Imagerie Multimodal quantitative phase avec Digital Holographic Microscopy Évalue avec précision guérison inflammation intestinale et épithéliales des plaies

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Lenz, P., Brückner, M., Ketelhut, S., Heidemann, J., Kemper, B., Bettenworth, D. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54460, doi:10.3791/54460 (2016).

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Abstract

L'incidence de la maladie inflammatoire de l' intestin, à savoir, la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, a considérablement augmenté au cours de la dernière décennie. L'étiologie des MICI reste inconnue et les stratégies thérapeutiques actuelles sont basées sur la suppression non spécifique du système immunitaire. Le développement de traitements qui ciblent spécifiquement l'inflammation intestinale et la guérison des plaies épithéliales pourrait améliorer considérablement la gestion des MII, mais cela nécessite une détection précise des changements inflammatoires. À l' heure actuelle, les candidats potentiels de médicaments sont généralement évaluées en utilisant des modèles animaux in vivo ou par des techniques à base de culture cellulaire in vitro. L'examen histologique nécessite habituellement les cellules ou les tissus d'intérêt à être colorés, qui peuvent modifier les caractéristiques de l'échantillon et, en outre, l'interprétation des résultats peut varier selon l'expertise des enquêteurs. La microscopie holographique numérique (DHM), basée sur la détection de la longueur de chemin optique de retard, permetsans tache contraste d'imagerie de phase quantitative. Cela permet aux résultats d'être directement corrélées avec les paramètres biophysiques absolus. Nous montrons comment la mesure des variations de densité des tissus avec DHM, basée sur la mesure de l'indice de réfraction permet de quantifier les altérations inflammatoires, sans taches, dans les différentes couches de spécimens de tissus du côlon des souris et des humains souffrant de colite. En outre, nous démontrons une surveillance sans étiquette multimodale en continu de la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro, en utilisant la DHM possible grâce à la détermination automatisée simple , de la zone blessée et la détermination simultanée des paramètres morphologiques tels que la masse sèche et une épaisseur de couche de cellules migrantes. En conclusion, DHM représente un précieux outil original et quantitative pour l'évaluation de l' inflammation intestinale avec des valeurs absolues pour les paramètres possibles, la quantification simplifiée de la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro et a un fort potentiel de u diagnostic translationnelle doncproprement parler.

Introduction

Les maladies inflammatoires de l' intestin (MICI), à savoir la rectocolite hémorragique (RCH) et la maladie de Crohn (MC) sont des troubles inflammatoires idiopathiques du tractus gastro - 1. La recherche sur la physiopathologie des MICI et l'évaluation des nouveaux médicaments potentiels ou approches diagnostiques nouveaux est particulièrement important. Dans la recherche fondamentale et la prise en charge clinique des patients atteints de MII, la muqueuse intestinale est devenu un centre d'attention 2,3. La muqueuse représente une limite anatomique, au cours de laquelle l'interaction entre les bactéries commensales, les cellules épithéliales et les différents composants cellulaires du système immunitaire intestinal orchestrer homéostasie intestinale 4,5. Cependant, chez les patients atteints de MII, l' inflammation intestinale non contrôlée et persistante conduit à la muqueuse des dommages, détectable comme ulcérations ou une sténose, qui peut finalement aboutir à répartition de la fonction de barrière épithéliale, qui s'aggrave l' inflammation locale 6.

7. La cicatrisation epitheliale peut être simulé in vitro dans la plaie et la guérison des tests dans des modèles murins d'inflammation intestinale 8,9. Fois in vitro et in vivo des approches présentent des inconvénients qui limitent la précision de l' évaluation expérimentale. Essais in vitro, comme des dosages classiques de grattage, exiger des procédures de coloration prolongées ou transfection avec des chromophores fluorescents. Ils sont souvent limités par leur surveillance discontinue de la prolifération cellulaire et la migration qui ne peuvent pas être automatisés 10. Modèles in vivo, tels que le sulfate de dextran de sodium (DSS) de la colite induite, manquent souvent robustes lecture-outs, en partie en raison de la variation importante vu des marqueurs de laboratoire, maroi de tels marqueurs inappropriés pour évaluer la colite gravité 11,12. L' analyse histologique de la muqueuse enflammée est encore actuellement l'approche la plus valable pour déterminer la colite gravité mais, comme la plaie de guérison des essais épithéliales in vitro, nécessite une coloration et dépend de l'expertise de l' enquêteur 13.

La microscopie holographique récemment numérique (DHM), une variante de microscopie de phase quantitative 14, a été identifié comme un outil utile pour l'évaluation de l' épithélium la cicatrisation in vitro et in vivo 15. DHM permet d' évaluer la densité du tissu en mesurant la longueur de trajet optique à retard (OPD) , qui diagnostic perspectives roman cancer 16-18 et la quantification de l' inflammation liée tissus altérations 19. En outre, la DHM permet la surveillance de la dynamique de la morphologie des cellules en déterminant l'épaisseur de la cellule, la cellule recouverte de surface et intracellulaires (protéine) la quantité de contenu in vitro, DHM permet également l'analyse de processus physiologiques, par exemple, cellulaire perméabilité à l'eau en évaluant les variations de volume cellulaire et d' épaisseur 21,22. En outre, les mesures DHM peuvent être automatisées qui empêche le biais de l'échantillon chercheur associé.

Ici, nous démontrons l'utilisation de DHM dans un modèle murin de l' inflammation intestinale, et appliquons également DHM à l' analyse d'échantillons de tissus humains pour le suivi quantitatif de la cicatrisation des plaies comme un test sans marqueur in vitro. Tout d'abord, nous évaluons les altérations inflammatoires de différentes couches murales colique chez la souris colitique et des coupes de tissus provenant d'êtres humains atteints de MICI. Après avoir décrit la DHM phase quantitative procédure d'imagerie, nous fournissons des instructions détaillées pour l'utilisation des composants de microscope, la préparation des coupes de tissus et aussi décrire l'évaluation des images de phase quantitatives acquises.

Ensuite, nous montrons que DHM peut être utilisée pour la surveillance multimodale continue de la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro, et décrire l'analyse des caractéristiques cellulaires telles que l' épaisseur de la couche de cellules, la masse sèche et le volume cellulaire donner un aperçu de la drogue induit et cellulaires altérations physiologiques.

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Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le comité régional d'éthique (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Allemagne) selon la loi sur la protection des animaux allemande. Le comité d'éthique local de l'Université de Münster a approuvé l'utilisation de tissus humains pour l'analyse histologique et microscope.

1. Les animaux et les matériaux

  1. Utilisez une femme ou des souris mâles de la souche DSS-sensibles nécessaires qui pèsent 20 à 25 g, et la maison conformément à la législation de protection des animaux. Fournir chow spéciale pour les rongeurs et autoclaves boire de l' eau ad libitum.
  2. Provoquer DSS colite aiguë par administration 3% p / v de sulfate de dextran sodium (DSS, poids moléculaire: 36,000-50,000 Da) dans l' eau du robinet autoclavée pendant 5 jours.
    NOTE: La puissance du DSS est très variable selon le fabricant et le lot. Testez votre DSS fournisseur fourni d'abord pour l'induction de l'activité de la maladie, pour laquelle dapoids corporel ily est un indicateur fiable et objective.
  3. Pour une évaluation histologique des échantillons de tissus du côlon, l' euthanasie des souris par le CO 2 insufflation (ou comme spécifié par les directives nationales et institutionnelles) à la fin de l'expérience.

2. Installation expérimentale pour DSS-colite et In-vitro Wound Healing Assays

  1. La culture cellulaire et la mise en place d'essai de cicatrisation.
    1. Cultivez cellules Caco-2 dans une humidité de 95% et 5% de CO 2 environnement à 37 ° C. En utilisant du milieu RPMI avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine.
    2. Seed cellules Caco-2 à une densité de 4 x 10 5 cellules / cm 2 sur 35 mm des boîtes de Pétri avec la haute culture-insert (voir la figure 4A).
      NOTE: L'insert génère deux zones recouvertes de cellules qui sont séparées par un espace libre de cellule définie représentant la zone blessée à analyser.
    3. Changer le milieu deux jours après seeding. Effectuer par le premier moyen d'aspiration résiduel avec des débris cellulaires à l'aide d'une pipette automatique, rincer avec 100 pi de tampon phosphate salin (PBS) et on ajoute du milieu RPMI frais ou du milieu de privation de sérum.
    4. cellules de culture pour 24 heures dans un milieu de sérum privé (0,1% de FBS) additionné de 20 ng EGF / ml de sérum ou 2 pg mitomycine c / ml de sérum pour détecter des altérations du comportement de cicatrisation des plaies. Ajouter un milieu RPMI normal de contrôler les cellules pendant 24 heures.
    5. Après 24 heures de culture, enlever et jeter des inserts de culture comme décrit dans l'étape 3.4 et effectuer DHM.
  2. Induction de colite aiguë DSS
    1. Dissoudre 3 g de DSS dans 100 ml d'eau autoclavés pour obtenir un 3% (p / v) solution DSS. Fournir cette solution en place de l' eau potable à des souris ad libitum pendant 7 jours. Calculer 5 ml de DSS-solution par souris / jour. Fournir de l' eau autoclavée sans DSS pour les souris de contrôle ad libitum.
  3. Préparation des sections cryostatiques de côlon humain et murin
    1. Euthanasier souris par CO 2 insufflation à la fin de l'expérience.
    2. Disséquer l'abdomen de l'animal par laparotomie 23. Retirez tout le côlon soigneusement à l'aide des pinces et couper l'extrémité de l'iléon et du rectum à l'aide des ciseaux chirurgicaux. Couper le côlon avec une paire de ciseaux longitudinalement du caecum à la fin du rectum et ouvrir le côlon. Retirez toutes les matières fécales de l'échantillon à l' aide de pinces , suivi par un lavage avec du PBS 24.
    3. Préparer roulés en enroulant l'ensemble du côlon avec un coton-tige longitudinalement à partir du caecum à la fin du rectum avec la muqueuse incurvée vers l'intérieur. Incluez échantillons colique de la température de coupe optimale (OCT) composé et maintenir congelé à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
    4. Incluez tissu du côlon humain de prélèvement chirurgical en coupe optimale température octobre composé et maintenir congelé à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
    5. sections coupées de 7 um d'épaisseur des échantillons OCT-composés-embedded avec l'aide d'un cryotomoi juste avant l'examen.
      NOTE: L'épaisseur optimale de l' échantillon dépend de la persistance et les propriétés de diffusion du type de tissu sous investigation. Pour les expériences décrites à l'aide de tissus du côlon, l'épaisseur de la tranche> 10 um cause augmentation significative du bruit en raison de la diffusion de la lumière dans les quantitatifs des images à contraste de phase DHM, alors que les échantillons d'épaisseur <5 um présentent un risque plus élevé de dommages induits par des artefacts du processus de coupe de cryo.
    6. Transfert sections sur une lame de verre porte-objet.

3. L'équipement technique, les logiciels et les procédures d'acquisition et d'évaluation des Hologrammes numériques

  1. microscope holographique numérique pour cellulaire quantitative et l'imagerie des tissus
    1. Utiliser un système de microscopie hors axe de Mach-Zehnder holographique numérique pour l' imagerie des cellules vivantes 25, comme représenté sur la figure 1. Assurez -vous que le microscope est équipé d'un10X lentille de microscope, une platine de microscope avec un support pour les objets en verre glissières de support et des boîtes de Petri d'un diamètre de 35 mm, une chambre de chauffe afin de préserver la température physiologique à 37 ° C et un logiciel d'imagerie de phase quantitative 25.
      NOTE: Par exemple, comme décrit dans Kemper et al 26 et Langehanenberg et al 27...
      REMARQUE: Vous pouvez également utiliser un système similaire qui est capable d'effectuer la microscopie en champ clair et l' imagerie de phase quantitative de cellules vivantes et les lames de tissus disséqués.
    2. Lentille de microscope propre et d'un condenseur avec du papier de nettoyage de lentille et un agent de nettoyage (par exemple, l' éthanol) , comme recommandé par le fabricant du microscope pour enlever la poussière ou d' autres contaminations.
    3. Démarrez le logiciel d'acquisition d'image du microscope DHM, sélectionnez le mode d'imagerie "en champ clair" et le commutateur "sur" l'illumination de la lumière blanche. Assurer Köhler-vignetagetion de l'échantillon, tel que recommandé par le constructeur du microscope en observant l'échantillon dans la fenêtre d'imagerie en temps réel du logiciel d'acquisition d'image (en variante, un logiciel d'acquisition d'image standard peut être utilisé dans cette étape).
      NOTE: L'intensité de l' image doit être répartie de manière homogène dans le champ de vision et la position de l' échantillon ne doit pas se déplacer pendant le recentrage optique avec le lecteur de mise au point du microscope.
    4. Sélectionnez le mode "DHM" d'imagerie, mettez "off" éclairage en lumière blanche et l'interrupteur "sur" la lumière laser. Vérifiez que l'éclairage avec une lumière laser est homogène ( à savoir que l' intensité lumineuse est répartie de façon homogène dans la fenêtre d'imagerie en direct du logiciel d'acquisition d'imagerie du microscope DHM) et observez que le transporteur motif de franges d' interférence hors axe apparaît avec un contraste adéquat dans le les images capturées (hologrammes numériques).
  2. Préparation des sections de cryostat pour l'imagerieavec DHM
    1. Prenez le (section de cryostat sur un porte-objet en verre, épaisseur: 7 pm, comme décrit dans 2.3) échantillon du congélateur. Décongeler l'échantillon pendant environ 5 min à température ambiante et de l'atmosphère normale.
    2. Ajouter de 50 à 100 ul de phosphate de la solution saline tamponnée (PBS) comme milieu d'inclusion sur la section de tissu à l'aide d'une pipette jusqu'à ce qu'elle soit complètement recouverte d'un tampon. Couvrir l'échantillon avec une lamelle de verre propre (épaisseur de verre de 170 um).
      REMARQUE: Un séchage peut induire des changements importants de l'indice de réfraction et des propriétés dispersives de l'échantillon.
    3. Assurez-vous que le fond du support de verre et la lamelle sont nettoyées de la poussière et d'autres contaminants qui peuvent induire une diffusion de la lumière. L'échantillon est prêt pour l'enquête sur le terrain avec la microscopie lumineuse et DHM.
  3. Imagerie en phase quantitative de coupes de tissus avec DHM
    1. Allumez le microscope holographique numérique, choisir la lentille de microscope 10X pour l'imagerie. Démarrez le ilogiciel d'acquisition de mage du microscope DHM et sélectionnez lumineux mode d'imagerie de fichier.
    2. Placer la lame de tissu comme décrit dans 2) dans le support de lame de microscope, avec la lamelle faisant face à l'objectif du microscope.
    3. Switch "sur" le champ éclairage lumineux du microscope DHM. Positionner l'échantillon avec la platine du microscope et faire en sorte que la zone de tissu d'intérêt est visible dans la fenêtre de surveillance en direct. Améliorer la netteté de l'image à l'aide mise au point de route du microscope.
      NOTE: En plus de la zone d'intérêt, une zone de diapositive sans tissus doivent également être présents dans le champ de vision.
    4. Capturer une image lumineuse sur le terrain de l'échantillon fortement concentré en utilisant le logiciel d'acquisition d'image.
    5. Sélectionnez "DHM" mode d'imagerie, mettez "off" l'illumination de la lumière blanche et tourner "sur" l'illumination de lumière laser. Sélectionnez le "temps d'exposition" pour l'enregistrement d'hologramme en dessous de 3 msec, observer que holographic hors-axe des franges d'interférence apparaissent avec un contraste suffisant dans la fenêtre d'imagerie en temps réel du logiciel d'acquisition d'images et de capturer un hologramme numérique.
    6. Répétez les étapes 3.3.3 - 3.3.5 jusqu'à ce qu'un nombre suffisant d'images de champ lumineux et des hologrammes numériques de zones échantillons différents ont été enregistrés. acquisition Hologram est maintenant terminée.
  4. Préparation des essais de cicatrisation de la plaie pour l'imagerie DHM
    1. Allumez la chambre de chauffage de boîte de Pétri du microscope DHM environ 1-3 heures avant le début de l'expérience afin d'assurer des conditions de température stables pendant les mesures DHM.
    2. Préparer établi avec l'équipement nécessaire (boîte de Petri pour le dosage de la cicatrisation est décrite au point 2.3): pipettes, pince à épiler, couvercle en verre pour boîte de Pétri, 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) tamponné milieu de culture cellulaire avec physiologique température (37 ° C) pour la préparation de l'échantillon dans un environnement stérile.
      REMARQUE: 3.
    3. Retirer le couvercle en plastique de la boîte de Petri et éliminer le milieu de culture de cellules avec une pipette. Retirez le cache de la boîte en bas Petri en utilisant des pinces.
    4. Laver l'échantillon 1 - 2 fois avec 1 ml de tampon HEPES milieu de culture cellulaire afin d'éliminer les cellules mortes et les composants cellulaires restants (par exemple, sérum) dans la zone de la plaie. Ajouter 2 ml de tampon HEPES milieu de culture cellulaire et de coiffer la boîte de Pétri avec le couvercle en verre.
    5. Assurez-vous que le couvercle de verre et le plat en bas Petri ont été nettoyées de la poussière et d'autres contaminants. L'échantillon est prêt pour le temps écoulé observation avec DHM.
  5. Surveillance continue multimodale de cicatrisation in vitro avec DHM
    1. Allumez la chambre de chauffage de boîte de Pétri du microscope DHM d'environ 1 - 3 heures avantau début de l'expérience pour assurer des conditions de température stables pendant les mesures DHM.
    2. Switch "sur" le microscope holographique numérique, sélectionner la lentille 10X de microscope pour l'imagerie. Démarrez le logiciel d'acquisition d'image du microscope DHM et sélectionnez le mode d'imagerie "en champ clair". Veiller à ce que la chambre de chauffage pour la boîte de Pétri fonctionne une température physiologique (37 ° C).
    3. Placer la boîte de Pétri avec le dosage de la cicatrisation des plaies, préparée comme décrit dans 4), dans la chambre de chauffage du microscope DHM.
    4. Sélectionnez lumineux mode d'imagerie de champ et de positionner l'échantillon avec la platine du microscope tout en observant dans la fenêtre de surveillance en direct du logiciel d'acquisition d'image du microscope DHM. Notez que la zone souhaitée de l'échantillon apparaît fortement concentré sous un éclairage de lumière blanche.
    5. Capturez des images lumineuses sur le terrain des différentes zones de l'échantillon (zone de la plaie et les zones environnantes avec des cellules confluentes) sous blancune lumière d'éclairage avec le logiciel d'acquisition d'images et le document de l'aspect, la densité cellulaire et l'homogénéité.
    6. Sélectionnez "champ clair" mode de fonctionnement du microscope DHM d'imagerie. Choisissez une zone de la plaie approprié sous la lumière blanche illumination dans la fenêtre de surveillance en temps réel avec le logiciel d'acquisition d'image du microscope DHM. Vérifiez que la surface de la plaie est exempt de cellules mortes et aucun sérum reste, et veiller à ce que les deux parties comprennent une seule couche de cellules homogène, de préférence avec des bordures droites.
    7. Capturez une image de lumière blanche de la zone initiale de la plaie en plein mode d'imagerie de champ avec le logiciel d'acquisition d'image du microscope DHM.
    8. Tourner "off" éclairage en lumière blanche, sélectionnez le mode "DHM" et le commutateur "sur" illumination laser. Sélectionnez un temps d'exposition inférieur à 3 ms pour enregistrement d'hologramme (observer que hors axe holographique franges d'interférence apparaissent avec un contraste adéquat dans la fenêtre d'imagerie en direct du logiciel d'acquisition d'images de til DHM microscope) et de capturer un hologramme numérique.
    9. Capturez un échantillon hologramme en mode DHM avec le logiciel d'acquisition d'image et de reconstruire une image quantitative de phase avec le logiciel de reconstruction du microscope DHM afin de vérifier la qualité d'image.
    10. Sélectionnez un délai approprié (par exemple, le 3 - 5 min) pour l' acquisition d'hologramme time-lapse avec le logiciel d'acquisition d'image du microscope DHM.
    11. Sélectionnez le mode d'acquisition time-lapse du logiciel d'acquisition d'image dans laquelle l'échantillon est seulement éclairé par une lumière laser lors de l'acquisition d'hologramme.
    12. Démarrez le time-lapse DHM observation de l'essai de cicatrisation.
    13. Arrêtez l'acquisition time-lapse après l'heure prévue, sélectionnez lumineux mode d'imagerie de champ et documenter l'aspect final de l'échantillon sous imagerie de lumière blanche.
  6. Reconstruire hologrammes numériques des tissus disséqués et déterminer l'indice de réfraction moyen comme un paramètre pour quantifierdensité tissulaire
    1. Reconstruire des images quantitatives de phase à partir des hologrammes numériques des tissus disséqués avec le logiciel du microscope DHM, par exemple, comme décrit dans Kemper et al. 26 et Langehanenberg et al. , 27.
    2. Déterminer le contraste de phase moyen Δφ dans les couches de tissus différents (épithélium, la sous - muqueuse, stroma) dans les régions choisies de manière appropriée des intérêts (ROI) 19.
    3. Déterminer l'indice de réfraction du milieu d'enrobage à l'aide d'un réfractomètre ou en variante en utilisant une valeur appropriée de la littérature. (valeurs d'indice de réfraction pour les médias typique d'enrobage: n eau = 1,334 28, n du tampon phosphate salin (PBS) = 1,337 29, n milieu de culture cellulaire = 1,337 à 1,339 29,30).
    4. Calculer les indices de réfraction des couches de tissu différentes des valeurs du contraste de phase moyenne 19
      L'équation 1 NOTE: Dans l' équation. 1 λ est la longueur d'onde de la lumière laser (ici: λ = 532 nm), d l'épaisseur des tissus disséqués (ici: 7 pm) et n moyen est l'indice de réfraction du milieu d' enrobage (ici: n moyen = n PBS = 1,337, déterminé par un abbé-réfractomètre).
  7. Reconstruire et évaluer des hologrammes numériques du time-lapse cicatrisation de la plaie observation de la série
    1. Reconstruire images quantitatives de phase à partir de la série temporelle lapse hologramme obtenu lors de l' observation de la cicatrisation des plaies avec le logiciel de microscope DHM 26,27.
    2. Normaliser chaque série d'images quantitatives de phase à l'image avec un contraste de phase maximale.
    3. Déterminer la surface S c qui est couverte par les cellules dans les images quantitatives DHM phase par la segmentation d' image, qui peut être parformé en utilisant la cellule profileur du logiciel libre (www.cellprofiler.org 31).
    4. Calculer le contraste de phase moyenne de la cellule des cellules dans la zone Δφ S c.
    5. Récupérez le cellulaire DM de masse sèche de la cellule Δφ de contraste de phase moyenne dans la zone S c 15
      équation 2 (2)
      NOTE: Dans l' équation 2 DM désigne la masse cellulaire sèche, S c présente la zone qui est occupée par les cellules et α = 0,002 m 2 / kg.
    6. Déterminer l'indice de réfraction n cellulaire cellule intégrale et l'indice de réfraction du milieu de culture cellulaire n moyenne. Déterminer n cellules séparément expérimentalement à partir de cellules en suspension comme décrit dans 30 et mesurer n moyenne avec un réfractomètre. Alternautiliser relativement valeurs de la littérature pour n cellules 30 et n moyenne 29,30.
    7. Calculer la cellule d moyenne épaisseur de la cellule de λ, cellule Δφ, n cellule et n moyenne 26,32
      l'équation 3 (3)
      NOTE: Dans l' équation. 3 la cellule paramètre d est l'épaisseur moyenne des cellules, λ désigne la longueur d' onde lumineuse de la lumière laser, une cellule Δφ désigne le contraste de phase moyenne, et n cellule et n moyen est l'indice de réfraction cellulaire intégré , et l'indice de réfraction du milieu environnant.

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Representative Results

Configuration typique pour DHM Imaging pour Digital Holographic Microscopy (DHM)

Pour effectuer l' imagerie du champ lumineux et quantitative DHM contraste de phase d' imagerie, nous avons appliqué un microscope inversé comme représenté sur la figure 1 B. Le système a été modifié par fixation d' un module de DHM, comme décrit précédemment 25. Hologrammes numériques ont été générées par l' illumination de l'échantillon avec la lumière d'un laser Nd double fréquence: YAG laser λ = 532 nm) dans une configuration de Mach-Zehnder (figure 1 A). Les tissus disséqués ont été analysés ex vivo sur des lames de support de verre. Des cultures de cellules vivantes ont été observées dans des plats spéciaux de Petri pour observer la cicatrisation des plaies comme le montre la Fig. 1 C. Les échantillons ont été imagées dans l'illumination de transmission via un 10X microscope lentille (NA = 0,3) et une lentille de tube. Une caméra de dispositif à couplage de charge a été utilisé pour enregistrer les motifs d'interférence (hologrammes hors axe numériques) générés en superposant l'image de l'échantillon (onde objet) avec l'onde de référence légèrement incliné. Les hologrammes capturées numériquement ont été reconstruits par phase spatiale décalage reconstruction en combinaison avec option holographique autofocalisation 26,33.

Évaluation de la colite murine DSS-induite par DHM

la colite aiguë a été induite chez des souris par administration de 3% p / v de sulfate de dextrane sodique (DSS) dans l'eau de boisson pendant 5 jours. La manifestation et l'évolution de la colite a été suivie en contrôlant la perte de poids progressive dans le groupe DSS-traité par rapport au groupe témoin. (Figure 2 adapté à partir de 19). Endoscopiquement, modérée à sévère colitis a été observé comme indiqué par un épaississement de la paroi du côlon, des altérations de la structure vasculaire (par exemple, un saignement spontané, la flèche rouge), exsudats de fibrine (flèche blanche) et la granularité de la surface de la muqueuse (figure 2B). Évaluation histologique conventionnelle de l' hématoxyline et de l' éosine (HE) tachée sections colique ont révélé un œdème marqué dans la paroi colique du DSS-traités vers les animaux témoins, principalement situées dans la sous - muqueuse (Figure 2 C flèche grise). Quantitatifs correspondant DHM images de contraste de phase et des cartes de réfraction associés de l'index extraites par l'équation 1, également représenté sur les altérations des tissus mentionnés ci-dessus. En outre, l'indice de réfraction, codé à 256 niveaux de gris, ont indiqué des différences de densité dans les couches de tissus , y compris l'épithélium (flèche blanche) et le stroma (flèche noire) dans des échantillons de tissus indigènes, non colorées (Figure 2 C). L'indice de réfraction était significativement réduite dans l'épithélium, ainsi que dans la sous - muqueuse et le stroma des souris colitique par rapport aux témoins sains (figure 2 E). En outre, une corrélation significative entre le paramètre clinique (perte relative de poids corporel) et le paramètre physique absolue (indice de réfraction) a pu être observé (R 2 = 0,64 linéaire, la figure 2 D, adapté 19).

L' évaluation de la maladie de Crohn chez les humains par DHM

La maladie de Crohn est souvent identifié par des altérations inflammatoires remarquables de la paroi intestinale, détectés par endoscopie gastro-intestinale. caractéristiques comprennent des caractéristiques macroscopiques de granularité de la surface de la muqueuse, des ulcères longitudinaux à la fibrine exudations (aussi appelés «pistes d'escargot») et spontanée des saignements (Figure 3 A). L'évaluation histologique par SE coloration des échantillons de tissus de patients atteints de MC active révèlent souvent paroi colique ainsi que muqueux œdème. Quantitatifs correspondant DHM images de contraste de phase et des cartes de réfraction connexes extraites de l' index par l' équation 1 a également été détecté inflammatoire médiée par l' amélioration / gonflement de la paroi du côlon, vu ici dans l'épithélium (figure 3 B). En outre, l'indice de réfraction en tant que paramètre absolu, a également été significativement réduite dans toutes les couches de paroi (épithélium, le stroma et la sous - muqueuse) dans des échantillons de tissus du côlon chez des patients atteints de la MC active vers ceux en phase de rémission (figure 3 C).

Surveillance Multimodal de la guérison des plaies in vitro

Caco-2 cellules cicatrisation des plaies essais ont été effectués au moyen d'un plat spécial Petri pour fournir des conditions normalisées. Le plat est équipé d'un insert de culture formant deux chambres différentes qui sont séparées par un intervalle de 500 um (figure 4 A). Afin de simuler des environnements physiologiques, les cellules ont été examinées sans traitement, stimulée par le facteur de croissance épidermique (EGF) ou inhibées par la mitomycine C. La configuration DHM permet une surveillance continue de la plaie processus au fil du temps de guérison, représenté ici par DHM images à contraste de phase quantitatives représentatives (codées à 256 niveaux de gris) après 0, 22,5 et 45 h après le début de l'expérience (Figure 4 B). Correspondant faux complots pseudo 3D code couleur de la figure 5 illustrent le développement spatial de l'épaisseur de la couche de cellules en trois dimensions. Sur la base de la longueur de retard de trajet optique, l'indice de réfraction cellulaire et les équations 2 et 3, DHM permet une évaluation dynamique simultanée de la migration, la prolifération et la morphologie par le suivi temporel des caractéristiques cellulaires telles que couverte cellulaire de surface, l'épaisseur moyenne de la cellule et de la masse cellulaire sèche ( la figure 4 C). En résumé, les données de la figure 4 montrent que les résultats de la simulation FEM dans une migration plus rapide des cellules dans la zone de la plaie, en une épaisseur moyenne de cellule accrue et à une masse sèche plus élevée dans le champ de vision par rapport aux cellules témoins. En revanche, les cellules inhibées mitomycine C couvrent une légère diminution de la surface que les cellules témoins pendant la durée de l'expérience et montrent également une augmentation de la masse sèche légèrement inférieure. Cependant, l'épaisseur moyenne de la cellule apparaît clairement diminué par rapport à la fois, stimulée et les cellules témoins.


Figure 1. Utilisé configuration hors axe pour Digital Holographic Microscopy (DHM). Schéma de configuration du poste de travail DHM (A). Correspondant photographie montrant la configuration du microscope (moniteur, l' image en direct et un logiciel de contrôle (1), hors axe configuration microscope numérique (2), (B), le chemin optique du microscope (ligne pointillée verte) et un échantillon (indiqué par le rouge flèche; (C)). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
La figure 2. Évaluation de la colite murine DSS-induite par DHM. Le cours de la colite a été suivie par moi quotidienneasurement de poids corporel relatif et endoscopique des examens répétés de suivi. Une perte massive de poids corporel du jour 4 après le début de l' administration DSS (adapté de 19) (A) a été accompagnée par des signes endoscopiques de colite établie , y compris des ulcérations focales et la vulnérabilité de la muqueuse (B). Analyse des sections cryostatiques classiques HE-tachés révélé muqueux œdème, un épaississement de la musculeuse et un infiltrat inflammatoire de la muqueuse prononcée dans la muqueuse. Correspondant quantitatives DHM images à contraste de phase et des cartes de réfraction connexes d'index récupérées par l' équation 1 (codée à 256 niveaux de gris) a confirmé les changements oedémateux de la sous - muqueuse au cours du processus inflammatoire (flèche blanche indique l' épithélium, la sous - muqueuse gris et stroma noir) (C). La perte relative de poids corporel (un paramètre clinique) sensiblement en corrélation avec l'indice de réfraction (un paramètre physique absolu, R 2 linéaire = 0,64; (D), adapté 19) qui a été significativement réduite dans l'épithélium, ainsi que dans la sous - muqueuse et le stroma des souris colitique par rapport aux témoins sains (moyenne ± SEM, *** P <0,001; e . ) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Évaluation de la maladie de Crohn chez les humains par DHM. Les échantillons de tissus du côlon des patients avec endoscopically et histologiquement confirmé la maladie de Crohn ont été examinés (A). HE-coloration affiché allongement des cryptes muqueuses et un infiltrat marquée de cellules inflammatoires. En outre, la sous-muqueuse oedème et de l'élargissement de la musculeuse a été détectée. L'analyse des corrÉPONDRE quantitatives DHM images à contraste de phase et des cartes de réfraction connexes d'index récupérées par l' équation (1) (codé à 256 niveaux de gris) ont également révélé des changements oedémateux (ici indiqués par une étoile blanche et noir) dans l'épithélium (B). Des différences significatives de l'indice de réfraction moyen ont été détectés dans des échantillons provenant de patients CD avec flare active (barres claires) ou la remise (barres noires). Ces différences sont observées dans chaque type de tissu (moyenne ± SEM, *** P <0,001; C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Suivi de épithéliale Wound Healing par White Light Microscopie et DHM. Les cellules cultivées ont été transferred en boîtes de Pétri avec des inserts spéciaux (flèche rouge). Avant que des inserts de culture ont été enlevés, les cellules ont été traitées soit avec l' EGF ou la mitomycine C pendant 24 heures, ou traités avec le milieu seul (témoin non stimulé) (A). Après le retrait des inserts de culture, la cicatrisation des plaies a été constamment surveillée par imagerie de contraste de phase par DHM au fil du temps. contours cellulaires pourraient être clairement reconnus. Représentatifs quantitatifs DHM images à contraste de phase sont présentés au début de l'expérience, après 22,5 h et à la fin de la mesure après 45 h (B). Panel (C) montre les changements correspondants temporels dans la surface recouverte de cellules (S c), l'épaisseur moyenne de la cellule (d cellules) et le cellulaire de masse sèche (MS). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


La figure 5. Illustration de la cellule de couche Morphologie Changements par Faux code couleur pseudo 3 Parcelles D des Quantitative DHM Phase Contrast Images. Représentatifs de faux complots des DHM images à contraste de phase quantitative de la figure 4B à t = 0 pseudo 3D code couleur, après 22,5 h et à la fin de la mesure après 45 h, illustrent le développement territorial de l'épaisseur des couches de cellules pour Control-, mitomycine c inhibé et les cellules de l' EGF stimulée en 3D. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Nous démontrons que DHM fournit une évaluation précise des dommages histologiques dans les modèles de colite murins et des échantillons humains de tissus colique ex vivo. En outre, nous avons montré DHM peut surveiller en permanence la cicatrisation épithéliale tout en fournissant simultanément l' information multimodale sur les altérations cellulaires. Dans DHM, la reconstruction d'hologrammes capturées numériquement est effectuée numériquement 32. Par conséquent, par rapport à la microscopie en champ clair, Zernike contraste de phase différentielle et la microscopie à contraste interférentiel, DHM fournit un contraste de phase quantitatif avec une correction en option de mise au point ultérieure numérique (multi-focus imagerie) 27. Imagerie en phase quantitative est basée sur la détermination des changements de longueur de chemin optique et est hautement indépendante du dispositif de mesure utilisé ainsi. Cela simplifie la comparaison des données de mesure qui sont acquises avec des instruments différents. En outre, DHM nécessite seulement une faible intensité lumineuse pour object illumination. Ceci permet une analyse minimalement invasive de tissus disséqués non colorés et minimise la quantité d'interaction avec l'échantillon nécessaire pendant les observations des cellules vivantes en accéléré à long terme.

L'arsenal thérapeutique pour les MII a considérablement élargi au cours des deux dernières décennies. Outre l'introduction de TNF-α thérapies anti, qui sont efficaces dans les deux UC et CD et ont des profils d'effets de côté acceptables, roman et des anticorps spécifiques ciblant les intégrines ont été récemment introduits dans la pratique clinique 34-37. Plusieurs autres agents prometteurs sont actuellement évalués pour leur efficacité thérapeutique dans les MICI 38-40. Cependant, avant l'utilisation clinique chez l'homme, l'efficacité et l'innocuité de ces thérapies potentielles doit être prouvée dans les études animales. La colite induite par DSS-est l' un des modèles de colite murines les plus fréquemment utilisés, en raison de sa reproductibilité élevée et de faibles coûts 23. En outre, ce modèle peut aldonc être appliqué à des souris génétiquement modifiées souches 41. Tandis que les marqueurs systémiques, par exemple, la CRP, sont très variables dans des modèles animaux, l' évaluation histologique du côlon représente l'approche la plus valable pour évaluer la sévérité des maladies 42,43. Néanmoins, l'évaluation quantitative de l'inflammation histologique selon les systèmes de notation est très dépendante de l'expertise et de l'expérience enquêteur. Évaluation automatisée et la notation par des paramètres objectifs que possible avec DHM surmonte ces limitations, et de plus est aussi de gagner du temps, en évitant la nécessité pour la coloration 19. En outre, DHM peut être utilisé pour examiner les spécimens colique chirurgicales ainsi que des échantillons de muqueuse obtenus au cours de l'endoscopie.

la régénération épithéliale et la cicatrisation est un mécanisme clé pendant plusieurs processus pathologiques, y compris l'ulcération gastro-intestinale ou une fuite anastomotique. Bien qu'il existe des approches prometteuses pour évaluer la cicatrisation des plaies épithéliales en vivo 44, ces techniques nécessitent des outils sophistiqués d'examen et ne sont actuellement pas largement disponibles. Par conséquent, actuellement cicatrisation épithéliale est couramment étudiée par des tests de grattage in vitro 9. Ces essais permettent d' examiner valide de fermeture de la plaie , mais nécessitent généralement d' abord la coloration des cellules, ce qui empêche alors l' évaluation 10,45 répétée. En outre, aucune donnée d'altération cellulaire peuvent être acquises en parallèle avec cette configuration expérimentale. Toutefois, cette information peut être d' une grande importance car il peut être utilisé pour différencier entre l' apoptose et la nécrose 46 et d'évaluer la prolifération cellulaire et la migration 46. Par conséquent, la possibilité de déterminer l'épaisseur de la cellule, la masse sèche ou la densité des tissus en même temps à la surveillance de la fermeture de la plaie par l'examen DHM est d'une grande valeur dans la recherche de la muqueuse.

Les objectifs du traitement pour les patients atteints de MII humains ont été en constante évolution au cours des dernières décennies <sup> 47. Bien que d' abord le contrôle de l' inflammation a été considéré comme de première importance, plus tard la rémission des stéroïdes sans et maintenant la cicatrisation des muqueuses sont des objectifs primaires de traitement 48. Récemment, il a été émis l' hypothèse que la remise histologique peut même être supérieure à la cicatrisation des muqueuses seuls 49. Cependant, bien qu'il existe quelques systèmes de notation histologiques disponibles pour IBD humaine, la variabilité inter-observateur reste élevé 50. Par conséquent, il est nécessaire d'adopter une approche normalisée pour l'évaluation des échantillons histologiques colique. DHM peut contribuer à cet objectif et devrait être encore évalué dans un essai clinique prospectif avec les patients MICI humains.

Dans la procédure expérimentale présentée, les échantillons sont éclairés et imagées par la lumière laser très cohérente. Par conséquent, la résolution en DHM est principalement limitée par les effets de diffusion et de diffraction de lumière causées par un mauvais alignement de l'éclairage de l'échantillon, les échantillons épais, la poussière oud'autres impuretés telles que l'eau condensée dans le chemin optique. Afin d'obtenir des données de mesure de haute précision à partir quantitatives des images à contraste de phase DHM, une préparation minutieuse et l'alignement de la configuration DHM et l'échantillon sont les étapes les plus importantes dans le protocole. Soigneusement nettoyé des éléments d'imagerie optique, en particulier l'objectif microscope condenseur et microscope, sont requis pour minimiser le bruit. Aussi diapositives échantillon de support, boîte de Pétri couvercle et le fond, ainsi que le milieu de culture cellulaire utilisé doit être exempt d'impuretés particulaires. Ce résultat est obtenu en nettoyant soigneusement tous les composants et le filtrage adéquat des liquides appliqués.

des conseils de dépannage plus détaillées sont les suivantes: si l'hologramme numérique et / ou les quantitatifs DHM images de phase de tissus disséqués sont bruyants, le porte-verre et lamelle peuvent être contaminés par la poussière. Si oui, nettoyer le support en verre et lamelle avec de l' alcool (par exemple, l' éthanol pur). Si l'épaisseurness du tissu disséquée est trop importante (> 10 um) et conduit donc à diffusion de la lumière, essayez d'utiliser des coupes de tissus plus minces. Dans le cas où l'éclairement avec la lumière laser ne soit pas répartie de façon homogène, aligner l'éclairage de l'objet via le microscope condenseur. Si l'eau condensée sur le fond du couvercle de verre induit des effets de diffusion, vérifier la température de la chambre de chauffage et de l'humidité ambiante. Dans le cas où la densité cellulaire est une croissance trop élevée ou d'une cellule dans plus d'une couche, de réduire la densité cellulaire lors de la préparation de tests de cicatrisation des plaies. Enfin, comme DHM est basée sur le principe de l'interférométrie, la méthode est sensible à des vibrations ou à d'autres perturbations mécaniques qui peuvent varier en fonction de l'environnement de laboratoire. Toutefois, ces influences peuvent généralement être minimisés par des temps d'exposition choisis de manière adéquate (typiquement dans la fourchette de milliseconde ou ci-dessous) pour l'enregistrement de l'holographie lors de la préparation de l'installation expérimentale.

En résumé, Nos résultats démontrent que DHM détient des avantages majeurs sur le terrain lumineux et des techniques de microscopie d'imagerie à contraste de phase existants tels que le contraste de phase Zernike et DIC en raison de sa capacité à évaluer quantitativement l' inflammation histologique ex vivo de façon presque automatique. En outre DHM permet sans marquage continu d' évaluation multimodale de la cicatrisation des plaies epitheliales in vitro avec une interaction réduite au minimum avec les échantillons. Cela ouvre la voie à un examen histologique automatisé en termes de '' la pathologie numérique '' et d'autres études prolongées pour explorer le potentiel de translation de DHM sur les patients atteints d'une MII. En outre, DHM offre roman in vitro possibilités d'étudier quantitativement la migration cellulaire, la morphologie et la prolifération.

La traduction de DHM dans la pratique clinique a le potentiel d'améliorer le diagnostic de MII. DHM que permet la quantification des différents degrés d' une inflammation intestinale par l' intermédiaire d'paramètres physiques tels que les changements de densité, une évaluation objective et plus précise de la maladie dans le sens d'une «pathologie numérique» semble possible. L'évaluation objective peut avoir un impact important sur la prise en charge clinique des patients atteints de MII.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Azoxymethane (AOM) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany A5486
Cell Culture Flask Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 658170
Costar Stripette Corning Inc., New York, USA 4488
Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
DMEM/Ham's F12 PAA Laboratories - Pasching - Austria E15-813
EGF Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany SPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
Falcon Tube 50 ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070
Isopentane (2-Methylbutane) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M32631-1L
Methylene blue Merck, Darmstadt, Germany 1159430025
Mitomycin C Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M4287
Microscope Slides G. Menzel, Braunschweig, Germany J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583
Pen/Strep/Amphotericin B Lonza, Verviers, Belgium 1558
Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
RPMI 1640 Lonza, Verviers, Belgium 3626
Sodium Chloride 0.9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
Trypsin EDTA Lonza, Verviers, Belgium 7815
Vitro – Clud R. Langenbrinck, Teningen, Germany 04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high ibidi GmbH, Munich, Germany 81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert ibidi GmbH, Munich, Germany 80050
Equipment
MICROM HM550 Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA 46320
Digital holographic microscope
Component Model Company
Inverted Microscope iMIC Till Photonics, Graefelfing, Germany
Laser Compass 315M Coherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lens Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 Zeiss, Goettingen, Germany
CCD camera DMK 41BF02 The Imaging Source, Bremen, Germany

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