Multimodal Kvantitativ Phase Imaging med Digital Holografisk Mikros Nøyaktig Vurderer tarmbetennelse og epithelial Wound Healing

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lenz, P., Brückner, M., Ketelhut, S., Heidemann, J., Kemper, B., Bettenworth, D. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54460, doi:10.3791/54460 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Forekomsten av inflammatorisk tarmsykdom, det vil si, Crohns sykdom og ulcerøs kolitt, har økt betydelig det siste tiåret. Etiologien av IBD er fortsatt ukjent og nåværende terapeutiske strategier er basert på den uspesifikke undertrykkelse av immunsystemet. Utviklingen av behandlinger som spesifikt retter tarmbetennelse og epitel sårtilheling kunne gi en betydelig bedre styring av IBD, men dette krever nøyaktig påvisning av betennelsesforandringer. Foreløpig er potensielle legemiddelkandidater vanligvis evaluert med dyremodeller in vivo eller med cellekulturbaserte teknikker i vitro. Histologisk undersøkelse krever vanligvis cellene eller vev av interesse å bli farget, noe som kan endre prøven egenskaper og dessuten kan tolkningen av resultatene varierer fra utprøver ekspertise. Digital holografisk mikroskopi (DHM), basert på påvisning av optiske veilengden forsinkelse, tillaterflekkfrie kvantitativ fase kontrast bildebehandling. Dette gjør at resultatene skal være direkte korrelert med absolutte biofysiske parametre. Vi viser hvordan måling av endringer i vev tetthet med DHM, basert på brytningsindeks måling, kan kvantifisere inflammatoriske forandringer, uten flekker, i forskjellige lag av colonic vevsprøver fra mus og mennesker med kolitt. I tillegg viser vi kontinuerlig multimodale label-fri overvåking av epitel sårtilheling in vitro, mulig å bruke DHM gjennom den enkle automatisert bestemmelse av de sårede området og samtidig bestemmelse av morfologiske parametere som tørr masse og tykkelse av trekkende celler. I konklusjonen, representerer DHM en verdifull, roman og kvantitative verktøy for vurdering av tarmbetennelse med absolutte verdier for parametrene mulige, forenklet kvantifisering av epitel sårtilheling in vitro, og derfor har stort potensial for translasjonsforskning diagnostisk use.

Introduction

Inflammatorisk tarmsykdom (IBD), det vil si, ulcerøs kolitt (UC) og Crohns sykdom (CD) er idiopatiske inflammatoriske sykdommer i mage-tarmkanalen 1. Forskning på den underliggende patofysiologien av IBD og vurdering av nye medikamenter eller nye diagnostiske metoder er særlig av betydning. I både grunnforskning og den kliniske behandlingen av IBD pasienter, har tarmslimhinnen blitt et fokus for oppmerksomhet 2,3. Mukosa representerer en anatomisk grense, ved hvilken interaksjonen mellom kommensale bakterier, epitelceller og forskjellige cellulære komponenter av tarmimmunsystemet organisere gut homeostase 4,5. Men i IBD pasienter, fører ukontrollert og vedvarende tarmbetennelse på slimhinneskader, påviselig som sår eller stenose, som til slutt kan ende i sammenbrudd av epitelial barrierefunksjon, noe som i seg selv forverrer lokal betennelse 6.

7. Epitelial sårheling kan simuleres i in vitro assays sårheling og i murine modeller av tarmbetennelse 8,9. Både in vitro og in vivo fremgangsmåter har ulemper, som begrenser nøyaktigheten av eksperimentell bedømmelse. In vitro-undersøkelser, som klassisk skrape analyser krever langvarige flekker prosedyrer eller transfeksjon med fluorescerende chromophores. De er ofte begrenset av deres usammenhengende overvåking av celleproliferasjon og migrasjon som ikke kan automatiseres 10. In vivo modeller, for eksempel dekstran natriumsulfat (DSS) -indusert kolitt, mangler ofte robuste read-outs, delvis på grunn av den betydelige variasjonen sett i laboratoriemarkører, making slike markører upassende å evaluere kolitt alvorlighetsgrad 11,12. Histologisk analyse av den betente slimhinne er for tiden fortsatt den mest gyldig metode for å bestemme graden kolitt, men dette, som in vitro epiteliale sårheling assays krever farging og er avhengig av undersøkers ekspertise 13.

Nylig digital holografisk mikroskopi (DHM), en variant av kvantitativ fasemikroskopi 14, ble identifisert som nyttig verktøy for evaluering av epiteliale sårheling in vitro og in vivo 15. DHM tillater vurdering av vev tetthet ved å måle optisk veilengde forsinkelse (OPD) som utsiktene roman kreftdiagnose 16-18 og kvantifisering av betennelser relatert vev endringer 19. I tillegg gir DHM overvåking av cellemorfologi dynamikk ved å bestemme celletykkelse, celle dekket flateareal og intracellulært (protein) innhold mengde in vitro-analyser, DHM muliggjør også analyse av fysiologiske prosesser, f.eks, cellulær vannpermeabiliteten ved å evaluere forandringer i cellevolumet og tykkelse 21,22. Videre kan DHM målinger automatiseres som hindrer etterforsker-forbundet sample bias.

Her viser vi bruken av DHM i en murin modell av intestinal inflammasjon, og gjelder også DHM for analyse av humane vev prøver for kvantitativ overvåkning av sårheling som en etikett fritt in vitro-analysen. Først vurderer vi inflammatoriske forandringer av ulike colonic vegg-lag i colitic mus og seksjoner vev fra mennesker med IBD. Etter beskriver DHM kvantitativ fase bildebehandling prosedyren, gir vi detaljerte instruksjoner for bruk av mikroskop komponenter, utarbeidelse av vevssnitt og også beskrive evalueringen av de oppkjøpte kvantitative fase bilder.

Deretter viser vi at DHM kan være UVIlized for kontinuerlig multimodal overvåking av epitel sårtilheling in vitro, og beskrive analyse av mobilnettet egenskaper som cellelag tykkelse, tørr masse og cellevolum gi innsikt i legemiddelinduserte og fysiologisk celle forandringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av regional etisk komité (den Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Tyskland) i henhold til tysk Dyrevernloven. Den lokale etikkutvalg ved universitetet i Münster godkjent bruk av menneskelig vev for histologisk og mikroskop analyse.

1. Dyr og materialer

  1. Bruk kvinnelig eller mannlig mus av den nødvendige DSS-mottakelig stamme som veier 20-25 g, og huset i henhold til lokale dyr omsorg lovgivning. Gi spesiell chow for gnagere og autoklaveres drikkevann ad libitum.
  2. Fremkall akutt DSS kolitt ved å gi 3% vekt / volum dekstransulfat natrium (DSS, molekylvekt: 36,000-50,000 Da) i Autoclaved vann fra springen i 5 dager.
    MERK: Styrken på DSS er svært variabel avhengig av produsent og batch. Test din leverandør-gitt DSS først for induksjon av sykdomsaktivitet, som daily kroppsvekt er en pålitelig og objektiv indikator.
  3. For histologisk evaluering av colonic vevsprøver, avlive mus ved CO 2 insufflasjon (eller som angitt ved nasjonale og institusjonens retningslinjer) ved slutten av forsøket.

2. Forsøksoppsett for DSS-kolitt og In-vitro sårtilheling Analyser

  1. Cellekultur og etablering av sårheling assay.
    1. Grow Caco-2-celler i en 95% luftfuktighet og 5% CO2 miljø ved 37 ° C. Bruke RPMI-medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin.
    2. Seed Caco-2-celler ved en tetthet på 4 x 10 5 celler / cm2 på 35 mm Petri-skåler med høy kulturinnsats (se figur 4A).
      MERK: innsats genererer to celle dekket områder som er adskilt med en definert celle fritt rom som representerer den sårede område som skal analyseres.
    3. Endre medium to dager etter seeding. Utføre ved først å aspirere gjenværende medium med cellerester ved hjelp av en automatisk pipette, skylles med 100 ul av fosfatbufret saltvann (PBS) og tilsett friskt RPMI-medium eller serum-belastede medium.
    4. Dyrke celler i 24 timer i serum-ute-medium (0,1% FBS) supplert med 20 ng EGF / ml serum eller 2 ug mitomycin c / ml serum for å detektere endringer i sårheling oppførsel. Legg normal RPMI-medium til å få tak-celler i 24 timer.
    5. Etter 24 timer med kultur, fjern og kast kultur inserts som beskrevet i trinn 3,4 og utføre DHM.
  2. Induksjon av akutt DSS kolitt
    1. Oppløs 3 g av DSS i 100 ml vann autoklaveres for å få en 3% (vekt / volum) DSS løsning. Gi denne løsning i stedet for drikkevann til mus ad libitum i 7 dager. Beregn 5 ml DSS-løsning per mus / dag. Gi Autoclaved vann uten DSS for kontrollmusene ad libitum.
  3. Utarbeidelse av cryostatic deler av murine og humane tykktarm
    1. Avlive mus ved CO 2 insufflasjon ved slutten av forsøket.
    2. Skjær dyrenes magen ved laparotomi 23. Fjern hele tykktarmen forsiktig med pinsett og kutte ileal og rektal slutt hjelp kirurgisk saks. Skjær tykktarmen med en saks i lengderetningen fra cecal til rektal enden og åpne tykktarmen. Fjern all avføring fra prøven ved hjelp av pinsett, etterfulgt av vasking med PBS 24.
    3. Forbered sveitsiske ruller ved å rulle opp hele tykktarmen med en bomullspinne i lengderetningen fra cecal til rektal ende med slimhinnen buet innover. Bygge inn colonic prøver i en optimal skjære temperatur (OCT) forbindelsen og holder frosset ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
    4. Embed menneskelige colonic vev fra kirurgiske prøven i optimal skjæring temperatur oktober sammensatte og holde frosset ved -80 ° C inntil videre bruk.
    5. Cut deler av 7 mikrometer tykkelse av oktober-sammensatte-embedded prøver med hjelp av en cryotomeg like før eksamen.
      MERK: Den optimale prøvens tykkelse avhenger av utholdenhet og spredningsegenskapene til vevstype under etterforskning. For de beskrevne eksperimenter med kolon vev, skive tykkelse> 10 mikrometer årsaken betydelig økning i støy på grunn av lysspredning i kvantitative DHM fase kontrast, mens prøver av tykkelse <5 mikrometer viser en høyere risiko for skader indusert gjenstander fra cryo skjæringen.
    6. Overfør seksjoner på et glass objekt bærer lysbilde.

3. Teknisk utstyr, programvare og prosedyrer for innhenting og evaluering av digitale Hologrammer

  1. Digital holografisk mikroskop for kvantitativ celler og vev bildebehandling
    1. Bruk en off-axis Mach-Zehnder digital holografisk mikroskopi system for live celle bildebehandling 25, som vist i figur 1. Påse at mikroskopet er utstyrt med en10X mikroskop linse, et objektbord med en holder for glass objektbæreglass og Petriskåler med en diameter på 35 mm, til et varmekammer bevare fysiologisk temperatur ved 37 ° C og programvare for kvantitativ avbildning fase 25.
      MERK: For eksempel, som beskrevet i Kemper et al 26 og Langehanenberg et al 27...
      MERK: Du kan også bruke et lignende system som er i stand til å utføre lyse felt mikroskopi og kvantitativ fase avbildning av levende celler og lysbilder dissekert vev.
    2. Rent mikroskop objektiv og kondensator med linsepapir og et rengjøringsmiddel (f.eks etanol) som anbefalt av produsenten av mikroskop for å fjerne støv eller andre forurensninger.
    3. Start image oppkjøpet programvaren til DHM mikroskop, velg "lyse felt" bildemodus og slå "på" hvitt lys belysning. Sikre Köhler-illuminasjon av prøven som anbefalt av mikroskopet produsenten mens observere prøven i live bildevinduet på bildet oppkjøpet programvare (alternativt en standard image oppkjøpet programvare kan brukes i dette trinnet).
      MERK: Bildet intensitet bør fordeles homogent i synsfeltet og prøven stillingen bør ikke bevege seg under optisk omstilling med fokus kjøring av mikroskopet.
    4. Velg "DHM" bildemodus ved å slå "av" hvitt lys belysning og slå "på" laserlys. Kontroller at belysning med laserlys er homogent (dvs. at lysintensiteten blir homogent fordelt i det levende bildevinduet på bilde anskaffelse programvaren til DHM mikroskop) og observere at off-aksen bæreinterferenslinjemønster synes med tilstrekkelig kontrast i tatt bilder (digitale hologrammer).
  2. Utarbeidelse av kryostatsnitt for bildebehandlingmed DHM
    1. Ta prøve (kryostatsnitt på et glass objekt bærer, tykkelse: 7 pm, som beskrevet i 2.3) ut av fryseren. Tine prøven i ca 5 min ved RT og normal atmosfære.
    2. Legg 50-100 ul fosfatbufret saltvann (PBS) som innebygging medium på vev seksjon ved hjelp av en pipette til den er helt dekket med buffer. Dekk prøven med et rent glass dekkglass (glass tykkelse 170 mikrometer).
      MERK: Over tørking kan indusere signifikante endringer i brytningsindeksen og spredning av egenskapene til prøven.
    3. Sørge for at bunnen av glasset bæreren og dekkglass blir renset for støv og andre forurensninger som kan indusere lysspredning. Prøven er klar for undersøkelse med lyse felt mikroskopi og DHM.
  3. Kvantitativ fase avbildning av vev seksjoner med DHM
    1. Slå på den digitale holografisk mikroskop, velger 10X mikroskop linse for bildebehandling. Start image oppkjøpet programvare av DHM mikroskopet og velg lyse fil avbildningsmodus.
    2. Plasser vev lysbilde som beskrevet i 2) i objektglass holderen, med dekkglasset vender mot mikroskopobjektiv.
    3. Switch "på" den lyse felt belysning av DHM mikroskop. Plasser prøven med mikroskopet scenen og sørge for at vevet område av interesse er synlig i live overvåking vinduet. Forbedre skarpheten i bildet ved hjelp av mikroskop fokus stasjonen.
      MERK: I tillegg til det aktuelle området, bør et område på lysbilde uten vev også være tilstede i synsfeltet.
    4. Ta et lyst felt bilde av skarpt fokusert prøve å bruke bildet oppkjøpet programvare.
    5. Velg "DHM" bildemodus ved å slå "av" det hvite lyset belysning og slå "på" laserlys belysning. Velg "eksponeringstid" for hologram opptak under 3 ms, observere at holographic off-axis interferenslinjer vises med tilstrekkelig kontrast i live bildevinduet til bilde oppkjøpet programvare og fange en digital hologram.
    6. Gjenta trinn 3.3.3 - 3.3.5 til et tilstrekkelig antall lyse felt bilder og digitale hologrammer av ulike prøveområdene har blitt registrert. Hologram Oppkjøpet er nå fullført.
  4. Utarbeidelse av sårtilheling analyser for DHM bildebehandling
    1. Slå på petriskål varmekammeret av DHM mikroskop omtrent 1 - 3 timer før start av forsøket for å sikre stabile temperaturforhold i løpet av DHM målingene.
    2. Forberede arbeidsbenk med det nødvendige utstyr (petriskål for sårheling analysen er beskrevet i 2.3): pipetter, pinsett, glasslokk til petriskålen, 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) bufret cellekulturmedium med fysiologisk temperatur (37 ° C) for prøvepreparering i sterilt miljø.
      MERK: NaHCO3.
    3. Fjern plastlokket fra petriskålen og fjerne cellekulturmediet med en pipette. Fjern innsatsen fra petriskål bunnen med pinsett.
    4. Vask prøven 1 - 2 ganger med 1 ml HEPES-bufret cellekulturmedium for å fjerne døde celler og gjenværende cellulære komponenter (for eksempel serum) i sårområdet. Tilsett 2 ml HEPES-bufret cellekulturmedium og cap petriskål med glasslokk.
    5. Pass på at glasslokket og petriskål bunnen er blitt renset for støv og annen forurensning. Prøven er klar for tidsinnstilte observasjon med DHM.
  5. Kontinuerlig multimodal overvåking av sårheling in vitro med DHM
    1. Slå på petriskål varmekammeret av DHM mikroskop omtrent 1 - 3 timer førtil starten av forsøket for å sikre stabile temperaturforhold i løpet av DHM målingene.
    2. Switch "på" det digitale holografisk mikroskop, velg 10X mikroskop linse for bildebehandling. Start image oppkjøpet programvaren til DHM mikroskopet og velg "lyse felt" bildemodus. Sørg for at varmekammer for petriskål opererer en fysiologisk temperatur (37 ° C).
    3. Sett petriskål med sårhelingsprosessen analysen, fremstilt som beskrevet i 4), i varmekammeret i DHM mikroskop.
    4. Velg lyse felt avbildningsmodus og plassere prøven med mikroskop scenen mens observere den i live overvåking vinduet på bildet oppkjøpet programvaren til DHM mikroskop. Legg merke til at det ønskede området av prøven vises skarpt fokusert under hvitt lys belysning.
    5. Capture lyse felt bilder av forskjellige områder av prøven (såret og omkringliggende områder med sammenflytende celler) under hvitlys belysning med bildet oppkjøpet programvare og dokumenter utseende, celletetthet og homogenitet.
    6. Velg "lyse felt" bildemodus for DHM mikroskop. Velg en passende såret under hvitt lys belysning i live overvåking vindu med bildet oppkjøpet programvaren til DHM mikroskop. Sørg for at såret området er fritt for døde celler og ingen serumrester, og sørge for at begge sider har en enkel homogen celle laget, fortrinnsvis med rette kanter.
    7. Ta et hvitt lys bilde av det opprinnelige såret området i lyse felt bildemodus med bilde oppkjøpet programvaren til DHM mikroskop.
    8. Slå "off" hvitt lys belysning, velg "DHM" -modus og slå "på" laserbelysning. Velg en eksponeringstid på under 3 ms for hologram opptak (observere at holografiske off-aksen interferenslinjer vises med tilstrekkelig kontrast i live bildevinduet på bildet oppkjøpet programvare than DHM mikroskop) og fange en digital hologram.
    9. Fange en prøve hologram i DHM modus med bilde oppkjøpet programvare og rekonstruere en kvantitativ fase bilde med gjenoppbyggingen programvaren til DHM mikroskop for å sjekke bildekvaliteten.
    10. Velg en passende tidsforsinkelse (f.eks 3-5 min) for time-lapse hologram oppkjøpet med bildet oppkjøpet programvaren til DHM mikroskop.
    11. Velg time-lapse oppkjøpet modus av bildet oppkjøpet programvare der prøven er kun belyst med laserlys under hologram oppkjøpet.
    12. Start time-lapse DHM observasjon av sårtilheling analysen.
    13. Stopp time-lapse oppkjøpet etter planlagt tid, velger lyse feltet avbildningsmodus og dokumentere det endelige utseendet av prøven under hvitt lys bildebehandling.
  6. Rekonstruere digitale hologrammer av dissekert vev og bestemme den gjennomsnittlige brytningsindeks som en parameter for å kvantifiserevevstetthet
    1. Rekonstruere kvantitative fase av bilder fra digitale hologrammer av dissekert vev med programvaren til DHM mikroskop, for eksempel, som beskrevet i Kemper et al. 26 og Langehanenberg et al. 27.
    2. Bestem den gjennomsnittlige fasekontrast Δφ i ulike vev lag (epitel, submucosa, stroma) i riktig utvalgte områder av interesse (Rois) 19.
    3. Bestemme brytningsindeksen for innstøpningsmediet ved hjelp av et refraktometer eller alternativt ved hjelp av en passende verdi fra litteraturen. (brytningsindeksverdier for typiske innstøping middel: n vann = 1,334 28, n Fosfatbufret saltvann (PBS) = 1,337 29, n cellekulturmediet = 1,337 til 1,339 29,30).
    4. Beregn brytningsindekser i ulike vev lag fra den gjennomsnittlige fasekontrast-verdier 19
      ligning 1 MERK: I Eq. 1 λ er bølgelengden av laserlyset (her: λ = 532 nm), d tykkelsen av de dissekerte vev (her: 7 pm) og n medium er brytningsindeksen for innstøpningsmediet (her: n medium = n PBS = 1,337, bestemt av en Abbe-Refraktometer).
  7. Rekonstruere og vurdere digitale hologrammer fra time-lapse sårbehandling serie observasjon
    1. Rekonstruere kvantitative fase bildene fra tid forfalle hologram serie innhentet under sårtilheling observasjon med DHM mikroskop programvare 26,27.
    2. Normaliser hver serie av kvantitative fasebilder av bildet med maksimal fasekontrast.
    3. Bestem område S c som er dekket av cellene i de kvantitative DHM fase bilder ved bildesegmentering, som kan være perdannet ved hjelp av fri programvare celle profiler (www.cellprofiler.org 31).
    4. Beregne gjennomsnittlig fasekontrast av celler Δφ celle i området S c.
    5. Hente celletørrvekt DM fra den gjennomsnittlige fasekontrast Δφ celle i området S c 15
      ligning 2 (2)
      MERK: I ligning 2 DM angir den celletørrvekt, presenterer S c det området som er okkupert av cellene og α = 0,002 m 2 / kg.
    6. Bestemme integralet cellebrytningsindeksen n celle og brytningsindeksen for det cellekulturmedium n medium. Bestemme n celle separat eksperimentelt fra suspenderte celler som beskrevet i 30 og måle n medium med et refraktometer. Alternasvis bruke litteraturverdier for n celle 30 og n medium 29,30.
    7. Beregne gjennomsnittlig celle tykkelse d celle fra λ, Δφ celle, n celle og n medium 26,32
      ligning 3 (3)
      MERK: I Eq. 3 parameteren d cellen er den gjennomsnittlige celletykkelse, λ betegner lys bølgelengde av laserlyset, betegner Δφ celle gjennomsnittlig fasekontrast, og n celle og n medium er integrert cellebrytningsindeks og brytningsindeksen til det omgivende medium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Typisk oppsett for DHM Imaging for Digital Holografisk Mikroskopi (DHM)

For å utføre lyse felt avbildning og kvantitativ DHM fasekontrast-imaging, søkte vi en invertert mikroskop som angitt i figur 1 B. Systemet ble modifisert ved å feste en DHM-modul, som beskrevet tidligere 25. Digitale hologrammer ble samlet ved belysning av prøven med lys av en frekvens-doblet Nd: YAG laser λ = 532 nm) i Mach-Zehnder konfigurasjon (figur 1 A). Dissekert vev ble analysert ex vivo på glass bære lysbilder. Levende cellekulturer ble observert i spesielle Petri-skåler for å observere sårheling som vist i Fig. 1C. Prøvene ble fotografert ved transmisjon belysning via en 10X microscope linse (NA = 0,3) og en tube linse. En CCD-kamera ble brukt til å spille inn interferensmønstre (digitale off-aksen hologrammer) som genereres av superimposing eksempelbilde (objekt bølge) med litt på skrå referansen bølge. De digitalt fanget hologrammer ble rekonstruert av romlig faseforskyvning rekonstruksjon i kombinasjon med valgfri holografisk autofokusering av 26,33.

Vurdering av Murine DSS-indusert kolitt av DHM

Akutt kolitt ble indusert i mus ved administrering av 3% vekt / volum dekstransulfat natrium (DSS) i drikkevannet i 5 dager. Den manifestasjon og forløpet av kolitt ble fulgt ved å overvåke for progressivt vekttap i DSS-behandlede gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. (Figur 2 A er tilpasset fra 19). Endoskopisk, moderat til alvorlig colitis ble observert som reflekteres av fortykkelse av tarmveggen, endringer i den vaskulære mønster (for eksempel spontane blødninger, rød pil), fibrin utsvetting (hvit pil) og kornete av slimhinnen (figur 2B). Konvensjonell histologisk evaluering av hematoxylin og eosin (HE) beiset colonic seksjoner avslørt markert ødem i tarmveggen DSS-behandlede vers kontroll dyr, hovedsakelig lokalisert i submucosa (figur 2 C grå pil). Tilsvarende kvantitative DHM fasekontrastbilder og tilhørende brytningsindekskart som hentes ved ligning 1, også vist de ovenfor nevnte vev endringer. I tillegg er brytningsindeksen, kodet til 256 grånivåer, indikerte forskjeller i tetthet i vev lag inkludert epitelet (hvit pil) og stroma (sort pil) i native, ufargede vevsprøver (figur 2 C). Brytningsindeksen var signifikant redusert i epitelet, så vel som i submukosa og stroma av de colitic mus sammenlignet med friske kontroller (figur 2 E). I tillegg kan en signifikant korrelasjon mellom kliniske parameter (relativ tap av kroppsvekt) og den absolutte fysisk parameter (brytningsindeks) observeres (R2 lineær = 0,64, figur 2 D, tilpasset fra 19).

Vurdering av Crohns sykdom hos mennesker av DHM

Crohns sykdom er ofte identifisert ved bemerkelsesverdige inflammatoriske forandringer i tarmveggen, som detekteres av gastrointestinal endoskopi. Karakteristiske makroskopiske funksjoner omfatter av kornete av slimhinnen, langsgående sår med fibrin exudationer (også referert til som "snegle stier") og spontan blødning (figur 3 A). Histologisk evaluering ved HE-farging av vevsprøver fra pasienter med aktiv CD ofte avsløre tykktarmvegg samt submucosal ødem. Tilsvarende kvantitative DHM fase kontrast og relaterte brytningsindeks kart hentet av ligning 1 også oppdaget inflammatorisk-mediert forbedring / hevelse i tarmveggen, her sett i epitel (figur 3 B). Videre brytningsindeks som en absolutt parameter, ble også betydelig redusert i alle vegg lag (epitel, submucosa og stroma) i colonic vevsprøver fra pasienter med aktiv CD vers de i remisjon (figur 3 C).

Multimodal Overvåking av Wound Healing In-vitro

Caco-2 celle sårheling analysene ble utført ved hjelp av en spesiell petriskål for å gi standardiserte betingelser. Skålen er utstyrt med en kulturinnsats som danner to forskjellige kammere, som er atskilt med et mellomrom på 500 um (figur 4 A). For å simulere forskjellige fysiologiske miljøer, ble cellene undersøkt enten uten behandling, stimulert av epidermal vekstfaktor (EGF) eller inhibert med mitomycin C. Den DHM oppsettet tillater kontinuerlig overvåking av sårhelingsprosessen over tid, er vist her ved representative kvantitative fasekontrastbilder DHM (kodet til 256 gråtoner) etter 0, 22,5 og 45 timer etter starten av eksperimentet (figur 4 B). Tilsvarende falske fargekodede pseudo 3D-plott i figur 5 illustrerer den romlige utviklingen av cellen tykkelse i tre didimensjoner. Basert på den optiske veilengde forsinkelse, den cellulære brytningsindeks og ligningene 2 og 3, gjør det mulig DHM samtidig dynamisk evaluering av migrering, proliferasjon og morfologi ved tidsmessig overvåkning av cellulære egenskaper som celle dekket overflateareal, midlere celletykkelse og cellulær tørrvekt ( Figur 4 C). I sammendrag, dataene i figur 4 viser at EGF simuleringsresultater i en hurtigere migrering av celler inn i såret område, i en øket gjennomsnittlig celletykkelse og i en høyere tørrmasse i synsfeltet sammenlignet med kontrollceller. I motsetning til dette, mitomycin C, inhiberte celler dekke et litt redusert overflateareal enn kontrollcellene i løpet av eksperimentet, og viser også en noe lavere tørr masse øker. Men vises den gjennomsnittlige celle tykkelse klart redusert i forhold til begge, stimulert og kontrollceller.


Figur 1. Benyttet Off-aksen Oppsett for Digital Holografisk Mikroskopi (DHM). Skjematisk oppsett av DHM arbeidsstasjon (A). Tilsvarende fotografi som avbilder mikroskop oppsett (skjerm, live image og kontroll programvare (1), off-axis oppsett digitalt mikroskop (2), (B), den optiske banen av mikroskopet (grønn stiplet linje) og en prøve (merket med en rød arrow, (C)). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Vurdering av Murine DSS-indusert kolitt av DHM. I løpet av kolitt ble etterfulgt av daglig megasurement av relativ kroppsvekt og gjentatt endoskopisk oppfølging eksamen. En massiv tap av relativ kroppsvekt fra dag 4 etter start av DSS administrasjon (tilpasset fra 19) (A) ble ledsaget av endoskopiske tegn på etablert kolitt inkludert fokale sår og mucosal sårbarhet (B). Analyse av konvensjonelle HE-fargede cryostatic seksjoner åpenbart submucosal ødem, fortykkelse av muscularis og en utpreget slimhinne inflammatorisk infiltrat i slimhinnen. Tilsvarende kvantitative DHM fasekontrastbilder og tilhørende brytningsindekskart som hentes ved ligning 1 (kodet til 256 gråtoner) bekreftet ødematøse endringer av submucosa i løpet av den inflammatoriske prosessen (hvit pil indikerer epitel, grå submucosa og svart stroma) (C). Den relative tap av kroppsvekt (et klinisk parameter) signifikant korrelert med brytningsindeks (en absolutt fysisk parameter, R2 = 0,6 lineære4; (D), innrettet til fra 19), som var signifikant redusert i epitelet, så vel som i submukosa og stroma av de colitic mus sammenlignet med friske kontroller (gjennomsnitt ± SEM, *** p <0,001;. E) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Vurdering av Crohns sykdom hos mennesker av DHM. Tykktarms vevsprøver fra pasienter med endoskopisk og histologisk bekreftet Crohns sykdom ble undersøkt (A). HE-farging vises forlengelse av slimhinne krypter og en markert infiltrat av betennelsesceller. Videre ble submucosal ødem og utvidelse av muscularis propria detektert. Analyse av korresponding kvantitative DHM fase kontrast og relaterte brytningsindeks kart hentet av ligning (1) (kodet til 256 gråtoner) avslørte også ødematøse endringer (her angitt med en hvit og svart stjerne) i epitelet (B). Signifikante forskjeller i gjennomsnittlig brytningsindeks ble påvist i prøver fra CD-pasienter med aktiv bluss (åpne søyler) eller remisjon (svarte striper). Disse forskjellene er sett i hver vevstype (gjennomsnitt ± SEM, *** p <0,001; C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Overvåking av epithelial Wound Healing av White Light Mikroskopi og DHM. Dyrkede celler var transferred i petriskåler med spesielle innsatser (rød pil). Før dyrkningsinnsatser ble fjernet, ble celler behandlet med enten EGF eller mitomycin C i 24 timer, eller behandlet med medium alene (ustimulert kontroll) (A). Etter fjerning av dyrkningsinnsatser, ble sårheling kontinuerlig overvåket ved fasekontrastbildedannelse ved DHM over tid. Celle skisserer kan bli klart anerkjent. Representative kvantitative DHM fasekontrastbilder er vist ved begynnelsen av forsøket, etter 22,5 timer og ved slutten av målingen etter 45 t (B). Panel (C) viser de tilsvarende tidsmessige endringer i cellen dekket overflaten (S c), gjennomsnittlig celletykkelsen (d celle) og mobiltørrvekt (DM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 5. Illustrasjon av Cell Layer morfologi Endringer av Falske Fargekodede Pseudo 3 D Tomter av de kvantitative DHM Fase kontrast. Representative falske fargekodede pseudo 3D-plott av de kvantitative DHM fase kontrast i 4B ved t = 0, etter 22,5 timer og på slutten av målingen etter 45 timer, illustrerer romlig utvikling av tykkelsen på cellelag for kontroll-, mitomycin c-hemmet og EGF-stimulert celler i 3D. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi viser at DHM gir nøyaktig vurdering av histologiske skader i murine kolitt modeller og prøver ex vivo menneskelige colonic vev. Videre har vi vist DHM kan kontinuerlig overvåke epitel sårheling samtidig gi multimodal informasjon om cellulære endringer. I DHM, er gjenoppbyggingen av digitalt fanget hologrammer utføres numerisk 32. Derfor, i forhold til lyse felt mikroskopi, Zernike fasekontrast og differensial interferens kontrast mikroskopi, gir DHM kvantitativ fase kontrast med eventuelt påfølgende tallfokuskorrigering (multi-fokus imaging) 27. Kvantitativ fase avbildning er basert på bestemmelsen av optiske banelengdeendringer, og således er sterkt uavhengig av måleinnretning som anvendes. Dette forenkler sammenligning av måledata som er anskaffet med ulike instrumenter. I tillegg krever DHM bare lav lysintensitet for object belysning. Dette gjør at en minimal invasiv analyse av ufargede dissekert vev og reduserer mengden av prøven samhandling kreves under langsiktige time-lapse observasjoner av levende celler.

Det terapeutiske armamentarium for IBD er betydelig utvidet i løpet av de to siste tiårene. I tillegg til innføring av anti-TNF α terapier, som er effektive i både UC og CD og som har akseptable bivirkningsprofiler, nye og spesifikke antistoffer målrettet mot integriner ble nylig introdusert i klinisk praksis 34-37. Flere andre lovende agenter blir nå evaluert for sin terapeutiske effekt i IBD 38-40. Men før klinisk bruk i mennesker, har effekt og sikkerhet av disse potensielle behandlinger for å bli påvist i dyrestudier. DSS-indusert kolitt er en av de mest brukte murine modeller kolitt, på grunn av høy reproduserbarhet og lave kostnader 23. I tillegg kan denne modellen alså bli brukt for å genetisk endrede mus stammer 41. Mens systemiske markører, f.eks, CRP, er svært variabel i dyremodeller, representerer histologisk vurdering av tykktarmen den mest gyldig metode for å vurdere sykdommens alvorlighetsgrad 42,43. Likevel er kvantitativ vurdering av histologisk betennelse i henhold til poengsystemer svært avhengig etterforsker kompetanse og erfaring. Automatisert vurdering og scoring av objektive parametere som mulig med DHM overvinner disse begrensningene, og dessuten er også tidsbesparende, unngå behovet for farging 19. Videre kan DHM brukes til å undersøke prøver kirurgiske colonic samt slimhinne prøver tatt i løpet av endoskopi.

Epitelial regenerering og sårtilheling er en sentral mekanisme i løpet av flere patologisk prosess inkludert gastrointestinal sårdannelse eller anastomotic lekkasje. Mens det er lovende tilnærminger for å vurdere epithelial sårtilheling i vIvo 44, disse teknikkene krever avanserte undersøkelsesverktøy, og er for øyeblikket ikke allment tilgjengelig. Derfor tiden epitelial healing er ofte undersøkt av skrape analyser in vitro 9. Disse analysene tillate gyldig undersøkelse for sårheling, men vanligvis først krever cellefarging, som deretter hindrer gjentatt evaluering 10,45. I tillegg kan ingen mobil endring data bli kjøpt opp parallelt med denne eksperimentelle oppsettet. Imidlertid kan denne informasjonen være av vesentlig betydning fordi det kan brukes til å differensiere mellom apoptose og nekrose 46 og for å vurdere celleproliferasjon og migrasjon 46. Derfor, for å bestemme muligheten for celletykkelse, tørr masse eller vev tetthet samtidig til overvåking av sårlukking ved DHM undersøkelse er av stor verdi i slimhinne forskning.

Behandlingsmålene for menneske IBD pasienter har vært i stadig endring de siste tiårene <sup> 47. Selv om utgangspunktet kontroll av betennelse ble ansett for å være av størst betydning, senere steroid-fri remisjon og nå slimhinnetilheling er primære mål for behandling 48. Nylig ble det antatt at histologisk remisjon kan også være bedre enn slimhinnetilheling alene 49. Men mens det er noen histologiske scoring systemer tilgjengelige for human IBD, forblir den inter-observatør variasjon høy 50. Derfor er det et behov for en standardisert metode for evaluering av histologiske colonic prøver. DHM kan bidra til dette målet, og bør vurderes nærmere i en prospektiv klinisk studie med menneskelige IBD pasienter.

I den eksperimentelle prosedyren presentert, blir prøvene belyses og avbildes ved bruk av svært koherent laserlys. Derfor er beslutningen i DHM hovedsakelig begrenset av lysspredning og diffraksjons-effekter forårsaket av forskyvning av prøve belysning, tykke prøver, støv ellerandre urenheter så som kondensert vann i den optiske bane. For å oppnå svært nøyaktige måledata fra kvantitative DHM fase kontrast, grundige forberedelser og justering av DHM oppsett og prøven er de viktigste trinnene i protokollen. Grundig rengjort optiske bildedannende elementer, spesielt mikroskop kondensatoren og mikroskopobjektiv, er nødvendig for å redusere støy. Også prøvebærer lysbilder, Petriskål lokk og bunn, så vel som den benyttede cellekulturmediet bør være fritt for partikkelformige forurensninger. Dette oppnås ved nøye rengjøring av alle komponenter og tilstrekkelig filtrering av de anvendte væsker.

Mer detaljerte feil- tips er som følger: Hvis det digitale hologram og / eller kvantitative DHM fase bilder av dissekerte vev er støyende, kan glassbærer og dekkglass være forurenset med støv. Hvis ja, rengjøre glasset bærer og dekkglass med alkohol (for eksempel ren etanol). Hvis den tykkesomhet av dissekert vev er for stor (> 10 mm) og dermed resulterer i lysspredning, prøv å bruke tynnere vevssnitt. I det tilfelle at den belysning med laserlys ikke er homogent fordelt, justere objektet belysning via mikroskoper kondensatoren. Hvis kondensert vann på bunnen av glasslokket induserer spredningseffekter, kontrollere temperaturen av varmekammeret og en luftfuktighet på. Dersom celletettheten er for høy eller cellevekst i mer enn ett lag, redusere celletettheten i løpet av fremstillingen av sårtilheling analyser. Til slutt, som DHM er basert på prinsippet om interferometri, er metoden følsom for vibrasjoner eller andre mekaniske forstyrrelser, som varierer i henhold til den individuelle laboratoriemiljø. Men slike påvirkninger som regel kan minimeres ved tilstrekkelig valgt eksponeringstider (typisk i millisekund utvalg eller under) for holografi opptak under utarbeidelsen av den eksperimentelle oppsettet.

oppsummertVåre resultater viser at DHM har store fordeler i forhold til lysfelt og eksisterende fasekontrastmikroskopi avbildningsteknikker slik som Zernike fasekontrast og DIC grunn av sin evne til å vurdere kvantitativt histologiske betennelse ex vivo i en nesten automatisert måte. Videre DHM tillater label-free kontinuerlig multimodal evaluering av epitel sårtilheling in vitro med minimert interaksjon med prøvene. Dette baner vei for automatisert histologisk undersøkelse i form av '' digital patologi '' og ytterligere utvidet studier for å utforske translasjonsforskning potensialet i DHM på pasienter med IBD. I tillegg DHM tilbyr nye in-vitro muligheter for å kvantitativt undersøke cellemigrering, morfologi og proliferasjon.

Oversettelsen av DHM i klinisk praksis har potensial til å forbedre IBD diagnostikk. Som DHM tillater kvantifisering av ulike grader av intestinal inflammasjon viafysikalske parametere som endres tetthet, en objektiv og mer nøyaktig vurdering av sykdom i betydningen av en "digital patologi" synes mulig. Den objektiv vurdering kan ha en viktig innflytelse på den kliniske behandlingen av IBD pasienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Azoxymethane (AOM) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany A5486
Cell Culture Flask Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 658170
Costar Stripette Corning Inc., New York, USA 4488
Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
DMEM/Ham's F12 PAA Laboratories - Pasching - Austria E15-813
EGF Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany SPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
Falcon Tube 50 ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070
Isopentane (2-Methylbutane) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M32631-1L
Methylene blue Merck, Darmstadt, Germany 1159430025
Mitomycin C Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M4287
Microscope Slides G. Menzel, Braunschweig, Germany J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583
Pen/Strep/Amphotericin B Lonza, Verviers, Belgium 1558
Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
RPMI 1640 Lonza, Verviers, Belgium 3626
Sodium Chloride 0.9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
Trypsin EDTA Lonza, Verviers, Belgium 7815
Vitro – Clud R. Langenbrinck, Teningen, Germany 04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high ibidi GmbH, Munich, Germany 81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert ibidi GmbH, Munich, Germany 80050
Equipment
MICROM HM550 Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA 46320
Digital holographic microscope
Component Model Company
Inverted Microscope iMIC Till Photonics, Graefelfing, Germany
Laser Compass 315M Coherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lens Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 Zeiss, Goettingen, Germany
CCD camera DMK 41BF02 The Imaging Source, Bremen, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369, (9573), 1641-1657 (2007).
  2. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114, (3), 385-391 (1998).
  3. Florholmen, J. Mucosal healing in the era of biologic agents in treatment of inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 50, (1), 43-52 (2015).
  4. Merga, Y., Campbell, B. J., Rhodes, J. M. Mucosal barrier, bacteria and inflammatory bowel disease: possibilities for therapy. Dig Dis. 32, (4), 475-483 (2014).
  5. Young, V. B., Kahn, S. A., Schmidt, T. M., Chang, E. B. Studying the Enteric Microbiome in Inflammatory Bowel Diseases: Getting through the Growing Pains and Moving Forward. Front Microbiol. 2, 144 (2011).
  6. Atreya, R., Neurath, M. F. IBD pathogenesis in 2014: Molecular pathways controlling barrier function in IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12, (2), 67-68 (2015).
  7. Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Front Biosci. 4, 303-309 (1999).
  8. Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, (2), 369-372 (1973).
  9. Singh, A., Nascimento, J. M., Kowar, S., Busch, H., Boerries, M. Boolean approach to signalling pathway modelling in HGF-induced keratinocyte migration. Bioinformatics. 28, (18), 495-501 (2012).
  10. Sakalar, C., et al. Pronounced transcriptional regulation of apoptotic and TNF-NF-kappa-B signaling genes during the course of thymoquinone mediated apoptosis in HeLa cells. Mol Cell Biochem. 383, (1-2), 243-251 (2013).
  11. Serada, S., et al. Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity biomarker in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 18, (11), 2169-2179 (2012).
  12. Turovskaya, O., et al. RAGE, carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis. Carcinogenesis. 29, (10), 2035-2043 (2008).
  13. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
  14. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors (Basel). 13, (4), 4170-4191 (2013).
  15. Bettenworth, D., et al. Quantitative stain-free and continuous multimodal monitoring of wound healing in vitro with digital holographic microscopy. PLoS One. 9, (9), 107317 (2014).
  16. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Sci Rep. 5, 9976 (2015).
  17. Wang, Z., Tangella, K., Balla, A., Popescu, G. Tissue refractive index as marker of disease. J Biomed Opt. 16, (11), 116017 (2011).
  18. Majeed, H., et al. Breast cancer diagnosis using spatial light interference microscopy. J Biomed Opt. 20, (11), 111210 (2015).
  19. Lenz, P., et al. Digital holographic microscopy quantifies the degree of inflammation in experimental colitis. Integr Biol (Camb). 5, (3), 624-630 (2013).
  20. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295, (2), 538-544 (2008).
  21. Klokkers, J., et al. Atrial natriuretic peptide and nitric oxide signaling antagonizes vasopressin-mediated water permeability in inner medullary collecting duct cells. Am J Physiol Renal Physiol. 297, (3), 693-703 (2009).
  22. Jourdain, P., et al. Determination of transmembrane water fluxes in neurons elicited by glutamate ionotropic receptors and by the cotransporters KCC2 and NKCC1: a digital holographic microscopy study. J Neurosci. 31, (33), 11846-11854 (2011).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2, (3), 541-546 (2007).
  24. Bettenworth, D., et al. The tripeptide KdPT protects from intestinal inflammation and maintains intestinal barrier function. Am J Pathol. 179, (3), 1230-1242 (2011).
  25. Kemper, B., et al. Modular digital holographic microscopy system for marker free quantitative phase contrast imaging of living cells. Proc. SPIE. 6191, (2006).
  26. Kemper, B., von Bally, G. Digital holographic microscopy for live cell applications and technical inspection. Appl Opt. 47, (4), 52-61 (2008).
  27. Langehanenberg, P., von Bally, G., Kemper, B. Autofocusing in digital holographic microscopy. 3D Research. 2, (1), 1-11 (2011).
  28. Daimon, M., Masumura, A. Measurement of the refractive index of distilled water from the near-infrared region to the ultraviolet region. Applied optics. 46, (18), 3811-3820 (2007).
  29. Przibilla, S., et al. Sensing dynamic cytoplasm refractive index changes of adherent cells with quantitative phase microscopy using incorporated microspheres as optical probes. J Biomed Opt. 17, (9), 0970011-0970019 (2012).
  30. Kemper, B., et al. Integral refractive index determination of living suspension cells by multifocus digital holographic phase contrast microscopy. J Biomed Opt. 12, (5), 054009 (2007).
  31. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (10), 100 (2006).
  32. Marquet, P., et al. Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy. Opt Lett. 30, (5), 468-470 (2005).
  33. Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl Opt. 47, (19), 176-182 (2008).
  34. Hanauer, S. B., et al. Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet. 359, (9317), 1541-1549 (2002).
  35. Colombel, J. F., et al. Adalimumab for maintenance of clinical response and remission in patients with Crohn's disease: the CHARM trial. Gastroenterology. 132, (1), 52-65 (2007).
  36. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. N Engl J Med. 369, (8), 699-710 (2013).
  37. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369, (8), 711-721 (2013).
  38. Monteleone, G., et al. Mongersen, an oral SMAD7 antisense oligonucleotide, and Crohn's disease. N Engl J Med. 372, (12), 1104-1113 (2015).
  39. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384, (9940), 309-318 (2014).
  40. Sandborn, W. J., et al. Ustekinumab induction and maintenance therapy in refractory Crohn's disease. N Engl J Med. 367, (16), 1519-1528 (2012).
  41. Natividad, J. M., et al. Commensal and probiotic bacteria influence intestinal barrier function and susceptibility to colitis in Nod1-/-; Nod2-/- mice. Inflamm Bowel Dis. 18, (8), 1434-1446 (2012).
  42. Melgar, S., et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 8, (6), 836-844 (2008).
  43. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. Int J Clin Exp Pathol. 7, (8), 4557-4576 (2014).
  44. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
  45. Zhao, K., Wang, W., Guan, C., Cai, J., Wang, P. Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells. Mol Biol Rep. 39, (3), 2607-2613 (2012).
  46. Pavillon, N., et al. Early cell death detection with digital holographic microscopy. PLoS One. 7, (1), 30912 (2012).
  47. Hindryckx, P., et al. Clinical trials in ulcerative colitis: a historical perspective. J Crohns Colitis. 9, (7), 580-588 (2015).
  48. Neurath, M. F., Travis, S. P. Mucosal healing in inflammatory bowel diseases: a systematic review. Gut. 61, (11), 1619-1635 (2012).
  49. Bryant, R. V., Winer, S., Travis, S. P., Riddell, R. H. Systematic review: histological remission in inflammatory bowel disease. Is 'complete' remission the new treatment paradigm? An IOIBD initiative. J Crohns Colitis. 8, (12), 1582-1597 (2014).
  50. Marchal Bressenot, A., et al. Review article: the histological assessment of disease activity in ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 42, (8), 957-967 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics