्रोस्कोप के लेंस और लेंस सफाई कागज और एक सफाई एजेंट (जैसे, इथेनॉल) के रूप में माइक्रोस्कोप के निर्माता से सिफारिश धूल या अन्य संदूषण को दूर करने के साथ कंडेनसर।
    3. डी एच माइक्रोस्कोप की छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू, "उज्ज्वल क्षेत्र" इमेजिंग मोड और स्विच सफेद रोशनी रोशनी "पर" का चयन करें। सुनिश्चित करें कोहलर-illuminनमूने के रूप में समझना माइक्रोस्कोप निर्माता से सिफारिश की है, जबकि छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (वैकल्पिक रूप से एक मानक छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर इस चरण में इस्तेमाल किया जा सकता है) का जीना इमेजिंग विंडो में नमूना देख।
      ध्यान दें: छवि तीव्रता देखने के क्षेत्र में समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए और नमूना स्थिति माइक्रोस्कोप का ध्यान केंद्रित ड्राइव के साथ ऑप्टिकल refocusing के दौरान नहीं बढ़ना चाहिए।
    4. "डी एच" इमेजिंग मोड, बारी "बंद" सफेद रोशनी रोशनी और स्विच लेजर प्रकाश "पर" का चयन करें। जाँच करें कि लेजर प्रकाश के साथ रोशनी सजातीय है (यानी, प्रकाश की तीव्रता ही ढंग डी एच माइक्रोस्कोप की इमेजिंग अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का जीना इमेजिंग विंडो में वितरित किया जाता है कि) और पालन कि बंद अक्ष वाहक हस्तक्षेप फ्रिंज पैटर्न में पर्याप्त विपरीत के साथ प्रकट होता है कब्जा कर लिया छवियों (डिजिटल होलोग्राम)।
  2. इमेजिंग के लिए cryostat वर्गों की तैयारीडी एच के साथ
    1. फ्रीजर से बाहर: (2.3 में वर्णित के रूप में 7 माइक्रोन, एक गिलास वस्तु वाहक पर cryostat अनुभाग, मोटाई) नमूना ले लो। आर टी और सामान्य वातावरण के बारे में 5 मिनट के लिए नमूना defrost।
    2. 100 μl फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) एक पिपेट का उपयोग कर जब तक यह पूरी तरह से बफर के साथ कवर किया जाता है ऊतक खंड पर मध्यम embedding के रूप में - 50 जोड़ें। एक साफ कांच कवर पर्ची (ग्लास मोटाई 170 माइक्रोन) के साथ नमूना कवर।
      नोट: ओवर सुखाने अपवर्तनांक की महत्वपूर्ण परिवर्तन और नमूना के बिखरने गुण पैदा कर सकते हैं।
    3. सुनिश्चित करें कि कांच के वाहक और कवर पर्ची के नीचे धूल और अन्य संदूषण कि रोशनी बिखरने से उत्पन्न हो सकता है साफ कर रहे हैं। नमूना उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी और डी एच के साथ जांच के लिए तैयार है।
  3. डी एच के साथ ऊतक वर्गों के मात्रात्मक चरण इमेजिंग
    1. डिजिटल होलोग्राफिक माइक्रोस्कोप पर स्विच, इमेजिंग के लिए 10X माइक्रोस्कोप के लेंस का चयन करें। मैं शुरूडी एच माइक्रोस्कोप का दाना अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और चमकदार फ़ाइल इमेजिंग मोड का चयन करें।
    2. ऊतक स्लाइड खुर्दबीन स्लाइड धारक में 2 में वर्णित) के रूप में, कवर पर्ची खुर्दबीन उद्देश्य का सामना करना पड़ के साथ रखें।
    3. स्विच "पर" डी एच माइक्रोस्कोप के उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी। खुर्दबीन मंच के साथ नमूना स्थिति और यह सुनिश्चित करें कि ब्याज के ऊतकों क्षेत्र को लाइव निगरानी विंडो में दिखाई दे रहा है। माइक्रोस्कोप का ध्यान ड्राइव का उपयोग कर छवि के तीखेपन में सुधार लाना।
      नोट: साथ ही ब्याज का क्षेत्र, ऊतक के बिना स्लाइड के एक क्षेत्र को भी देखने के क्षेत्र में मौजूद होना चाहिए।
    4. तेजी से ध्यान केंद्रित नमूना छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने का एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि पर कब्जा है।
    5. चुनें "डी एच" इमेजिंग मोड, "बंद" सफेद रोशनी रोशनी बारी बारी और लेजर प्रकाश रोशनी "पर"। 3 मिसे नीचे होलोग्राम रिकॉर्डिंग के लिए "जोखिम समय" का चयन करें, कि Hologr निरीक्षणaphic बंद अक्ष हस्तक्षेप किनारे इमेजिंग अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का जीना इमेजिंग विंडो में पर्याप्त विपरीत के साथ दिखाई देते हैं और एक डिजिटल होलोग्राम कब्जा।
    6. दोहराएँ कदम 3.3.3 - 3.3.5 जब तक उज्ज्वल क्षेत्र छवियों और अलग नमूना क्षेत्रों के डिजिटल होलोग्राम के लिए पर्याप्त संख्या में दर्ज किया गया है। होलोग्राम अधिग्रहण अब पूरा हो गया है।
  4. डी एच इमेजिंग के लिए घाव भरने assays की तैयारी
    1. डी एच माइक्रोस्कोप के बारे में 1 की पेट्री डिश हीटिंग चैम्बर पर स्विच - 3 घंटा प्रयोग के शुरू होने से पहले डी एच माप के दौरान स्थिर तापमान की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए।
    2. आवश्यक उपकरण (घाव भरने परख 2.3 में वर्णित है के लिए पेट्री डिश) के साथ कार्यक्षेत्र तैयार: pipettes, चिमटी, पेट्री डिश के लिए कांच के ढक्कन, 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) शारीरिक के साथ सेल संस्कृति के माध्यम बफर तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) बाँझ वातावरण में नमूना तैयार करने के लिए।
      नोट: 3 NaHCO से बना है।
    3. पेट्री डिश से प्लास्टिक के ढक्कन निकालें और एक विंदुक के साथ सेल संस्कृति के माध्यम से हटा दें। पेट्री डिश चिमटी का उपयोग कर नीचे से डालने निकालें।
    4. मृत कोशिकाओं और घाव क्षेत्र में शेष सेलुलर घटकों (जैसे, सीरम) हटाने के लिए आदेश में 1 मिलीलीटर HEPES बफर सेल संस्कृति के माध्यम से 2 बार - नमूना धो 1। 2 मिलीलीटर HEPES बफर सेल संस्कृति के माध्यम जोड़ें और कांच के ढक्कन के साथ पेट्री डिश टोपी।
    5. सुनिश्चित करें कि कांच के ढक्कन और पेट्री डिश नीचे धूल और अन्य संक्रमण से साफ कर दिया गया है। नमूना डी एच के साथ समय व्यतीत हो जाने के अवलोकन के लिए तैयार है।
  5. सतत बहुविध डी एच के साथ इन विट्रो में घाव भरने की निगरानी
    1. 3 घंटा पहले है - डी एच माइक्रोस्कोप के बारे में 1 की पेट्री डिश हीटिंग चैम्बर पर स्विचप्रयोग के शुरू करने के लिए डी एच माप के दौरान स्थिर तापमान की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए।
    2. स्विच डिजिटल होलोग्राफिक माइक्रोस्कोप "पर", इमेजिंग के लिए 10X माइक्रोस्कोप के लेंस का चयन करें। डी एच माइक्रोस्कोप की छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू और "उज्ज्वल क्षेत्र" इमेजिंग मोड का चयन करें। सुनिश्चित करें कि पेट्री डिश के लिए हीटिंग चैम्बर एक शारीरिक तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) काम कर रही है।
    3. डी एच माइक्रोस्कोप के ताप कक्ष में घाव भरने परख के साथ पेट्री डिश, 4 में वर्णित के रूप में तैयार), रखें।
    4. उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग मोड का चयन करें और खुर्दबीन मंच के साथ नमूना स्थिति, जबकि यह डी एच माइक्रोस्कोप की छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का जीना निगरानी विंडो में देख। ध्यान से देखें कि नमूने के वांछित क्षेत्र में तेजी से सफेद रोशनी रोशनी के तहत ध्यान केंद्रित प्रकट होता है।
    5. उज्ज्वल क्षेत्र सफेद तहत (मिला हुआ कोशिकाओं के साथ आसपास के क्षेत्रों में घाव क्षेत्र और) नमूना के विभिन्न क्षेत्रों की छवियों पर कब्जाछवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और दस्तावेज़ उपस्थिति, सेल घनत्व और एकरूपता के साथ प्रकाश रोशनी।
    6. "उज्ज्वल क्षेत्र" डी एच माइक्रोस्कोप की इमेजिंग मोड का चयन करें। डी एच माइक्रोस्कोप की छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ लाइव निगरानी विंडो में सफेद रोशनी रोशनी के तहत एक उपयुक्त घाव क्षेत्र का चयन करें। सुनिश्चित करें घाव क्षेत्र मृत कोशिकाओं और कोई सीरम अवशेष से मुक्त है, और यह सुनिश्चित करें कि दोनों पक्षों ने एक भी सजातीय सेल परत, अधिमानतः सीधे सीमाओं के साथ शामिल हैं।
    7. डी एच माइक्रोस्कोप की छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग मोड में प्रारंभिक घाव क्षेत्र की एक सफेद प्रकाश छवि पर कब्जा है।
    8. "बंद" सफेद रोशनी रोशनी बारी, "" पर लेजर रोशनी "डी एच" मोड और स्विच का चयन करें। होलोग्राम की रिकॉर्डिंग के लिए नीचे 3 मिसे के एक जोखिम समय (पालन कि होलोग्राफिक बंद अक्ष हस्तक्षेप किनारे टी की छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का जीना इमेजिंग विंडो में पर्याप्त विपरीत के साथ दिखाई देते हैं का चयन करेंवह माइक्रोस्कोप डी एच एम) और एक डिजिटल होलोग्राम कब्जा।
    9. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ डी एच मोड में एक नमूना होलोग्राम पर कब्जा है और आदेश छवि गुणवत्ता की जांच करने के डी एच माइक्रोस्कोप के पुनर्निर्माण के सॉफ्टवेयर के साथ एक मात्रात्मक चरण की छवि को फिर से संगठित।
    10. डी एच माइक्रोस्कोप की छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ समय व्यतीत होलोग्राम अधिग्रहण के लिए - (5 मिनट के जैसे, 3) एक उपयुक्त समय में देरी का चयन करें।
    11. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में जो नमूना केवल होलोग्राम अधिग्रहण के दौरान लेजर प्रकाश के साथ प्रकाशित किया जाता है के समय चूक अधिग्रहण मोड का चयन करें।
    12. घाव भरने परख के समय चूक डी एच अवलोकन शुरू करो।
    13. इरादा समय के बाद समय चूक अधिग्रहण बंद करो, उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग मोड का चयन करें और सफेद प्रकाश इमेजिंग के तहत नमूने के फाइनल दस्तावेज़।
  6. विच्छेदित ऊतकों की डिजिटल होलोग्राम फिर से संगठित और एक पैरामीटर यों के रूप में औसत अपवर्तनांक निर्धारितऊतक के घनत्व
    1. , डी एच माइक्रोस्कोप, जैसे की सॉफ्टवेयर के साथ विच्छेदित ऊतकों की डिजिटल होलोग्राम से मात्रात्मक चरण छवियों पुनर्निर्माण किया। केम्पर एट अल। 26 और Langehanenberg एट अल 27 में वर्णित है।
    2. अलग ऊतक परतों (उपकला, submucosa, स्ट्रोमा) हितों (ROIs), 19 की उचित रूप से चुने हुए क्षेत्रों में औसत चरण विपरीत Δφ निर्धारित करते हैं।
    3. एक refractometer का या वैकल्पिक रूप से साहित्य से एक उचित मूल्य का उपयोग करके embedding माध्यम के अपवर्तनांक निर्धारित करते हैं। (ठेठ एम्बेड मीडिया के लिए अपवर्तनांक मान: n पानी = 1.334 28, एन फास्फेट खारा (पीबीएस) = 1.337 29, एन सेल संस्कृति के माध्यम = 1.337-1.339 29,30 बफर)।
    4. अलग ऊतक परतों के अपवर्तक सूचकांक की गणना औसत चरण विपरीत से मानों 19
      1 समीकरण ध्यान दें: Eq में। , डी विच्छेदित ऊतकों की मोटाई (यहाँ: 7 माइक्रोन): 1 λ लेजर प्रकाश (λ = 532 एनएम यहाँ) की तरंग दैर्ध्य है और एन मध्यम embedding मध्यम (यहाँ के अपवर्तनांक है: मध्यम = n पीबीएस n = 1.337, एक एब्बे-Refractometer द्वारा निर्धारित)।
  7. फिर से संगठित और समय चूक से डिजिटल होलोग्राम का मूल्यांकन घाव भरने श्रृंखला अवलोकन
    1. समय व्यतीत हो जाने के होलोग्राम डी एच माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर 26,27 के साथ घाव भरने अवलोकन के दौरान प्राप्त की श्रृंखला से मात्रात्मक चरण छवियों पुनर्निर्माण किया।
    2. अधिकतम चरण विपरीत के साथ छवि के लिए मात्रात्मक चरण छवियों के प्रत्येक श्रृंखला मानक के अनुसार।
    3. निर्धारित बनाने के लिए क्षेत्र की एस सी है कि छवि विभाजन से मात्रात्मक डी एच चरण छवियों में कोशिकाओं द्वारा कवर किया जाता है, जो प्रति हो सकता हैमुफ्त सॉफ्टवेयर सेल प्रोफाइलर का उपयोग का गठन (www.cellprofiler.org 31)।
    4. क्षेत्र एस सी में कोशिकाओं Δφ सेल की औसत चरण विपरीत गणना।
    5. क्षेत्र एस सी 15 में औसत चरण विपरीत Δφ सेल से सेलुलर शुष्क जन डीएम निकालते
      2 समीकरण (2)
      नोट: समीकरण में 2 डीएम सेलुलर शुष्क जन अर्थ, एस सी क्षेत्र में है कि कोशिकाओं और α = 0.002 मीटर 2 / किलो के कब्जे में है प्रस्तुत करता है।
    6. अभिन्न सेलुलर अपवर्तनांक n सेल और सेल संस्कृति के माध्यम से n माध्यम के अपवर्तनांक निर्धारित करते हैं। 30 में वर्णित के रूप में निलंबित कोशिकाओं से अलग प्रयोगात्मक n सेल का निर्धारण करते हैं और एक साथ refractometer n मध्यम उपाय। वैकल्पिकtively n सेल 30 और एन मध्यम 29,30 के लिए साहित्य मूल्यों का उपयोग करें।
    7. Λ, Δφ सेल, एन सेल और एन मध्यम 26,32 से औसत सेल मोटाई डी सेल की गणना
      3 समीकरण (3)
      ध्यान दें: Eq में। 3 डी सेल पैरामीटर औसत सेल मोटाई, अर्थ लेजर प्रकाश की तरंग दैर्ध्य प्रकाश है λ, Δφ सेल औसत चरण विपरीत अर्थ है, और एन सेल और एन मध्यम अभिन्न सेलुलर अपवर्तनांक और आसपास के माध्यम के अपवर्तनांक हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

डिजिटल होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी के लिए डी एच इमेजिंग के लिए विशिष्ट सेटअप (डी एच एम)

उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग और मात्रात्मक डी एच चरण विपरीत इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए, हम एक औंधा माइक्रोस्कोप के रूप में चित्रा 1 बी में दर्शाया लागू होता है। के रूप में पहले 25 में वर्णित प्रणाली, एक डी एच मॉड्यूल संलग्न द्वारा संशोधित किया गया था। YAG लेजर λ = 532 एनएम) मच Zehnder विन्यास (चित्रा 1 ए) में: डिजिटल होलोग्राम रोशनी से एक आवृत्ति दोगुनी एन डी के प्रकाश के साथ नमूना उत्पन्न किया गया। विच्छेदित ऊतकों पूर्व vivo कांच वाहक स्लाइड्स पर विश्लेषण किया गया। के रूप में छवि। 1 सी में दिखाया जीवित कोशिका संस्कृतियों के अवलोकन के घाव भरने के लिए विशेष पेट्री डिश में मनाया गया। नमूने एक 10X मील के माध्यम से प्रसारण रोशनी में imaged थेcroscope लेंस (एनए = 0.3) और एक ट्यूब लेंस। एक आरोप युग्मित डिवाइस कैमरा थोड़ा झुका संदर्भ लहर के साथ हस्तक्षेप पैटर्न (डिजिटल बंद अक्ष होलोग्राम) नमूना छवि (वस्तु लहर) superimposing द्वारा उत्पन्न रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। डिजिटल कब्जा कर लिया होलोग्राम स्थानिक चरण वैकल्पिक होलोग्राफिक Autofocusing 26,33 के साथ संयोजन में पुनर्निर्माण के स्थानांतरण द्वारा खंगाला गया।

डी एच द्वारा Murine DSS प्रेरित कोलाइटिस का आकलन

एक्यूट कोलाइटिस 5 दिनों के लिए पीने के पानी में डब्ल्यू / वी dextran सल्फेट सोडियम (डीएसएस) 3% की प्रशासन द्वारा चूहों में प्रेरित किया गया था। अभिव्यक्ति और कोलाइटिस के पाठ्यक्रम नियंत्रण समूह की तुलना में इस के बारे इलाज समूह में प्रगतिशील वजन घटाने के लिए निगरानी के द्वारा पीछा किया गया था। (चित्रा 2 एक 19 से अनुकूलित)। Endoscopically, गंभीर कोलाई के लिए उदारआज़ादी के रूप में colonic दीवार का उमड़ना से परिलक्षित मनाया गया, संवहनी पैटर्न (जैसे, सहज खून बह रहा है, लाल तीर), आतंच exudations (सफेद तीर) और mucosal सतह (चित्रा 2 बी) के विघटन के परिवर्तन। Hematoxylin और eosin की पारंपरिक histological मूल्यांकन (एचई) दाग colonic वर्गों के नियंत्रण जानवरों, मुख्य रूप से submucosa (चित्रा 2 सी ग्रे तीर) में स्थित छंद DSS इलाज colonic दीवार में उल्लेखनीय शोफ का पता चला। मात्रात्मक डी एच चरण विपरीत छवियों और संबंधित अपवर्तनांक नक्शे 1 समीकरण के द्वारा प्राप्त अनुरूप भी उपर्युक्त ऊतक परिवर्तन दर्शाया। इसके अतिरिक्त, अपवर्तनांक, 256 ग्रे स्तर के लिए कोडित, उपकला (सफेद तीर) और स्ट्रोमा (काला तीर) देशी, बेदाग ऊतकों के नमूनों में (चित्रा 2 सहित ऊतक परतों में घनत्व में मतभेद का संकेत दिया सी)। अपवर्तनांक काफी उपकला में, साथ ही स्वस्थ नियंत्रण (चित्रा 2 ई) की तुलना में submucosa और colitic चूहों के स्ट्रोमा में कम हो गया था। इसके अतिरिक्त, नैदानिक ​​पैरामीटर (शरीर के वजन के रिश्तेदार हानि) और पूर्ण शारीरिक पैरामीटर (अपवर्तनांक) के बीच एक महत्वपूर्ण संबंध मनाया जा सकता है (2 आर रैखिक = 0.64, चित्रा 2 डी, 19 से अनुकूलित)।

डी एच द्वारा मनुष्य में Crohn रोग का आकलन

Crohn रोग अक्सर आंतों की दीवारों की उल्लेखनीय भड़काऊ परिवर्तन, जठरांत्र एंडोस्कोपी से पता लगाया द्वारा की पहचान की है। विशेषता स्थूल सुविधाओं mucosal सतह के विघटन का समावेश, आतंच exudat साथ अनुदैर्ध्य अल्सरआयनों और सहज खून बह रहा है (चित्रा 3 ए) (भी "घोंघा ट्रेल्स" कहा जाता है)। सक्रिय सीडी के साथ रोगियों से ऊतकों के नमूनों के महामहिम धुंधला द्वारा histological मूल्यांकन अक्सर colonic दीवार के रूप में अच्छी तरह से सबम्यूकोसल शोफ प्रकट करते हैं। मात्रात्मक डी एच चरण विपरीत छवियों और संबंधित अपवर्तनांक नक्शे 1 समीकरण के द्वारा प्राप्त अनुरूप भी भड़काऊ मध्यस्थता वृद्धि / colonic दीवार की सूजन, यहाँ उपकला (चित्रा 3 बी) में देखा पता चला। इसके अलावा, एक निरपेक्ष पैरामीटर के रूप में अपवर्तनांक, भी काफी सब दीवार परतों (उपकला, submucosa और स्ट्रोमा) colonic ऊतकों के नमूनों में रोगियों से छूट में उन आयतों सक्रिय सीडी (चित्रा 3 सी) के साथ कम हो गया था।

इन विट्रो घाव भरने के मल्टीमॉडल निगरानी

Caco -2 सेल चिकित्सा assays एक विशेष पेट्री डिश का उपयोग कर मानकीकृत स्थिति प्रदान करने के लिए प्रदर्शन किया गया घाव। पकवान दो अलग-अलग कक्षों, जो 500 माइक्रोन (चित्रा 4 ए) के अंतराल से अलग हो रहे हैं बनाने के लिए एक संस्कृति डालने के साथ सुसज्जित है। विभिन्न शारीरिक वातावरण अनुकरण करने के लिए, कोशिकाओं epidermal वृद्धि कारक (EGF) से प्रेरित या Mitomycin ग के साथ हिचकते इलाज के बिना जांच की गई तो,। डी एच सेटअप घाव भरने के समय के साथ प्रक्रिया, प्रयोग के शुरू (चित्रा 4 बी) के बाद प्रतिनिधि मात्रात्मक डी एच चरण विपरीत छवियों (256 ग्रे स्तर के लिए कोडित) द्वारा यहां दर्शाया 0, 22.5 और 45 घंटे के बाद की सतत निगरानी की अनुमति देता है। चित्रा 5 में झूठी कलर-कोडेड छद्म 3 डी भूखंडों इसी तीन di में सेल परत की मोटाई के स्थानिक विकास का वर्णनmensions। ऑप्टिकल पथ लंबाई देरी, सेलुलर अपवर्तनांक के आधार पर और 2 और 3 समीकरणों, डी एच ऐसे सेल कवर सतह क्षेत्र, औसत सेल मोटाई और सेलुलर शुष्क जन के रूप में (सेलुलर विशेषताओं के अस्थायी निगरानी द्वारा प्रवास, प्रसार और आकृति विज्ञान के एक साथ गतिशील मूल्यांकन की अनुमति देता चित्रा 4 सी)। सारांश में, चित्रा 4 में डेटा है कि घाव क्षेत्र में कोशिकाओं के एक तेजी से पलायन, एक वृद्धि की औसत सेल मोटाई में और देखने के क्षेत्र में एक उच्च सूखी मास में EGF सिमुलेशन परिणाम कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए की तुलना में वर्णन। इसके विपरीत, Mitomycin ग हिचकते कोशिकाओं को कवर एक थोड़ा नियंत्रण कक्षों से सतह क्षेत्र प्रयोग के दौरान कमी आई है और यह भी एक से थोड़ा कम शुष्क जन वृद्धि दिखा। हालांकि, औसत सेल मोटाई स्पष्ट रूप से दोनों की तुलना में कमी आई है, प्रेरित और नियंत्रण कक्षों प्रकट होता है।


चित्रा 1। डिजिटल होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी (डी एच एम)। डी एच कार्य केंद्र (ए) के योजनाबद्ध स्थापना के लिए बंद अक्ष सेटअप का उपयोग किया। माइक्रोस्कोप सेटअप (मॉनिटर, लाइव छवि और नियंत्रण सॉफ्टवेयर (1) चित्रण फोटोग्राफ इसी बंद अक्ष सेटअप डिजिटल माइक्रोस्कोप (2), (बी), माइक्रोस्कोप (हरी बिंदीदार रेखा) और एक नमूने के ऑप्टिकल पथ (लाल ने संकेत तीर, (सी))। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2। डी एच द्वारा Murine DSS प्रेरित कोलाइटिस का आकलन। कोलाइटिस बेशक मेरे दैनिक द्वारा पीछा किया गया थारिश्तेदार शरीर के वजन और दोहराया इंडोस्कोपिक अनुवर्ती परीक्षा के asurement। एक बड़े पैमाने पर DSS प्रशासन (19 से अनुकूलित) (ए) के शुरू होने के बाद 4 दिन से रिश्तेदार शरीर के वजन के नुकसान फोकल छालों और श्लैष्मिक असुरक्षा (बी) सहित स्थापित कोलाइटिस के इंडोस्कोपिक के संकेत के साथ गया था। पारंपरिक महामहिम से सना हुआ cryostatic वर्गों के विश्लेषण सबम्यूकोसल सूजन, पेशीय और म्यूकोसा में एक स्पष्ट श्लैष्मिक सूजन घुसपैठ का उमड़ना का पता चला। मात्रात्मक डी एच चरण विपरीत छवियों और संबंधित अपवर्तनांक नक्शे 1 समीकरण के द्वारा प्राप्त इसी (256 ग्रे स्तर के लिए कोडित) भड़काऊ प्रक्रिया के दौरान submucosa के edematous परिवर्तन की पुष्टि की (सी) (सफेद तीर उपकला, ग्रे और काले submucosa स्ट्रोमा इंगित करता है)। शरीर के वजन के रिश्तेदार हानि (एक नैदानिक ​​पैरामीटर) काफी अपवर्तनांक (एक पूर्ण शारीरिक पैरामीटर, आर 2 रैखिक = 0.6 के साथ सहसंबद्ध4; (डी), 19 से अनुकूलित) है, जो काफी उपकला में के रूप में अच्छी तरह से submucosa और स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में colitic चूहों के स्ट्रोमा में कम हो गया था (SEM ± मतलब है, *** पी <0.001;। ई) पर क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्र तीन
चित्रा 3. डी एच द्वारा मनुष्य में Crohn रोग का आकलन। Endoscopically और histologically की पुष्टि की है Crohn रोग के साथ रोगियों से Colonic ऊतकों के नमूनों की जांच की गई (ए)। HE-धुंधला श्लैष्मिक तहखाने की लंबी और भड़काऊ कोशिकाओं की एक चिह्नित घुसपैठ का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, सबम्यूकोसल शोफ और पेशीय Propria की वृद्धि का पता चला था। CORR का विश्लेषणमात्रात्मक डी एच चरण विपरीत छवियों और संबंधित अपवर्तनांक नक्शे समीकरण द्वारा लिया गया esponding (1) (256 ग्रे स्तर के लिए कोडित) भी उपकला (बी) में edematous परिवर्तन (यहाँ एक सफेद और काले सितारा द्वारा इंगित) का पता चला। औसत अपवर्तनांक में महत्वपूर्ण मतभेद सक्रिय भड़क (स्पष्ट सलाखों) या छूट (काली सलाखों) के साथ सीडी रोगियों से नमूनों में पाया गया। (मतलब ± SEM, *** पी <0.001, ग) इन मतभेदों प्रत्येक ऊतक प्रकार में देखा जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. सफेद प्रकाश माइक्रोस्कोपी और डी एच द्वारा उपकला घाव भरने की निगरानी करना। संवर्धित कोशिकाओं Tran थेविशेष सम्मिलित करता है (लाल तीर) के साथ पेट्री डिश में sferred। इससे पहले कि संस्कृति सम्मिलित हटा दिया गया है, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए या तो EGF या Mitomycin ग के साथ इलाज, या अकेले मध्यम (unstimulated नियंत्रण) (ए) के साथ इलाज किया गया। संस्कृति आवेषण को हटाने के बाद, घाव भरने लगातार चरण विपरीत इमेजिंग द्वारा डी एच द्वारा समय पर नजर रखी थी। सेल की रूपरेखा स्पष्ट रूप से मान्यता प्राप्त किया जा सकता है। प्रतिनिधि मात्रात्मक डी एच चरण विपरीत छवियों प्रयोग की शुरुआत में दिखाए जाते हैं, 22.5 घंटे के बाद और माप के अंत में 45 घंटा (बी) के बाद कम से। पैनल (सी) के लिए इसी लौकिक सेल कवर सतह (सी) में परिवर्तन, औसत सेल मोटाई (डी सेल) और सेलुलर शुष्क जन (डीएम) से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 5। झूठी रंग कोडित छद्म 3 डी मात्रात्मक डी एच चरण विपरीत छवियों के भूखंडों द्वारा सेल परत आकृति विज्ञान परिवर्तन का चित्रण। प्रतिनिधि झूठी कलर-कोडेड मात्रात्मक डी एच चरण विपरीत = 0 टी में चित्रा 4 बी में छवियों के छद्म 3 डी भूखंडों, 22.5 घंटे के बाद और 45 घंटे के बाद माप के अंत में, नियंत्रण के लिए सेल परतों की मोटाई के स्थानिक विकास का वर्णन, Mitomycin सी-हिचकते हैं और 3 डी में EGF उत्तेजित कोशिकाओं। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम जानते हैं कि डी एच murine कोलाइटिस मॉडल में ऊतकीय नुकसान और मानव colonic ऊतकों के नमूनों पूर्व vivo का सही आकलन प्रदान करता है प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, हम पता चला डी एच लगातार whilst एक साथ सेलुलर परिवर्तन के बारे में जानकारी प्रदान करने के बहुविध उपकला घाव भरने की निगरानी कर सकते हैं। डी एच में, डिजिटल कब्जा कर लिया होलोग्राम के पुनर्निर्माण संख्यानुसार 32 किया जाता है। इसलिए, उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी, Zernike चरण विपरीत और अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी की तुलना में, डी एच वैकल्पिक बाद संख्यात्मक फोकस सुधार (बहु-ध्यान इमेजिंग) के साथ मात्रात्मक चरण विपरीत 27 प्रदान करता है। मात्रात्मक चरण इमेजिंग ऑप्टिकल पथ लंबाई परिवर्तन के निर्धारण पर आधारित है और इस प्रकार माप उपकरण उपयोग किया की अत्यधिक स्वतंत्र है। यह माप डेटा है कि विभिन्न उपकरणों के साथ अर्जित कर रहे हैं की तुलना सरल करता है। इसके अलावा, डी एच obje के लिए ही कम प्रकाश की तीव्रता की आवश्यकता हैसीटी रोशनी। इस बेदाग विच्छेदित ऊतकों की एक न्यूनतम इनवेसिव विश्लेषण सक्षम बनाता है और नमूना बातचीत जीवित कोशिकाओं की लंबी अवधि के समय चूक टिप्पणियों के दौरान आवश्यक की राशि को कम करता है।

आईबीडी के लिए चिकित्सीय साधन काफी पिछले दो दशकों से अधिक चौड़ी है। विरोधी TNF-α चिकित्सा, जो दोनों यूसी और सीडी में प्रभावी रहे हैं और स्वीकार्य पक्ष प्रभाव प्रोफाइल, उपन्यास और लक्षित कर इंटेग्रिन हाल ही में नैदानिक ​​अभ्यास 34-37 में पेश किए गए विशिष्ट एंटीबॉडी है की शुरूआत के अलावा। कई अन्य होनहार एजेंटों वर्तमान में आईबीडी 38-40 में उनकी चिकित्सीय प्रभावकारिता के लिए मूल्यांकन किया जा रहा है। हालांकि, मनुष्यों में नैदानिक ​​इस्तेमाल करने से पहले, प्रभावकारिता और इन संभावित उपचारों की सुरक्षा जानवरों के अध्ययन में साबित हो गया है। DSS प्रेरित कोलाइटिस सबसे अक्सर इस्तेमाल किया murine कोलाइटिस मॉडलों में से एक है, इसकी उच्च reproducibility और कम लागत 23 की वजह से है। साथ ही, इस मॉडल कर सकते हैं अलइसलिए आनुवंशिक रूप से परिवर्तित चूहों के लिए लागू किया 41 उपभेदों। जबकि प्रणालीगत मार्कर, जैसे, सीआरपी, पशु मॉडल में अत्यधिक चर रहे हैं, पेट के histological आकलन सबसे अधिक मान्य दृष्टिकोण रोग की गंभीरता का आकलन करने के 42,43 प्रतिनिधित्व करता है। फिर भी, स्कोरिंग प्रणाली के अनुसार ऊतकीय सूजन के मात्रात्मक मूल्यांकन अन्वेषक विशेषज्ञता और अनुभव पर निर्भर है। स्वचालित आकलन और डी एच के साथ संभव के रूप में उद्देश्य मापदंडों द्वारा स्कोरिंग इन सीमाओं पर काबू, और इसके अलावा, यह भी समय की बचत है 19 धुंधला करने के लिए जरूरत से बचने। इसके अलावा, डी एच शल्य colonic नमूनों के साथ ही म्यूकोसा नमूने एंडोस्कोपी के दौरान प्राप्त की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

उपकला उत्थान और घाव भरने जठरांत्र छालों या anastomotic रिसाव सहित कई रोग की प्रक्रिया के दौरान एक निर्णायक तंत्र है। जबकि वहाँ दृष्टिकोण का वादा कर रहे वी में उपकला घाव भरने का आकलन करने केइवो ​​44, इन तकनीकों परिष्कृत परीक्षा उपकरणों की आवश्यकता होती है और वर्तमान में व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। इसलिए, वर्तमान में उपकला चिकित्सा आमतौर पर खरोंच संसाधनों द्वारा इन विट्रो 9 में जांच की है। ये assays घाव बंद का वैध परीक्षा की अनुमति है, लेकिन आम तौर पर पहले सेल धुंधला है, जो तब मूल्यांकन 10,45 दोहराया रोकता आवश्यकता होती है। इसके अलावा, कोई सेलुलर परिवर्तन डेटा इस प्रयोगात्मक स्थापना के साथ समानांतर में प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, इस जानकारी को महत्वपूर्ण महत्व का हो सकता है, क्योंकि यह apoptosis और नेक्रोसिस 46 के बीच अंतर करने के लिए और सेल प्रसार और प्रवास 46 का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, संभावना सेल मोटाई, शुष्क जन या ऊतक के घनत्व का निर्धारण करने के डी एच परीक्षा से घाव बंद की निगरानी करने के लिए एक साथ श्लैष्मिक अनुसंधान के क्षेत्र में उच्च मूल्य का है।

मानव आईबीडी मरीजों के लिए इलाज के लक्ष्यों को लगातार पिछले दशकों में बदल गया है <sup> 47। हालांकि शुरू में सूजन के नियंत्रण प्राथमिक महत्व, बाद में स्टेरॉयड-मुक्त छूट का हो सकता है और अब चिकित्सा mucosal को माना गया था उपचार 48 का प्राथमिक लक्ष्य कर रहे हैं। हाल ही में, यह धारणा थी ऊतकीय छूट भी अकेले 49 चिकित्सा mucosal करने के लिए बेहतर हो सकता है। हालांकि, जबकि वहाँ कुछ ऊतकीय स्कोरिंग मानव आईबीडी के लिए उपलब्ध प्रणालियों रहे हैं, अंतर-पर्यवेक्षक परिवर्तनशीलता उच्च 50 बनी हुई है। इसलिए, वहाँ ऊतकीय colonic नमूने के मूल्यांकन के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण के लिए एक की जरूरत है। डी एच इस लक्ष्य के लिए योगदान कर सकते हैं और आगे मानव आईबीडी मरीजों के साथ एक संभावित चिकित्सीय परीक्षण में मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रक्रिया में, नमूने प्रबुद्ध और अत्यधिक सुसंगत लेजर प्रकाश का उपयोग imaged हैं। इसलिए, डी एच में संकल्प मुख्य रूप से नमूना रोशनी के misalignment की वजह से प्रकाश बिखरने और विवर्तन प्रभाव से सीमित है, मोटी नमूने, धूल याऐसे ऑप्टिकल पथ में सघन पानी के रूप में अन्य अशुद्धियों। आदेश में मात्रात्मक डी एच चरण विपरीत छवियों, सावधान तैयारी और डी एच सेटअप के संरेखण और नमूना से बहुत सटीक माप डेटा प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। अच्छी तरह से ऑप्टिकल इमेजिंग तत्वों, विशेष रूप से माइक्रोस्कोप कंडेनसर और माइक्रोस्कोप उद्देश्य, शोर को कम करने के लिए आवश्यक हैं साफ कर दिया। इसके अलावा नमूना वाहक स्लाइड, पेट्री डिश ढक्कन और नीचे, के रूप में अच्छी तरह के रूप में उपयोग सेल संस्कृति के माध्यम से कण दोष से मुक्त होना चाहिए। यह ध्यान से सभी घटकों और लागू तरल पदार्थ की पर्याप्त छानने सफाई से हासिल की है।

डिजिटल होलोग्राम और / या विच्छेदित ऊतकों की मात्रात्मक डी एच चरण छवियों शोर कर रहे हैं, तो कांच के वाहक और पर्ची कवर धूल के साथ दूषित हो सकता है: अधिक विस्तृत मुसीबत शूटिंग टिप्स इस प्रकार हैं। यदि हां, तो कांच के वाहक और शराब (जैसे, शुद्ध इथेनॉल) के साथ कवर पर्ची साफ। मोटी हैंविच्छेदित ऊतकों की सत्ता बहुत बड़ी (> 10 माइक्रोन) प्रकाश बिखरने में है और इस तरह के परिणाम, पतली ऊतक वर्गों उपयोग करने की कोशिश है। घटना है कि लेजर प्रकाश के साथ रोशनी समान रूप से वितरित नहीं है, माइक्रोस्कोप कंडेनसर के माध्यम से वस्तु रोशनी संरेखित। कांच के ढक्कन के नीचे पर सघन पानी के प्रभाव बिखरने लाती हैं, हीटिंग चैम्बर और कमरे में नमी का तापमान की जाँच करें। मामले में सेल घनत्व एक से अधिक परत में बहुत अधिक या सेल के विकास है, घाव भरने assays की तैयारी के दौरान सेल घनत्व को कम। अंत में, के रूप में डी एच इंटरफेरोमेट्री के सिद्धांत पर आधारित है, विधि कंपन या अन्य यांत्रिक गड़बड़ी है, जो अलग-अलग प्रयोगशाला वातावरण के अनुसार भिन्न करने के लिए संवेदनशील है। हालांकि, इस तरह के प्रभावों आमतौर पर प्रयोगात्मक सेटअप की तैयारी के दौरान होलोग्रफ़ी रिकॉर्डिंग के लिए पर्याप्त रूप से चुना जोखिम बार (आमतौर पर मिलीसेकंड रेंज में या नीचे) के द्वारा कम किया जा सकता है।

संक्षेप में, हमारे परिणाम है कि डी एच उज्ज्वल क्षेत्र और ऐसे Zernike चरण विपरीत और डीआईसी के रूप में मौजूदा चरण विपरीत इमेजिंग तकनीक माइक्रोस्कोपी से अधिक प्रमुख फायदे रखती प्रदर्शित मात्रात्मक लगभग एक स्वचालित फैशन में ऊतकीय सूजन पूर्व vivo का आकलन करने की क्षमता के कारण। इसके अलावा डी एच के नमूनों के साथ कम से कम बातचीत के साथ इन विट्रो में उपकला घाव भरने का लेबल मुक्त सतत मूल्यांकन बहुविध अनुमति देता है। इस आईबीडी के साथ मरीजों पर डी एच के translational क्षमता का पता लगाने के लिए '' डिजिटल विकृति '' और आगे बढ़ाया के अध्ययन के मामले में स्वचालित ऊतकीय परीक्षा के लिए मार्ग प्रशस्त। इसके अलावा, डी एच में इन विट्रो के अवसरों मात्रात्मक अध्ययन करने के लिए सेल प्रवास, आकृति विज्ञान और प्रसार उपन्यास प्रदान करता है।

नैदानिक ​​अभ्यास में डी एच के अनुवाद आईबीडी निदान में सुधार करने की क्षमता है। डी एच के माध्यम से आंतों में सूजन के विभिन्न डिग्री की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है के रूप मेंघनत्व में परिवर्तन, एक "डिजिटल विकृति 'के अर्थ में इस बीमारी का एक उद्देश्य और अधिक सटीक आकलन की तरह शारीरिक मापदंडों संभव लगता है। उद्देश्य मूल्यांकन आईबीडी रोगियों के नैदानिक ​​प्रबंधन पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Azoxymethane (AOM) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany A5486
Cell Culture Flask Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 658170
Costar Stripette Corning Inc., New York, USA 4488
Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
DMEM/Ham's F12 PAA Laboratories - Pasching - Austria E15-813
EGF Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany SPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
Falcon Tube 50 ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070
Isopentane (2-Methylbutane) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M32631-1L
Methylene blue Merck, Darmstadt, Germany 1159430025
Mitomycin C Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M4287
Microscope Slides G. Menzel, Braunschweig, Germany J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583
Pen/Strep/Amphotericin B Lonza, Verviers, Belgium 1558
Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
RPMI 1640 Lonza, Verviers, Belgium 3626
Sodium Chloride 0.9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
Trypsin EDTA Lonza, Verviers, Belgium 7815
Vitro – Clud R. Langenbrinck, Teningen, Germany 04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high ibidi GmbH, Munich, Germany 81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert ibidi GmbH, Munich, Germany 80050
Equipment
MICROM HM550 Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA 46320
Digital holographic microscope
Component Model Company
Inverted Microscope iMIC Till Photonics, Graefelfing, Germany
Laser Compass 315M Coherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lens Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 Zeiss, Goettingen, Germany
CCD camera DMK 41BF02 The Imaging Source, Bremen, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369, (9573), 1641-1657 (2007).
  2. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114, (3), 385-391 (1998).
  3. Florholmen, J. Mucosal healing in the era of biologic agents in treatment of inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 50, (1), 43-52 (2015).
  4. Merga, Y., Campbell, B. J., Rhodes, J. M. Mucosal barrier, bacteria and inflammatory bowel disease: possibilities for therapy. Dig Dis. 32, (4), 475-483 (2014).
  5. Young, V. B., Kahn, S. A., Schmidt, T. M., Chang, E. B. Studying the Enteric Microbiome in Inflammatory Bowel Diseases: Getting through the Growing Pains and Moving Forward. Front Microbiol. 2, 144 (2011).
  6. Atreya, R., Neurath, M. F. IBD pathogenesis in 2014: Molecular pathways controlling barrier function in IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12, (2), 67-68 (2015).
  7. Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Front Biosci. 4, 303-309 (1999).
  8. Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, (2), 369-372 (1973).
  9. Singh, A., Nascimento, J. M., Kowar, S., Busch, H., Boerries, M. Boolean approach to signalling pathway modelling in HGF-induced keratinocyte migration. Bioinformatics. 28, (18), 495-501 (2012).
  10. Sakalar, C., et al. Pronounced transcriptional regulation of apoptotic and TNF-NF-kappa-B signaling genes during the course of thymoquinone mediated apoptosis in HeLa cells. Mol Cell Biochem. 383, (1-2), 243-251 (2013).
  11. Serada, S., et al. Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity biomarker in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 18, (11), 2169-2179 (2012).
  12. Turovskaya, O., et al. RAGE, carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis. Carcinogenesis. 29, (10), 2035-2043 (2008).
  13. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
  14. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors (Basel). 13, (4), 4170-4191 (2013).
  15. Bettenworth, D., et al. Quantitative stain-free and continuous multimodal monitoring of wound healing in vitro with digital holographic microscopy. PLoS One. 9, (9), 107317 (2014).
  16. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Sci Rep. 5, 9976 (2015).
  17. Wang, Z., Tangella, K., Balla, A., Popescu, G. Tissue refractive index as marker of disease. J Biomed Opt. 16, (11), 116017 (2011).
  18. Majeed, H., et al. Breast cancer diagnosis using spatial light interference microscopy. J Biomed Opt. 20, (11), 111210 (2015).
  19. Lenz, P., et al. Digital holographic microscopy quantifies the degree of inflammation in experimental colitis. Integr Biol (Camb). 5, (3), 624-630 (2013).
  20. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295, (2), 538-544 (2008).
  21. Klokkers, J., et al. Atrial natriuretic peptide and nitric oxide signaling antagonizes vasopressin-mediated water permeability in inner medullary collecting duct cells. Am J Physiol Renal Physiol. 297, (3), 693-703 (2009).
  22. Jourdain, P., et al. Determination of transmembrane water fluxes in neurons elicited by glutamate ionotropic receptors and by the cotransporters KCC2 and NKCC1: a digital holographic microscopy study. J Neurosci. 31, (33), 11846-11854 (2011).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2, (3), 541-546 (2007).
  24. Bettenworth, D., et al. The tripeptide KdPT protects from intestinal inflammation and maintains intestinal barrier function. Am J Pathol. 179, (3), 1230-1242 (2011).
  25. Kemper, B., et al. Modular digital holographic microscopy system for marker free quantitative phase contrast imaging of living cells. Proc. SPIE. 6191, (2006).
  26. Kemper, B., von Bally, G. Digital holographic microscopy for live cell applications and technical inspection. Appl Opt. 47, (4), 52-61 (2008).
  27. Langehanenberg, P., von Bally, G., Kemper, B. Autofocusing in digital holographic microscopy. 3D Research. 2, (1), 1-11 (2011).
  28. Daimon, M., Masumura, A. Measurement of the refractive index of distilled water from the near-infrared region to the ultraviolet region. Applied optics. 46, (18), 3811-3820 (2007).
  29. Przibilla, S., et al. Sensing dynamic cytoplasm refractive index changes of adherent cells with quantitative phase microscopy using incorporated microspheres as optical probes. J Biomed Opt. 17, (9), 0970011-0970019 (2012).
  30. Kemper, B., et al. Integral refractive index determination of living suspension cells by multifocus digital holographic phase contrast microscopy. J Biomed Opt. 12, (5), 054009 (2007).
  31. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (10), 100 (2006).
  32. Marquet, P., et al. Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy. Opt Lett. 30, (5), 468-470 (2005).
  33. Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl Opt. 47, (19), 176-182 (2008).
  34. Hanauer, S. B., et al. Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet. 359, (9317), 1541-1549 (2002).
  35. Colombel, J. F., et al. Adalimumab for maintenance of clinical response and remission in patients with Crohn's disease: the CHARM trial. Gastroenterology. 132, (1), 52-65 (2007).
  36. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. N Engl J Med. 369, (8), 699-710 (2013).
  37. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369, (8), 711-721 (2013).
  38. Monteleone, G., et al. Mongersen, an oral SMAD7 antisense oligonucleotide, and Crohn's disease. N Engl J Med. 372, (12), 1104-1113 (2015).
  39. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384, (9940), 309-318 (2014).
  40. Sandborn, W. J., et al. Ustekinumab induction and maintenance therapy in refractory Crohn's disease. N Engl J Med. 367, (16), 1519-1528 (2012).
  41. Natividad, J. M., et al. Commensal and probiotic bacteria influence intestinal barrier function and susceptibility to colitis in Nod1-/-; Nod2-/- mice. Inflamm Bowel Dis. 18, (8), 1434-1446 (2012).
  42. Melgar, S., et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 8, (6), 836-844 (2008).
  43. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. Int J Clin Exp Pathol. 7, (8), 4557-4576 (2014).
  44. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
  45. Zhao, K., Wang, W., Guan, C., Cai, J., Wang, P. Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells. Mol Biol Rep. 39, (3), 2607-2613 (2012).
  46. Pavillon, N., et al. Early cell death detection with digital holographic microscopy. PLoS One. 7, (1), 30912 (2012).
  47. Hindryckx, P., et al. Clinical trials in ulcerative colitis: a historical perspective. J Crohns Colitis. 9, (7), 580-588 (2015).
  48. Neurath, M. F., Travis, S. P. Mucosal healing in inflammatory bowel diseases: a systematic review. Gut. 61, (11), 1619-1635 (2012).
  49. Bryant, R. V., Winer, S., Travis, S. P., Riddell, R. H. Systematic review: histological remission in inflammatory bowel disease. Is 'complete' remission the new treatment paradigm? An IOIBD initiative. J Crohns Colitis. 8, (12), 1582-1597 (2014).
  50. Marchal Bressenot, A., et al. Review article: the histological assessment of disease activity in ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 42, (8), 957-967 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics