레이저를 이용한 가축 접합체의 세포질 미세 주입을

1Department of Animal Science, University of California, Davis
Published 10/05/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Genetics

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Bogliotti, Y. S., Vilarino, M., Ross, P. J. Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes. J. Vis. Exp. (116), e54465, doi:10.3791/54465 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

1 셀 배아의 세포질 미세 주입은 매우 강력한 기술이다. 또, 예를 들면, 유전자 기능을 연구 나 유전자 편집 동물을 생성하는 유전자가 녹아웃을 제조 배아에 어떤 솔루션을 제공에 사용될 수있다. 대부분의 농업 관련 농장 동물 접합자는 세포질이 불투명 어두운 만드는 매우 높은 지방산 조성. 또한 상당히 탄성 원형질막 (PM)을 갖는다. 이러한 특성은 설치류 종의 도전과 종종 부정확에 사용되는 기존의 전핵 / 세포질 주입을 사용하여 미세 주입을합니다.

이를 수행하기가 쉽습니다 또한 더 높은 생존 능력이 결과, 주입 된 배아에 덜 손상이 발생하기 때문에 세포질 마이크로 인젝션은 전핵 미세 주입을 통해 이점이있다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 농장 동물 접합체의 세포질에 솔루션을 제공하기위한 성공적인 방법을 설명하는 것입니다. 수행 할 수 있어야합니다가축 배아 고효율 세포질 마이크로 인젝션은 레이저는 평활 말단 유리 바늘이 미세 주입에 사용되는 투명대 (ZP) 다음에 구멍을 생성하는데 사용된다. 이 전략은 주입하는 동안 배아에 각인 기계적인 손상을 감소하는 것을 목표로하고있다. 그리고, 주사 바늘 내부 세포질 콘텐츠 흡인 용액 배아의 세포질 내로 전달되는 것을 보장 PM 효율적 자신감 파괴 할 수있다.

이 기술은 이미 성공적 접합체 세포질 3,4-으로 siRNA를 전달하고 클러스터 정기적 interspaced 짧은 상동 반복 (CRISPR) / CRISPR 연관된 시스템 (9) (Cas9) 시스템 (5)을 사용하여 돌연변이를 생성 소 태아에서 사용되어왔다. 또한 소 운 동봉 된 난 모세포 (6)를 주입하기 (약간의 수정과)에 적합하다. 여기서, 우리는 우리의 염료를 제공 주입 프로토콜을 설명하는 데 어떤 주입에 적용 할 수있다수정란 내로 IRED 용액 및이 기술을 사용하여 최소한의 용해가 발생 초기 배아 발달에 영향을주지 않는 것으로 나타났다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 마이크로 피펫 생산

  1. 사출 마이크로 피펫
    1. 보로 실리케이트 유리 모세관 (1.0 mm, 내경 (ID) : 외경 (OD) 0.75 mm) 배치 마이크로 피펫 풀러에서 (오른쪽과 왼쪽 모세관 홀더의 중심을)하고 잠급니다.
    2. 그것은 긴 캐처 얇은 팁을 초래하므로 유리 모세관을 당겨 적절한 프로그램을 사용하십시오. (예 : 열 : 825; 당겨 : 30; 속도 : 120; 시간 : 200; 압력 : 500).
    3. 조심스럽게 장치에서 뽑아 피펫을 제거하고 수평 위치에 microforge에 놓습니다.
    4. 인출 된 피펫과 초점에 그 유리 구슬과 microforge 히터 필라멘트를 가져옵니다. 원하는 두께를 측정하고 히터 필라멘트 대상 내경 (5 μm의)에 도달 할 때까지 수평으로 피펫을 이동 접안 레티클을 사용합니다.
    5. 약 45 %의 열을 조절하고 필라멘트에 닿을 수 있도록 부드럽게 아래로 피펫을 가지고. 잠시 히터를 활성화합니다. 이 w병 약간 필라멘트에 접착되도록 피펫을 용융 및 냉각시에, 피펫 직선 절단을 생성하는 접촉 지점에서 중단된다.
      참고 : 너무 높은 온도가 피펫 벤드를 만들 것입니다 따라서 직선 절단 할 수 없습니다 너무 낮은 온도가 피펫 (그림 1A)를 용융하기에 충분하지 않을 것이기 때문에 적절한 온도를 설정하면이 단계의 핵심이다.
    6. 히터 필라멘트에서 약 10 μm의 멀리 위치하여 피펫 팁 근처 대략 30 ° 각도를 확인합니다. 60 %의 온도를 상기 히터를 작동.
      참고 :이 필라멘트를 통해 피펫을 구부 것입니다. 이 각도는 인젝터 (도 1b)에 장착 될 때 바늘의 선단이 주입 판 표면에 평행하도록 요구된다.
    7. 그들은 매우 선명하고 깨지기 쉬운만큼주의를 미세 주입 피펫을 처리합니다.
  2. 개최 마이크로 피펫
    1. borosilic 배치(: 1.0 mm, ID : OD 0.75 mm) 유리 모세관 먹었다 (오른쪽과 왼쪽 모세관 홀더의 중앙에) 마이크로 피펫 풀러의를하고 잠급니다.
    2. 이 긴 경우에도 테이퍼 및 병렬 벽 얇은 팁을 초래하므로 유리 모세관을 당겨 적절한 프로그램을 사용하여 (: 열 : 예 815; 당겨 : 20; 속도를 : 140; 시간 : 175; 압력 : 200).
    3. 조심스럽게 끌어 당기는 장치에서 뽑아 피펫을 제거하고 수평 위치에 microforge 홀더에 놓습니다. 히터 필라멘트 및 피펫에 초점을 조정합니다.
    4. 피펫 직경을 측정하고 필라멘트를 통해 직경 180 μm의에 도달 할 때까지 피펫을 이동 접안 레티클을 사용합니다.
    5. 지정된 크기에서, 다이아몬드 팁 펜으로 유리 모세관을 표시 한 다음 부드럽게 유리를 깰 수있는 뽑아 끝에 누릅니다. 이 직선 절단 (그림 1C)가 발생한다.
    6. 필라멘트에 가까운 그것의 끝이 수직 위치로 피펫을 이동합니다. 온도를 설정 60 %에 microforge의.
    7. 화재 폴란드어는 40 μm의의 ID에 도달 할 때까지 표준 기술 7을 사용 피펫의 팁. 아이디 (그림 1D)를 확인하기 위해 접안 레티클을 사용합니다.
    8. 피펫에 각도를 확인합니다.
      1. 약 10 μm의 거리에 필라멘트와 거리의 끝에서 5mm에서 다시 수평 위치로 피펫을 가져옵니다. 약 60 %로 온도를 설정하고 필라멘트를 통해 피펫이 구부러 히터를 활성화합니다. (30 O의) 소정의 각도에 도달 할 때까지 가열을 계속한다. 각도 시각 (그림 1E)에서 확인하십시오.
        주 : 피펫은 일반적으로 사출 접시의 바닥에 대해 60 (O)의 대략적인 각도에서 마이크로 인젝터에 장착된다. 그것의 중간 평면에서 배아의 정확한 주입에 필요한 접시의 바닥에 평행하도록 피펫의 선단은 절곡되어있다.
제작 "> 2. 미세 조작기 설치

  1. microinjectors가 완전히 기름을 적재되는 시스템에 기포가 없는지합니다 (마이크로 인젝터에 기포가 주입의 미세 제어를 방지) 확인합니다.
  2. 미세 조작기는 중앙 위치에 있는지 확인하십시오. 이는 피펫의 이동의 넓은 범위를 허용한다.
  3. 왼쪽 micromanipulator에 홀더에 들고 피펫 오른쪽 미세 조작 홀더에 주입 피펫을 삽입합니다.
  4. 오일이 모세관 현상에 의해 피펫에 입력하고 시스템이 마이크로 인젝터 컨트롤을 사용하여 피펫 내부 위아래로 오일을 이동하여 제대로 작동하는지 확인할 수 있습니다.
    주 : 바늘의 내부에는 오일의 움직임이없는 경우, 막힘이있을 수도있다. 이 경우, 새로운 니들을 사용한다.
  5. 보기의 현미경의 필드의 중심에 피펫을 가지고하는 미세 조작기 컨트롤을 사용합니다. 4 배의 배율을 사용하여 마이크로 피펫 팁 (올바른 각도로 페이지 있는지 확인접시의 바닥)에 arallel.
    참고 : 바늘의 올바른 설치가 성공적으로 주입 및 결과의 일관성을 위해 중요하다.
  6. 제조자의 설명서 교정 다음 레이저 시스템 교정.

사출 접시 3. 준비 (그림 2)

  1. 100mm의 페트리 접시 뚜껑의 중앙에 20 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 가온 (37 ° C) SOF-HEPES (재료 부분에 자세히 조성물)의 50 μL를 떨어 놓는다. 용액 2 μL 드롭 주입 드롭에 가까운 주입 할 - 1이 놓습니다. 배아는 RT 이하로 냉각하지 않았는지 확인합니다.
    참고 :이 프로토콜에서 우리는 주사 부위를 시각화하고 나중에 추적 할 수 있도록 주입 용액에 덱스 트란 - 붉은 염료를 추가합니다.
  2. 미네랄 오일을 약 10 ㎖을 사용하여 사출 접시 방울 커버.
  3. 거꾸로 현미경의 무대에 주입 접시를 놓고 주사위를 가지고분사 방울로 ettes. 바늘 드롭 내부에 초점이 있는지 확인합니다. micromanipulator에 컨트롤을 사용하여 필요에 따라 자신의 높이를 조정합니다.
  4. 사출 강하의 상측 - (20 시간 후 수정 (HPF) (17)) 30 접합자 - 마이크로 디스펜서를 사용하여 약 20로드. 사출 강하 배아의 개수가 사람을 주입 할 수있는 속도에 의해 결정되도록 상온에서 주입을 수행한다. 30 분에 주입 할 수있는 것보다 더 많은 배아를 넣지 마십시오.
    1. 마이크로 디스펜서에 배아를로드하려면 완전히 플런저를 우울하게하고 배아를 포함하는 용액에 끝을 담가. 터치 배아 유리 모세관의 선단 (시 하나)로 촬상 천천히 플런저 각각의 배아 모세관 체결 해제된다. 모든 배아가 선택됩니다 또는 마이크로 디스펜서의 용량이 가득 찰 때까지이 과정을 반복합니다.
    2. ,로드 된 배아를 해제 전체 볼륨의 공동 때까지 부드럽게 플런저를 우울하게하려면배아를 ntaining하는 모세관에서 해제된다.

4. 미세 주입

  1. 4 배의 대물 렌즈를 사용하여 부압 (흡인)을인가하여 주입 피펫으로 주입 할 수있는 용액을로드. 3 접합자 - 2를 주입 할 수있는 충분한 솔루션을로드합니다. 그런 다음 주입 드롭으로 이동합니다.
  2. 끝이 접합체에 가까운 얻을 수 있도록 주입 드롭 내에서 유지 피펫을 이동합니다. 수정란은 20 배 목표로 유지 피펫과 변화에 고정되는 있도록 유지 마이크로 인젝터와 부압 (흡인)을 적용합니다.
  3. 수정란이 유지 피펫에 부착되면, 조심스럽게 분리하지 않고 주위의 배아를 이동 주입 피펫을 사용하여 품질을 확인합니다. 좋은 품질의 접합자는 두 극성 몸이 (하나만 볼 가끔 있지만)과 균일 한 세포질한다. 이상 접합자 (그림 3A)를 주입하지 마십시오.
  4. 필요한 경우, 적절한 주입 배아 재배치위치. 좋은 위치 결정되는 ZP와 PM 사이에 약간의 공간이 때문에 PM이 레이저에 의해 손상되지 않는다는 것이다.
  5. 주입 피펫은 부드럽게 주사 부위의 접합자를 터치하여 배아의 중간면에 위치되어 있는지 확인합니다. 그것의 중간면에없는 경우, 바늘 배아 대신 천자 회전하게하는 경향이있다. 필요에 따라 주입 피펫의 높이를 조정한다.
  6. 레이저 (그림 3B)를 사용하여 ZP에 구멍을 만듭니다.
    1. 레이저의 소프트웨어 놓고 구멍 (배아가 유지 피펫에 부착되는 곳의 반대측에) 될 것이다 ZP되는 레이저 레티클 사용. 화재 버튼 레이저 제어 창 클릭을 사용. 구멍의 크기가 PM에 손상을주지 않고 통과 바늘 용 ZP에 개구를 생성하기에 충분히 큰지 확인 (예 : 0.662 msec의 펄스 폭 / 6.9 ㎛의 구멍 크기).
  7. 주사 바늘을 통과상기 ZP 구멍을 통해 PM과의 접촉을 만든다. 바늘이 배아 (그림 3C)에 방법의 ¾ 때까지 앞으로 피펫을 눌러 계속합니다.
  8. 이것이 일관 주입량을 제어 할 수있는 바와 같이, 솔루션 오일 계면에서의 메 니스 커스의 위치를 ​​관찰한다.
  9. PM과 세포질이 주사 바늘로 흡입 할 것을 발생합니다 주입 피펫에 부압 (흡인)을 적용합니다. 바늘로 세포질의 움직임이 가속 될 때까지 또는 주사 용액과 함께 혼합 세포질 함량을 알 수있는 경우에 계속. 다음은 PM (그림 3D)의 파손을 나타냅니다.
  10. 용액 유 계면에서의 메 니스 커스가 시작점 과거 1 접합체의 직경에 상당하는 고급까지 양압 (주입)을인가하여 접합체의 세포질 내로 용액 다음 세포질 콘텐츠를 주입한다.
    참고 : 우리의 조건이 파트 :변위량 주입 솔루션 (그림 3E)의 약 7 와줘.
  11. 4 배 목표로 변경하고 주입 드롭의 하부에 주입 된 배아 / s로 이동합니다. 유지 마이크로 인젝터에 양압을 적용하여 배아를 놓습니다. 분사 / 비 - 주입 된 배아를 추적하고 효율적으로 작업 할 수 있도록 상측의 비 주입 배아 드롭의 하측에 삽입 된 것들을 유지한다.

5. 배아 복구 및 사출 결과

  1. 미리 예열 SOF-HEPES로 새로운 접시에 약 200 ㎕를 3 방울을 확인합니다. 마이크로 디스펜서 (위의 설명 참조)를 사용하여 주입 된 배아를 수집합니다. 3 SOF-HEPES를 통해 방울을 이동하여 주입 된 배아를 씻으십시오.
  2. 미세 주입 중에 용해 배아를 계산하고이를 폐기합니다.
    첫 번째 전체 ZP을 작성, 반투명 나타납니다 보낸 용해 접합자는 그대로 하나 쉽게 구별 할 수 있으며, 일반적으로 세포질을 가지고 참고 :배아의 외부로 누출되는 콘텐츠.
  3. 선택적으로, 형광 현미경을 이용하여 미세 주입 효율을 확인합니다. 자외선 노출이 후속 개발에 영향을 미칠 수있는 배아의 손상을 유도 할 수 있음을 유의하십시오.
  4. 38.5 ℃에서의 미네랄 오일 아래 4 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)으로 보충 칼륨 단면 최적화 배지 50㎕의 방울 (KSOM) 25 주입 배아 배양 기, 포화 5 % 공기 중의 CO 2, 습도.
  5. 이일 주사 후 5 % FBS와 문화 매체를 보충합니다.
  6. 주사 후 배반포 (BL) 요금 7 일을 확인합니다. 배반포 배아 / 그 드롭 배양 된 배아의 총 수의 총 수와 BL 속도를 계산합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

레이저를 이용한 세포질 미세 주입은 가축 접합체의 세포질에 솔루션을 제공하는 강력하고 신뢰할 수있는 프로토콜입니다. 3 전 및 사출뿐만 아니라 기술의 전반적인 개요 후 접합자의 일반적인 개요를 보여줍니다. 덱스 트란 레드 주입 및 주입 효율 및 정확도를 추적 사이트 있도록 주입 용액으로서 사용된다. 용액의 성공적인 전송은 염료가 균일 세포질에 분포되어있는 최근 주입 배아를 나타내는도 4에 도시되어있다. 배아의 100 %가 세포질 주입이 기술을 사용.

이 프로토콜은 소 및 양의 접합자 최소한의 용해 속도를 가지고 설명했다. 전용 15.6 ± 5 주입 배아 5.8 ± 3.9 %로 마이크로 인젝션 한 결과, 각각 소와 양에 용해시켰다 (그림 6) 또한, 통계적으로 유의 한 양 소에 대한 주입 그룹에 비해 컨트롤의 배반포 개발 속도의 차이 (32.8 ± 6.6 % 컨트롤, 31.4 ± 5.9 % 주입)과 양의 배아 (40.3 ± 7.8 제어가 30.3,있다 6.0 % ~ ±) 주입.

이러한 결과는 레이저를 이용한 세포질 내 주입이 정상 배반포 개발 속도에 주입 결과 중 최소한의 피해를 나타냅니다.

그림 1
그림 1 : 일반 다이어그램 지주 및 주입 피펫을 확인하는 방법을 표시합니다. AB) 주입 피펫, CE) 피펫을 들고. A)는 조심스럽게 원하는 직경 (5 μm의)에서 뽑아 피펫 필라멘트를 터치합니다. 히터 짧게 활성화 (O를 보여 주었다 범위). 이 필라멘트와, 피펫은 피펫을 배치하여 약 0.5 cm 거리의 끝에서 피펫 인치 B) 확인하고 각도 직선 컷을 생성 접점에서 중단됩니다 냉각에 부착 있도록이 약간 피펫을 녹아 약 10 μm의 거리 가열기 필라멘트. 원하는 각도가 될 때까지). C 가열을 계속 표시하는 다이아몬드 팁 펜을 사용 할 때까지, 화재 - 폴란드어를 수직 위치에서 원하는 직경 (180 μm의). D)에서 유지 피펫의 팁을 유지 피펫을 잘라 원하는 내경 (40 μm의). E)가 몇 μm의 거리에 필라멘트에서 약 0.5 cm 거리의 끝에서 수평 위치로 다시 피펫을 가져 피펫에 각도를 확인 도달한다. 필라멘트를 통해 피펫이 구부러 히터를 활성화합니다. 원하는 각도가 달성 될 때까지 가열을 계속한다. 바늘을 만드는 방법에 대한 자세한 내용은 8,9,10를 참조하십시오.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 :.. 사출 접시의 일반 설정 피펫, 배열 방울 및 배아이 도면에 표시되는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 :. 레이저를 이용한 세포질 내 주입 프로토콜 A) 주입하기 전에 유지 피펫에 부착 된 접합체의 일반도. PB : 폴라 기관, ZP : 투명대, CYT : 세포질, PN : 전핵, PM : 플라즈마 membran즉, HP : 지주 피펫, IP는 :. B) 레이저를 이용하여 유지 피펫에 부착 된 접합체의 ZP에 구멍을 만들기 C) 배아의 반대측을 향해 분사 피펫 소개 :. 주입 피펫) 마이크로 인젝션 단계 BE . 메 니스 커스 (b) 과거의 시작점 한 접합체 직경에 도달 할 때까지)의 메 니스 커스 (a). D의 위치를 확인 주입 피펫 내부 세포질 콘텐츠를 흡입하여 세포막 브레이크. E를)이 접합체 세포질로 세포질 함량 및 용액을 다시 주입 . 거리 AB 주입 솔루션입니다. F) 주입 후 접합자의 일반 다이어그램 ~ 7 (PL)을 나타냅니다. 주입 된 용액이 균일하게 세포질에 퍼져 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 4 :..와 덱스 트란 붉은 삽입 된 Zygote의 A) 주입 된 수정란 (B)의 명 시야 이미지) 주입 된 수정란의 형광 이미지의 대표 그림 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 :. 데이터 (4) 소 배아에 대한 복제 나타내는 두 개의 다른 종에 Zygote의 미세 주입 후 용해 배아의 비율은 3 (103 주입 접합체의 총)는 양의 배아 (173 주입 접합체의 총)에 대한 복제합니다. 오차 막대는 SEM 대표 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.

그림 6
. 그림 6 : 소와 양의 태아 데이터의 포배 요금은 4 주입 (102) 및 (156) 제어 배아의 총 소 종에 대한 복제 및 3 주입 163, 239 제어 배아의 총과 양의 종에 대한 복제 나타냅니다. 오차 막대는 SEM을 대표하는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

접합체의 미세 주입은 포유 동물의 배아에 솔루션을 도입하기위한 잘 정립 된 방법이다. 종 및 실험 목적에 따라 일부 변형이 기술은 광범위하게 사용될 수있다. 우리는 평활 말단 마이크로 피펫의 입구를 돕기 위해 레이저를 사용하여 세포질 마이크로 인젝션을 수행하는 방법을 보여준다. (예 : 소, 양, 돼지 등) 일부 가축 종의 접합자는 배아의 내부에 한 번 주입 피펫의 시각화를 방해, 어두운 세포질을 가지고있다. 또한, 자신의 세포막이 매우 신축성있는 달성하기 어렵다 (주로 설치류의 접합체를 주입하는 데 사용)를 경사 아군 바늘 그들의 침투하기. 이러한 한계를 극복하기 위해, 세포막 및 배아의 세포질 내부 용액의 방출이 파손되도록하여 투명대 세포질 콘텐츠의 후속 흡입 통해 평활 말단 바늘의 통과를 가능하게하는 레이저를 사용했다. 또한, injecti에 의해바늘 입구의 반대 사이트에서 NG (약 3/4 배아 내부) 우리는 PN을 대체함으로써 자신의 흡입 / 주입을 방지하는 것을 목표로하고 있습니다. 또한,이 이렇게 낮은 용해 속도의 결과로, 깨진 막 치유하기위한 접촉의 더 많은 지점을 제공합니다.

미세 조작기로 설정 좋은 가능한 Micropipette (특별히 주입 피펫)을 생산하고 적절하게하는 것은이 기술 좋은 결과를 달성하는 열쇠입니다. 주사 바늘이만큼 주입 용액이 바늘의 내부로 원활하게 이동을 위해 사용될 수있다. 때때로, 세포질 콘텐츠 또는 콘텐츠 전핵 흐름이 불균일하게 실행할 일으켜 주입을 복잡 바늘의 선단 내부에 걸리면 (이 또한 용해 속도를 증가시키고 프로세스를 지연시킨다). 이런 주사 바늘이 장착 프로토콜에 최적의 결과를 얻기 위해 필요하다. 배아 인큐베이터 벗어난 시간은 중요일관된 생존율을 얻기 위해 30 분을 초과 할 수 없습니다. 훈련과 연습을 한 후, 운영자는 일반적으로 분당 1-2 주입 된 배아의 주입 속도를 달성한다. 이 프로토콜의 성공을위한 또 다른 중요한 점은 일관 배아 당 용액의 부피의 동일한 양을 주입하는 것이다. 이것은 용이하고 정확하게 용액 오일 인터페이스 메 니스 커스의 이동을 관찰함으로써 제어된다. 이는 피펫 직경 조작 사이에 선단이 규칙적이고 일정한 직경이 일치하는 것이 중요하다. 팁에서 5 μM의 ID 피펫으로 7 - 주입 부피 10 PL은 접합체의 길이에 상응 주입함으로써 달성된다. 이상 주입은 종종 배아 용해가 발생합니다.

이 프로토콜을 이용하여, 배아의 100 % 완전히 잘못된 난황 주위 공간을 주입 (도 4) 피 세포질 내로 적절히 주입된다. (이는 신뢰성을 극대화하고, 상기 분석의 재현성이 행해지고상관없이 결과 사람 주입 용액) 만 주사 용액의 효과가 아닌 주입 불일치에 기인한다. 주입 된 접합자 중 일부는 일반적으로 인해 주입시 기계적 손상에 용균됩니다. 주입 후 생존의 일반적인 비율은 75 % (11)이다. 이 방법을 사용하여, 우리는 용해 배아 (그림 5)의 최소 비율을 얻을 수 있습니다. 또한, 포배 발달율은 분사 기술은 초기 배아 발달에 유해한 영향이없는 것을 나타내는 비 주사 (대조군) 배아 (도 6)으로 비교 하였다. 이 프로토콜의 효율은 최근 소 접합체 (5)를 주입하기위한 종래의 세포질 마이크로 인젝션 프로토콜 (레이저의 사용없이 경 사진 유리 아군 바늘을 사용하여 직접 세포질 마이크로 인젝션이 ZP 드 침투)와 비교 하였다. 결과는 용해 배아의 상당히 높은 요금과 직접 cytopl에 대한 배반포 형성의 낮은 비율을 보였다asmic 미세 주입. 우리는 레이저를 이용한 세포질 마이크로 인젝션을 사용하여이 프로토콜 우리의 실험실에서 가축 종을 주입하기위한 바람직한 일 할 때 이러한 차이가 바늘 침투 중 적은 기계적 손상에 기인 생각합니다.

여기서는 체외 수정에 의해 얻어진 소 및 양의 태아에 대한 데이터를 제공 할뿐만 아니라 유사한 결과를 획득하는 돼지 배아 (데이터 미도시) 생체 내시험관 사용되는 프로토콜을 시험 하였다. 분사 된 용액에 따라,이 프로토콜은 많은 응용에 사용될 수있다. 최근에, 우리는 노크 아웃하는 특정 유전자를 체외 수정 된 소 배아에 CRISPR / Cas9 시스템을 도입하는 데 사용하고 높은 돌연변이 시퀀스 포배의 비율 발견 배아의 50 % (N = 6) biallelic 돌연변이를 가지고 있었다 , 33 %는 (N = 4) monoallelic 돌연변이가 있고, 17 %는 (N = 2) 야생형 5이었다. 이 프로토콜은 매우 안정되어 왔으며에 사용될 수있는여러 종과 수많은 응용 프로그램.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micropipette puller Sutter Instrument P-97
Glass capillary Sutter instruments B100-75-10 These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge Narishige MF-9 Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator Nikon/ Narishige NT88-V3
Inverted microscope Nikon TE2000-U Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.
Laser Research Instruments 7-47-500 Saturn 5 Active laser.
Microdispenser Drummond 3-000-105 The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
100 x 15 mm culture dish Falcon 351029 Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.
35 mm culture dish Corning 430165 These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.
Incubator Sanyo MCO-19AIC Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope Nikon SMZ800 Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.
Control Unit HT Minitube 12055/0400 Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage Minitube 12055/0003 Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red Thermo Scientific D1828 A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil sigma M8410 Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine Zenit ZEBV-100 Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.
FBS Gemini-Bio 100-525 Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl Sigma S5886 Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl Sigma P5405 Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4 Sigma P5655 Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCl2 6H2O Sigma M2393 Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate Sigma L4263 Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2 Sigma C7902 Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose  Sigma F3510 Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES  Sigma H4034 Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA Sigma M7145 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA Sigma B6766 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3 Sigma S5761 Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate Sigma P4562 Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax Gibco 35050 Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA Sigma A-3311 Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin Sigma G-1397 Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer Sigma W1503 Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium Made in the lab pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118, (1), 163-170 (2000).
  2. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, (13), 4438-4442 (1985).
  3. Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8, (1), (2008).
  4. Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (7), 2400-2405 (2012).
  5. Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27, (1), 94-94 (2015).
  6. Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9, (9), 1271-1279 (2014).
  7. Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10, (1), 123-128 (2008).
  8. Sutter Instrument. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. Sutter Instrument. www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2015).
  9. Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
  10. Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. Academic Press. (2002).
  11. Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60, (4), 433-438 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats