Multimodal Kvantitativ Phase Imaging med Digital Holografisk Microscopy Præcist Vurderer tarmbetændelse og Epithelial Sårheling

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lenz, P., Brückner, M., Ketelhut, S., Heidemann, J., Kemper, B., Bettenworth, D. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54460, doi:10.3791/54460 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Forekomsten af inflammatorisk tarmsygdom, dvs, Crohns sygdom og colitis ulcerosa, steget betydeligt i det seneste årti. Ætiologien for IBD er ukendt og nuværende terapeutiske strategier er baseret på den uspecifikke undertrykkelse af immunsystemet. Udviklingen af ​​behandlinger, der specifikt er målrettet mod tarmbetændelse og epitelial sårheling væsentlig grad kan forbedre forvaltningen af ​​IBD, men dette kræver nøjagtig påvisning af inflammatoriske forandringer. I øjeblikket er potentielle lægemiddelkandidater sædvanligvis evalueret under anvendelse af dyremodeller in vivo eller med cellekultur-baserede teknikker in vitro. Histologisk undersøgelse normalt kræver de celler eller væv af interesse, der skal farves, hvilket kan ændre prøven egenskaber og desuden kan fortolkningen af ​​resultaterne variere fra investigator ekspertise. Digital holografisk mikroskopi (DHM), baseret på påvisning af længden forsinkelse optiske vej, tilladerplet-fri kvantitativ fasekontrast billeddannelse. Dette gør det muligt at underkaste dem en direkte korreleret med absolutte biofysiske parametre. Vi viser, hvordan målingen af ​​ændringer i vævstæthed med DHM, baseret på brydningsindeks måling, kan kvantificere inflammatoriske ændringer, uden farvning, i forskellige lag af colon vævsprøver fra mus og mennesker med colitis. Derudover viser vi kontinuerlig multimodal label-free overvågning af epitelial sårheling in vitro, muligt ved hjælp DHM gennem simpel automatiseret bestemmelse af det sårede område og samtidig bestemmelse af morfologiske parametre såsom tør masse og lagtykkelse på migrerende celler. Afslutningsvis DHM repræsenterer en værdifuld, hidtil ukendt og kvantitativ værktøj til vurdering af tarmbetændelse med absolutte værdier for parametre er muligt, forenkles kvantificering af epitelial sårheling in vitro og har derfor stort potentiale for translationel diagnostisk uSE.

Introduction

Inflammatorisk tarmsygdom (IBD), dvs., colitis ulcerosa (UC) og Crohns sygdom (CD) er idiopatiske inflammatoriske sygdomme i mavetarmkanalen 1. Forskning i den underliggende patofysiologi IBD og evalueringen af ​​potentielle nye lægemidler eller nye diagnostiske metoder er især af betydning. I både grundforskning og den kliniske behandling af IBD patienter har tarmslimhinden blive fokus for opmærksomhed 2,3. Slimhinden betegner en anatomisk grænse, hvor interaktionen mellem kommensale bakterier, epitelceller og forskellige cellulære bestanddele af den intestinale immunsystem iscenesætte gut homeostase 4,5. I IBD patienter, ukontrolleret og vedvarende tarmbetændelse fører imidlertid til mucosale skade, kan påvises som ulcerationer eller stenose, som endelig kan kulminere i nedbrydning af epitelial barrierefunktion, som i sig selv forværrer lokal inflammation 6.

7. Epithelial sårheling kan simuleres i in vitro sårheling assays og i murine modeller af tarmbetændelse 8,9. Både in vitro- og in vivo fremgangsmåder har ulemper, som begrænser nøjagtigheden af eksperimentel vurdering. In vitro-assays, som klassiske scratch assays, kræver langvarige farvningsprocedurer eller transfektion med fluorescerende kromoforer. De er ofte begrænset af deres diskontinuerlig overvågning af celleproliferation og migration, der ikke kan automatiseres 10. In vivo modeller, såsom dextran natriumsulfat (DSS) -induceret colitis, ofte mangler robuste udlæsninger, delvis på grund af den betydelige variation set i laboratoriemarkører, making sådanne markører upassende at evaluere colitis sværhedsgrad 11,12. Histologisk analyse af den betændte slimhinde, er stadig den mest anvendelig metode til bestemmelse colitis sværhedsgrad men dette, som in vitro epiteliale sårhelende assays kræver farvning og er afhængig af investigators ekspertise 13.

Senest digital holografisk mikroskopi (DHM), en variant af kvantitativ fase mikroskopi 14, blev identificeret som nyttigt redskab til evaluering af epitelial sårheling in vitro og in vivo 15. DHM tillader vurdering af væv densitet ved måling af optisk vejlængde forsinkelse (OPD) , hvor der er udsigt roman kræftdiagnose 16-18 og kvantificering af inflammation relateret væv forandringer 19. Derudover DHM tillader overvågning af cellemorfologi dynamik ved at bestemme celle tykkelse, celle dækket overfladeareal og intracellulære (protein) indhold mængde in vitro-assays, DHM muliggør også analyse af fysiologiske processer, fx cellulære vandpermeabilitet ved at evaluere ændringer i cellevolumen og tykkelse 21,22. Desuden kan DHM målinger automatiseres som forhindrer investigator-associeret prøve bias.

Her demonstrerer vi brug af DHM i en musemodel af tarmbetændelse, og gælder også DHM til analyse af humane væv prøver til kvantitativ overvågning af sårheling som en etiket-fri in vitro assay. Først, vi evaluerer inflammatoriske ændringer af forskellige colon væg-lag i colitic mus og vævssnit fra mennesker med IBD. Efter at have beskrevet den kvantitative fase imaging procedure DHM, giver vi detaljerede instruktioner for brug af mikroskop komponenter, udarbejdelse af vævssnit og også beskrive evalueringen af ​​de overtagne fase billeder kvantitative.

Dernæst viser vi, at DHM kan være utilized til kontinuerlig multimodal overvågning af epitelial sårheling in vitro, og beskrive den analyse af cellulære egenskaber som celle lagtykkelse, tørvægt og cellulære volumen giver indsigt i narkotika-induceret og fysiologisk celle forandringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter dyr blev godkendt af den regionale etiske komité (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Tyskland) i henhold til den tyske Animal Protection Law. Den lokale etiske udvalg fra University of Münster godkendt brugen af ​​humane væv til histologisk og mikroskop analyse.

1. Dyr og materialer

  1. Brug kvindelig eller mandlig mus af den krævede DSS-følsom stamme, der vejer 20 til 25 g, og huset i henhold til lokal lovgivning dyr pleje. Giv særlige chow for gnavere og autoklaveres drikkevand ad libitum.
  2. Inducere akut DSS colitis ved indgivelse 3% vægt / volumen dextransulfat-natrium (DSS, molekylvægt: 36,000-50,000 Da) i autoklaveret postevand i 5 dage.
    BEMÆRK: Styrken af DSS er meget variabel alt efter producent og batch. Test din leverandør-forudsat DSS først for induktion af sygdomsaktivitet, som daily kropsvægt er en pålidelig og objektiv indikator.
  3. For histologisk evaluering af colon vævsprøver, aflive mus ved CO 2 insufflation (eller som angivet af nationale og institutionelle retningslinier) i slutningen af forsøget.

2. Eksperimentel opsætning til DSS-colitis og In-vitro sårheling Analyser

  1. Celledyrkning og etablering af sårheling assay.
    1. Grow Caco-2-celler i et fugtigt 95% og 5% CO2 miljø ved 37 ° C. Brug RPMI medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin.
    2. Seed Caco-2-celler ved en densitet på 4 x 10 5 celler / cm2 på 35 mm petriskåle med høj kultur-indsats (se figur 4A).
      BEMÆRK: Indsatsen genererer to cellekulturer dækket områder, der er adskilt med en defineret celle frirum repræsenterer det sårede område, der skal analyseres.
    3. Skift medium to dage efter seeding. Udføre ved først at bortsuge tilbageværende medium med celleaffald ved anvendelse af en automatisk pipette, skylles med 100 pi phosphatpufret saltvand (PBS), og der tilsættes frisk RPMI-medium eller serum-berøvet medium.
    4. Dyrke celler i 24 timer i serum-berøvet medium (0,1% FBS) suppleret med 20 ng EGF / ml serum eller 2 ug mitomycin c / ml serum for at detektere ændringer i sårheling adfærd. Tilføj normal RPMI-medium med kontrolceller i 24 timer.
    5. Efter 24 timer af kultur, fjerne og kassere kultur indsætter som beskrevet i trin 3.4 og udfører DHM.
  2. Induktion af akut DSS colitis
    1. Opløses 3 g DSS i 100 ml autoklaveret vand for at få en 3% (vægt / volumen) DSS opløsning. Tilvejebringe denne opløsning i stedet for drikkevand til mus ad libitum i 7 dage. Beregn 5 ml DSS-opløsning pr mus / dag. Giv autoklaveret vand uden DSS for kontrol mus ad libitum.
  3. Fremstilling af kryostatisk sektioner af murine og humane colon
    1. Aflive mus ved CO 2 insufflation ved slutningen af eksperimentet.
    2. Dissekere dyrenes maven ved laparotomi 23. Fjern hele tyktarmen omhyggeligt med en pincet og skære ileum og rektal ende ved hjælp kirurgiske sakse. Skær tyktarmen med en saks langs fra cecale til den rektale ende og åben tyktarmen. Fjern alle afføring fra prøven ved hjælp af en pincet efterfulgt af vask med PBS 24.
    3. Forbered schweiziske ruller ved at rulle op hele tyktarmen med en vatpind på langs fra cecale til rektal ende med slimhinden buede indad. Integrer colon prøver i optimal skæring temperatur (OLT) sammensatte og holde nedfrosset ved -80 ° C indtil videre anvendelse.
    4. Integrer menneske colon væv fra kirurgiske modellen i optimal skæring temperatur OCT-forbindelse og holde nedfrosset ved -80 ° C indtil videre anvendelse.
    5. Cut sektioner af 7 um tykkelse OLT-sammensatte-embedded prøver ved hjælp af en cryotomig lige før eksamen.
      BEMÆRK: Den optimale tykkelse prøve afhænger af vedholdenhed og spredningen egenskaber af vævstype under efterforskning. For de eksperimenter, der bruger kolon væv, skive tykkelse> 10 um årsag betydelig stigning i støj på grund af lysspredning i kvantitative DHM fase kontrast, mens prøver af tykkelse <5 um viser en højere risiko for skader fremkaldt artefakter fra kryo opskæringen.
    6. Overfør afsnit om til et glas objekt luftfartsselskab slide.

3. Teknisk udstyr, software og procedurer for erhvervelse og evaluering af digitale Hologrammer

  1. Digital holografisk mikroskop til kvantitativ celler og væv imaging
    1. Brug en off-akse Mach-Zehnder digital holografisk mikroskopi for levende celler 25, som vist i figur 1. Kontroller, at mikroskopet er forsynet med en10X mikroskop linse, et mikroskop scene med en holder til glas objekt carrier dias og petriskåle med en diameter på 35 mm, til et varmekammer bevare fysiologisk temperatur ved 37 ° C og software til kvantitativ fase billeddannelse 25.
      BEMÆRK: For eksempel, som beskrevet i Kemper et al 26 og Langehanenberg et al 27...
      BEMÆRK: Alternativt kan du bruge et lignende system, der er i stand til at udføre lysfeltmikroskopi og kvantitativ fase billeddannelse af levende celler og dissekerede væv dias.
    2. Ren mikroskop linse og kondensator med linse rengøring papir og et rengøringsmiddel (f.eks ethanol) som anbefalet af producenten af mikroskop for at fjerne støv eller andre forureninger.
    3. Start købet billedsoftware af DHM mikroskop, skal du vælge "lyse felt" imaging mode og switch "på" hvidt lys belysning. Sikre Köhler-illumination af prøven som anbefalet af mikroskopet producenten under iagttagelse prøven i direkte billedvisning vindue af købet billede software (alternativt en standard erhvervelse billede software kan bruges i dette trin).
      BEMÆRK: Billedet Intensiteten bør fordeles homogent i synsfeltet, og prøven position bør ikke bevæger sig under optisk fokusering med fokus drevet af mikroskopet.
    4. Vælg "DHM" billedtilstand, drej "off" hvidt lys belysning og switch "på" laserlyset. Kontroller, at belysning med laserlys er homogen (dvs. at lysintensitet homogent fordelt i direkte billedvisning vindue af købet imaging software af DHM mikroskop), og konstatere, at off-aksen carrier interferens frynser mønster vises med tilstrækkelig kontrast i optagne billeder (digitale hologrammer).
  2. Fremstilling af cryostatsnit til billeddannelsemed DHM
    1. Tag (afsnit kryostat på et glas objekt luftfartsselskab, tykkelse: 7 pm, som beskrevet i 2.3) prøven ud af fryseren. Afrime prøven i ca. 5 minutter ved stuetemperatur og normal atmosfære.
    2. Der tilsættes 50 - 100 pl phosphatbufret saltvand (PBS) som omsluttende medium på vævssnittet med en pipette, indtil den er helt dækket med puffer. Dæk prøven med en ren glas dækglas (glastykkelse 170 um).
      BEMÆRK: Over-tørring kan fremkalde væsentlige ændringer af brydningsindekset og lysspredende egenskaber af prøven.
    3. Sikre, at bunden af ​​glasset bærer og dækglasset rengøres mod støv og anden forurening, som kan inducere lysspredning. Prøven er klar til efterforskning med lysfeltmikroskopi og DHM.
  3. Kvantitativ fase billeddannelse af vævssnit med DHM
    1. Tænd det digitale holografiske mikroskop, skal du vælge 10X mikroskop linse til billeddannelse. Start image erhvervelse software af DHM mikroskop og vælge lyse fil imaging mode.
    2. Placer væv dias som beskrevet i 2) i holderen mikroskopobjektglasset, med dækglasset vender mikroskopobjektivet.
    3. Switch "på" den lyse felt belysning af DHM mikroskop. Anbring prøven med mikroskopbordet og sikre, at vævet område af interesse er synlig i levende overvågning vinduet. Forbedre skarpheden af ​​billedet ved hjælp af mikroskop fokus drev.
      BEMÆRK: Samt interesseområdet, bør et område med dias uden væv også være til stede i synsfeltet.
    4. Fang et lyst felt billede af skarpt fokuserede prøve ved hjælp købet billedet software.
    5. Vælg "DHM" billedtilstand, drej "off" det hvide lys belysning og slå "på" laserlys belysning på. Vælg "eksponeringstid" for hologram optagelse under 3 ms, konstatere, at holographic off-aksen interferens frynser vises med tilstrækkelig kontrast i direkte billedvisning vindue af købet imaging software og fange et digitalt hologram.
    6. Gentag trin 3.3.3 - 3.3.5 indtil der er registreret et tilstrækkeligt antal af lyse felt billeder og digitale hologrammer af forskellige forsøgsområder. Hologram erhvervelse er nu færdig.
  4. Udarbejdelse af sårheling analyser for DHM billeddannelse
    1. Tænd petriskålen opvarmningskammeret af DHM mikroskop omkring 1 - 3 ud time før starten af ​​forsøget for at sikre stabile temperaturforhold i de DHM målinger.
    2. Forbered arbejdsbænk med det nødvendige udstyr (petriskål til sårheling assay er beskrevet i 2.3): pipetter, pincet, glas låg til petriskål, 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) bufret cellekulturmedium med fysiologisk temperatur (37 ° C) i prøveforberedelse i sterilt miljø.
      BEMÆRK: NaHCO3.
    3. Fjern plastik låg fra petriskålen og fjern cellekulturmediet med en pipette. Fjern indsatsen fra petriskålen bunden med en pincet.
    4. Vask prøven 1 - 2 gange med 1 ml HEPES bufret cellekulturmedium for at fjerne døde celler og tilbageværende cellulære bestanddele (f.eks serum) i sårområdet. Tilsæt 2 ml HEPES bufferet cellekulturmedium og cap petriskålen med glas låg.
    5. Sørg for, at glas låg og petriskålen bunden er renset for støv og anden forurening. Prøve er klar til tidsforskydningen observation med DHM.
  5. Kontinuerlig multimodal overvågning af sårheling in vitro med DHM
    1. Tænd petriskålen opvarmning kammer i DHM mikroskop omkring 1 - 3 ud timer førtil starten af ​​forsøget for at sikre stabile temperaturforhold i de DHM målinger.
    2. Switch "på" den digitale holografiske mikroskop, skal du vælge 10X mikroskop linse til billeddannelse. Start købet billedsoftware af DHM mikroskop og vælg "lyse felt" imaging mode. Sikre, at varmekammeret for petriskålen driver en fysiologisk temperatur (37 ° C).
    3. Anbring petriskålen med sårheling assay fremstillet som beskrevet i 4), i opvarmningskammeret af DHM mikroskop.
    4. Vælg lyse felt imaging mode og placere prøven med mikroskopet scenen under iagttagelse det i live-overvågning vindue af købet billedsoftware af DHM mikroskop. Bemærk at det ønskede område af prøven vises skarpt fokuseret under belysning med hvidt lys.
    5. Capture lyse felt billeder af forskellige områder af prøven (sårområdet og de omkringliggende områder med sammenflydende celler) under hvidtlys belysning med købet billedet software og dokumentets udseende, celle tæthed og ensartethed.
    6. Vælg "lyse felt" billedbehandlingstypen af ​​DHM mikroskop. Vælg en passende sår område under hvidt lys belysning i live-overvågning vinduet med købet billedsoftware af DHM mikroskop. Sørg sårområdet er fri for døde celler og ingen serum rester, og sikre, at begge parter omfatter en enkelt homogen cellelag, helst med lige kanter.
    7. Tag et hvidt lys billede af den oprindelige sårområdet i lyse felt billedbehandlingstype med købet billedsoftware af DHM mikroskop.
    8. Slå "off" hvidt lys belysning, skal du vælge "DHM" mode og switch "på" laser belysning. Vælg en eksponeringstid på under 3 ms for hologram optagelse (observere, at holografiske off-aksen interferens frynser vises med tilstrækkelig kontrast i direkte billedvisning vindue af købet billedet software than DHM mikroskop) og fange et digitalt hologram.
    9. Fang en prøve hologram i DHM tilstand med købet billedet software og rekonstruere en kvantitativ fase billede med genopbygningen software af DHM mikroskop for at kontrollere kvaliteten af ​​billedet.
    10. Vælg en passende tidsforsinkelse (f.eks 3 - 5 min) til time-lapse hologram overtagelse med købet billedsoftware af DHM mikroskop.
    11. Vælg time-lapse dataopsamling af købet billedet software, hvor prøven kun belyses med laserlys under hologram erhvervelse.
    12. Start time-lapse DHM observation af sårhelingen assay.
    13. Stop købet time-lapse efter den påtænkte tid, skal du vælge lyse felt imaging mode og dokumentere endelige udseende af prøven under hvidt lys billeddannelse.
  6. Rekonstruere digitale hologrammer af dissekerede væv og bestemme den gennemsnitlige brydningsindeks som en parameter til at kvantificerevævstæthed
    1. Rekonstruere billeder kvantitative fase fra den digitale hologrammer af dissekerede væv med softwaren til DHM mikroskop, f.eks som beskrevet i Kemper et al. 26 og Langehanenberg et al. 27.
    2. Bestem den gennemsnitlige fasekontrast Δφ i forskellige vævslag (epitel, submucosa, stroma) i passende udvalgte områder af interesse (ROI'er) 19.
    3. Bestem brydningsindekset for indlejringsmediet ved anvendelse af en refraktometer eller alternativt ved anvendelse af en passende værdi fra litteraturen. (brydningsindeksværdier for typiske indlejring medier: n vand = 1,334 28, n phosphatbufret saltvand (PBS) = 1,337 29, n celledyrkningsmedium = 1,337-1,339 29,30).
    4. Beregn brydningsindeks forskellige vævslag fra gennemsnittet fasekontrast værdier 19
      ligning 1 BEMÆRK: I Eq. 1 λ er bølgelængden af laserlyset (her: λ = 532 nm), D er tykkelsen af de dissekerede væv (her: 7 um) og n medium er brydningsindekset for det omsluttende medium (her: n medium = n PBS = 1,337, bestemt af en Abbe-Refractometer).
  7. Rekonstruere og evaluere digitale hologrammer fra time-lapse sårheling serie observation
    1. Rekonstruere billeder kvantitative fase fra det tidspunkt, bortfalder hologram serien opnået under sårheling observation med DHM mikroskop software 26,27.
    2. Normalisér hver serie af kvantitative fase billeder til billedet med maksimal fasekontrast.
    3. Arealet S c, der er omfattet af cellerne i de kvantitative DHM fase billeder ved billedet segmentering, som kan være perdannes ved hjælp af den gratis software celle profiler (www.cellprofiler.org 31).
    4. Beregn den gennemsnitlige fasekontrast af celler Δφ celle i området S c.
    5. Hent den cellulære tørvægt DM fra gennemsnittet fasekontrast Δφ celle i området S c 15
      ligning 2 (2)
      BEMÆRK: I ligning 2 DM betegner den cellulære tørvægt, S c viser det område, der er besat af cellerne og α = 0,002 m2 / kg.
    6. Bestem integralet cellulære brydningsindeks n celle og brydningsindekset for cellekulturmediet n medium. Bestem n celle separat eksperimentelt fra suspenderede celler som beskrevet i 30 og måle n medium med et refraktometer. Alternativt bruge litteratur værdier for n celle 30 og n medium 29,30.
    7. Beregn den gennemsnitlige tykkelse celle d celle fra λ, Δφ celle, n celle og n medium 26,32
      ligning 3 (3)
      BEMÆRK: I Eq. 3 parameteren d celle er den gennemsnitlige celle tykkelse, λ betegner lyset bølgelængde af laserlyset, Δφ celle angiver den gennemsnitlige fasekontrast, og n celle og n medium er integralet cellulære brydningsindeks og brydningsindekset for det omgivende medium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Typisk Opsætning til DHM Imaging for Digital Holografisk Microscopy (DHM)

For at udføre lyse felt billedbehandling og kvantitativ DHM fase kontrast imaging, vi anvendte et omvendt mikroskop som vist i figur 1 B. Systemet blev modificeret ved at fastgøre en DHM modul, som tidligere beskrevet 25. Digitale hologrammer blev genereret ved belysning af prøven med lys af en frekvens-fordoblet Nd: YAG laser λ = 532 nm) i Mach-Zehnder-konfigurationen (figur 1 A). Dissekerede væv blev analyseret ex vivo på glas carrier objektglas. Living cellekulturer blev observeret i specielle petriskåle til iagttagelse sårheling som vist i fig. 1 C. Prøverne blev afbildet i transmission belysning via en 10X microscope linse (NA = 0,3) og et rør linse. En afgift-coupled device-kamera blev brugt til at optage interferensmønstre (digitale off-axis hologrammer), der genereres ved at overlejre prøve billede (objekt bølge) den med lidt på skrå henvisningen bølge. De digitalt optagne hologrammer blev rekonstrueret af rumlig faseskift genopbygning i kombination med valgfri holografisk autofokusering 26,33.

Vurdering af murint DSS-induceret colitis ved DHM

Akut colitis blev induceret i mus ved administrering af 3% vægt / volumen dextransulfat-natrium (DSS) i drikkevandet i 5 dage. Manifestation og forløbet af colitis blev fulgt ved overvågning for gradvis vægttab i DSS-behandlede gruppe sammenlignet med kontrolgruppen. (Figur 2 A tilpasset fra 19). Endoskopisk, moderat til svær colitis blev observeret som afspejlet ved fortykkelse af colon væg, ændringer af vaskulær mønster (f.eks spontan blødning, rød pil), fibrin udsvedning (hvid pil) og granularitet af slimhindeoverfladen (figur 2B). Konventionel histologisk evaluering af hematoxylin og eosin (HE) farvet colon sektioner afslørede markant ødem i colon væg af DSS-behandlede vers kontroldyr, fortrinsvis beliggende i submucosa (Figur 2 C grå pil). Tilsvarende kvantitative DHM fase kontrast og relaterede brydningsindeks kort hentes af ligning 1, afbildet også de ovennævnte vævsforandringer. Derudover brydningsindekset, kodet til 256 gråtoner, angivet forskelle i densitet i vævslag herunder epitelet (hvid pil) og stroma (sort pil) i native, ufarvede vævsprøver (figur 2 C). Brydningsindekset blev reduceret betydeligt i epitelet samt i submucosa og stroma af de colitic mus sammenlignet med de raske kontroller (figur 2 E). Derudover kunne en signifikant korrelation mellem den kliniske parameter (relativt tab af legemsvægt) og den absolutte fysiske parameter (brydningsindeks) observeres (R2 lineære = 0,64; Figur 2 D, tilpasset fra 19).

Vurdering af Crohns sygdom hos mennesker ved DHM

Crohns sygdom er ofte identificeret ved bemærkelsesværdige inflammatoriske ændringer af tarmvæggen, opdaget af gastrointestinal endoskopi. Karakteristiske makroskopiske egenskaber omfatter detaljeringsgrad af slimhindeoverfladen, langsgående sår med fibrin exudationer (også omtalt som "snail trails") og spontan blødning (figur 3 A). Histologisk evaluering af HE farvning af vævsprøver fra patienter med aktiv CD ofte afslører colon væg samt submucosa ødem. Tilsvarende kvantitative DHM fase kontrast og relaterede brydningsindeks kort hentes af ligning 1 også detekteret inflammatorisk-medieret forstærkning / hævelse af colon væg, her ses i epitel (Figur 3 B). Endvidere brydningsindeks som en absolut parameter, blev også signifikant reduceret i alle væglag (epitel, submucosa og stroma) i colon vævsprøver fra patienter med aktiv CD vers dem i remission (Figur 3 C).

Multimodal Overvågning af sårheling In vitro

Caco-2 celler sårhelende assays blev udført ved anvendelse af en speciel petriskål til at give standardiserede betingelser. Skålen er udstyret med en kultur insert danner to forskellige kamre, som er adskilt af et mellemrum på 500 um (figur 4 A). At simulere forskellige fysiologiske miljøer blev celler undersøgt enten uden behandling, stimuleret af epidermal vækstfaktor (EGF) eller inhiberes med mitomycin C. Den DHM opsætning tillader kontinuerlig overvågning af sårhelingsprocessen over tid, afbildet her ved repræsentative kvantitative DHM fase kontrast (kodet til 256 gråtoner) efter 0, 22,5 og 45 timer efter starten af forsøget (figur 4 B). Tilsvarende falske farvekodede pseudo 3D plots i figur 5 illustrerer den rumlige udvikling af tykkelsen cellelaget i tre disioner. Baseret på vejlængde forsinkelse det optiske, det cellulære brydningsindeks og ligninger 2 og 3, DHM muliggør samtidig dynamisk vurdering af migration, proliferation og morfologi ved tidsmæssig overvågning af cellulære egenskaber såsom celle dækket overfladeareal, gennemsnitlig cellestørrelse tykkelse og cellulær tørvægt ( Figur 4 C). Sammenfattende dataene i figur 4 illustrerer, at EGF simulering resultater i en hurtigere migration af celler i sårområdet, i en forøget gennemsnitlig celle tykkelse og i en højere tør masse i synsfeltet sammenlignet med kontrolceller. I modsætning hertil mitomycin C hæmmede celler dækker en let formindsket overfladeareal end kontrolceller i løbet af forsøget og viser også en lidt lavere tør masseforøgelse. Imidlertid synes den gennemsnitlige tykkelse celle klart faldet i forhold til både, stimuleres og kontrol celler.


Figur 1. Udnyttet Off-aksen Opsætning til Digital Holografisk Microscopy (DHM). Skematisk opsætning af DHM arbejdsstation (A). Tilsvarende fotografi, der viser mikroskopet setup (skærm, levende billede og styresoftware (1), off-axis setup digital mikroskop (2), (B), den optiske vej af mikroskopet (grøn stiplet linje) og en prøve (angivet med en rød arrow, (C)). klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Vurdering af murint DSS-induceret colitis ved DHM. Forløbet af colitis blev efterfulgt af daglige migasurement af relativ kropsvægt og gentagen endoskopisk opfølgende undersøgelse. En massiv tab af relativ kropsvægt fra dag 4 efter start DSS administration (tilpasset fra 19) (A) blev ledsaget af endoskopiske tegn på etablerede colitis, herunder fokale ulcerationer og slimhinder sårbarhed (B). Analyse af konventionelle HE-farvede kryostatisk sektioner afslørede submukøst ødem, fortykkelse af muscularis og en udtalt slimhinde-inflammatorisk infiltrat i slimhinden. Tilsvarende kvantitative DHM fase kontrast og relaterede brydningsindeks kort hentes af ligning 1 (kodet til 256 gråtoner) bekræftede de ødematøse ændringer i submucosa under den inflammatoriske proces (hvid pil angiver epitel, grå submucosa og sort stroma) (C). Den relative tab af kropsvægt (en klinisk parameter) signifikant korreleret med brydningsindeks (en absolut fysisk parameter, R2 lineær = 0,64; (D), tilpasset fra 19), som i væsentlig grad blev reduceret i epitelet samt i submucosa og stroma af de colitic mus sammenlignet med de raske kontroller (middel ± SEM, *** P <0,001;. E) venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Vurdering af Crohns sygdom hos mennesker ved DHM. Colon vævsprøver fra patienter med endoskopisk og histologisk bekræftet Crohns sygdom blev undersøgt (A). HE-farvning viste forlængelse af mucosale krypter og et markant infiltrat af inflammatoriske celler. Endvidere påvistes submukøse ødemer og udvidelse af muscularis propria. Analyse af corresponding kvantitative DHM fase kontrast og relaterede brydningsindeks kort hentes af ligning (1) (kodet til 256 gråtoner) afslørede også ødematøse ændringer (her angivet med en hvid og sort stjerne) i epitel (B). Blev påvist signifikante forskelle i gennemsnitlige brydningsindeks i prøver fra CD patienter med aktiv flare (klare søjler) eller remission (sorte søjler). Disse forskelle ses i hver vævstype (gennemsnit ± SEM, *** P <0,001; C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Overvågning af Epithelial Wound Healing af White Light Microscopy og DHM. Dyrkede celler var transferred i petriskåle med særlige indsatser (rød pil). Før kultur insertioner blev fjernet, blev celler behandlet med enten EGF eller mitomycin C i 24 timer, eller behandlet med medium alene (ustimuleret kontrol) (A). Efter fjernelse af kultur skær, blev sårheling løbende overvåges ved fasekontrast billeddannelse af DHM over tid. Cell skitserer klart kunne genkendes. Repræsentative kvantitative DHM fasekontrast billeder vises ved begyndelsen af forsøget, efter 22,5 timer og ved afslutningen af målingen efter 45 timer (B). Panel (C) viser de tilsvarende midlertidige ændringer i celle-dækkede overflade (S c), tykkelsen gennemsnitlige celle (d celle) og den cellulære tørvægt (DM). Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 5. Illustration af Cell Layer Morfologi Ændringer af Falske Farvekodede Pseudo 3 D Plots af de kvantitative DHM fasekontrast billeder. Repræsentative falske farvekodede pseudo 3D plots af de kvantitative DHM fase kontrast billeder i figur 4B ved t = 0, efter 22,5 timer og ved afslutningen af målingen efter 45 timer, viser rumlig udvikling af tykkelsen af cellelag for kontrol-, Mitomycin c-hæmmede og EGF-stimulerede celler i 3D. klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi viser, at DHM giver nøjagtig vurdering af histologiske skader i murine colitis modeller og prøver menneskelige colon væv ex vivo. Desuden er vi vist DHM kan løbende overvåge epitelial sårheling og samtidig give multimodal information om cellulære ændringer. I DHM, er genopbygningen af digitalt tilfangetagne hologrammer udføres numerisk 32. Derfor, i sammenligning med lysfeltmikroskopi, Zernike fasekontrast og differentieret interferens kontrast mikroskopi, DHM giver kvantitativ fasekontrast med valgfri efterfølgende numerisk korrektion fokus (multi-fokus imaging) 27. Kvantitativ fase billeddannelse er baseret på bestemmelse af ændringer lysvej og er således yderst uafhængig af måleindretningen anvendes. Dette forenkler sammenligning af måledata, der er opnået med forskellige instrumenter. Desuden DHM kræver kun lav lysintensitet for object belysning. Dette muliggør en minimalt invasiv analyse af ufarvede dissekerede væv og minimerer mængden af ​​prøven interaktion kræves under langsigtede time-lapse observationer af levende celler.

Den terapeutiske armamentarium for IBD har betydeligt udvidet i løbet af de to sidste årtier. Udover indførelsen af anti-TNF-α terapier, som er effektive i både UC og CD og har acceptable bivirkningsprofiler, roman og specifikke antistoffer rettet mod integriner blev for nylig introduceret til klinisk praksis 34-37. Flere andre lovende midler er i øjeblikket ved at blive evalueret for deres terapeutiske virkning i IBD 38-40. forud for den kliniske anvendelse på mennesker, effekt og sikkerhed af disse potentielle behandlinger skal dog bevises i dyreforsøg. DSS-induceret colitis er en af de mest hyppigt anvendte murine colitis modeller, på grund af sin høje reproducerbarhed og lave omkostninger 23. Desuden er denne model kan alså anvendes på genetisk ændrede mus stammer 41. Mens systemiske markører, fx CRP, er meget varierende i dyremodeller, histologisk vurdering af tyktarmen er den mest gyldige metode til at vurdere sygdommens sværhedsgrad 42,43. Alligevel kvantitativ vurdering af histologisk inflammation ifølge pointsystemer er meget afhængig af investigator ekspertise og erfaring. Automatiseret vurdering og scoring efter objektive parametre som muligt med DHM overvinder disse begrænsninger, og desuden er også tidsbesparende, undgå behovet for farvning 19. Endvidere kan DHM anvendes til at undersøge kirurgiske colon prøver samt mucosa prøver udtaget ved endoskopi.

Epiteliale regenerering og sårheling er en central mekanisme under flere patologiske proces, herunder gastrointestinal ulceration eller anastomotiske lækage. Mens der er lovende tilgange til at vurdere epitelial sårheling hos vivo 44, disse teknikker kræver sofistikerede undersøgelse værktøj og er i øjeblikket ikke bredt tilgængelige. Derfor øjeblikket epitel heling er almindeligt undersøgt af scratch-assays in vitro 9. Disse assays tillader gyldig undersøgelse af sårlukning men normalt først kræver cellefarvning, som derefter forhindrer gentagen evaluering 10,45. Desuden kan ingen cellulær ombygning data erhverves sideløbende med denne forsøgsopstillingen. Imidlertid kan denne information være af stor betydning, da det kan bruges til at skelne mellem apoptose og nekrose 46 og for at vurdere celledeling og migration 46. Derfor er muligheden for at bestemme celle tykkelse, tørvægt eller væv tæthed samtidigt til overvågning af sårlukning ved DHM undersøgelse er af stor værdi i slimhinde forskning.

Behandling mål for human IBD patienter er blevet konstant forandring i de seneste årtier <sup> 47. Mens det i begyndelsen kontrol af inflammation blev anset for at være af største vigtighed, senere steroid-fri remission og nu slimhindeheling er primære mål for behandling 48. For nylig blev det en hypotese, at histologisk remission selv kan være bedre end slimhindeheling alene 49. Mens der er et par histologiske pointsystemer til rådighed til human IBD, er imidlertid fortsat den inter-observatør variation høj 50. Derfor er der behov for en standardiseret procedure for evaluering af histologiske colon prøver. DHM kan bidrage til dette mål og bør yderligere evalueret i et prospektivt klinisk forsøg med humane IBD patienter.

I den eksperimentelle procedure, stilles der prøverne belyst og filmede med stærkt kohærent laserlys. Derfor er beslutningen i DHM primært begrænset ved lysspredning og diffraktion virkninger forårsaget af forskydning af belysningen prøven, tykke prøver, støv ellerandre urenheder, såsom kondenseret vand i den optiske bane. For at opnå meget præcise måledata fra kvantitative DHM fase kontrast, omhyggelig forberedelse og tilpasning af DHM setup og prøven er de vigtigste trin i protokollen. Grundigt rengjort optiske billeddannende elementer, især mikroskopet kondensator og mikroskop mål, er forpligtet til at minimere støj. Også prøvebærer dias, petriskål låg og bund samt det udnyttede celledyrkningsmediet bør være fri for partikelformige urenheder. Dette opnås ved omhyggelig rengøring af alle komponenter og tilstrækkelig filtrering af de anvendte væsker.

Mere detaljerede fejlfinding tips er som følger: hvis den digitale hologram og / eller de kvantitative DHM fase billeder af dissekerede væv er støjende, kan glasset luftfartsselskab og dækglas være forurenet med støv. Hvis ja, rengøre glasset luftfartsselskab og dækglasset med alkohol (f.eks ren ethanol). Hvis den tykkeness af dissekerede væv er for stor (> 10 um) og dermed resulterer i lysspredning, så prøv med tyndere vævssnit. I tilfælde af at belysningen med laserlys ikke er homogent fordelt, justere objektet belysning via mikroskoper kondensatoren. Hvis kondenseret vand på bunden af ​​glasset låget inducerer spredende effekter, kontrollere temperaturen af ​​opvarmningskammeret og rumfugtighed. I tilfælde celledensiteten er for høj eller cellevækst i mere end et lag, reducere celledensiteten under fremstilling af sårheling assays. Endelig, som DHM er baseret på princippet om interferometri, metoden er følsom over for vibrationer eller andre mekaniske forstyrrelser, som varierer efter den enkelte laboratoriemiljø. Men sådanne påvirkninger som regel kan minimeres ved tilstrækkeligt valgte eksponeringstider (typisk i millisekunder eller under) for holografi optagelse under udarbejdelsen af ​​forsøgsopstillingen.

sammenfattende, Vores resultater viser, at DHM besidder store fordele i forhold lysfelt og eksisterende fasekontrast billeddannelse mikroskopi teknikker såsom Zernike fasekontrast og DIC grund af sin evne til kvantitative vurderinger histologisk inflammation ex vivo i en næsten automatiseret måde. Endvidere DHM tillader label-free kontinuerlig multimodal evaluering af epitelial sårheling in vitro med minimeret interaktion med prøverne. Dette baner vejen til automatiserede histologisk undersøgelse i form af '' digital patologi '' og yderligere udvidede undersøgelser for at udforske den translationelle potentiale DHM på patienter med IBD. Desuden DHM tilbyder hidtil ukendt in vitro muligheder for kvantitativt studere cellemigrering, morfologi og proliferation.

Oversættelsen af ​​DHM til klinisk praksis har potentiale til at forbedre IBD diagnose. Som DHM tillader kvantificering af forskellige grader af tarmbetændelse viafysiske parametre såsom ændringer densitet, en objektiv og mere præcis vurdering af sygdommen i betydningen en "digital patologi" synes muligt. Den objektive vurdering kan have en betydelig indvirkning på den kliniske behandling af IBD patienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Azoxymethane (AOM) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany A5486
Cell Culture Flask Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 658170
Costar Stripette Corning Inc., New York, USA 4488
Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
DMEM/Ham's F12 PAA Laboratories - Pasching - Austria E15-813
EGF Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany SPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
Falcon Tube 50 ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070
Isopentane (2-Methylbutane) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M32631-1L
Methylene blue Merck, Darmstadt, Germany 1159430025
Mitomycin C Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M4287
Microscope Slides G. Menzel, Braunschweig, Germany J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583
Pen/Strep/Amphotericin B Lonza, Verviers, Belgium 1558
Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
RPMI 1640 Lonza, Verviers, Belgium 3626
Sodium Chloride 0.9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
Trypsin EDTA Lonza, Verviers, Belgium 7815
Vitro – Clud R. Langenbrinck, Teningen, Germany 04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high ibidi GmbH, Munich, Germany 81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert ibidi GmbH, Munich, Germany 80050
Equipment
MICROM HM550 Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA 46320
Digital holographic microscope
Component Model Company
Inverted Microscope iMIC Till Photonics, Graefelfing, Germany
Laser Compass 315M Coherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lens Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 Zeiss, Goettingen, Germany
CCD camera DMK 41BF02 The Imaging Source, Bremen, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369, (9573), 1641-1657 (2007).
  2. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114, (3), 385-391 (1998).
  3. Florholmen, J. Mucosal healing in the era of biologic agents in treatment of inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 50, (1), 43-52 (2015).
  4. Merga, Y., Campbell, B. J., Rhodes, J. M. Mucosal barrier, bacteria and inflammatory bowel disease: possibilities for therapy. Dig Dis. 32, (4), 475-483 (2014).
  5. Young, V. B., Kahn, S. A., Schmidt, T. M., Chang, E. B. Studying the Enteric Microbiome in Inflammatory Bowel Diseases: Getting through the Growing Pains and Moving Forward. Front Microbiol. 2, 144 (2011).
  6. Atreya, R., Neurath, M. F. IBD pathogenesis in 2014: Molecular pathways controlling barrier function in IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12, (2), 67-68 (2015).
  7. Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Front Biosci. 4, 303-309 (1999).
  8. Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, (2), 369-372 (1973).
  9. Singh, A., Nascimento, J. M., Kowar, S., Busch, H., Boerries, M. Boolean approach to signalling pathway modelling in HGF-induced keratinocyte migration. Bioinformatics. 28, (18), 495-501 (2012).
  10. Sakalar, C., et al. Pronounced transcriptional regulation of apoptotic and TNF-NF-kappa-B signaling genes during the course of thymoquinone mediated apoptosis in HeLa cells. Mol Cell Biochem. 383, (1-2), 243-251 (2013).
  11. Serada, S., et al. Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity biomarker in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 18, (11), 2169-2179 (2012).
  12. Turovskaya, O., et al. RAGE, carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis. Carcinogenesis. 29, (10), 2035-2043 (2008).
  13. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
  14. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors (Basel). 13, (4), 4170-4191 (2013).
  15. Bettenworth, D., et al. Quantitative stain-free and continuous multimodal monitoring of wound healing in vitro with digital holographic microscopy. PLoS One. 9, (9), 107317 (2014).
  16. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Sci Rep. 5, 9976 (2015).
  17. Wang, Z., Tangella, K., Balla, A., Popescu, G. Tissue refractive index as marker of disease. J Biomed Opt. 16, (11), 116017 (2011).
  18. Majeed, H., et al. Breast cancer diagnosis using spatial light interference microscopy. J Biomed Opt. 20, (11), 111210 (2015).
  19. Lenz, P., et al. Digital holographic microscopy quantifies the degree of inflammation in experimental colitis. Integr Biol (Camb). 5, (3), 624-630 (2013).
  20. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295, (2), 538-544 (2008).
  21. Klokkers, J., et al. Atrial natriuretic peptide and nitric oxide signaling antagonizes vasopressin-mediated water permeability in inner medullary collecting duct cells. Am J Physiol Renal Physiol. 297, (3), 693-703 (2009).
  22. Jourdain, P., et al. Determination of transmembrane water fluxes in neurons elicited by glutamate ionotropic receptors and by the cotransporters KCC2 and NKCC1: a digital holographic microscopy study. J Neurosci. 31, (33), 11846-11854 (2011).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2, (3), 541-546 (2007).
  24. Bettenworth, D., et al. The tripeptide KdPT protects from intestinal inflammation and maintains intestinal barrier function. Am J Pathol. 179, (3), 1230-1242 (2011).
  25. Kemper, B., et al. Modular digital holographic microscopy system for marker free quantitative phase contrast imaging of living cells. Proc. SPIE. 6191, (2006).
  26. Kemper, B., von Bally, G. Digital holographic microscopy for live cell applications and technical inspection. Appl Opt. 47, (4), 52-61 (2008).
  27. Langehanenberg, P., von Bally, G., Kemper, B. Autofocusing in digital holographic microscopy. 3D Research. 2, (1), 1-11 (2011).
  28. Daimon, M., Masumura, A. Measurement of the refractive index of distilled water from the near-infrared region to the ultraviolet region. Applied optics. 46, (18), 3811-3820 (2007).
  29. Przibilla, S., et al. Sensing dynamic cytoplasm refractive index changes of adherent cells with quantitative phase microscopy using incorporated microspheres as optical probes. J Biomed Opt. 17, (9), 0970011-0970019 (2012).
  30. Kemper, B., et al. Integral refractive index determination of living suspension cells by multifocus digital holographic phase contrast microscopy. J Biomed Opt. 12, (5), 054009 (2007).
  31. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (10), 100 (2006).
  32. Marquet, P., et al. Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy. Opt Lett. 30, (5), 468-470 (2005).
  33. Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl Opt. 47, (19), 176-182 (2008).
  34. Hanauer, S. B., et al. Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet. 359, (9317), 1541-1549 (2002).
  35. Colombel, J. F., et al. Adalimumab for maintenance of clinical response and remission in patients with Crohn's disease: the CHARM trial. Gastroenterology. 132, (1), 52-65 (2007).
  36. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. N Engl J Med. 369, (8), 699-710 (2013).
  37. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369, (8), 711-721 (2013).
  38. Monteleone, G., et al. Mongersen, an oral SMAD7 antisense oligonucleotide, and Crohn's disease. N Engl J Med. 372, (12), 1104-1113 (2015).
  39. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384, (9940), 309-318 (2014).
  40. Sandborn, W. J., et al. Ustekinumab induction and maintenance therapy in refractory Crohn's disease. N Engl J Med. 367, (16), 1519-1528 (2012).
  41. Natividad, J. M., et al. Commensal and probiotic bacteria influence intestinal barrier function and susceptibility to colitis in Nod1-/-; Nod2-/- mice. Inflamm Bowel Dis. 18, (8), 1434-1446 (2012).
  42. Melgar, S., et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 8, (6), 836-844 (2008).
  43. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. Int J Clin Exp Pathol. 7, (8), 4557-4576 (2014).
  44. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
  45. Zhao, K., Wang, W., Guan, C., Cai, J., Wang, P. Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells. Mol Biol Rep. 39, (3), 2607-2613 (2012).
  46. Pavillon, N., et al. Early cell death detection with digital holographic microscopy. PLoS One. 7, (1), 30912 (2012).
  47. Hindryckx, P., et al. Clinical trials in ulcerative colitis: a historical perspective. J Crohns Colitis. 9, (7), 580-588 (2015).
  48. Neurath, M. F., Travis, S. P. Mucosal healing in inflammatory bowel diseases: a systematic review. Gut. 61, (11), 1619-1635 (2012).
  49. Bryant, R. V., Winer, S., Travis, S. P., Riddell, R. H. Systematic review: histological remission in inflammatory bowel disease. Is 'complete' remission the new treatment paradigm? An IOIBD initiative. J Crohns Colitis. 8, (12), 1582-1597 (2014).
  50. Marchal Bressenot, A., et al. Review article: the histological assessment of disease activity in ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 42, (8), 957-967 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics