Multimodal Fase cuantitativa de imágenes con Digital holográfica Microscopía evaluación exacta de la inflamación intestinal Curación de heridas y epitelial

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Lenz, P., Brückner, M., Ketelhut, S., Heidemann, J., Kemper, B., Bettenworth, D. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54460, doi:10.3791/54460 (2016).

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Abstract

La incidencia de la enfermedad inflamatoria intestinal, es decir, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, ha aumentado considerablemente en la última década. La etiología de la IBD permanece desconocida y estrategias terapéuticas actuales se basan en la supresión no específica del sistema inmune. El desarrollo de tratamientos que se dirigen específicamente la inflamación intestinal y la curación de la herida epitelial podría mejorar significativamente la gestión de la EII, sin embargo esto requiere una detección precisa de los cambios inflamatorios. Actualmente, los posibles candidatos a fármacos se evalúan por lo general el uso de modelos animales in vivo o con técnicas basadas en cultivos celulares in vitro. El examen histológico por lo general requiere que las células o tejidos de interés para ser teñidas, que pueden alterar las características de la muestra y, además, la interpretación de los resultados puede variar por la experiencia del investigador. microscopía holográfica digital (DHM), basado en la detección de retardo de longitud del camino óptico, permite-Libre de manchas de imágenes de contraste de fase cuantitativa. Esto permite que los resultados que se correlacionan directamente con los parámetros biofísicos absolutos. Se demuestra cómo la medición de los cambios en la densidad del tejido con DHM, basado en la medición del índice de refracción, puede cuantificar alteraciones inflamatorias, sin tinción, en diferentes capas de muestras de tejido del colon de ratones y seres humanos con colitis. Además, demostramos monitoreo libre de etiquetas multimodal continua de la curación de heridas epiteliales in vitro, utilizando DHM posible gracias a la determinación automatizada sencilla de la zona de la herida y la determinación simultánea de los parámetros morfológicos, como una masa seca y espesor de la capa de células que migran. En conclusión, DHM representa un valioso, herramienta novedosa y cuantitativo para la evaluación de la inflamación intestinal con valores absolutos de los parámetros posibles, la cuantificación simplificada de la curación de heridas epiteliales in vitro y por lo tanto tiene un alto potencial de diagnóstico u traslacionalse.

Introduction

Enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), es decir, la colitis ulcerosa (UC) y la enfermedad de Crohn (CD) son trastornos inflamatorias idiopáticas del tracto gastrointestinal 1. La investigación sobre la fisiopatología subyacente de la EII y la evaluación de los potenciales nuevos fármacos o enfoques novedosos de diagnóstico es de particular importancia. Tanto en la investigación básica y el manejo clínico de los pacientes con EII, la mucosa intestinal se ha convertido en un foco de atención 2,3. La mucosa representa un límite anatómico, en la que la interacción entre bacterias comensales, células epiteliales y diversos componentes celulares del sistema inmunitario intestinal orquestar intestino homeostasis 4,5. Sin embargo, en los pacientes con EII, la inflamación intestinal incontrolada y persistente conduce a la mucosa daño, detectable como ulceraciones o estenosis, que finalmente pueden culminar en la descomposición de la función de la barrera epitelial, que a su vez agrava la inflamación local 6.

7. Epitelial cicatrización de la herida puede ser simulado en la herida in vitro los ensayos de curación y en modelos murinos de inflamación intestinal 8,9. Tanto in vitro como in vivo enfoques tienen inconvenientes, que limitan la precisión de la evaluación experimental. Ensayos in vitro, como los ensayos de cero clásicos, requerir procedimientos de tinción o prolongadas de la transfección con cromóforos fluorescentes. A menudo están limitadas por su monitorización discontinua de la proliferación celular y la migración que no puede ser automatizado 10. Modelos in vivo, tales como sulfato de dextrano sódico (DSS) La colitis inducida, con frecuencia carecen de robustos lectura de los, en parte debido a la variación significativa vista en los marcadores de laboratorio, marey dichos marcadores inadecuados para evaluar la gravedad de la colitis 11,12. El análisis histológico de la mucosa inflamada es actualmente todavía el método más válido para determinar la gravedad colitis pero esto, como los ensayos de curación de heridas epiteliales in vitro, requiere tinción y depende de la experiencia del investigador 13.

Microscopía holográfica Recientemente digital (DHM), una variante de la microscopía de fase cuantitativa 14, se identificó como herramienta útil para la evaluación de epitelial cicatrización de heridas in vitro y in vivo 15. DHM permite la evaluación de la densidad del tejido mediante la medición de retardo de longitud del camino óptico (OPD) , que el diagnóstico del cáncer perspectivas novela 16-18 y cuantificación de las alteraciones del tejido relacionado con la inflamación 19. Además, DHM permite la monitorización de la dinámica de la morfología celular mediante la determinación de espesor de la celda, el área de superficie de la célula cubierta y intracelular (proteína) la cantidad de contenido in vitro, DHM también permite el análisis de procesos fisiológicos, por ejemplo, celular permeabilidad al agua mediante la evaluación de los cambios en el volumen celular y el espesor de 21,22. Por otra parte, las mediciones se pueden automatizar DHM que evita el sesgo de la muestra por el investigador asociado.

A continuación, se demuestra el uso de DHM en un modelo murino de inflamación intestinal, y también aplicar DHM para el análisis de muestras de tejidos humanos para la monitorización cuantitativa de la cicatrización de heridas como un ensayo libre de etiquetas in vitro. En primer lugar, se evalúa alteraciones inflamatorias de las diferentes capas de la pared del colon-en ratones colíticos y secciones de tejidos de seres humanos con EII. Después de describir el procedimiento de formación de imágenes DHM fase cuantitativa, se proporcionan instrucciones detalladas para el uso de los componentes del microscopio, la preparación de secciones de tejido y también describir la evaluación de las imágenes de fase cuantitativos adquiridos.

A continuación, mostramos que DHM puede ser utilizado para la monitorización multimodal continua de la curación de heridas epiteliales in vitro, y describir el análisis de las características celulares como espesor de la capa de células, masa seca y el volumen celular dar una idea de las alteraciones inducidas por drogas y celulares fisiológica.

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Protocol

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética regional (la Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Alemania) de acuerdo con la Ley de Protección de Animales alemán. El comité de ética local de la Universidad de Münster aprobó el uso de tejidos humanos para el análisis histológico y el microscopio.

1. Los animales y Materiales

  1. Utilice femenino o ratones macho de la cepa susceptible DSS requiere que pesan 20 a 25 g, y la casa de acuerdo a la legislación local cuidado de los animales. Proporcionar comida especial para roedores y en autoclave beber agua ad libitum.
  2. Inducir la colitis DSS aguda mediante la administración de un 3% w / v de dextrano sulfato sódico (DSS, peso molecular: 36,000-50,000 Da) en agua del grifo tratada en autoclave durante 5 días.
    NOTA: La potencia de DSS es muy variable dependiendo del fabricante y lote. Pruebe su proveedor DSS-proporcionada por primera vez para la inducción de la actividad de la enfermedad, para la que dapeso corporal AIA es un indicador fiable y objetiva.
  3. Para la evaluación histológica de las muestras de tejido del colon, la eutanasia a los ratones por CO 2 insuflación (o según lo especificado por las directrices nacionales e institucionales) al final del experimento.

2. Configuración experimental para DSS-colitis y in vitro Los ensayos de curación de heridas

  1. Cultivo de células y ensayo de establecimiento de la cicatrización de heridas.
    1. Crecer células Caco-2 en una humedad del 95% y 5% de CO 2 medio ambiente a 37 ° C. Utilice medio RPMI con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina.
    2. Seed células Caco-2 a una densidad de 4 x 10 5 células / cm 2 en 35 mm placas de Petri con la alta cultura-inserción (véase la Figura 4A).
      NOTA: El inserto genera dos áreas de célula cubierta que se separan con un espacio libre de células se define en representación de la zona de la herida que va a analizarse.
    3. Cambie medio dos días después de seedingramo. Realizar aspirando primero medio residual con los residuos celulares mediante el uso de una pipeta automática, enjuague con 100 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se añade medio RPMI fresco o medio privadas de suero.
    4. células de cultivo para 24 horas en medio privadas de suero (0,1% de FBS), complementado con 20 ng de suero EGF / ml o 2 mg de mitomicina c / ml de suero para detectar alteraciones en el comportamiento de cicatrización de heridas. Añadir medio normal RPMI con las células control durante 24 horas.
    5. Después de 24 horas de cultivo, retirar y desechar insertos de cultivo como se describe en el paso 3.4 y realizar DHM.
  2. La inducción de la colitis DSS aguda
    1. Disolver 3 g de DSS en 100 ml de agua en autoclave para obtener un 3% (v w /) solución de DSS. Proporcionar esta solución en lugar de agua potable a los ratones ad libitum durante 7 días. Calcular 5 ml de solución por DSS-ratón / día. Proporcionar agua tratada en autoclave sin DSS para los ratones de control ad libitum.
  3. Preparación de las secciones criostáticas de murino y de colon humano
    1. La eutanasia a los ratones por CO 2 insuflación al final del experimento.
    2. Diseccionar el abdomen de los animales mediante laparotomía 23. Retire todo el colon con cuidado utilizando pinzas y cortar el extremo ileal y rectal utilizando tijeras quirúrgicas. Cortar el colon con una tijera longitudinalmente desde el cecal hasta el final rectal y abrir el colon. Retirar todas las heces de la muestra utilizando unas pinzas, seguido de un lavado con PBS 24.
    3. Preparar brazos de gitano enrollando todo el colon con un bastoncillo de algodón longitudinalmente desde el ciego hasta el final del recto con la mucosa curvada hacia el interior. Incrustar muestras de colon en el compuesto temperatura óptima de corte (OCT) y mantenerse congeladas a -80 ° C hasta su uso posterior.
    4. Incrustar tejido colónico humano a partir de la pieza quirúrgica en una óptima temperatura de corte compuesto OCT y se congeló a mantenerse -80 ° C hasta su uso posterior.
    5. Corte secciones de 7 m de espesor de las muestras de compuesto OCT-embebido con la ayuda de un cryotome justo antes de un examen.
      NOTA: El espesor óptimo de la muestra depende de la persistencia y las propiedades de dispersión del tipo de tejido bajo investigación. Para los experimentos descritos utilizando tejido de colon, grosor de corte> 10 micras causa importante aumento en el ruido debido a la dispersión de la luz en imágenes de contraste de fase DHM cuantitativos, mientras que las muestras de espesor <5 micras muestran un mayor riesgo de daño inducido por los artefactos del proceso de corte crio.
    6. Transferir secciones sobre un porta portaobjetos de vidrio.

3. Equipo Técnico, Software y procedimientos para la adquisición y evaluación de hologramas digitales

  1. microscopio holográfico digital para celular cuantitativa y obtener imágenes de tejidos
    1. Utilizar un sistema de microscopía fuera del eje Mach-Zehnder digitales holográfica de imágenes de células vivas 25, como se muestra en la Figura 1. Asegúrese de que el microscopio está equipado con una10X lente de un microscopio, una platina de microscopio con un soporte para diapositivas portaobjetos de vidrio y placas de Petri con un diámetro de 35 mm, una cámara de calentamiento para conservar la temperatura fisiológica a 37 ° C y el software para imágenes de fase cuantitativa 25.
      NOTA: Por ejemplo, como se describe en Kemper et al 26 y 27 Langehanenberg et al...
      NOTA: También puede utilizar un sistema similar que es capaz de realizar la microscopía de campo claro y Fase cuantitativa de imágenes de células vivas y las diapositivas de tejidos disecados.
    2. Lente de microscopio limpio y condensador con papel de limpieza de lentes y un agente de limpieza (por ejemplo, etanol) según lo recomendado por el fabricante del microscopio para eliminar el polvo u otras contaminaciones.
    3. Ejecutar el software de adquisición de imágenes del microscopio DHM, seleccione el modo "campo brillante" de imagen y cambio "en" iluminación de luz blanca. Garantizar Köhler-Correcación de la muestra tal como se recomienda por el fabricante microscopio, mientras que la observación de la muestra en la ventana de imagen en directo del software de adquisición de imágenes (alternativamente, un software estándar de adquisición de imágenes se puede utilizar en este paso).
      NOTA: La intensidad de la imagen debe ser distribuido de manera homogénea en el campo de visión y la posición de la muestra no debe moverse durante la reorientación óptica con la unidad de enfoque del microscopio.
    4. Seleccione el modo "DHM" imagen, "apagar" iluminación de luz blanca y el interruptor "on" la luz láser. Compruebe que la iluminación con luz láser es homogénea (es decir, que la intensidad de la luz se distribuye homogéneamente en la ventana de imagen en directo del software de adquisición de imágenes del microscopio DHM) y observe que el portador de patrón de franjas de interferencia fuera del eje aparece con contraste adecuado en el imágenes capturadas (hologramas digitales).
  2. Preparación de secciones de criostato para formación de imágenescon DHM
    1. Tome la (sección de criostato sobre un portaobjetos de vidrio, espesor: 7 micras, tal como se describe en el punto 2.3) de la muestra del congelador. Descongelar la muestra durante aproximadamente 5 min a temperatura ambiente y atmósfera normal.
    2. Añadir 50 - solución salina tamponada con fosfato 100 l (PBS) como medio de inclusión en la sección de tejido con una pipeta hasta que está completamente cubierto con tampón. Cubrir la muestra con un cubreobjetos de vidrio limpio (espesor de vidrio de 170 micras).
      NOTA: El secado excesivo puede inducir cambios significativos del índice de refracción y propiedades de dispersión de la muestra.
    3. Asegúrese de que la parte inferior del soporte de vidrio y la hoja de la cubierta se limpian del polvo y otros contaminantes que pueden inducir la dispersión de la luz. La muestra está lista para la investigación con microscopía de campo brillante y DHM.
  3. Fase cuantitativa de imágenes de secciones de tejido con DHM
    1. Encienda el microscopio holográfico digital, elegir la lente del microscopio 10X para la imagen. Iniciar el iSoftware de adquisición de mago del microscopio DHM y seleccionar el modo de imagen brillante de archivos.
    2. Colocar el portaobjetos de tejido como se describe en 2) en el soporte del portaobjetos del microscopio, con la hoja de la cubierta frente al objetivo del microscopio.
    3. Switch "sobre" la iluminación de campo brillante del microscopio DHM. Coloque la muestra con la platina del microscopio y asegurar que el área de tejido de interés es visible en la ventana de monitoreo en vivo. Mejorar la nitidez de la imagen utilizando la unidad de enfoque del microscopio.
      NOTA: Además de la zona de interés, un área de diapositiva sin tejido también deben estar presentes en el campo de visión.
    4. Capturar una imagen de campo brillante de la muestra se centró fuertemente el uso del software de adquisición de imágenes.
    5. Seleccionar el modo de imagen "DHM", "apagar" la iluminación de luz blanca y girar "sobre" la iluminación de luz láser. Seleccione el "tiempo de exposición" para la grabación del holograma por debajo de 3 ms, observar que holographic fuera del eje franjas de interferencia aparecen con un contraste adecuado en la ventana de imágenes en vivo del software de adquisición de imágenes y la captura de un holograma digital.
    6. Repita los pasos 3.3.3 - 3.3.5 hasta que se haya registrado un número suficiente de imágenes de campo claro y hologramas digitales de diferentes áreas de la muestra. adquisición holograma se ha completado.
  4. Preparación de ensayos de cicatrización de la herida para imágenes DHM
    1. Conectar la cámara de calentamiento placa de Petri del microscopio DHM sobre 1-3 h antes del inicio del experimento para garantizar condiciones de temperatura estables durante las mediciones DHM.
    2. Preparar banco de trabajo con el equipo necesario (placa de Petri para el ensayo de cicatrización de la herida se describe en 2.3): pipetas, pinzas, tapa de vidrio para la placa de Petri, 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) tamponada con medio de cultivo celular fisiológica la temperatura (37 ° C) para la preparación de muestras en el entorno estéril.
      NOTA: de NaHCO3.
    3. Retire la tapa de plástico de la placa de Petri y se elimina el medio de cultivo de células con una pipeta. Retire la inserción de la parte inferior del plato de Petri con unas pinzas.
    4. Lavar la muestra 1 - 2 veces con 1 ml de tampón HEPES medio de cultivo celular con el fin de eliminar las células muertas y restantes componentes celulares (por ejemplo, suero) en el área de la herida. Añadir 2 ml de HEPES medio de cultivo celular tamponado y la tapa de la caja de Petri con la tapa de cristal.
    5. Asegúrese de que la tapa de vidrio y el fondo del plato de Petri se han limpiado de polvo y otros contaminantes. Muestra está lista para la observación lapso de tiempo con DHM.
  5. Monitorización multimodal continua de la curación de heridas in vitro con DHM
    1. Encienda la cámara de calentamiento placa de Petri del microscopio DHM cerca de 1 - 3 horas antesal comienzo del experimento para garantizar condiciones de temperatura estables durante las mediciones DHM.
    2. Switch "sobre" el microscopio holográfico digital, seleccionar la lente del microscopio 10X para la imagen. Ejecutar el software de adquisición de imágenes del microscopio DHM y seleccionar el modo de imagen "de campo claro". Asegúrese de que la cámara de calentamiento para la placa de Petri está operando una temperatura fisiológica (37 ° C).
    3. Coloque la placa de Petri con el ensayo de curación de heridas, preparado como se describe en 4), en la cámara de calentamiento del microscopio DHM.
    4. Seleccionar el modo de imagen de campo claro y la posición de la muestra con la platina del microscopio, mientras que la observación de que en la ventana de monitoreo en vivo del software de adquisición de imágenes del microscopio DHM. Observe que el área deseada de la muestra aparezca enfocada fuertemente bajo iluminación de luz blanca.
    5. Capturar imágenes brillantes de campo de diferentes áreas de la muestra (área de la herida y sus alrededores con células confluentes) bajo blancoiluminación de luz con el software de adquisición de la imagen y la apariencia del documento, la densidad celular y la homogeneidad.
    6. Seleccionar el modo de imagen "de campo claro" del microscopio DHM. Elija un área de la herida adecuado bajo iluminación blanca de la luz en la ventana de monitoreo en vivo con el software de adquisición de imágenes del microscopio DHM. Asegúrese de que el área de la herida está libre de células muertas y no hay restos de suero, y asegúrese de que ambas partes incluyen una sola capa de células homogénea, preferentemente con bordes rectos.
    7. Capturar una imagen de luz blanca de la zona de la herida inicial en el modo de imagen de campo claro con el software de adquisición de imágenes del microscopio DHM.
    8. "Apagar" iluminación de luz blanca, seleccione el modo "DHM" y el interruptor "en la" iluminación láser. Seleccionar un tiempo de exposición de por debajo de 3 ms para el registro de holograma (observar que holográfica fuera del eje franjas de interferencia aparecen con un contraste adecuado en la ventana de imágenes en vivo del software de adquisición de imágenes de tque DHM microscopio) y la captura de un holograma digital.
    9. Captura de un holograma muestra en el modo de DHM con el software de adquisición de imagen y reconstruir una imagen de fase cuantitativa con el software de reconstrucción del microscopio DHM con el fin de comprobar la calidad de la imagen.
    10. Seleccionar un retardo de tiempo adecuado (por ejemplo, 3 a 5 min) para de lapso de tiempo de adquisición de holograma con el software de adquisición de imágenes del microscopio DHM.
    11. Seleccione el modo de adquisición de lapso de tiempo del software de adquisición de imágenes en el que la muestra solamente se ilumina con luz láser durante la adquisición de holograma.
    12. Iniciar la medición del DHM lapso de tiempo del ensayo de cicatrización de la herida.
    13. Detener la adquisición de lapso de tiempo después de la hora prevista, seleccionar el modo de imagen de campo claro y documentar el aspecto final de la muestra en la imagen de luz blanca.
  6. Reconstruir hologramas digitales de tejidos disecados y determinar el índice de refracción promedio como un parámetro para cuantificarla densidad del tejido
    1. Reconstruir imágenes de fase cuantitativas de los hologramas digitales de tejidos disecados con el software del microscopio DHM, por ejemplo, como se describe en Kemper et al. 26 y Langehanenberg et al. 27.
    2. Determinar la diferencia de fase Δφ promedio en diferentes capas de tejido (epitelio, submucosa, estroma) en regiones elegidas adecuadamente de interés (ROI) 19.
    3. Determinar el índice de refracción del medio de inclusión mediante el uso de un refractómetro o, alternativamente, mediante el uso de un valor apropiado de la literatura. (valores de índice de refracción de los medios de comunicación típica incrustación: n = 1.334 agua 28, n tampón fosfato salino (PBS) = 1,337 29, n medio de cultivo celular = 1,337 a 1,339 29,30).
    4. Calcular los índices de refracción de las diferentes capas de tejido del contraste de fase Valores 19
      Ecuación 1 NOTA: En la Ec. 1 λ es la longitud de onda de la luz láser (aquí: λ = 532 nm), d el espesor de los tejidos disecados (en este caso: 7 m) yn medio es el índice de refracción del medio de inclusión (en este caso: n medio = n PBS = 1.337, determinado por un refractómetro Abbe-).
  7. Reconstruir y evaluar hologramas digitales del lapso de tiempo de observación serie cicatrización de heridas
    1. Reconstruir imágenes fase cuantitativa de la serie lapso holograma tiempo obtenido durante la observación cicatrización de la herida con el software microscopio DHM 26,27.
    2. Normalizar cada serie de imágenes de fase cuantitativa a la imagen con contraste de fase máxima.
    3. Determinar el área S c que está cubierta por las células en las imágenes de fase cuantitativos DHM por la segmentación de imágenes, que puede ser porformado usando el generador de perfiles de células software libre (www.cellprofiler.org 31).
    4. Calcular el contraste de fase media de la célula células Δφ en la zona S c.
    5. Recuperar el DM masa seca celular de la célula de contraste de fase Δφ media en la zona S c 15
      Ecuación 2 (2)
      NOTA: En la ecuación 2 DM indica la masa seca celular, S c presenta la zona que está ocupada por las células y α = 0,002 m 2 / kg.
    6. Determinar la célula de refracción celular integral índice n y el índice de refracción del medio de medio de cultivo de células n. Determinar celular n por separado experimentalmente a partir de células en suspensión como se describe en el 30 y medir medio n con un refractómetro. Alternativamente utilizar valores de la literatura para la celda n 30 yn medio 29,30.
    7. Calcular el promedio de células d espesor de la celda de λ, célula Δφ, n celular y n medio 26,32
      Ecuación 3 (3)
      NOTA: En la Ec. 3 la célula parámetro d es el espesor medio de celda, λ denota la longitud de onda de luz de la luz láser, célula Δφ indica la diferencia de fase media, y n celular y n medio son el índice de refracción celular integral y el índice de refracción del medio circundante.

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Representative Results

Configuración típica de los DHM de imagen digital para microscopía holográfica (DHM)

Para llevar a cabo formación de imágenes de campo brillante y la imagen de contraste de fase cuantitativa DHM, se aplicó un microscopio invertido como se representa en la Figura 1 B. El sistema fue modificado uniendo un módulo DHM, como se describió anteriormente 25. Hologramas digitales se han generado por la iluminación de la muestra con la luz de un láser de Nd doble frecuencia: λ láser YAG = 532 nm) en la configuración de Mach-Zehnder (Figura 1 A). Tejidos disecados se analizaron ex vivo en portaobjetos de soporte de vidrio. Se observaron de estar cultivos de células en platos de Petri especiales para la observación de la cicatrización de heridas como se muestra en la Fig. 1 C. Las muestras se obtuvieron imágenes en la iluminación de la transmisión a través de un 10X millascroscope lente (NA = 0,3) y una lente de tubo. Una cámara de dispositivo de carga acoplada se utilizó para registrar los patrones de interferencia (digitales hologramas fuera de eje) generados por la superposición de la (onda del objeto) imagen de la muestra con la onda de referencia ligeramente inclinada. Los hologramas capturadas digitalmente fueron reconstruidos por desplazamiento de fase espacial de reconstrucción en combinación con la opción de enfoque automático holográfica 26,33.

Evaluación de la colitis inducida por DSS murino por DHM

colitis aguda se indujo en ratones mediante la administración de 3% w / v de dextrano sulfato de sodio (DSS) en el agua potable durante 5 días. La manifestación y el curso de la colitis se siguió mediante el control de la pérdida de peso progresiva en el grupo de DSS-tratado en comparación con el grupo control. (Figura 2 A una adaptación de 19). Endoscópicamente, de moderada a severa colitis se observó como se refleja por el engrosamiento de la pared del colon, las alteraciones del patrón vascular (por ejemplo, sangrado espontáneo, flecha roja), exudaciones de fibrina (flecha blanca) y la granularidad de la superficie de la mucosa (Figura 2B). Convencional evaluación histológica de hematoxilina y eosina (HE) manchado secciones del colon reveló edema marcado en la pared del colon de DSS-tratada versos animales de control, predominantemente localizados en la submucosa (Figura 2 C flecha gris). Correspondiente imágenes de contraste de fase cuantitativa DHM y mapas de índice de refracción relacionados recuperados por la Ecuación 1, también se representa las alteraciones de los tejidos antes mencionados. Además, el índice de refracción, codificado a 256 niveles de gris, indicó diferencias en la densidad en las capas de tejido, incluyendo el epitelio (flecha blanca) y el estroma (flecha negro) en muestras de tejido nativo, no teñidas (Figura 2 C). El índice de refracción se redujo significativamente en el epitelio, así como en la submucosa y el estroma de los ratones colíticos en comparación con los controles sanos (Figura 2 E). Además, se pudo observar una correlación significativa entre el parámetro clínico (pérdida relativa de peso corporal) y el parámetro físico absoluto (índice de refracción) (R 2 lineal = 0,64; Figura 2 D, adaptado de 19).

Evaluación de la enfermedad de Crohn en los seres humanos por DHM

la enfermedad de Crohn se identifica a menudo por notables alteraciones inflamatorias de la pared intestinal, detectadas por endoscopia gastrointestinal. características macroscópicas características forman parte de granularidad de la superficie de la mucosa, úlceras longitudinales con exudat fibrinaiones (también referido como "rastros de caracol") y sangrado espontáneo (Figura 3 A). La evaluación histológica de SE tinción de muestras de tejido de pacientes con EC activa menudo revelan la pared del colon, así como edema de la submucosa. Correspondientes imágenes de contraste de fase cuantitativa DHM y mapas de índice de refracción relacionados recuperados por la Ecuación 1 también detectada-inflamatoria mediada por la mejora / inflamación de la pared del colon, visto aquí en el epitelio (Figura 3 B). Además, el índice de refracción como un parámetro absoluto, también se redujo significativamente en todas las capas de pared (epitelio, submucosa y estroma) en muestras de tejido del colon de pacientes con EC activa versos aquellos en remisión (Figura 3 C).

Monitorización multimodal de la curación de heridas in vitro

Caco-2 células cicatrización de la herida los ensayos se realizaron usando un plato especial Petri para proporcionar condiciones estandarizadas. El plato está equipado con un inserto de cultivo formando dos cámaras diferentes, que están separadas por un hueco de 500 micras (Figura 4 A). Para simular diferentes ambientes fisiológicos, se examinaron las células, bien sin tratamiento, estimulada por el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o inhibido con mitomicina c. La configuración DHM permite la monitorización continua de la herida proceso en el tiempo de curación, representado aquí por imágenes representativas cuantitativos DHM contraste de fase (codificados a 256 niveles de gris) después de 0, 22,5 y 45 h después del inicio del experimento (Figura 4 B). Correspondientes parcelas de pseudo 3D con código de colores falsos en la Figura 5 ilustran el desarrollo espacial del espesor de la capa de células en tres dimensiones. Sobre la base de la demora longitud del camino óptico, el índice de refracción celular y las ecuaciones 2 y 3, DHM permite la evaluación dinámica simultánea de la migración, la proliferación y la morfología mediante la monitorización temporal de características celulares tales como célula cubierta área de superficie, el espesor medio de celda y de la masa en seco celular ( Figura 4 C). En resumen, los datos de la Figura 4 ilustran que los resultados de simulación EGF en una migración más rápida de las células en el área de la herida, en un espesor medio de celda incrementado y en una masa seca más alto en el campo de visión en comparación con las células control. Por el contrario, mitomicina C cubren células inhibidas una disminuyó ligeramente área de superficie que las células de control durante el curso del experimento y también muestran un aumento ligeramente menor masa seca. Sin embargo, el espesor medio de celda aparece disminuyó claramente en comparación con ambos, y estimuló las células de control.


Figura 1. Utilizada de configuración fuera de eje para Digital holográfica Microscopía (DHM). Configuración esquemática de la estación de trabajo DHM (A). Correspondiente fotografía que representa la configuración del microscopio (monitor, la imagen en vivo y software de control (1), microscopio digital de configuración fuera del eje (2), (B), el camino óptico del microscopio (verde línea de puntos) y una muestra (indicado por el rojo flecha; (C)). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
La Figura 2. Evaluación de la colitis inducida por DSS murino por DHM. El curso de la colitis fue seguido por mí todos los díasasurement de peso corporal relativo y endoscópica examen de seguimiento repetido. Una pérdida masiva de peso corporal relativo desde el día 4 después del inicio de la administración de DSS (adaptado de 19) (A) se acompaña de signos endoscópicos de colitis crónica, incluyendo ulceraciones focales y la vulnerabilidad de la mucosa (B). El análisis de secciones teñidas con HE cryostatic convencionales reveló un edema submucoso, el engrosamiento de la capa muscular y un infiltrado inflamatorio de la mucosa pronunciada en la mucosa. Correspondiente imágenes de contraste de fase cuantitativa DHM y mapas de índice de refracción relacionados recuperados por la Ecuación 1 (codificado a 256 niveles de gris) confirmó los cambios edematosos de la submucosa durante el proceso inflamatorio (flecha blanca indica epitelio, submucosa gris y negro estroma) (C). La pérdida relativa de peso corporal (un parámetro clínico) se correlacionó significativamente con el índice de refracción (un parámetro físico absoluta, R2 = 0,6 lineal4; (D), adaptado de 19), que se redujo de manera significativa en el epitelio como en la submucosa y el estroma de los ratones colíticos en comparación con los controles sanos (media ± SEM, *** P <0,001;. E) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Evaluación de la Enfermedad de Crohn en humanos por DHM. Muestras de tejido del colon de pacientes con enfermedad de Crohn por vía endoscópica e histológicamente confirmado fueron examinados (A). HE-tinción representada alargamiento de criptas de la mucosa y un infiltrado marcado de células inflamatorias. Además, se detectó edema de la submucosa y la ampliación de la muscular propia. Análisis de corrESPONDER imágenes de contraste de fase cuantitativa DHM y mapas de índice de refracción relacionados recuperados por la Ecuación (1) (codificado a 256 niveles de gris) también reveló cambios edematosos (aquí marcados con una estrella blanco y negro) en el epitelio (B). No se detectaron diferencias significativas en el índice de refracción promedio en las muestras de pacientes con EC activa, con un toque (barras claras) o la remisión (barras negras). Se observan estas diferencias en cada tipo de tejido (media ± SEM, *** P <0,001; C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Seguimiento del epitelial Curación de Heridas por White Light Microscopy y DHM. Las células cultivadas fueron transferred en placas de Petri con insertos especiales (flecha roja). Antes se retiraron insertos de cultivo, las células se trataron con EGF o mitomicina C durante 24 horas, o se trataron con medio solo (control no estimulado) (A). Después de la eliminación de insertos de cultivo, la curación de heridas se monitorizó continuamente mediante formación de imágenes de contraste de fase por DHM en el tiempo. contornos celulares podrían ser claramente reconocidos. Representativos imágenes de contraste de fase cuantitativa DHM se muestran al principio del experimento, después de 22,5 h, y al final de la medición después de 45 hr (B). El panel (C) muestra los correspondientes cambios temporales en la superficie cubierta por células (S c), el espesor medio de las celdas (células D) y el celular de masa seca (MS). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


La Figura 5. Ilustración de la capa de células de morfología Los cambios por los falsos codificados por colores Pseudo 3 parcelas D del contraste Imágenes cuantitativa DHM fase. Codificadas por colores falsos representativos parcelas de pseudo 3D de las imágenes de contraste de fase cuantitativa DHM en la figura 4B en t = 0, después de 22,5 horas y se al final de la medición después de 45 horas, ilustran el desarrollo espacial del espesor de las capas de células de control-, mitomicina C-inhibido y las células estimuladas con EGF en 3D. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Demostramos que DHM proporciona una evaluación precisa del daño histológico en modelos murinos de colitis y muestras de tejido del colon humanas ex vivo. Además, hemos demostrado DHM puede monitorizar de forma continua la curación de heridas epiteliales mismo tiempo, proporcione información multimodal sobre las alteraciones celulares. En DHM, la reconstrucción de hologramas capturadas digitalmente se realiza numéricamente 32. Por lo tanto, en comparación con la microscopía de campo claro, contraste de fase Zernike y diferencial microscopía de contraste de interferencia, DHM proporciona contraste de fase cuantitativa con la opción numérica posterior corrección de enfoque (de imágenes multi-enfoque) 27. Fase cuantitativa de imágenes se basa en la determinación de los cambios de longitud del camino óptico y por lo tanto es altamente independiente del dispositivo de medición utilizado. Esto simplifica la comparación de los datos de medición que se adquieren con diferentes instrumentos. Además, DHM requiere sólo baja intensidad de luz para los objeiluminación ct. Esto permite un análisis mínimamente invasivo de tejidos disecados no teñidas y reduce al mínimo la cantidad de interacción de la muestra requerida durante las observaciones de lapso de tiempo a largo plazo de las células vivas.

El arsenal terapéutico para la EII se ha ampliado considerablemente en las últimas dos décadas. Además de la introducción de terapias de TNF-α anti, que son eficaces tanto en la UC y CD y tienen perfiles de efectos secundarios aceptables, novedosos y anticuerpos específicos dirigidos a las integrinas se introdujeron recientemente en la práctica clínica 34-37. Varios otros agentes prometedores están siendo evaluados para su eficacia terapéutica en la EII 38-40. Sin embargo, antes de la utilización clínica en seres humanos, la eficacia y seguridad de estos posibles terapias tiene que ser demostrado en estudios con animales. La colitis inducida por DSS es uno de los modelos de colitis murinos de uso más frecuente, debido a su alta reproducibilidad y bajos costes de 23. Además, este modelo puede colasí que se aplica a los ratones genéticamente alterados cepas 41. Mientras que los marcadores sistémicos, por ejemplo, PCR, son muy variables en los modelos animales, la evaluación histológica de los dos puntos representa el enfoque más válido para evaluar la gravedad de la enfermedad 42,43. Sin embargo, la evaluación cuantitativa de la inflamación histológica de acuerdo a los sistemas de puntuación depende de la experiencia investigadora y experiencia ampliamente. Evaluación y puntuación automatizada de parámetros objetivos como sea posible con DHM supera estas limitaciones, y además es también el ahorro de tiempo, evitando la necesidad de teñir 19. Además, DHM puede ser utilizado para examinar especímenes colónicos quirúrgicos, así como muestras de mucosa obtenidos durante la endoscopia.

la regeneración epitelial y la curación de heridas es un mecanismo fundamental en varios procesos patológicos incluyendo ulceración gastrointestinal o dehiscencia de la anastomosis. Si bien no son prometedores enfoques para evaluar la cicatrización de la herida epitelial en vivo 44, estas técnicas requieren herramientas sofisticadas y de examen son actualmente no están ampliamente disponibles. Por lo tanto, actualmente la curación epitelial se investiga habitualmente por los ensayos de cero in vitro 9. Estos ensayos permiten el examen válida de cierre de la herida, pero por lo general requieren en primer lugar la tinción de las células, que a su vez evita la evaluación 10,45 repite. Además, no hay datos de alteración celular pueden ser adquiridos en paralelo con esta configuración experimental. Sin embargo, esta información puede ser de gran importancia ya que se puede utilizar para diferenciar entre la apoptosis y la necrosis 46 y para evaluar la proliferación celular y la migración 46. Por lo tanto, la posibilidad de determinar el espesor de la célula, masa seca o la densidad del tejido simultáneamente con el seguimiento de cierre de la herida mediante el examen DHM es de gran valor en la investigación de la mucosa.

Los objetivos del tratamiento para los pacientes con EII humanos han sido constantemente cambiando en las últimas décadas <sup> 47. Aunque en un principio el control de la inflamación fue considerado para ser de primera importancia, después remisión esteroide libre y ahora curación de la mucosa son principales objetivos del tratamiento 48. Recientemente, se planteó la hipótesis de que la remisión histológica puede ser incluso superior a la curación de la mucosa solo 49. Sin embargo, aunque hay algunos sistemas de puntuación histológicos disponibles para la EII humana, la variabilidad entre observadores se mantiene elevada 50. Por lo tanto, hay una necesidad de un enfoque estandarizado para la evaluación de las muestras de colon histológicos. DHM puede contribuir a este objetivo y debe ser evaluado en un ensayo clínico prospectivo con pacientes con EII humanos.

En el procedimiento experimental presentado, las muestras se iluminan y la imagen usando luz láser altamente coherente. Por lo tanto, la resolución en DHM está limitada principalmente por la dispersión y difracción efectos de luz causados ​​por la desalineación de la iluminación de la muestra, muestras gruesas, polvo ootras impurezas tales como el agua condensada en el camino óptico. Con el fin de lograr los datos de medición de alta precisión a partir de imágenes cuantitativas de fase DHM contraste, una preparación cuidadosa y la alineación de la configuración DHM y la muestra son los pasos más importantes en el protocolo. Limpiado a fondo los elementos de imagen óptica, en particular el objetivo de condensador del microscopio y microscopio, se requieren para minimizar el ruido. También diapositivas de muestra portador, Petri tapa de la placa y la parte inferior, así como el medio de cultivo celular utilizado debe estar libre de impurezas de partículas. Esto se logra limpiando cuidadosamente todos los componentes y el filtrado adecuado de los líquidos aplicados.

consejos más detallados solución de problemas son las siguientes: si el holograma digital y / o las imágenes cuantitativas de fase DHM de tejidos disecados son ruidosos, el soporte de vidrio y la hoja de la cubierta pueden estar contaminados con polvo. Si es así, limpie el soporte de vidrio y la hoja de la cubierta con el alcohol (por ejemplo, etanol puro). Si el espesordad de tejido diseccionado es demasiado grande (> 10 m) y da lugar así a la dispersión de luz, pruebe a utilizar las secciones de tejidos finos. En el caso de que la iluminación con luz láser no se distribuye homogéneamente, alinear la iluminación del objeto a través del condensador de microscopios. Si se condensa el agua en la parte inferior de la tapa de vidrio induce efectos de dispersión, comprobar la temperatura de la cámara de calentamiento y la humedad ambiente. En caso de que la densidad celular es el crecimiento demasiado alta o celular en más de una capa, reducir la densidad de las células durante la preparación de ensayos de curación de heridas. Por último, como DHM se basa en el principio de la interferometría, el método es sensible a las vibraciones u otras perturbaciones mecánicas, que varían de acuerdo con el entorno de laboratorio individual. Sin embargo, tales influencias por lo general se pueden minimizar los tiempos de exposición elegido adecuadamente (típicamente en el rango de milisegundos o menos) para la grabación de la holografía durante la preparación de la configuración experimental.

En resumen, Nuestros resultados demuestran que DHM tiene grandes ventajas sobre técnicas de campo brillante y de imágenes de microscopía de contraste de fase existentes, tales como de contraste de fase Zernike y DIC debido a su capacidad para evaluar cuantitativamente la inflamación histológica ex vivo de una manera casi automática. Además DHM permite etiqueta libre de evaluación multimodal continuo de curación de la herida epitelial in vitro con la interacción minimizado con las muestras. Esto allana el camino para el examen histológico automatizado en términos de '' la patología digital '' y más estudios prolongados para explorar el potencial de traslación de DHM en pacientes con EII. Además, DHM ofrece novela in-vitro oportunidades para estudiar cuantitativamente la migración celular, la morfología y la proliferación.

La traducción de DHM en la práctica clínica tiene el potencial de mejorar el diagnóstico de EII. Como DHM permite la cuantificación de diferentes grados de inflamación intestinal a travésparámetros físicos como los cambios de densidad, una evaluación objetiva y más precisa de la enfermedad en el sentido de un "patología digital" parece posible. La evaluación objetiva puede tener un impacto importante en el manejo clínico de los pacientes con EII.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Azoxymethane (AOM) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany A5486
Cell Culture Flask Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 658170
Costar Stripette Corning Inc., New York, USA 4488
Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
DMEM/Ham's F12 PAA Laboratories - Pasching - Austria E15-813
EGF Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany SPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
Falcon Tube 50 ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070
Isopentane (2-Methylbutane) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M32631-1L
Methylene blue Merck, Darmstadt, Germany 1159430025
Mitomycin C Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M4287
Microscope Slides G. Menzel, Braunschweig, Germany J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583
Pen/Strep/Amphotericin B Lonza, Verviers, Belgium 1558
Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
RPMI 1640 Lonza, Verviers, Belgium 3626
Sodium Chloride 0.9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
Trypsin EDTA Lonza, Verviers, Belgium 7815
Vitro – Clud R. Langenbrinck, Teningen, Germany 04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high ibidi GmbH, Munich, Germany 81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert ibidi GmbH, Munich, Germany 80050
Equipment
MICROM HM550 Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA 46320
Digital holographic microscope
Component Model Company
Inverted Microscope iMIC Till Photonics, Graefelfing, Germany
Laser Compass 315M Coherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lens Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 Zeiss, Goettingen, Germany
CCD camera DMK 41BF02 The Imaging Source, Bremen, Germany

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