Multimodal Kvantitativ fas Imaging med Digital Holographic Microscopy Bedömer Noggrant tarminflammation och epitelceller sårläkning

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lenz, P., Brückner, M., Ketelhut, S., Heidemann, J., Kemper, B., Bettenworth, D. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54460, doi:10.3791/54460 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Förekomsten av inflammatorisk tarmsjukdom, det vill säga, Crohns sjukdom och ulcerös kolit, har ökat kraftigt under det senaste decenniet. Etiologin för IBD är okända och nuvarande terapeutiska strategier är baserade på den ospecifika undertryckande av immunsystemet. Utvecklingen av behandlingar som specifikt riktar tarminflammation och epitel sårläkning skulle avsevärt förbättra förvaltningen av IBD, men detta kräver noggrann detektering av inflammatoriska förändringar. För närvarande är potentiella läkemedelskandidater vanligtvis utvärderas med hjälp av djurmodeller in vivo eller med cellodlingsbaserade tekniker in vitro. Histologisk undersökning kräver oftast cellerna eller vävnaderna av intresse att färgas, som kan förändra prov egenskaper och dessutom kan tolkningen av resultaten varierar med utredare expertis. Digitala holografiska mikroskopi (DHM), baserat på detekteringen av optisk fördröjnings väglängd, tillåterfläck-fri kvantitativ faskontrastbildframtagning. Detta gör att resultaten är direkt korrelerad med absoluta biofysiska parametrar. Vi visar hur mätning av förändringar i vävnadsdensitet med DHM, baserat på brytningsindexmätning, kan kvantifiera inflammatoriska förändringar, utan färgning, i olika skikt av kolon vävnadsprover från möss och människor med kolit. Dessutom visar vi kontinuerlig multimodala etikett fri övervakning av epitelial sårläkning in vitro, möjligt med DHM genom den enkla automatiserade bestämningen av de sårade området och samtidig bestämning av morfologiska parametrar såsom torr massa och tjocklek av migrerande celler. Sammanfattningsvis, DHM utgör en värdefull, ny och kvantitativa verktyg för bedömning av tarminflammation med absoluta värden för parametrar möjliga, förenklade kvantifiering av epitel sårläkning in vitro och har stor potential för translationell diagnostisk u därförse.

Introduction

Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), dvs, Ulcerative Colitis (UC) och Crohns sjukdom (CD) är idiopatiska inflammatoriska sjukdomar i mag-tarmkanalen 1. Forskning om den underliggande patofysiologi IBD och utvärdering av potentiella nya läkemedel eller nya diagnostiska metoder är särskilt viktigt. I både grundforskning och klinisk behandling av IBD-patienter, har tarmslemhinnan hamnat i fokus för uppmärksamheten 2,3. Slemhinnan representerar en anatomisk gräns, vid vilken interaktionen mellan bakteriefloran, epitelceller och olika cellulära komponenter i tarmimmunsystemet orchestrate gut homeostas 4,5. Men i IBD-patienter, leder okontrollerad och ihållande tarminflammation till mukosala skador upptäckas som sårbildningar eller stenos, som slutligen kan kulminera i nedbrytning av epitelial barriärfunktion, vilket i sin tur förvärrar lokal inflammation 6.

7. Epitel sårläkning kan simuleras in vitro sårläkningsanalyser och i musmodeller av tarminflammation 8,9. Både in vitro och in vivo metoder har nackdelar, som begränsar riktigheten i experimentell utvärdering. In vitro-analyser, som klassiska skrap analyser kräver utdragna förfaranden färgning eller transfektion med fluorescerande kromoforer. De är ofta begränsas av deras diskontinuerliga övervakning av celltillväxt och migration som inte kan automatiseras 10. In vivo-modeller, såsom dextran natriumsulfat (DSS) -inducerad kolit, ofta saknar robusta avläsningar, delvis på grund av den betydande variation sett i laboratoriemarkörer, making sådana markörer olämpliga att utvärdera kolit svårighetsgrad 11,12. Histologisk analys av den inflammerade slemhinnan är för närvarande fortfarande den mest effektiv strategi för att bestämma kolit svårighetsgrad, men detta, liksom in vitro epitelceller sårläkningsanalyser kräver färgning och är beroende av utredare kompetens 13.

Nyligen digital holografisk mikroskopi (DHM), en variant av kvantitativ fas mikroskopi 14, identifierades som användbart verktyg för utvärdering av epitel sårläkning in vitro och in vivo 15. DHM tillåter bedömning av vävnad densitet genom att mäta fördröjning optisk våglängd (OPD) , som prospekterar nya cancerdiagnosen 16-18 och kvantifiering av inflammation relaterade vävnadsförändringar 19. Dessutom, DHM tillåter övervakning av cellmorfologin dynamik genom att bestämma celltjockleken, cell täckt yta och intracellulära (protein) innehåll kvantitet in vitro-analyser, DHM gör det också möjligt att analysera fysiologiska processer, till exempel, cellulär vattenpermeabilitet genom att utvärdera förändringar i cellvolym och tjocklek 21,22. Dessutom kan DHM mätningar automatiseras vilket förhindrar utredare associerade prov partiskhet.

Här visar vi användning av DHM i en musmodell av tarminflammation, och gäller även DHM analys av mänskliga vävnader prover för kvantitativ övervakning av sårläkning som en etikett fritt in vitro-analys. Först utvärderar vi inflammatoriska förändringar av olika kolon vägg lager i colitic möss och vävnadssnitt från människor med IBD. Efter beskriver DHM kvantitativ fas avbildningsproceduren tillhandahåller vi detaljerade instruktioner för att använda mikroskop komponenter, framställning av vävnadssnitt och även beskriva utvärdering av de förvärvade kvantitativa fas bilder.

Därefter visar vi att DHM kan vara UVIseras för kontinuerlig multimodala övervakning av epitel sårläkning in vitro, och beskriver analys av cellulära egenskaper som cellskikttjocklek, torrvikt och cellvolym ger inblick i läkemedelsinducerad och fysiologisk cellförändringar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök har godkänts av den regionala etiska kommittén (Lande für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Tyskland) enligt den tyska djurskyddslagen. Den lokala etiska kommittén vid universitetet i Münster godkänt användningen av mänskliga vävnader för histologisk och mikroskop analys.

1. Djur och material

  1. Använd hona eller hanmöss av önskad DSS-känslig stam som väger 20 till 25 g, och huset enligt lokal lagstiftning djurvård. Ge särskild chow för gnagare och autoklaveras dricksvatten efter behag.
  2. Inducera akut DSS kolit genom administrering 3% vikt / vol dextransulfat natrium (DSS, molekylvikt: 36,000-50,000 Da) i autoklaverat kranvatten under 5 dagar.
    OBS: Potensen hos DSS är mycket varierande beroende på tillverkare och batch. Testa din leverantör tillhandahållna DSS först för induktion av sjukdomsaktivitet, där daily kroppsvikt är en tillförlitlig och objektiv indikator.
  3. För histologisk utvärdering av kolon vävnadsprover, avliva möss av CO 2 insufflation (eller i enlighet med nationella och institutionella riktlinjer) vid slutet av experimentet.

2. experimentuppställning för DSS-kolit och In vitro Sårvård Analyser

  1. Cellodling och etablering av sårläkning analys.
    1. Växa Caco-2-celler i en 95% fuktighet och 5% CO2 miljö vid 37 ° C. Använd RPMI-medium med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin.
    2. Seed Caco-2-celler vid en densitet av 4 x 10 5 celler / cm 2 på 35 mm petriskålar med hög kultur-insats (se figur 4A).
      OBS: Insatsen genererar två celltäckta områden som är separerade med en definierad cellfritt utrymme som representerar den skadade området som skall analyseras.
    3. Ändra medel två dagar efter seeding. Utföra genom att först aspirera rester medium med cellfragment genom användning av en automatisk pipett, skölj med 100 | j, l av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt färskt RPMI-medium eller serum-berövat medium.
    4. Odlingsceller under 24 h i serum berövat medium (0,1% FBS) utökat med 20 ng EGF / ml serum eller 2 | ig mitomycin c / ml serum för att detektera förändringar i sårläknings beteende. Lägga normal RPMI-medium med kontrollceller under 24 h.
    5. Efter 24 timmar av kultur, ta bort och kasta kulturinsatser som beskrivs i steg 3,4 och utföra DHM.
  2. Induktion av akut DSS kolit
    1. Lös 3 g DSS i 100 ml autoklaveras vatten för att få en 3% (vikt / volym) DSS-lösning. Tillhandahålla denna lösning i stället för dricksvatten, till möss ad libitum i 7 dagar. Beräkna 5 ml DSS-lösning per mus / dag. Ge autoklaverat vatten utan DSS för kontrollmöss efter behag.
  3. Framställning av cryostatic sektioner av murina och humana kolon
    1. Avliva möss genom CO 2 insufflation vid slutet av experimentet.
    2. Dissekera djurens buken genom laparotomi 23. Ta bort hela tjocktarmen försiktigt med pincett och skär ileal och rektal ände med hjälp av kirurgisk sax. Skär kolon med en sax i längdled från cecal till rektal änden och öppna kolon. Ta bort alla avföring från provet med hjälp av pincett, följt av tvättning med PBS 24.
    3. Förbereda rulltårta genom att rulla upp hela kolon med en bomullstopp i längdriktningen från cecal till den rektala änden med slemhinnan böjda inåt. Bädda in colonic prover i optimal skärtemperatur (oktober) förening och hålla fryst vid -80 ° C tills vidare användning.
    4. Bädda in human kolonvävnad från kirurgiska förlagan i optimal skärtemperaturen oktober förening och hålla frystes vid -80 ° C tills vidare användning.
    5. Cut sektioner av 7 pm tjocklek av oktober sammansatta inbäddade prover med hjälp av en cryotomig strax före undersökning.
      OBS: Den optimala provtjockleken beror på uthållighet och spridningsegenskaper vävnadstypen under utredning. För de beskrivna experiment med användning av kolonvävnad, skivtjocklek> 10 mikrometer orsakar betydande ökning av buller på grund av ljusspridning i kvantitativa DHM fas kontrastrika bilder, medan prover av tjocklek <5 pm visar en högre risk för skador inducerade artefakter från Cryo styckningen.
    6. Överför sektioner på en glasföremål bärare slide.

3. Teknisk utrustning, programvara och förfaranden för förvärv och utvärdering av digitala Hologram

  1. Digitala holografiska mikroskopet för kvantitativ cell- och vävnads imaging
    1. Använda en off-axis Mach-Zehnder-digitala holografiska mikroskopi system för levande cell imaging 25, såsom visas i figur 1. Se till att Mikroskopet är utrustat med en10X mikroskop lins, ett mikroskop scenen med en hållare för glasföremål bärare diabilder och petriskålar med en diameter på 35 mm, till en värmekammare bevara fysiologisk temperatur vid 37 ° C och programvara för kvantitativ fas avbildning 25.
      OBS: Till exempel, såsom beskrivs i et al Kemper 26 och Langehanenberg et al 27...
      OBS: Du kan också använda ett liknande system som är i stånd att utföra ljusfältsmikroskopi och kvantitativ fas avbildning av levande celler och dissekerade vävnad diabilder.
    2. Ren mikroskop lins och kylare med linsrengöringspapper och rengöringsmedel (t.ex. etanol) som rekommenderas av tillverkaren av mikroskop för att ta bort damm eller andra föroreningar.
    3. Starta bilden förvärvet programvara för DHM mikroskop, välj "ljusa fält" imaging läge och switch "på" vitt ljus belysning. Se Köhler-illumintion av provet som rekommenderas av mikroskopet tillverkaren med iakttagande provet i levande avbildning fönstret i bilden förvärvet programvara (alternativt en standardbild förvärv programvara kan användas i detta steg).
      OBS: Bilden intensitet bör fördelas homogent i synfältet och provposition bör inte röra sig under optisk omfokusering med fokus drivningen av mikroskop.
    4. Välj "DHM" bildläget, stänga "av" vitt ljus belysning och switch "på" laserljuset. Kontrollera att belysning med laserljus är homogen (dvs att ljusintensiteten är homogent fördelad i levande avbildning fönstret i scanning programvaran för DHM mikroskop) och observera att den asymmetriska bäraren interferensfransmönster visas med tillräcklig kontrast i tagna bilder (digitala hologram).
  2. Framställning av kryostatsnitt för avbildningmed DHM
    1. Ta provet (kryostat avsnitt på en glasobjektbärare, tjocklek: 7 | j, m, såsom beskrivs i 2,3) ut ur frysen. Tina provet under ca 5 min vid RT och normal atmosfär.
    2. Lägga 50-100 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som inbäddningsmedium på vävnadssektionen med användning av en pipett tills den är helt täckt med buffert. Täck provet med en ren glastäckglas (glastjocklek 170 um).
      OBS: Över torkning kan inducera betydande förändringar av brytningsindex och spridningsegenskaper hos provet.
    3. Se till att botten av glasbäraren och locket glida rengörs från damm och andra föroreningar som kan inducera ljusspridning. Provet är redo för undersökning med ljusfältsmikroskopi och DHM.
  3. Kvantitativ fas avbildning av vävnadssnitt med DHM
    1. Slå på den digitala holografiska mikroskopet, välj 10X mikroskop objektiv för avbildning. Starta den i:mage förvärv programvara för DHM mikroskop och välj ljus fil bildläget.
    2. Placera vävnaden bilden som beskrivs i 2) i objektglas hållaren med locket glida mot mikroskop målet.
    3. Switch "på" den ljusa fält belysning av DHM mikroskop. Placera provet med mikroskop scenen och se till att vävnadsområdet av intresse är synlig i live övervakningsfönstret. Förbättra skärpan i bilden med hjälp av mikroskop fokus enhet.
      OBS: Förutom det intressanta området, bör ett område med bild utan vävnad också vara närvarande i synfältet.
    4. Fånga en ljust fält bild av skarpt fokuserade provet med hjälp av bilden förvärvet programvara.
    5. Välj "DHM" bildläget, stänga "av" det vita ljuset belysning och slå "på" laserljusbelysning. Välj "exponeringstiden" för holograminspelning under 3 ms, konstatera att holographic off-axeln interferensfransar visas med tillräcklig kontrast i levande avbildning fönster bild förvärv programvara och fånga en digital hologram.
    6. Upprepa steg 3.3.3 - 3.3.5 tills ett tillräckligt antal ljusa fält bilder och digitala hologram av olika provområden har registrerats. Hologram förvärv är nu klar.
  4. Framställning av sårläkning analyser för DHM avbildning
    1. Slå på petriskålen värmekammare DHM mikroskop ungefär 1-3 timmar före starten av experimentet för att säkerställa stabila temperaturförhållanden under DHM mätningarna.
    2. Förbereda arbetsbänk med nödvändig utrustning (petriskål för sårläknings analys beskrivs i 2,3): pipetter, pincett, glaslock för petriskål, 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) buffrat cellkulturmedium med fysiologisk temperatur (37 ° C) under provberedning i steril miljö.
      OBS! 3.
    3. Ta bort plastlocket från petriskål och avlägsna cellkulturmedium med en pipett. Ta bort insatsen från petriskålen botten med hjälp av en pincett.
    4. Tvätta provet 1 - 2 gånger med 1 ml HEPES-buffrad cellodlingsmedium för att avlägsna döda celler och återstående cellulära komponenter (t.ex. serum) i sårområdet. Tillsätt 2 ml HEPES-buffrad cellodlingsmedium och locket petriskålen med glaslock.
    5. Se till att glaslocket och petriskålen botten har rengjorts från damm och andra föroreningar. Prov är redo för tid förfaller observation med DHM.
  5. Kontinuerlig multimodal övervakning av sårläkning in vitro med DHM
    1. Slå på petriskålen värmekammare DHM mikroskop ca 1-3 h företill början av experimentet för att säkerställa stabila temperaturförhållanden under DHM mätningarna.
    2. Switch "på" den digitala holografiska mikroskopet, välj 10X mikroskop objektiv för avbildning. Starta bilden förvärvet programvara för DHM mikroskop och välj "ljust fält" bildläget. Se till att värmekammaren för petriskålen är i drift en fysiologisk temperatur (37 ° C).
    3. Placera petriskålen med sårläknings assay, framställd såsom beskrivs i 4), i uppvärmningskammaren för DHM mikroskop.
    4. Välj ljusa fält avbildning läge och placera provet med mikroskop scenen med iakttagande det i live-övervakningsfönstret av bilden förvärvet programvara för DHM mikroskop. Observera att det önskade området av provet kraftigt verkar fokuserade under vitt ljus belysning.
    5. Fånga ljusa fält bilder av olika områden av provet (sårområdet och omgivande områden med sammanflytande celler) under vittljus belysning med bilden förvärvet programvara och dokument utseende, celltäthet och homogenitet.
    6. Välj "ljust fält" bildläget i DHM mikroskop. Välj en lämplig sårområdet under vitt ljus belysning i live övervakningsfönstret med bilden förvärvet programvara för DHM mikroskop. Se till att sårområdet är fri från döda celler och inga serum lämningar, och se till att båda sidor omfattar en enda homogen cellskikt, företrädesvis med raka kanter.
    7. Fånga ett vitt ljus bild av den ursprungliga sårytan i ljusa fält bildläget med bilden förvärvet programvara för DHM mikroskop.
    8. Stäng "off" vitt ljus belysning, välj "DHM" läge och switch "på" laser belysning. Välj en exponeringstid på under 3 ms för hologram inspelning (observera att holografiska off-axis interferensfransar visas med tillräcklig kontrast i levande avbildning fönstret i bilden förvärvet programvara than DHM mikroskop) och fånga en digital hologram.
    9. Fånga en prov hologram i DHM läge med bilden förvärvet programvara och rekonstruera en kvantitativ fas bild med återuppbyggnaden programvaran i DHM mikroskop för att kontrollera bildkvaliteten.
    10. Välj en lämplig tidsfördröjning (t.ex. 3-5 minuter) för time-lapse hologram förvärv med bilden förvärvet programvara för DHM mikroskop.
    11. Välj tidsförlopp förvärvsläge för bilden förvärvet programvara i vilken provet endast belyses med laserljus under hologram förvärv.
    12. Starta tidsförlopp DHM observation av sårläknings analysen.
    13. Stoppa time-lapse förvärv efter avsedd tid, välj ljusa fält avbildning läge och dokumentera det slutliga utseendet av provet under vitt ljus avbildning.
  6. Rekonstruera digitala hologram av dissekerade vävnader och fastställa den genomsnittliga brytningsindex som en parameter för att kvantifieravävnadsdensitet
    1. Rekonstruera kvantitativa fas bilder från de digitala hologrammen av dissekerade vävnader med programvaran för DHM mikroskop, t.ex. som beskrivs i et al. Kemper 26 och Langehanenberg et al. 27.
    2. Bestäm den genomsnittliga faskontrast Δφ i olika vävnadsskikt (epitel, submucosa, stroma) i lämpligt valda områden av intresse (ROI) 19.
    3. Bestämma brytningsindex för inbäddningsmediet genom användning av en refraktometer eller alternativt genom användning av ett lämpligt värde från litteraturen. (brytningsindexvärden för typiska inbäddning media: n vatten = 1,334 28, n Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) = 1,337 29, n cellodlingsmedium = 1,337-1,339 29,30).
    4. Beräkna brytningsindexen för olika vävnadsskikt från det genomsnittliga faskontrast värden 19
      ekvation 1 OBS: I Eq. 1 λ är våglängden för laserljuset (här: λ = 532 nm), d tjockleken på dissekerade vävnader (här: 7 pm) och n mediet är brytningsindex för inbäddning medium (här: n medel = N PBS = 1,337, bestäms av en Abbe-refraktometer).
  7. Rekonstruera och utvärdera digitala hologram från tidsförlopp sårläknings serie observation
    1. Rekonstruera kvantitativa fas bilder från tiden förflutit hologramserien som erhållits under sårläkning observation med DHM mikroskop programvara 26,27.
    2. Normalisera varje serie av kvantitativa fas bilder till bilden med maximal kontrast fas.
    3. Bestäm arean S c som täcks av cellerna i de kvantitativa DHM fas bilder av bildsegmentering, som kan vara perbildas med hjälp av fri programvara cellprofilerare (www.cellprofiler.org 31).
    4. Beräkna den genomsnittliga faskontrast av celler Δφ cellen i området S c.
    5. Hämta den cellulära torrvikt DM från den genomsnittliga faskontrast Δφ cell i området S c 15
      ekvation 2 (2)
      OBS: I ekvation 2 DM betecknar den cellulära torrvikt, presenterar S c det område som upptas av cellerna och α = 0,002 m 2 / kg.
    6. Bestämma integralen cellulära brytningsindex n cell och brytningsindex för cellodlingsmediet n medium. Bestäm n cell separat experimentellt från suspenderade celler såsom beskrivits i 30 och mäta n medium med en refraktometer. Alternativt använda litteraturvärden för n cell 30 och n medel 29,30.
    7. Beräkna den genomsnittliga celltjockleken d cell från λ, Δφ cell, n cell och n medel 26,32
      ekvation 3 (3)
      OBS: I Eq. 3 parametern d cellen är den genomsnittliga celltjockleken, λ betecknar ljusets våglängd av laserljuset, betecknar Δφ cell den genomsnittliga faskontrast, och n cell och n mediet är integralen cellulära brytningsindex och brytningsindexet för det omgivande mediet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Typisk Setup för DHM Imaging för Digital Holografisk mikroskopi (DHM)

För att utföra ljusa fält avbildning och kvantitativ DHM faskontrastbildframtagning ansökte vi ett inverterat mikroskop som visas i figur 1 B. Systemet modifierades genom att fästa en DHM modul, såsom beskrivits tidigare 25. Digitala hologram alstrades genom belysning av provet med ljus av en frekvens-dubble Nd: YAG-laser λ = 532 nm) i Mach-Zehnder-konfiguration (figur 1 A). Dissekerade vävnader analyserades ex vivo på glasbärare diabilder. Levande cellodlingar observerades i speciella petriskålar för att observera sårläkning såsom visas i fig. 1 C. Proverna avbildades i transmissionsbelysning via en 10X mimikroskop lins (NA = 0,3) samt ett rör lins. En laddningskopplad anordning kamera användes för att registrera de interferensmönster (digitala off-axis hologram) som genereras genom överlagring av provbilden (objektvågen) med något lutande referensvågen. De digitalt fångade hologram rekonstruerades av rumslig fasförskjutning återuppbyggnaden i kombination med valfri holografisk autofokusering 26,33.

Bedömning av Murine DSS-inducerad kolit genom DHM

Akut kolit inducerades i möss genom administrering av 3% vikt / vol dextransulfat natrium (DSS) i dricksvatten under 5 dagar. Manifestationen och förlopp kolit följdes genom övervakning för progressiv viktförlust i DSS-behandlade gruppen jämfört med kontrollgruppen. (Figur 2 A anpassad från 19). Endoskopiskt, måttlig till svår colitis observerades såsom återspeglas av förtjockning av kolon väggen, förändringar av den vaskulära mönster (t.ex., spontana blödningar, röd pil), fibrin exudations (vit pil) och granularitet slemhinneytan (Figur 2B). Konventionell histologisk utvärdering av hematoxylin och eosin (HE) färgade kolon sektioner avslöjade markant ödem i kolon vägg DSS-behandlade verser kontrolldjur, främst belägna i submukosa (Figur 2 C grå pilen). Motsvarande kvantitativa DHM faskontrast bilder och tillhörande brytningsindexkartor hämtas av ekvation 1, avbildas även de ovan nämnda vävnadsförändringar. Dessutom, brytningsindex, kodad till 256 grånivåer, indikerade skillnaderna i täthet i vävnadsskikt inklusive epitelet (vit pil) och stroma (svart pil) i nativa, ofärgade vävnadsprover (Figur 2 C). Brytningsindex var signifikant reducerad i epitelet, såväl som i den submukosa och stroma av de colitic möss jämfört med de friska kontrollerna (Figur 2 E). Dessutom kunde en signifikant korrelation mellan den kliniska parameter (relativ förlust kroppsvikt) och den absoluta fysikalisk parameter (brytningsindex) (R2 linjär = 0,64; Figur 2 D, anpassad från 19).

Bedömning av Crohns sjukdom hos människor av DHM

Crohns sjukdom är ofta identifieras med anmärkningsvärda inflammatoriska förändringar i tarmväggen, som upptäckts av gastrointestinal endoskopi. Karakteristiska makroskopiska egenskaper består av granularitet slemhinneytan, längsgående sår med fibrin exudatjoner (också kallade "snigel spår") och spontan blödning (figur 3 A). Histologisk utvärdering av HE färgning av vävnadsprover från patienter med aktiv CD avslöjar ofta kolon vägg samt submukosala ödem. Motsvarande kvantitativa DHM fas kontrastrika bilder och tillhörande brytningsindex kartor hämtas av ekvation 1 detekterades även inflammatorisk-medierad förstärkning / svullnad i kolon väggen, här ses i epitel (Figur 3 B). Dessutom brytningsindex som en absolut parameter, reducerades också signifikant i alla vägglager (epitel, submucosa och stroma) i kolon vävnadsprover från patienter med aktiv CD verser de i remission (Figur 3 C).

Multimodal Övervakning av sårläkning in vitro

Caco-2-cell sårläkningsanalyser utfördes med användning av en speciell petriskål för att tillhandahålla standardiserade förhållanden. Skålen är försedd med en odlingsinsatsen bildar två olika kammare, vilka är åtskilda av ett gap på 500 | j, m (Figur 4 A). Att simulera olika fysiologiska miljöer ades celler undersökas antingen utan behandling, stimulerad av epidermal tillväxtfaktor (EGF) eller hämmas med mitomycin C. Den DHM inställning tillåter kontinuerlig övervakning av sårläkningsprocessen över tiden, skildras här genom representativa kvantitativa DHM fas kontrastrika bilder (kodade till 256 grå nivåer) efter 0, 22,5 och 45 timmar efter starten av experimentet (Figur 4 B). Motsvarande falska färgkodade pseudo 3D tomter i figur 5 illustrerar den rumsliga utvecklingen av cellskiktet tjocklek i tre dimåtten. Baserat på den optiska väglängden fördröjning, den cellulära brytningsindex och ekvationerna 2 och 3, tillåter DHM samtidig dynamisk bedömning av migration, proliferation och morfologi genom tidsmässig övervakning av cellulära egenskaper, såsom cell som täcks ytarea, genomsnittlig celltjocklek och cellulära torrvikt ( Figur 4 C). Sammanfattningsvis visar data i figur 4 illustrerar att EGF simuleringsresultat i en snabbare migrering av celler in i sårområdet, i en ökad medelcelltjocklek och i en högre torrvikt i synfältet jämfört med kontrollceller. I kontrast, mitomycin C inhiberade celler täcker en minskade något yta än kontrollceller under loppet av experimentet och visar också en något lägre torrvikt ökar. Dock verkar tydligt minskade den genomsnittliga celltjockleken jämfört med både, stimuleras och kontrollceller.


Figur 1. Utnyttjat Off-axis Setup for Digital Holografisk Mikroskopi (DHM). Schematisk uppställning av DHM arbetsstation (A). Motsvarande fotografi som visar mikroskop setup (monitor, sökarbilden och styrprogramvara (1), off-axis inställning digital mikroskop (2), (B), den optiska vägen för mikroskopet (grön streckad linje) och ett prov (indikeras med röd pil, (C)). klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Bedömning av Murina DSS-inducerad kolit av DHM. Förloppet kolit följdes genom daglig migasurement av relativ kroppsvikt och upprepas endoskopisk uppföljning undersökning. En massiv förlust av relativ kroppsvikt från dag fyra efter starten av DSS administration (anpassad från 19) (A) åtföljdes av endoskopiska tecken på etablerade kolit inklusive bränn sår och mucosal sårbarhet (B). Analys av konventionella HE-färgade cryostatic sektioner avslöjade submukosala ödem, förtjockning av muscularis och en uttalad mucosal inflammatoriskt infiltrat i slemhinnan. Motsvarande kvantitativa DHM fas kontrastrika bilder och tillhörande brytningsindex kartor hämtas av ekvation 1 (kodad till 256 grånivåer) bekräftade ödematösa förändringar av submucosa under den inflammatoriska processen (vita pilen indikerar epitel, grå submucosa och svart stroma) (C). Den relativa förlusten av kroppsvikt (en klinisk parameter) signifikant korrelerad med brytningsindex (en absolut fysisk parameter, R2 linjär = 0,64; (D), anpassad från 19), vilket avsevärt reducerades i epitelet samt i submukosa och stroma av de colitic möss jämfört med de friska kontroller (medelvärde ± SEM, *** P <0,001;. E) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Bedömning av Crohns sjukdom hos människor av DHM. Kolon vävnadsprover från patienter med endoskopiskt och histologiskt bekräftad Crohns sjukdom undersöktes (A). HE-färgning visas förlängning av slemhinnor kryptor och en markerad infiltrat av inflammatoriska celler. Vidare submukosal ödem och utvidgningen av muscularis propria detekterades. Analys av korresponding kvantitativa DHM fas kontrastrika bilder och tillhörande brytningsindex kartor hämtas av ekvation (1) (kodad till 256 grånivåer) avslöjade också ödematösa förändringar (här indikeras av en vit och svart stjärna) i epitel (B). Signifikanta skillnader i genomsnitt brytningsindex upptäcktes i prover från CD patienter med aktiv flare (tydliga staplar) eller eftergift (svarta staplar). Dessa skillnader ses i varje vävnadstyp (medelvärde ± SEM, *** P <0,001; C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Övervakning av Epithelial sårläkning genom White Light Microscopy och DHM. Odlade celler transferred i petriskålar med särskilda insatser (röd pil). Innan odlings skär avlägsnades, behandlades celler med antingen EGF eller mitomycin C under 24 h, eller behandlas med enbart medium (ostimulerade kontroller) (A). Efter avlägsnande av odlingsinsatser, var sårläkning kontinuerligt övervakas av faskontrast avbildning av DHM över tiden. Cell konturer kan identifieras. Representativa kvantitativa DHM fas kontrastrika bilder visas i början av experimentet, efter 22,5 timmar och i slutet av mätningen efter 45 timmar (B). Panel (C) visar motsvarande tidsmässiga förändringar i celltäckta yta (S c), den genomsnittliga celltjockleken (d cell) och den cellulära torrvikt (DM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 5. Illustration av cellskikt Morfologi Förändringar av falska Färgkodade Pseudo 3 D Tomter av de kvantitativa DHM faskontrast bilder. Representativa falska färgkodade pseudo 3D tomter av de kvantitativa DHM fas kontrastrika bilder i figur 4B vid t = 0, efter 22,5 timmar och i slutet av mätningen efter 45 timmar, visar den fysiska utvecklingen av tjockleken av cellskikt för styrning, mitomycin C-inhiberade och EGF-stimulerade celler i 3D. klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi visar att DHM ger noggrann bedömning av histologiska skador i murina kolit modeller och kolon vävnadsprover ex vivo mänskliga. Dessutom är vi visat DHM kan kontinuerligt övervaka epitel sårläkning samtidigt som man multimodal information om cellulära förändringar. I DHM är återuppbyggnaden av digitalt fångade hologram utförs numeriskt 32. Därför, i jämförelse med ljusfältsmikroskopi, Zernike faskontrast och differentialinterferenskontrast mikroskopi, erbjuder DHM kvantitativ faskontrast med valfri efterföljande numeriska fokuskorrigering (multi-fokus imaging) 27. Kvantitativ fas avbildning baserad på fastställandet av optiska förändringar väg längd och därmed är mycket oberoende av mätanordningen utnyttjas. Detta förenklar jämförelsen av mätdata som förvärvas med olika instrument. Dessutom kräver DHM endast låg ljusintensitet för OBJEct belysning. Detta möjliggör en minimalinvasiv analys av ofärgade dissekerade vävnader och minimerar mängden prov interaktion krävs under långa tidsförlopp observationer av levande celler.

Den terapeutiska arsenal för IBD har väsentligt breddat under de två senaste decennierna. Förutom införandet av anti TNF-α terapier, som är effektiva i både UC och CD och har acceptabla biverkningsprofiler, nya och specifika antikroppar inriktade integriner har nyligen införts i klinisk praxis 34-37. Flera andra lovande medel utvärderas för närvarande för deras terapeutiska effekt i IBD 38-40. Men innan den kliniska användningen i människor, har effekt och säkerhet av dessa potentiella behandlingar som skall bevisas i djurstudier. DSS-inducerad kolit är en av de mest frekvent använda murina kolit modeller, beroende på dess höga reproducerbarhet och låga kostnader 23. Dessutom, denna modell kan alså tillämpas på genetiskt förändrade möss stammar 41. Medan systemmarkörer, till exempel, CRP, är mycket varierande i djurmodeller, histologisk bedömning av tjocktarmen är den mest giltig metod för att bedöma sjukdomens svårighetsgrad 42,43. Ändå är kvantitativ utvärdering av histologiska inflammation enligt poängsystem starkt beroende av utredare kompetens och erfarenhet. Automatiserad bedömning och poängsättning av objektiva parametrar som möjligt med DHM vinner dessa begränsningar, och dessutom är också tidsbesparande, undvika behovet av färgning 19. Vidare kan DHM användas för att undersöka kirurgiska colonic prover samt mukosa prover erhållna under endoskopi.

Epiteliala förnyelse och sårläkning är en central mekanism under flera patologiska processen inklusive gastrointestinala sår eller anastomotic läckage. Även om det är lovande metoder för att bedöma epitelial sårläkning i vivo 44, dessa tekniker kräver sofistikerade undersökningsverktyg och är för närvarande inte allmänt tillgängliga. Därför närvarande epitel läkning vanligtvis undersökts av skrap analyser in vitro 9. Dessa analyser medger giltig undersökning av sårläknings men oftast först kräver cellfärgning, som sedan förhindrar upprepad utvärdering 10,45. Dessutom kan inga celländringsdata förvärvas parallellt med detta experimentuppställning. Emellertid kan denna information vara av stor betydelse, eftersom det kan användas för att skilja mellan apoptos och nekros 46 och för att bedöma celltillväxt och migration 46. Därför möjligheten bestämma celltjocklek, torrvikt eller vävnadsdensiteten samtidigt till övervakningen av sårtillslutning av DHM undersökning är av stort värde i mucosal forskning.

behandlingsmål för humana IBD-patienter har ständigt förändras under de senaste årtiondena <sup> 47. Även initialt kontrollen av inflammationer ansågs vara av största vikt, senare steroid remission och nu slemhinneläkning är primära mål för behandling 48. Nyligen visade det en hypotes att histologisk remission och med kan vara överlägsen enbart 49 slemhinneläkning. Men samtidigt som det finns några histologiska poängsystem som human IBD förblir mellan observatör variabilitet hög 50. Därför finns det ett behov av ett standardiserat tillvägagångssätt för utvärdering av histologiska kolon prover. DHM kan bidra till detta mål och bör utvärderas ytterligare i en prospektiv klinisk studie med humana IBD-patienter.

I den experimentella proceduren presenteras, är proven belyses och avbildas med hjälp av mycket koherent laserljus. Därför är upplösningen i DHM huvudsakligen begränsas av ljusspridning och diffraktion effekter som orsakas av felaktig inriktning av provbelysning, tjocka prover, damm ellerandra föroreningar, såsom kondenserat vatten i den optiska banan. För att uppnå uppgifter mycket exakta mätningar från kvantitativa DHM fas kontrastrika bilder, noggranna förberedelser och anpassning av DHM installationen och provet är de viktigaste stegen i protokollet. Rengöras noggrant optiska avbildningselement, i synnerhet mikroskop kondensor och mikroskopobjektiv, krävs för att minimera buller. Även provbärare diabilder, petriskål lock och botten, samt utnyttjad cellodlingsmediet bör vara fri från partikelföroreningar. Detta uppnås genom omsorgsfull rengöring alla komponenter och tillräcklig filtrering av de applicerade vätskor.

Närmare felsökningstips är följande: om det digitala hologrammet och / eller kvantitativa DHM fas bilder av dissekerade vävnader är bullriga, kan glasbärare och täckglas vara förorenade med damm. Om så är fallet, rengör glasbärare och täckglas med alkohol (t.ex. ren etanol). Om den tjockaness dissekerade vävnad är för stor (> 10 um) och därmed resulterar i ljusspridning, prova att använda tunnare vävnadssnitt. I händelse av att belysningen med laserljus inte är homogent fördelad, justera objektet belysning via mikroskop kondensor. Om kondenserat vatten på botten av glaslocket framkallar spridning effekter, kontrollera temperaturen av värmekammaren och rummets luftfuktighet. I händelse av att celltätheten är för hög eller celltillväxt i mer än ett skikt, reducera celldensitet under framställning av sårläkningsanalyser. Slutligen, som DHM bygger på principen om interferometri är metoden känslig för vibrationer eller andra mekaniska störningar, som varierar beroende på det enskilda laboratoriemiljö. Men sådana influenser vanligtvis kan minimeras genom adekvat valda exponeringstider (typiskt i millisekund intervall eller lägre) för holografi inspelningen under utarbetandet av experimentuppställning.

SammanfattningsvisVåra resultat visar att DHM har stora fördelar jämfört med ljusa fält och befintliga faskontrastbildframtagning mikroskopi tekniker såsom Zernike faskontrast och DIC på grund av dess förmåga att kvantitativt bedöma histologiska inflammation ex vivo i en nästan automatiserat sätt. Dessutom DHM tillåter etikettfria kontinuerlig multimodal utvärdering av epitel sårläkning in vitro med minimerad interaktion med proverna. Detta banar väg för automatiserad histologisk undersökning när det gäller '' digital patologi '' och ytterligare utökade studier för att undersöka translationell potential DHM på patienter med IBD. Dessutom erbjuder DHM roman in vitro möjligheter att kvantitativt studera cell migration, morfologi och spridning.

Översättningen av DHM i klinisk praxis har potential att förbättra IBD diagnostik. Som DHM tillåter kvantifiering av olika grader av tarminflammation viafysikaliska parametrar såsom densitetsförändringar, en objektiv och mer exakt bedömning av sjukdomen i betydelsen en "digital patologi" verkar möjligt. Objektiv bedömning kan ha en betydande inverkan på den kliniska hantering av IBD-patienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Azoxymethane (AOM) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany A5486
Cell Culture Flask Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 658170
Costar Stripette Corning Inc., New York, USA 4488
Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
DMEM/Ham's F12 PAA Laboratories - Pasching - Austria E15-813
EGF Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany SPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
Falcon Tube 50 ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070
Isopentane (2-Methylbutane) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M32631-1L
Methylene blue Merck, Darmstadt, Germany 1159430025
Mitomycin C Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M4287
Microscope Slides G. Menzel, Braunschweig, Germany J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583
Pen/Strep/Amphotericin B Lonza, Verviers, Belgium 1558
Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
RPMI 1640 Lonza, Verviers, Belgium 3626
Sodium Chloride 0.9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
Trypsin EDTA Lonza, Verviers, Belgium 7815
Vitro – Clud R. Langenbrinck, Teningen, Germany 04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high ibidi GmbH, Munich, Germany 81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert ibidi GmbH, Munich, Germany 80050
Equipment
MICROM HM550 Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA 46320
Digital holographic microscope
Component Model Company
Inverted Microscope iMIC Till Photonics, Graefelfing, Germany
Laser Compass 315M Coherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lens Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 Zeiss, Goettingen, Germany
CCD camera DMK 41BF02 The Imaging Source, Bremen, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369, (9573), 1641-1657 (2007).
  2. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114, (3), 385-391 (1998).
  3. Florholmen, J. Mucosal healing in the era of biologic agents in treatment of inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 50, (1), 43-52 (2015).
  4. Merga, Y., Campbell, B. J., Rhodes, J. M. Mucosal barrier, bacteria and inflammatory bowel disease: possibilities for therapy. Dig Dis. 32, (4), 475-483 (2014).
  5. Young, V. B., Kahn, S. A., Schmidt, T. M., Chang, E. B. Studying the Enteric Microbiome in Inflammatory Bowel Diseases: Getting through the Growing Pains and Moving Forward. Front Microbiol. 2, 144 (2011).
  6. Atreya, R., Neurath, M. F. IBD pathogenesis in 2014: Molecular pathways controlling barrier function in IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12, (2), 67-68 (2015).
  7. Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Front Biosci. 4, 303-309 (1999).
  8. Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, (2), 369-372 (1973).
  9. Singh, A., Nascimento, J. M., Kowar, S., Busch, H., Boerries, M. Boolean approach to signalling pathway modelling in HGF-induced keratinocyte migration. Bioinformatics. 28, (18), 495-501 (2012).
  10. Sakalar, C., et al. Pronounced transcriptional regulation of apoptotic and TNF-NF-kappa-B signaling genes during the course of thymoquinone mediated apoptosis in HeLa cells. Mol Cell Biochem. 383, (1-2), 243-251 (2013).
  11. Serada, S., et al. Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity biomarker in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 18, (11), 2169-2179 (2012).
  12. Turovskaya, O., et al. RAGE, carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis. Carcinogenesis. 29, (10), 2035-2043 (2008).
  13. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
  14. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors (Basel). 13, (4), 4170-4191 (2013).
  15. Bettenworth, D., et al. Quantitative stain-free and continuous multimodal monitoring of wound healing in vitro with digital holographic microscopy. PLoS One. 9, (9), 107317 (2014).
  16. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Sci Rep. 5, 9976 (2015).
  17. Wang, Z., Tangella, K., Balla, A., Popescu, G. Tissue refractive index as marker of disease. J Biomed Opt. 16, (11), 116017 (2011).
  18. Majeed, H., et al. Breast cancer diagnosis using spatial light interference microscopy. J Biomed Opt. 20, (11), 111210 (2015).
  19. Lenz, P., et al. Digital holographic microscopy quantifies the degree of inflammation in experimental colitis. Integr Biol (Camb). 5, (3), 624-630 (2013).
  20. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295, (2), 538-544 (2008).
  21. Klokkers, J., et al. Atrial natriuretic peptide and nitric oxide signaling antagonizes vasopressin-mediated water permeability in inner medullary collecting duct cells. Am J Physiol Renal Physiol. 297, (3), 693-703 (2009).
  22. Jourdain, P., et al. Determination of transmembrane water fluxes in neurons elicited by glutamate ionotropic receptors and by the cotransporters KCC2 and NKCC1: a digital holographic microscopy study. J Neurosci. 31, (33), 11846-11854 (2011).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2, (3), 541-546 (2007).
  24. Bettenworth, D., et al. The tripeptide KdPT protects from intestinal inflammation and maintains intestinal barrier function. Am J Pathol. 179, (3), 1230-1242 (2011).
  25. Kemper, B., et al. Modular digital holographic microscopy system for marker free quantitative phase contrast imaging of living cells. Proc. SPIE. 6191, (2006).
  26. Kemper, B., von Bally, G. Digital holographic microscopy for live cell applications and technical inspection. Appl Opt. 47, (4), 52-61 (2008).
  27. Langehanenberg, P., von Bally, G., Kemper, B. Autofocusing in digital holographic microscopy. 3D Research. 2, (1), 1-11 (2011).
  28. Daimon, M., Masumura, A. Measurement of the refractive index of distilled water from the near-infrared region to the ultraviolet region. Applied optics. 46, (18), 3811-3820 (2007).
  29. Przibilla, S., et al. Sensing dynamic cytoplasm refractive index changes of adherent cells with quantitative phase microscopy using incorporated microspheres as optical probes. J Biomed Opt. 17, (9), 0970011-0970019 (2012).
  30. Kemper, B., et al. Integral refractive index determination of living suspension cells by multifocus digital holographic phase contrast microscopy. J Biomed Opt. 12, (5), 054009 (2007).
  31. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (10), 100 (2006).
  32. Marquet, P., et al. Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy. Opt Lett. 30, (5), 468-470 (2005).
  33. Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl Opt. 47, (19), 176-182 (2008).
  34. Hanauer, S. B., et al. Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet. 359, (9317), 1541-1549 (2002).
  35. Colombel, J. F., et al. Adalimumab for maintenance of clinical response and remission in patients with Crohn's disease: the CHARM trial. Gastroenterology. 132, (1), 52-65 (2007).
  36. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. N Engl J Med. 369, (8), 699-710 (2013).
  37. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369, (8), 711-721 (2013).
  38. Monteleone, G., et al. Mongersen, an oral SMAD7 antisense oligonucleotide, and Crohn's disease. N Engl J Med. 372, (12), 1104-1113 (2015).
  39. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384, (9940), 309-318 (2014).
  40. Sandborn, W. J., et al. Ustekinumab induction and maintenance therapy in refractory Crohn's disease. N Engl J Med. 367, (16), 1519-1528 (2012).
  41. Natividad, J. M., et al. Commensal and probiotic bacteria influence intestinal barrier function and susceptibility to colitis in Nod1-/-; Nod2-/- mice. Inflamm Bowel Dis. 18, (8), 1434-1446 (2012).
  42. Melgar, S., et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 8, (6), 836-844 (2008).
  43. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. Int J Clin Exp Pathol. 7, (8), 4557-4576 (2014).
  44. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
  45. Zhao, K., Wang, W., Guan, C., Cai, J., Wang, P. Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells. Mol Biol Rep. 39, (3), 2607-2613 (2012).
  46. Pavillon, N., et al. Early cell death detection with digital holographic microscopy. PLoS One. 7, (1), 30912 (2012).
  47. Hindryckx, P., et al. Clinical trials in ulcerative colitis: a historical perspective. J Crohns Colitis. 9, (7), 580-588 (2015).
  48. Neurath, M. F., Travis, S. P. Mucosal healing in inflammatory bowel diseases: a systematic review. Gut. 61, (11), 1619-1635 (2012).
  49. Bryant, R. V., Winer, S., Travis, S. P., Riddell, R. H. Systematic review: histological remission in inflammatory bowel disease. Is 'complete' remission the new treatment paradigm? An IOIBD initiative. J Crohns Colitis. 8, (12), 1582-1597 (2014).
  50. Marchal Bressenot, A., et al. Review article: the histological assessment of disease activity in ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 42, (8), 957-967 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics