Formação Light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular

Bioengineering
 

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Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), e54462, doi:10.3791/54462 (2016).

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Abstract

Clique químicos têm sido investigados para utilização em numerosas aplicações biomateriais, incluindo a entrega de drogas, engenharia de tecidos, e cultura de células. Em particular, as reacções de clique luz-mediadas, tais como reacções de tiol-eno-ino e tiol fotoiniciada, proporcionar controlo sobre as propriedades do material espaço-temporal e permitir a concepção de sistemas com um elevado grau de controlo das propriedades dirigido pelo utilizador. Fabricação e modificação dos biomateriais à base de hidrogel, utilizando a precisão proporcionada pela luz e a versatilidade oferecido por estes químicos tiol-X Photoclick são de interesse crescente, em particular para a cultura de células dentro bem definidas, microambientes biomiméticos. Aqui, descrevemos métodos para a photoencapsulation de células e subsequente photopatterning de pistas bioquímicos dentro de matrizes de hidrogel usando blocos versáteis e modulares de construção polimerizados por uma reação Photoclick tiol-eno. Especificamente, uma abordagem é apresentada para constructing hidrogéis de aliloxicarbonilo (Alloc) e ligações cruzadas de péptidos -functionalized unidades peptidicas pendente funcionalizado e poli-tiol (etileno glicol) (PEG), que polimeriza rapidamente na presença de fotoiniciador acylphosphinate lítio e doses cytocompatible de longo comprimento de onda ultravioleta (UV). Facile técnicas para visualizar e quantificar a photopatterning concentração de péptidos adicionados são descritos. Além disso, os métodos são estabelecidos para as células de encapsulação, especificamente as células estaminais mesenquimais humanas, e determinar a sua viabilidade e actividade. Enquanto a formação e padronização inicial de hidrogéis tiol-Alloc são mostradas aqui, estas técnicas podem ser amplamente aplicada a um número de sistemas de materiais de outra fonte de luz e radicais iniciados (por exemplo, tiol-norborneno, tiol-acrilato) para gerar substratos padronizados.

Introduction

Clique químicas são cada vez mais utilizados na concepção de materiais para diversas aplicações biomédicas, incluindo a entrega de drogas, engenharia de tecidos e cultura de células controlado, devido às suas e eficientes, e muitas vezes reacções cytocompatible seletivos. 1-3 Photoclick químicas que utilizam luz para desencadear ou iniciar reacções (por exemplo, azida-alcino, 4 tiol-eno, e 5-tetrazolo alceno 6) são de particular interesse para a formação ou a modificação de biomateriais. Taxas rápidas sob condições suaves e controle de quando e onde eles ocorrem com luz fazem essas reações bem adequada para o controle dirigido pelo usuário de propriedades de biomateriais na presença de células 7,8, em particular., Têm sido utilizados produtos químicos tiol-eno Photoclick para gerar biomateriais à base de hidrogel com propriedades mecânicas consistentes e 5,9 para o encapsulamento de uma ampla variedade de tipos de células, incluindo, mas nãot limitado a, células estaminais mesenquimais humanas (hMSCs), fibroblastos, condrócitos, células pancreáticas, e com promessa para cultura de células e de entrega. 10,11 Além disso, estes produtos químicos têm sido utilizados para o padrão espacial de sinais bioquímicos para imitar aspectos fundamentais de microambientes celulares nativas e facilitar as interações célula-matriz apropriadas, incluindo a adesão, diferenciação e invasão. 3,12

Para a construção de hidrogéis tiol-eno com luz, péptidos contendo cisteína (tiol) comumente reagem com polímeros funcionalizados com acrilatos ou norbornenos ( 'ene') para uma rápida, a polimerização fotoiniciada em condições cytocompatible. 13 A expansão desta caixa de ferramentas, procurou-se estabelecer métodos para a formação de hidrogel com novos blocos de construção versátil e acessível que exigiam processamento sintético mínimo ou comercialmente disponíveis para a sua ampla utilização como matrizes extracelulares sintéticas.14 Especificamente, os péptidos foram modificados com aliloxicarbonilo (Alloc)-protegido lisinas: um para pingente, grupos de ligação de integrina para promover a adesão celular [K (alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] ou dois para ligações cruzadas não degradáveis ou células-degradáveis [K ( alloc) RGKGRKGK (alloc) G ou KK (alloc) GGPQGIWGQGK (alloc) K = Pep2Alloc, respectivamente]. Com estas sequências, foram estabelecidas as condições de reacção rápida (1-5 min) com quatro braços de poli-tiol modificado (etileno glicol) (PEG4SH) utilizando doses cytocompatible de luz UV de comprimento de onda longo (10 mW / cm2 a 365 nm) e o fotoiniciador lítio fenil-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). Os hidrogéis resultantes eram estáveis ​​sob condições de cultura de células para semanas. Para permitir que a degradação e remodelação conduzido de células, um péptido enzimaticamente clivável foi incorporada dentro das ligações cruzadas de gel (isto é, GPQGIWGQ), 15 e uma célula primária modelo, as células estaminais mesenquimais humanas (hMSCs), manteve-se altamente viáveis após encapsulação e durang cultura dentro destas matrizes. Além disso, os péptidos foram espacialmente modelado dentro destes materiais, e hMSCs permanecem viáveis ​​e metabolicamente ativo em condições photopatterning. Sequências peptídicas pingente alternativos, não mostrado aqui (por exemplo, IKVAV, YIGSR, GFOGER, etc), também podem ser incorporados dentro de matrizes para investigar interacções celulares adicionais com o microambiente circundante. Estes resultados são promissores para a aplicação destes materiais à base de hidrogel para a cultura tridimensional (3D) de células e de entrega e para estudar as interacções célula-matriz directos para uma variedade de tipos de células.

Nisto, os métodos para photoencapsulate células e sinais bioquímicos subsequentemente photopattern dentro do sistema proposto hidrogel são apresentados (Figura 1). Técnicas para observar e quantificar estas photopatterns também são demonstradas: nomeadamente, i) a utilização quantitativa e qualitativa do ensaio de Ellman para determinar a modificação de tióis livres dentro substratos estampados e ii) a utilização qualitativa complementar de peptídeos fluorescentes (AF488Pep1Alloc) para observar esses padrões em três dimensões. Além disso, ensaios para determinar a viabilidade (ao vivo / morto viabilidade / citotoxicidade coloração) e actividade metabólica (MTS; 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazólio) são apresentados para que os usuários podem determinar a citocompatibilidade de condições photoencapsulation e photopatterning para diferentes linhas de células dentro de matrizes de hidrogel. Enquanto que o protocolo é demonstrado por um sistema Photoclick hidrogel à base de luz fácil, as técnicas podem ser aplicadas a vários outros sistemas de hidrogel radicalmente-iniciadas para photoencapsulation photopatterning e na presença de células.

Protocol

1. Preparação de Materiais para a formação de hidrogel

  1. Sintetizar pingente (Pep1Alloc, AF488Pep1Alloc) e peptídeos de reticulação (Pep2Alloc) por síntese de peptídeos em fase sólida padrão (SPPS) técnicas e funcionalizado com tiol polímero por meio do processo de três passos para a modificação do grupo terminal (PEG4SH). 14,16 alternativa, comprar PEG4SH (M N ~ 20 kDa), Pep1Alloc, e Pep2Alloc comercialmente.
  2. Sintetizar o fotoiniciador (LAP) pela reação de duas etapas descritas abaixo. 14,17 Execute as etapas de síntese (1.2.1-1.2.11) em um exaustor e tenha cuidado ao manusear produtos químicos (usar luvas, roupas e óculos) . LAP também podem ser adquiridos comercialmente.
    1. Dry todos os vidros no forno (> 2 horas, 80 ° C).
    2. Adicionar uma barra de agitação com um frasco vazio-neck único fundo redondo (100 ml) e tampa com um septo.
    3. Fixe o balão no topo de uma placa de agitação quente magnética com um stand de anel e grampo.
    4. EuNSERT uma agulha (18 L) através do septo e deixar a extremidade externa aberta para a atmosfera. Insira uma segunda agulha acoplada a uma linha de gás inerte. Abra a linha de gás inerte (por exemplo, árgon ou azoto) e purgar o balão durante 10-15 min.
      NOTA: O sistema vai ser continuamente purgado com gás inerte, de árgon ou de azoto, ao longo da reacção.
    5. Transferência de 1,5 g (~ 1,4 ml) phenylphosphonite dimetil (CUIDADO) ao frasco, utilizando uma seringa com a agulha para perfurar o septo. Ligue a placa de agitação (velocidade média) e ter cuidado para que o conteúdo não espirrar para os lados do balão.
    6. Adicionar 1,6 g (~ 1,46 mL) de cloreto de 2,4,6-trimetilbenzoil (CUIDADO) gota a gota ao balão contendo phenylphosphonite de dimetilo, utilizando uma seringa com uma agulha para perfurar o septo.
    7. Cobrir o vaso de reacção com uma folha para proteger da luz e agita-se durante 18 h sob atmosfera de árgon ou de azoto.
    8. No dia seguinte, aumentar a altura do frasco, colocar num banho de óleo sobre o agitador, umnd baixe cuidadosamente o balão no banho de óleo. Aqueça o banho e o balão a 50 ° C enquanto se mantinha agitação magnética.
    9. Dissolve-se brometo de lítio 3,05 g em 50 ml de 2-butanona. Elevar o balão do banho de óleo e adicionar a solução de brometo de lítio ao frasco de fundo redondo, removendo rapidamente o septo para derramar para dentro do frasco.
      1. Fecha-se o frasco novamente com o septo (CUIDADO: Septo ainda terá uma agulha que leva às linhas de árgon e uma agulha para ventilar), baixar o frasco volta para o banho de óleo aquecido, e deixar a reacção prosseguir durante 10 min. Um precipitado sólido vai formar.
    10. Depois de 10 minutos, desligar árgon, retirar o balão do calor, e deixe a mistura repousar durante 4 horas (coberto de uma camada para proteger da luz como um iniciador sensível à luz foi produzido. Manter o lugar da agulha de ventilação.
    11. Deite o produto para um funil de frita de vidro ou funil revestido com papel de filtro adequado. Enxaguar filtrado 3 vezes com 50 ml de 2-butanona para retirar qualquer brometo de lítio que não reagiu.
    12. A seco (primeiro na bancada e, em seguida, em exsicador de vácuo) e análise do produto por 1H RMN em D 2 O. picos característicos a 1,8-1,9 (6H, s), 2,1-2,2 (3H, s), 6,7-6,8 (2H, s), 7,3-7,4 (2H, m), 7,4-7,5 (1H, m), e 7,5 -7,7 (2H, m). 14,17
  3. Use uma planilha para calcular o volume ea concentração de cada solução-mãe (PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, LAP) que deve estar preparado para fazer hidrogéis (Tabela 1). Para fazer géis não modelado, garantir que [SH] = [Alloc] para que todos os grupos reagentes são consumidos durante a polimerização. Se photopatterning dos géis está previsto, incluem uma quantidade em excesso de grupos funcionais tiol durante a formação de gel com base na estequiometria (por exemplo, 0,2-5 mM, [SH]> [Alloc]) por reacção posterior com Pep1Alloc.
    NOTA: Gel deve conter mais do que 5 por cento em peso (% em peso) para assegurar PEG4SH polimerização rápida (dentro de 5 min). No entanto, menor peso faixa%s pode ser explorada se o aplicativo chama para hidrogéis com módulos inferiores (por exemplo, <0,5 kPa); polimerização devem ser verificados e ajustados em conformidade para estas composições% wt baixos. Da mesma forma, a concentração Pep1Alloc pode ser ajustado para diferentes aplicações (por exemplo, 0,2-5 mM) como relatado na literatura para os péptidos funcionalizados com tiol. 18-21 concentração LAP é recomendado em torno de 0,067% em peso (2,2 mM) ou menos, tal como descrito, quanto concentrações mais elevadas podem diminuir a viabilidade celular.
  4. Preparar soluções stock de Pep1Alloc, Pep2Alloc, PEG4SH, e LAP em condições estéreis para cultura de células com base em cálculos da Tabela 1.
    1. Para Pep1Alloc e Pep2Alloc, pesar individualmente a massa total de Pep1Alloc e Pep2Alloc da síntese peptídica, e dissolvem-se em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) contendo 1% de penicilina / estreptomicina (PS) e 0,5 ug / ml de fungizona (FZ). As concentrações típicas de soluções de reserva preparado intervalo20-100 mg / ml de péptido. Misture estes stocks para alcançar géis com módulos final que sejam relevantes para aplicações de tecidos moles (módulo de Young ~ 0,5-5 kPa). 22,23 alíquotas e armazenar a -20 ° C até o uso.
    2. Para PEG4SH, pesar PEG4SH para um tubo de microcentrífuga estéril e dissolvem-se em PBS + PS + FZ. As concentrações típicas desta gama solução estoque de 250-430 mg / ml (20-30% PEG4SH em peso).
    3. Para LAP, pesar LAP para um tubo de microcentrífuga estéril e dissolvem-se em PBS + PS + FZ para uma concentração final de 7,5 mg / ml.
      NOTA: Preparar soluções frescas de PEG4SH e LAP é recomendado para cada encapsulamento ou experimento gel para garantir tempos de polimerização consistentes.
  5. Prepare estéreis da seringa Moldes para formação de hidrogéis.
    1. Cuidadosamente corte as pontas fora de seringas de 1 ml, utilizando uma lâmina de barbear e, posteriormente, remover os êmbolos dos eixos de seringas.
    2. Submergir os eixos de seringas e êmbolos em etanol 70% por 15 min umad lugar em um capuz de cultura de células estéril para secar (30 minutos). Se gotas excesso de etanol permanecem no interior do eixo da seringa, use o êmbolo para empurrá-los para fora.
  6. Prepare estéril de vidro Deslize Moldes para formação de hidrogéis.
    1. Mergulhe lâminas de vidro (múltiplos de 2) e juntas de borracha (0,254 mm de espessura; 2 pequenos pedaços usados ​​como calços, um retângulo com discos perfurados para fora, ou forma de moldura quadrada) em etanol 70% por 15 min, e coloque na capa de cultura de células estéril secar.
    2. Revestimento metade das lâminas esterilizadas com revestimento anti-adesivo de acordo com as instruções do fabricante para impedir a adesão do topo do gel para a superfície de deslize (por exemplo, se houver 4 lâminas, 2 lâminas serão revestidos com o anti-aderente). Estes irão servir como a parte superior do molde lâmina de vidro.
  7. Calibrar a lâmpada para moldes de seringa ou lâmina de vidro.
    NOTA: Para estas experiências, foi usada uma lâmpada de arco de mercúrio com uma montagem de adaptador de filtro externo e 365 nm, filtro externo. Outros lâmpadas que produzem intensidades adequadas de luz UV de comprimento de onda pode ser utilizado como relatado por outros 24-27.
    1. Anexar uma lente de colimação para a extremidade do guia da luz de líquido para assegurar a intensidade relativamente uniforme de luz em todas as amostras. Conforme necessário, ajustar a distância entre a guia de luz a partir da amostra (s) para atingir um tamanho de ponto que vai cobrir as amostras de interesse.
    2. Coloque um molde de corte de seringa num suporte de tubos de microcentrífuga (para segurar a seringa de molde na posição vertical). Segurar o radiómetro na altura da ponta da seringa, onde as amostras vai ser realizada e ajuste do obturador (% aberto) para conseguir uma intensidade de luz de 10 mW / cm2 a 365 nm. Grave os ajustes para uso posterior.
    3. Coloque um molde lâmina de vidro sobre o topo de uma superfície estéril (por exemplo, o topo da caixa de uma ponta de pipeta dentro de uma cabine de segurança biológica). Segurar o detector radiómetro na altura do molde lâmina de vidro e ajustar obturador (% aberto) para conseguir uma intensidade de luz de 10 mW / cm2 a 365 nm. Grave os ajustes para uso posterior.

2. Formação hidrogel e Photopatterning

  1. Preparação de hidrogéis não-padronizados.
    NOTA: neste momento no protocolo, se hidrogéis são para ser utilizados em aplicações de cultura de células, todas as etapas subsequentes devem ser realizados sob condições estéreis numa câmara estéril ou capa.
    1. Misture as soluções concentradas de PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP, e PBS + PS + FZ acordo com o cálculo de planilha (ver Tabela 1 exemplo). Pipetar a solução precursora de gel resultante vigorosamente para assegurar uma mistura uniforme da solução.
    2. Prepare hidrogéis espessa moldada em pontas de seringa por pipetagem de 10-20 uL de solução precursora em gel (PEG / Pep / LAP / PBS) para a ponta de uma solução estéril, seringa corte. Faça um único gel por seringa, cerca de 0,5-1,5 mm de espessura com base no volume e diâmetro seringa.
      NOTA: volumes maiores podem ser exploradas com base emo tamanho desejado gel onde os limites superiores podem existir com base limitações difusionais para Pep1Alloc durante photopatterning e / ou nutrientes / resíduos para / a partir de células encapsuladas em cultura de células.
    3. Prepare hidrogéis finas em moldes de vidro deslizantes, colocando a junta de borracha (0,254 mm de espessura) em torno das bordas da placa de vidro não revestido. Pipeta solução precursora de gel de 5-10 ul (5-10 ul géis únicas ou múltiplas podem ser feitas por pipetagem de um ou mais pontos de solução sobre uma única lâmina) sobre a lâmina de vidro não revestido e colocar a lâmina de vidro revestida com anti-adesiva na parte superior da solução de gel (geles maiores, até ao tamanho da placa de vidro, pode ser feita dependendo da aplicação final). Garantir as lâminas de vidro com pequenos grampos da pasta para estabilizar.
    4. Moldes lugar sob a lâmpada e definir a intensidade da lâmpada (por exemplo,% obturador aberto) para alcançar 10 mW / cm2 na superfície do gel para moldes ponta da seringa ou moldes lâmina de vidro com base em medições no passo 1.7.2 e1.7.3, respectivamente.
    5. Aplicar luz durante 1 a 5 minutos para permitir que a polimerização completa de geles. Usar um tempo de polimerização mais curto para géis com teor mais elevado PEG4SH (8% em peso ou maior, 1 min) e mais para géis com menor teor de PEG4SH (5-8% em peso, de 3-5 min) para produzir hidrogeles totalmente polimerizados com módulos dentro a gama de tecidos moles (0,5-5 kPa).
    6. géis lugar a partir de moldes de extremidade da seringa sobre uma placa de 48 poços não-tratados estéril, e Colocar as lâminas de vidro em um prato estéril.
    7. Lavar 3 x 15 minutos com meio de cultura celular ou tampão apropriado (por exemplo, PBS + PS + FZ, tampão de reacção de Ellman), com base em experiências planeadas, como detalhado abaixo.
  2. Preparação de hidrogéis modelados.
    1. Misture as soluções concentradas de PEG4SH, Pep2Alloc, LAP, e PBS + PS + FZ acordo com o cálculo de planilha, deixando tióis livres (0,2-5 mm) para reacção posterior com Pep1Alloc. Pipetar a solução precursora vigorosamente para assegurar uma mistura uniforme da solução.
    2. Prepare hidrogéis grossas e finas como definidos nos passos 2.1.2 a 2.1.6.
      NOTA: Não coloque géis em meio de crescimento antes da photopatterning. Tióis livres podem ser consumidos por espécies no meio de crescimento (por exemplo, formação de dissulfureto com proteínas contendo tiol) e não irá permitir padronização do gel sem passos adicionais de processamento (por exemplo, redução de ligações dissulfureto).
    3. Preparar soluções de Pep1Alloc (concentração final ~ 3-20 mg / ml) e 2,2 mM LAP.
    4. Cubra géis pré-formados com solução / LAP Pep1Alloc e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
    5. Remova o excesso de solução Pep1Alloc / LAP. Se géis foram moldados numa ponta de seringa, utilizar uma espátula para transferir cuidadosamente os geles a partir da placa de 48 poços em que são incubação a uma lâmina de vidro estéril para padronização.
    6. Coloque uma fotomáscara com o padrão desejado directamente no topo de geles moldado por deslizamento de seringas e vidro. Certifique-se de que a parte impressa da máscara toca o gel para Patt idealfidelidade ern (ou seja, a máscara deve ler direito e estar lado da emulsão para baixo). Colocar as amostras sob a lâmpada e irradiar durante 1 min com as configurações de iluminação utilizado para lâminas de vidro (passo 1.7.3).
    7. Após padronização, géis lugar seringa-moldado em uma placa tratada cultura não-tecido estéril, de 48 poços, e local de vidro géis que sejam respeitadas as lâminas de vidro em um prato estéril slide-moldado.
    8. Lavar 3 x 15 minutos com meio de cultura celular ou tampão apropriado (por exemplo, PBS + PS + FZ, tampão de reacção de Ellman), com base em experiências planeadas.

3. A visualização e quantificação de Photopatterning

  1. Ensaio de Ellman para detectar e quantificar tióis livres no Photopatterned hidrogéis.
    1. Preparar tampão de Ellman reacção, a solução de trabalho de cisteína, normas, e o reagente de Ellman conforme descrito abaixo.
      1. Para Tampão de Reacção de Ellman, dissolver 2,4 g de fosfato de sio dibico (Na 2 HPO4) e 74,4 mg de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em 200 ml de DIH 2 O (0,1 M de Na 2 HPO 4, 1 mM de EDTA). Ajustar o pH para 7,5-8 com soluções de hidróxido de sódio (NaOH) ou ácido fosfórico (H 3 PO 4).
      2. Para Cisteína solução de trabalho, se dissolvem 5,27 mg de cisteína em 15 ml de tampão de reacção (cisteína 2 mM).
      3. Para Normas de cisteína, dilui-se a solução de trabalho de cisteína em tampão de reacção para uma concentração final de 2, 1,5, 1,25, 1, 0,75, 0,5, 0,25, e 0 mM de cisteína.
      4. Para o reagente de Ellman, dissolve-se 4 mg de reagente de Ellman em 1 ml de tampão de reacção. Sonicar para dissolver completamente o reagente de Ellman.
    2. Quantificar a concentração de tióis livres em géis com ensaio de Ellman (Figura 2).
      NOTA: "magra" 5 ul hidrogéis, moldado entre lâminas de vidro, são descritas no procedimento abaixo e recomendado para permitir a rápida difusão do reagente de Ellman ttravés do gel (isto é, leva-se o reagente de mais tempo para se difundir através géis espessos).
      1. Determinar o volume de gel inchado de géis "magra" 5 ul (V S) com base na relação volumétrica de inchamento, P.
        1. Faça três 20 l géis 'grossas' usando moldes de seringas. Géis lugar em tampão de reação de Ellman para 24 horas e, posteriormente, pesar (equilíbrio inchada massa, M S). Liofilizar os géis e, posteriormente, pesar (massa seca, M D).
        2. Usando as massas medidas para géis espessos, calcular o rácio volumétrico inchaço 28 por Q = 1 + ρ polímero / solvente ρ (H S / D M -1) onde polímero ρ = 1,07 g / cm3 para PEG, 29 ρ solvente = 1,0 g / cm 3 para PBS / H 2 O.
        3. Calcula-se a massa seca teórica do gel para ser usado para ensaio de Ellman (aqui, "magra" géis de 5 ul u são tipicamentesed), pela soma das massas dos componentes individuais PEG4SH, Pep1Alloc e Pep2Alloc (M D = M PEG4SH + M + M Pep1Alloc Pep2Alloc). Por exemplo, um gel de 5 ul contendo 10% em peso PEG4SH contém aproximadamente 0,000535 g de PEG tal como calculado por M PEG4SH = 0,005 cm 3 x 1,07 g / cm 3 x 0,10. Massas Pep1Alloc Pep2Alloc e pode ser calculada de um modo semelhante com base na% em peso em solução (ver a folha de cálculo para valores), assumindo ρ ≈ 1,0 g / cm3 para estas soluções aquosas.
          NOTA: Os géis podem também ser seco e pesado em vez de calcular a massa seca teórico. No entanto, pode ser um desafio para medir de forma consistente a massa seca das, 5 géis ul finas.
        4. Com base na massa seca previsto e o valor de Q determinada a partir de géis de "grossos", calcular a massa inchada previu H S sobre o gel "fina" (equação no passo 3.1.2.1.1). Suponha que ρ ≈ 1,0 g / cm S V S ≈. Utilizar esta calculada V S para executar ensaio quantitativo de Ellman.
          NOTA: O método acima é recomendado para determinar V s para géis inchados como os geles de 5 ul "magra" são difíceis de transferir para a pesagem.
      2. Formar hidrogéis finas para padronização conforme descrito na seção 2.2 (5 volume de ul). Especificamente, fazer géis com excesso de tióis livres e "padrão" de metade destas amostras com uma lamela utilizando Pep1Alloc claro para inundar expor todo o gel com luz (por exemplo, 6 totais géis com excesso de tiol: 3 não modificado não'patterned 'e 3' modelado ').
        NOTA: Para este ensaio, 'modelado' géis são inundação expostos à luz sem uma fotomáscara. Este método é utilizado para determinar o número total de tióis livres consumidos em toda a amostra em gel e para demonstrar a eficiência com tióis livres podem ser modificados com o péptido. A partir desta informação,o número de tióis livres consumidos durante a padronização com uma fotomáscara pode ser previsto com base na espessura do gel e a área de teste padrão (regiões expostas à luz).
      3. Ponto 'modelado' e não-'patterned 'géis em poços de uma placa de 48 poços e lavar 3 x 15 min com tampão de reacção de Ellman para permitir a difusão de espécies que não reagiram para fora do gel e equilíbrio de inchamento de ocorrer.
      4. Adicionar tampão de reacção adicional de Ellman para os géis de modo a que enxaguadas V s com tampão de reacção é um múltiplo de 20 ul. Por exemplo, se o predito V S é de 15 ul, adicionar 5 uL de tampão de reacção (20 ul), e se o predito V S é de 30 ul, adicionam-se 10 ul de tampão de reacção (40 ul).
      5. Pipetar as normas de cisteína em poços individuais (não contendo géis) de uma placa de 96 poços em múltiplos de 20 ul dependendo do volume utilizado na etapa anterior (ou seja, se o passo anterior tinha V S + extra reacção bpode ser prejudicado = 40 ul, adicionar 40 ul de cada padrão aos poços vazios individuais).
      6. Dilui-se reagente de Ellman em tampão de reacção (múltiplos de 180 ul de tampão de reacção de + 3,6 ul de reagente de Ellman, por exemplo, 183,6 para 20 ul ou 367,2 ul para 40 ul no passo 3.1.2.5).
      7. Adiciona-se reagente de Ellman diluído aos poços que contêm os padrões e amostras. Para amostras de 20 ml, adicionar 183,6 ul de solução a cada poço. Duas vezes essa quantidade de reagente de Ellman diluída para 40 ul amostras (ou escalar em conformidade com base no tamanho da amostra).
      8. Incubar ou colocar num agitador durante 1 hora e 30 minutos (à temperatura ambiente) ou até a cor da solução coincide com a cor do gel por inspecção visual para verificar a difusão suficiente do di-anião de 2-nitro-5-tiobenzoato amarelo (TNB 2-), que é gerado na reacção de reagente de Ellman com tióis livres, a partir do gel.
      9. Tome 100 ul de solução a partir de amostras e sORMAS e colocar em poços de uma placa de 96 poços.
      10. Ler a absorvância a 405 nm num leitor de placas.
      11. Para processar os dados, traçar a curva padrão (amostras do passo 3.1.1.3) (absorbância versus concentração) e ajustar uma função linear. Usando a função linear, a concentração de tióis livres na solução de 'gel diluídos' (+ gel de tampão de reacção) pode ser calculado com base nas leituras de absorvância. Por último, tendo em conta o 'diluição' com tampão de reacção, determinar a concentração de tiol livre nos géis sem tampão de reacção. (Por exemplo, se 15 ul de gel foi diluída com tampão de reacção 5 ul, multiplicar por 20/15).
    3. A visualização de photopatterns com reagente de Ellman (Figura 3A).
      1. Mergulhe hidrogéis finos estampados com Pep1Alloc em tampão de reação de Ellman, durante 1 hora.
      2. Remover o excesso de tampão de reacção suavemente limpando em torno das bordas do hidrogel com um lenço de papel.
      3. O reagente de Ellman pipeta directamente sobre a superfície do gel. Imediatamente imagem em um microscópio de luz em 10X ou estereomicroscópio com uma câmera de cor.
        Nota: Os géis deve ser trabalhada imediatamente, porque os padrões de visualização irá se dissipar dentro de 5 min como a TNB amarelo 2- ion produzido por clivagem do reagente de Ellman após reacção com tióis na região não-estampados difunde em todo o gel. regiões não-padronizadas aparecem vagamente amarelo a olho nu; para uma melhor resolução e padrões menores, de ampliação (por exemplo, o uso de um microscópio) é necessária.
  2. A visualização de Photopatterns com péptidos fluorescentes (Figura 3B).
    1. Para visualizar os padrões com maior resolução ou em três dimensões, um photopattern Pep1Alloc AF488-modificado (ou semelhante péptido fluorescente) para os géis no passo 2.2.
    2. Imagem num microscópio de fluorescência. Um microscópio confocal pode ser utilizado aqui para levar Z-rACK imagens do gel de modo a que o padrão pode ser observado na x, y, e z-aviões.
      NOTA: Com a fluorescência, géis deve ser protegida da luz para garantir a estabilidade do fluoróforo AF488 e de fluorescência máxima. Géis não precisa ser fotografada imediatamente uma vez que o péptido fluorescente é bastante estável se protegido da luz (armazenar em um recipiente envolvido em folha, a 4 ° C).

4. encapsulamento de células em hidrogéis e Photopatterning

  1. A coleta e preparação de células para encapsulamento.
    1. Seguindo os procedimentos de cultura de células de mamíferos estéreis padrão, trypsinize e recolher as células de interesse das placas. Extingue-se a tripsina com meio de crescimento depois da separação ocorre (por exemplo, para um frasco T-75, 5 ml de tripsina, extingue-se com 5 ml de meio, lavar placa com 5 ml de meio para o total de 15 ml).
      NOTA: Tempos de tripsinização pode variar entre os tipos de células, mas ocorrem tipicamente entre 5 e 15 min. detachmen celulares alternativosagentes T (por exemplo, Versene) pode ser usado para recolher as células, se desejado.
    2. Contagem de células (um mínimo de 100 ou segundo o protocolo do fabricante) de aliquotas da suspensão de células tratadas com tripsina utilizando um hemocitómetro ou outro dispositivo de contagem de células, enquanto a centrifugação da suspensão de células grandes quantidades (90-110 xg, 5 min). Re-suspender a pelete de células, após a centrifugação num volume mínimo de PBS ou meio de crescimento e re-se a contagem de suspensão de células tripsinizadas inicial é demasiado diluída.
    3. células num volume mínimo de PBS e as partes alíquotas para cada condição de gel re-suspender em tubos de microcentrífuga de modo que haverá 5.000 células / ml quando misturada com a solução de gel (antes da polimerização).
      NOTA: se alíquotas de células típicas contêm 300,000-500,000 células e são suficientes para tornar 60-100 ul de suspensão de gel / célula que pode ser usada para 3-5 x 20 ul géis com 5000 células / ul. densidades celulares superiores ou inferiores pode ser usado para a encapsulação, dependendo da quantidade de célula-célulavs. contacto de matriz celular desejado, respectivamente, e devem ser determinadas para cada aplicação.
    4. Centrifugar células / PBS aliquotas (90-110 xg, 5 min).
    5. Aspirar cuidadosamente PBS de pellet celular em tubo de microcentrífuga direita antes de encapsulamento.
      NOTA: Se as células são sensíveis às forças de cisalhamento, o segundo passo de centrifugação pode ser eliminado por meio da contagem (por exemplo, hemocitómetro) e subsequentemente aliquotting da suspensão de células tratadas com tripsina (tripsina + media + células) em porções necessárias para cada condição de gel. Estas aliquotas foram centrifugados uma vez (90-110 xg, 5 min) e a tripsina + meio é aspirado, deixando um pelete de células durante o encapsulamento.
  2. Encapsulação de células em hidrogéis não-padronizados.
    1. Imediatamente após aspirar PBS, suspender as células precipitadas em PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP, e PBS + PS + FZ como calculados na planilha para uma concentração final de 5.000 células / ml.
    2. Molde e polimerizar hidrogéis como described em passos 2.1.2 a 2.1.6.
      NOTA: quando da encapsulação de células em moldes lâmina de vidro, deve ser tomado cuidado ao remover a lamela superior de pós-polimerização para impedir o gel de cisalhamento, o que pode resultar na morte da célula. Para ajudar com a remoção do gel a partir do molde, moldes de deslizamento possam ser colocados em PBS estéril ou meio de crescimento depois da polimerização, para molhar a junta e hidrogel, tornando-o mais fácil de remover o cursor superior. Um método para evitar que esse cisalhamento é completamente através da utilização de moldes de seringa.
    3. géis de enxaguamento 3 x 10 min em meio de crescimento para remover espécies que não reagiram e excesso de LAP.
    4. Incubar geles em meio de crescimento a 37 ° C e 5% de CO 2 até que o ponto de tempo desejado para posterior análise. Reabastecer média a cada 48 horas ou como determinado para a aplicação (por exemplo, o intervalo de alimentação típica de tipo específico de célula e médio).
  3. Encapsular células e Photopatterning na presença de células.
    1. Imediatamente após a aspiração do PBS,suspender as células precipitadas em PEG4SH, Pep2Alloc, LAP, e PBS + PS + FZ como calculados na planilha para uma concentração final de 5.000 células / ml. Deixar uma concentração apropriada de tióis livres (por exemplo, 2 mm) para reacção posterior com Pep1Alloc.
    2. Molde, polimerizar, e hidrogéis de padrão, tal como descrito nos passos 2.2.2 a 2.2.8.
    3. géis de enxaguamento 3 x 10 min em meio de crescimento após a padronização para remover espécies que não reagiram e excesso de LAP.
    4. Incubar geles em meio de crescimento a 37 ° C e 5% de CO 2 até que o ponto de tempo desejado para posterior análise. Reabastecer média a cada 48 horas ou como determinado para a aplicação.

5. Determinação da Actividade Viabilidade e metabólica de células encapsuladas

  1. Apresentar ao vivo / morto Ensaio de citotoxicidade para determinar a viabilidade celular encapsulado (Figura 4A).
    1. Remover o meio de crescimento a partir de géis e lavar 3 x 15 min com PBS para permitir a difusão do meio a partir do gels.
    2. / soluções descongelamento vivos mortos ensaio de citotoxicidade (etídio homodímero-1 e calceína AM).
    3. Adicionar 2 mL da etídio 2 mM homodímero-1 e 0,5 ul de soluções de calceína AM 4 mM a 1 ml de PBS estéril. Vortex para assegurar uma mistura completa.
    4. Adicionar 300 uL de solução de coloração para cada gel molde seringa em placas de 48 poços, ou o suficiente para cobrir a superfície do gel sobre uma lâmina de vidro em um prato estéril, e incubar durante 45 min.
    5. Remover o excesso de solução de coloração e enxaguar para remover o excesso de corante a partir dos géis (3 x 15 min com PBS).
    6. Imagem de um microscópio confocal (imagens Z-stack) ou num microscópio de epi-fluorescência com capacidade de Z-pilha a 10X e 488/525 nm Ex / Em. Quantificar o número de células viáveis, projetando os z-stacks e contagem do número de células com software de imagem ao vivo (verde por todo o corpo celular) e mortos (núcleos vermelhos).
  2. Executar ensaio de atividade metabólica para determinar a atividade das células pós-encapsulamento (Figure 4B).
    1. 24 h antes do ensaio de alimentação, encapsulado células com meio de crescimento fresco.
      NOTA: Adicionar suporte a alguns poços adicionais (que não contenham géis ou géis sem células) como controle (leituras de fundo).
    2. No ponto de tempo de interesse, descongelar solução de reagente MTS.
      NOTA: De modo a determinar a actividade metabólica ao longo do tempo, um ponto de tempo inicial (12-24 horas pós-encapsulação) é recomendada como uma referência de comparação para os pontos de tempo posteriores.
    3. Adiciona-se reagente MTS a cada cavidade (20 ul por 100 ul de meio de crescimento).
    4. Incubar as amostras durante 1-4 h a 37 ° C e CO2 a 5%, segundo as instruções do fabricante.
      NOTA: Os tempos de incubação deverá ser suficiente para as células para reduzir o MTS e permitir a difusão do produto formazano para fora do gel. Consequentemente, géis espessos, tais como géis de ponta para seringas pode exigir tempos de incubação mais longos (~ hr 4) para a redução de MTS suficiente e difusão.
    5. Pipetar 100 ul reduzida MTS / Mediumpara limpar os poços de uma placa e ficha absorvância de 96 poços a 490 nm num leitor de placas.
    6. Subtrair a absorvância de fundo para poços sem células de valores de absorção de exemplo para gerar os valores de absorção baseline.

Representative Results

A configuração e procedimento para photoencapsulate células e géis subsequentemente photopattern contendo células encapsuladas está representado na Figura 1, e um exemplo para a preparação de soluções de estoque para formar um gel a 10% em peso é fornecida na Tabela 1. Utilizando a Tabela 1, a quantidade de monómeros (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) e fotoiniciador (LAP) necessária para polimerizar hidrogeles é calculado. Com base nestes cálculos, as soluções concentradas de PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, e LAP são preparados e misturados com e sem Pep1Alloc para a formação de géis e photopatterning, respectivamente (Figura 1A). Subsequentemente, as células são recolhidas a partir de placas, contadas e centrifugadas em quantidades adequadas para encapsulamento (Figura 1B). O sedimento de células é re-suspenso em solução de formador de gel (péptido / polímero / LAP em PBS), e as misturas de células / monómero são transferidos para uma seringa de vidro ou molds. As células são encapsulados dentro do hidrogel aquando da aplicação de luz (1-5 minutos de 10 mW / cm2 a 365 nm) (Figura 1C). Para photopatterning (Figura 1D), géis são embebidas com Pep1Alloc e LAP durante 30 min a 1 h e 30 min, permitindo a difusão do peptídeo e do iniciador na matriz polimerizada. Estes geles de péptido-carga, são cobertos com máscaras com padrões desejados e exposto a uma segunda dose de luz (1 min) para conjugar os péptidos a tióis livres no interior da matriz. Amarras pingente só são covalentemente ligados ao gel em regiões expostas à luz, o que facilita as interacções célula-matriz apropriados e imitando principais propriedades mecânicas e bioquímicas do microambiente celular nativo para sondar a função de células e destino in vitro.

ensaio de Ellman proporciona um método fácil e pouco dispendioso para quantificar modificação gel e incorporação péptido dentro photopattesubstratos rned. Estampados e géis não-padrão (ou seja, géis com ou sem modificação peptídeo) são embebidos em tampão de reação pós-polimerização de Ellman. Em seguida, os padrões de cisteína e os géis embebidos em tampão são colocados em placas de 48 poços e incubou-se com reagente de Ellman (Figura 2A, esquerda). Após 1 hora e 30 minutos, aliquotas de amostras são colocadas em cavidades individuais de uma placa de 96 poços, e a absorvância é registada a 405 nm. Uma curva de calibração (Figura 2A, direita) a partir dos padrões de cisteína é traçada (absorvância vs concentração, ajuste linear), e a quantidade de tióis livres em géis pode ser determinada com base no seu factor de diluição. Estas concentrações tiol livres para várias condições de polimerização e photopatterning de um gel a 10% em peso são apresentados na Figura 2B. Géis polimerizada durante 1 ou 5 minutos, sem Pep1Alloc (barras azuis, I = 1 min e II = 5 min) têm concentrações tiol livres estatisticamente semelhantes, indicando tchapéu ocorre uma reacção rápida e de gelificação está completa dentro de 1 min (bicaudal teste t, p> 0,05). Assim, a exposição adicional a luz (2-5 minutos) não resulta em mais de conversão de grupos funcionais. Géis polimerizados durante 1 minuto sem Pep1Alloc foram embebidos com Pep1Alloc (3 mg / ml) e LAP (2,2 mM) durante 30 min e 90 min (barras verdes, II = 30 min e IV = 90 min) e exposto a uma segunda dose de luz durante 1 min. A diminuição em tióis livres (60-80% no que diz respeito à condição de 1 min) indica a modificação eficiente dos géis com pistas pingente sob estas condições. Se maior modificação é desejada, o aumento das concentrações de solução Pep1Alloc pode ser utilizado como a acessibilidade de Pep1Alloc a tióis livres em soluções mais diluídas de péptidos podem limitar a conversão; Por exemplo, verificou-se que concentrações de até 20 mg / ml Pep1Alloc produzem> 90% de conversão de tióis livres.

Excepcionalmente, os padrões de péptidos adicionados ao hidrogel podeser rapidamente visualizados com reagente de Ellman (Figura 3A, sob 5 min). No entanto, a visualização do padrão é perdido ao longo do tempo (maior do que 5 minutos), devido à difusão do amarelo TNB 2- dianião através do gel. Para melhorar a resolução de imagem e observar os padrões em três dimensões (x, y, e z-planos) e na presença de células, a adição de péptido fluorescente (AF488Pep1Alloc) pode ser utilizada. Na Figura 3B x, y e z-projeções de pilhas de imagens tiradas com um microscópio confocal são mostrados, demonstrando resolução padrão (escala mm).

Aproximadamente (94 ± 2)% e (94 ± 1)% de hMSCs encapsulados dentro de géis degradáveis ​​(Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) permanecem (corpos de células verdes) viáveis ​​1 e 6 dias após o encapsulamento, respectivamente, com as células mortas alguns (núcleos vermelhos ) observada (Figura 4A). Além disso, hMSC espalhamento é observada a 6 dias pós-encapsulação ( Rong> Figura 4A, inserção), o que indica que as células podem remodelar e interagir com estas matrizes MMP-degradáveis modificados com RGDS de ligação â integrina. Ensaios de actividade metabólicos realizados em células encapsuladas em géis não degradáveis (Pep2Alloc = RGKGRK) 1 e 3 dias pós-encapsulação (Figura 4B) proporcionar uma segunda medida de viabilidade celular e demonstram que as células permanecem activas para as várias condições photoencapsulation e photopatterning testados com ensaio de Ellman (Figura 2B). Em particular, não existe nenhuma diferença significativa na actividade metabólica entre 30 min e 90 min incubações com Pep1Alloc + LAP (condições III e IV) e a encapsulação inicial (condições I e II), indicando que o procedimento é adequado para aplicações de photopatterning em a presença de células encapsuladas (bicaudal teste t, p> 0,05).

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Figura 1:. Configuração para encapsular células dentro de hidrogéis e, posteriormente, photopatterning com sugestão bioquímica (A) As soluções de macr�eros e fotoiniciador são preparados e mista (PEG4SH = backbone, Pep2Alloc = reticulação, Pep1Alloc = pingente porção adesiva (RGDS), LAP = fotoiniciador ). (B) As células são recolhidas para encapsulamento. (C) As células são misturadas com soluções de macrómeros sem ou com péptidos de ligação a integrina (PEG4SH / Pep2Alloc / LAP ou PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP, respectivamente) e são encapsulados por exposição à luz. (D) Os géis que contêm grupos tiol em excesso durante a formação de gel (aqui, PEG4SH / Pep2Alloc / LAP, formado com 2 mM de excesso de tiol) pode ser modelado com sinais bioquímicos através da adição subsequente de péptidos funcionalizados com um único grupo alloc (Pep1Alloc, por exemplo, RGDS, IKVAV, etc.) para promover a adesão celulardentro de regiões específicas do gel. Aqui, padronização de géis com RGDS marcados com fluorescência é mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. Configuração do ensaio e resultados quantitativos de Ellman para avaliar a alteração de hidrogéis estampados Gel (A) e padrões de cisteína são incubadas em placas de 48 poços com o reagente de Ellman. Uma curva padrão é traçada linear para determinar a concentração de cisteína em amostras de gel. (B) tióis livres em excesso são incorporadas dentro de hidrogéis durante a formação do gel e consumido sobre a modelação com um pingente de Alloc-péptido (I = 1 min de polimerização; II = 5 min de polimerização; III = 30 min de incubação com Pep1Alloc; Wi incubação IV = 90 min th Pep1Alloc; tanto III e IV polimerizado e modelado com luz durante 1 min). Os dados apresentados ilustram a média (n = 3) com barras de erro que mostram o erro padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Ensaio da Ellman e imagens fluorescentes para visualizar hidrogéis photopatterned reagente (A) de Ellman pode ser usado para detectar rapidamente padrões (linhas) em X e Y planos (amarelo = região unpatterned, Escala da barra = 1 mm). (B) os péptidos fluorescentes podem ser usados para observar padrões na x, y, e z-aviões (verde = região modelada; 200 bar mm escala; 10X de água-dipping objetiva; Ex / Em 488/525 nm).large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
. Figura 4: Viabilidade e atividade metabólica das células dentro hidrogéis photopatterned não degradáveis (A) Exemplo confocal z-stack (z-projeção; 10X de água-dipping objetiva) do viáveis (verde; Ex / Em 488/525 nm) e mortos hMSCs (vermelho; Ex / Em 543/580 nm) encapsulado dentro de hidrogéis 24 horas pós-encapsulamento (barra de escala = 200 mm). As células se espalham dentro desses hidrogéis 6 dias após o encapsulamento (imagem inserir, Scale bar = 50 mm). (B) As células são metabolicamente activa 1 e 3 dias (barras escuras e claras, respectivamente) pós-encapsulação para os diferentes polimerização (I = 1 min de polimerização; II = 5 min a polimerização) e em condições de modelação (III = 30 min de incubação com Pep1Alloc ; IV = 90 min incubatioN com Pep1Alloc; tanto polimerizado e modelado com luz durante 1 min). Os dados apresentados ilustram a média (n = 3) com barras de erro que mostram o erro padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tabela 1
Tabela 1: Exemplo de configuração para calcular volumes de soluções de estoque para fazer hidrogéis células dentro da planilha que estão destacadas em azul indicam parâmetros definidos pelo usuário;. as outras quantidades são calculadas com base nessas definições. Os volumes finais para cada solução de estoque para fazer um gel são destacadas de laranja. As células brancas contêm fórmulas usadas para calcular os volumes finais com base nos parâmetros definidos pelo usuário. Note-se que uma concentração de 2,2 mM LAP é equivalente a 0,067% em peso.

Discussion

O procedimento aqui apresentado demonstra técnicas para photoencapsulate células dentro de hidrogéis formados por tiol-eno clique química e posteriormente photopattern os géis com sinais bioquímicos. A utilização de luz para formar hidrogeles inicialmente permite que a mistura homogénea e a suspensão das células na solução de polímero antes da polimerização. Polimerização rápida fechaduras '' o gel na forma do molde definido e encapsulando células dentro da rede de hidrogel suspensa. Os géis podem também ser moldado em numerosas formas diferentes (por exemplo, lâminas de vidro ou de pontas de seringa), dependendo da aplicação final desejada. Por exemplo, as células encapsuladas para a cultura em 3D hidrogeles ligados a lâminas de vidro são particularmente úteis para aplicações de imagem de atenuação da luz é limitado dentro de uma amostra fina. moldes de seringa pode ser utilizada para encapsulamento de células rápida, permitindo que um maior número de amostras a serem preparadas em um curto período de tempo (em relação à lâmina de vidros) que pode ser utilizado para experiências que requerem um grande número de células, tais como citometria de fluxo ou qPCR. Subsequentemente, estes géis podem então ser modelado com sinais bioquímicos para desencadear respostas celulares desejados, tais como a diferenciação ou invasão 30,31.

Os ensaios para a viabilidade e a actividade metabólica indicam a sobrevivência das células para o sistema de materiais e condições de modelação apresentados. Note-se que a actividade metabólica foi monitorizado até o dia 3 em geles não degradáveis ​​(RGKGRK reticulação péptido) para avaliar os efeitos iniciais de condições de polimerização e modelação sobre a função celular. Além disso, um ensaio de integridade da membrana (ao vivo / morto viabilidade / citotoxicidade coloração) de hMSCs em 1 e 6 dias pós-encapsulamento em géis formulados com uma reticulação peptídeo degradável (GPQGIWGQ) suporta que as células permaneçam viáveis ​​e difundidos a 1 semana de cultura. A viabilidade de linhas celulares adicionais foi avaliado para as condições photopatterning 32 semelhantes aosutilizado aqui e podem ser avaliados para o sistema de hidrogel descrito utilizando coloração vivo / morto e ensaios de actividade metabólica. Embora não tenhamos observado problemas com a viabilidade celular utilizando este sistema de materiais e procedimentos conexos (4.2 e 4.3), alguns tipos de células podem ser sensíveis aos radicais livres e / ou exposição à luz. Neste caso, os usuários podem considerar o uso de sistemas de materiais não-fotoiniciada, como azida-alcino, 12 FXIII, 31 ou químicos de formação de hidrogel à base de Alder Diels. 33

Facile técnicas para detectar e quantificar a padronização de sinais bioquímicos dentro geles também são apresentados (3.1 e 3.2). Ensaio de Ellman é de particular interesse porque os reagentes estão comercialmente disponíveis e não há passos de processamento extra ou sintética reagentes mais dispendiosos (por exemplo, de péptido marcado fluorescentemente) são necessários. ensaio de Ellman pode ser utilizado para determinar com precisão a modificação de tióis livres com sinais bioquímicos sob difereNT photopatterning condições, assim como para visualizar rapidamente padrões. Para quantificar a incorporação de péptidos, a concentração do grupo funcional tiol antes e depois da modelação, como uma medida quantitativa da incorporação de péptido, está directamente avaliadas com ensaio de Ellman. Embora este tipo de quantificação pode ser feita com péptidos marcados com fluorescência, 34 quantificação baseado em imagiologia requer mais de manipulação e análise de passos que consomem tempo (por exemplo, a síntese de um péptido fluorescentemente marcado e geração de uma curva de calibração para relacionar fluorescência a concentração de peptídeo usando análise de imagem). Para imagem de incorporação de péptidos, reagente de Ellman pode ser directamente aplicada a amostras e imediatamente visualizado. Embora limitado ao xey planos para visualização padrão, a técnica pode ser utilizada como um método simples, de rotina para determinar se as matrizes que contêm grupos tiol livres têm sido modelado. É importante notar que o ensaio de Ellman não é cConsiderado cytocompatible, Assim, embora possa ser usada para observar e quantificar photopatterns, ele não pode ser feito na presença de células. Para imagiologia de modelação em três dimensões e na presença de células, a conjugação de péptidos fluorescentes dentro de matrizes de hidrogel continua a ser uma abordagem poderosa e amplamente utilizado. Resolução de padrões podem ser avaliadas na x, y, e z-planos utilizando microscopia confocal, e este método é cytocompatible modo que as células dentro das regiões modeladas ou regiões não modelado pode ser identificado. Tomados em conjunto, técnicas de ensaio e com base em imagens de Ellman são ferramentas complementares para pesquisadores para avaliar quantitativa e qualitativamente o photopatterning de pistas bioquímicos dentro do sistema de materiais.

Photoclick, ou, mais amplamente fotoiniciada, produtos químicos para a formação de hidrogéis e de modificação, na presença de células são numerosas. A moldagem, encapsulamento e padronização técnicas apresentadas aqui não são limITED para o sistema de material descrito e pode ser aplicado a produtos químicos à base de luz alternativas, tais como tiol-alcino, 35 azida-alcino, 4 e outras químicas de tiol-eno (por exemplo, tiol-norborneno), 10,13, bem como com fotoiniciadores diferentes, tais como Irgacure 2959, Eosina Y, e canforoquinona. Nota, os usuários podem precisar de ajustar parâmetros de procedimento (por exemplo, tempos de incubação, os tempos de polimerização, a densidade celular) para garantir que as condições permaneçam cytocompatible para esses outros sistemas. Uma vez que o processo de modelação requer a difusão do péptido (s) modificado com Alloc no hidrogel (2.2.3-2.2.5), este processo pode ser mais útil para a adição de porções de ligação a integrina (por exemplo, péptidos ou proteínas da matriz extracelular fragmentos) para o hidrogel, em que é necessária a ligação do ligando para a rede para a geração de forças de tracção através da activação de células e integrina completa. 36 Nota, para biomoléculas que podeser igualmente activa em solução ou em cima de imobilização (por exemplo, factores de crescimento ou citoquinas), o passo de incubação para a difusão fracção (~ 1 h) em que o hidrogel pode levar a acontecimentos de sinalização que CONVOLUTE resultados de padronização. Outros métodos foram estabelecidos para fator de crescimento de imobilização ou sequestro local para a sua padronização. 37-39 Além disso, a resolução padrão é ditada pelo controle sobre a exposição à luz. Aqui, máscaras permitir a criação de padrões através da profundidade gel e no xey aviões; no entanto, um maior controlo espacial sobre padrões de sinais bioquímicos dentro de geles pode ser conseguida com métodos alternativos de irradiação, tais como o uso de um microscópio confocal de dois fotões para gerar padrões no x-, y- e z- 34,40 aviões. finalmente, é importante notar que, enquanto o sistema de material utilizado dentro deste processo só é inicialmente modificada com sinais bioquímicos, químicos Photoclick ortogonais pode ser utilizada para permitir alterações em propriedades da matriz ao longo do tempo. 12 do procedimento e técnicas apresentadas aqui incluir a diversidade das abordagens atuais para a criação de matrizes sintéticas com propriedades bem definidas e controladas-espaço-temporalmente. Em particular, a disponibilidade comercial dos reagentes e materiais usados ​​neste processo são úteis para uma ampla gama de investigadores interessados ​​no uso de biomateriais à base de hidrogel para aplicação em cultura de células controlada.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelos programas de Delaware Cobre em Drug Discovery e em Biomateriais Avançados financiados pelo Prêmio de Desenvolvimento Institucional do Instituto Nacional de generais Ciências Médicas no National Institutes of Health (P20GM104316 e GM110758-01 P30, respectivamente), a Pew Charitable Trusts (00026178), um Prémio Carreira National Science Foundation (DMR-1253906), o Fundo Burroughs Wellcome (1.006.787), e do programa de Ciência da Fundação Nacional IGERT SBE2 na Universidade de Delaware (comunhão de L. Sawicki). Os autores agradecem a bioimaging Centro de Delaware Biotechnology Institute da Universidade de Delaware para a formação e acesso a microscopia confocal, a Sra Katherine Wiley para a assistência durante a filmagem do vídeo, o Sr. Matthew Rehmann para generosamente fornecer hMSCs isoladas de medula óssea, Prof. Christopher J . Kloxin e Mr. Stephen Ma para generosamente fornecem máscaras e Prof. Wilfred Chen para o uso do leitor automático de placas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom Peptides Various Vendors ---- Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep.
4-arm PEG Thiol, MW 20k JenKem USA 4ARM-SH Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced.
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate Colorado Photopolymer Solutions Li-TPO
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470 Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
2,4,6-Trimethylbenzoyl Chloride Sigma Aldrich 682519 Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Lithium Bromide Sigma Aldrich 213225
2-Butanone Sigma Aldrich 360473
Flask, Round Bottom, 100 ml Chemglass CG-1506-05
80 ml Filter Funnel, Buchner, Medium Frit Chemglass CG-1402-L-02 Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired.
Magnetic Stir Bars Various Vendors ----
Magnetic Stirring and Hot Plate Various Vendors ----
Vacuum Dessicator Various Vendors ----
Deuterium Oxide Acros Organics 16630
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190-250
Penicillin Streptomycin ThermoFisher Scientific 15070-063
Fungizone ThermoFisher Scientific 15290-018
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red ThermoFisher Scientific 15400-054 Select appropriate medium and trypsin depending on cell type.
Microcentrifuge tubes Various Vendors ---- 1.5 or 2 ml sizes, sterile.
BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle) Fisher Scientific 14-823-16H Product number listed here is for a 1 ml syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX).
Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-1
High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket) McMaster Carr 87315K62
Ethanol, 200 Proof Decon Labs 2701
RainX, Original Amazon 800002243 May be purchased from other vendors.
Sigmacote Sigma Aldrich SL2
Photomasks Advance Reproductions Corporation ---- Photomask Division, different designs may be printed as desired.
DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) ThermoFisher Scientific PI-22582
Sodium Phosphate Dibasic Sigma Aldrich S5136
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E6758
Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS Fisher Scientific S318
Orthophosphoric Acid Alfa Aesar 33266
Cysteine Hydrochloride Monohydrate Sigma Aldrich C7880
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells ThermoFisher Scientific L-3224
CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay Promega G3582
Centrifuge Various Vendors ---- Capable of speeds at 90-110 x g.
Multiwell Plate Reader Various Vendors ---- Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate.
Epifluorescent or Confocal Microscope Various Vendors ---- To visualize peptide patterns and cells within hydrogels.
Omnicure Exfo Series 2000 Excelitas Technologies ---- Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels.
Zeiss Zen Lite Software Zeiss ---- Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes
ImageJ NIH ---- Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis

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