Cytoplasmique microinjection dans zygotes Bétail assistée par laser

1Department of Animal Science, University of California, Davis
Published 10/05/2016
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Genetics

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Bogliotti, Y. S., Vilarino, M., Ross, P. J. Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes. J. Vis. Exp. (116), e54465, doi:10.3791/54465 (2016).

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Abstract

Introduction

microinjection cytoplasmique d'embryons 1 cellules est une technique très puissante. Il peut être utilisé pour fournir une quelconque solution dans l'embryon, par exemple, produire des gènes knock-out pour étudier la fonction des gènes ou pour générer des animaux génétiquement modifiés. Zygotes des animaux d'élevage plus d'intérêt agronomique ont une composition en acides gras très élevé qui rend leur cytoplasme opaque et sombre 1. Ils ont aussi une membrane plasmique assez élastique (PM). Ces caractéristiques font de microinjection pronucléaire utilisant / injection cytoplasmique classique utilisé dans des espèces de rongeurs difficiles et souvent inexactes.

La micro - injection cytoplasmique présente des avantages sur la micro - injection pronucléaire car il est plus facile à réaliser et entraîne aussi moins de dommages aux embryons injectés, ce qui entraîne la viabilité élevée 2. L'objectif global de ce protocole est de démontrer une méthode efficace pour la fourniture de solutions dans le cytoplasme des zygotes des animaux d'élevage. Pour être en mesure d'effectuerla micro-injection cytoplasmique avec un rendement élevé sur des embryons de bétail, un laser est utilisé pour produire un trou dans la zone pellucide (ZP), puis une aiguille de verre à extrémité émoussée est utilisée pour la micro-injection. Cette stratégie vise à réduire les dommages mécaniques imprimé sur l'embryon lors de l'injection. Ensuite, l'aspiration du contenu cytoplasmique à l'intérieur de l'aiguille d'injection permet une rupture efficace et sûre de la MP en sorte que la solution est délivré dans le cytoplasme de l'embryon.

Cette technique a déjà été utilisée avec succès dans les embryons de bovins pour délivrer l' ARNsi dans le cytoplasme 3,4 zygotique et pour générer des mutations à l' aide des séquences répétées courtes regroupées régulièrement espacées (palindromiques CRISPR) / CRISPR associé du système 9 du système (cas9) 5. Il est également approprié (avec des modifications mineures) pour injecter bovins cumulus-ovocytes enfermés 6. Ici, nous décrivons notre protocole d'injection délivrant un colorant, qui peut être applicable à l'injection d'une quelconque dessolution IRED dans le zygote, et de montrer que l'utilisation de cette technique provoque la lyse minimale et n'a aucune incidence sur le développement précoce de l'embryon.

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Protocol

1. Micropipette production

  1. L'injection d'une micropipette
    1. Placez un capillaire de verre borosilicate (diamètre extérieur (OD): 1,0 mm, diamètre interne (ID): 0,75 mm) dans un extracteur micropipette (dans le centre des détenteurs de droits et capillaires à gauche) et le verrouiller.
    2. Utilisez un programme approprié pour tirer le capillaire en verre de sorte qu'il en résulte une fine pointe avec une longue tapper. (Exemple: la chaleur: 825; Pull: 30; Vitesse: 120; Temps: 200; Pression: 500).
    3. Retirez délicatement les pipettes tirés de l'appareil et placez-le sur un microforge en position horizontale.
    4. Apportez la pipette tiré et l'microforge chauffe filament avec son perle de verre dans le foyer. Utiliser le réticule d'oculaire pour mesurer l'épaisseur désirée et déplacer la pipette horizontalement jusqu'à ce que le filament chauffant atteint la cible diamètre intérieur (5 um).
    5. Ajuster la température à environ 45% et porter doucement la pipette vers le bas afin qu'il touche le filament. Activer le chauffe brièvement. Ce wfondre mal légèrement la pipette de sorte qu'il adhère au filament et lors du refroidissement, la pipette se brisera au point de générer une coupe droite de contact.
      Remarque: Réglage de la température appropriée est la clé de cette étape car les températures trop élevées feront la courbure de la pipette et donc une coupe droite ne sera pas possible et les températures trop basses ne seront pas suffisantes pour faire fondre la pipette (figure 1A).
    6. Faire une angle de 30 ° environ près de la pointe de la pipette en le positionnant à environ 10 um loin du filament chauffant. Régler la température à 60%, et activer l'élément chauffant.
      Note: Ceci pliez la pipette sur le filament. Cet angle est souhaité de sorte que la pointe de l'aiguille est parallèle à la surface de la plaque d'injection quand il est monté dans l'injecteur (figure 1B).
    7. Poignée pipettes microinjection avec prudence car ils sont extrêmement forte et fragile.
  2. micropipette Tenir
    1. Placer un borosilicmangé capillaire en verre (OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) dans un extracteur micropipette (dans le centre des détenteurs de droits et capillaires à gauche) et le verrouiller.
    2. Utilisez un programme approprié pour tirer le capillaire en verre de sorte qu'il en résulte une pointe fine avec une longue même cône et des parois parallèles (Exemple: Heat: 815; Pull: 20; Vitesse: 140; Temps: 175; Pression: 200).
    3. Retirez délicatement la pipette tiré du dispositif de traction et placez-le sur le porte-microforge en position horizontale. Réglez la mise au point sur le filament chauffant et pipette.
    4. Utilisez le réticule de l'oculaire pour mesurer le diamètre de la pipette et déplacer la pipette jusqu'à ce que son diamètre sur le filament atteint 180 um.
    5. A la taille indiquée, marquer le capillaire en verre avec un stylo à pointe de diamant, puis appuyez doucement sur la pointe tirée pour briser le verre. Cela devrait se traduire par une coupe droite (figure 1C).
    6. Déplacer la pipette en position verticale avec sa pointe à proximité du filament. Réglez la température du microforge à 60%.
    7. Fire-polish la pointe de la pipette en utilisant des techniques standard 7 jusqu'à ce qu'il atteigne un ID de 40 um. Utilisez le réticule de l' oculaire pour vérifier l'ID (figure 1D).
    8. Faire un angle sur la pipette.
      1. Apportez la pipette à une position horizontale d'environ 10 pm loin du filament et 5 mm de sa pointe. Régler la température à environ 60%, et activer le dispositif de chauffage pour plier la pipette sur le filament. Continuer à chauffer jusqu'à ce qu'un angle (d'environ 30 o) souhaitée est atteinte. Vérifiez l'angle visuel (figure 1E).
        Remarque: La pipette est habituellement monté sur le micro - injecteur selon un angle approximatif de 60 ° par rapport au fond de la cuvette d'injection. La pointe de la pipette est plié de sorte qu'il soit parallèle au fond de la cuvette, qui est nécessaire pour l'injection correcte de l'embryon à son plan médian.
le "Setup Micromanipulateur> 2.

  1. Vérifiez que les microinjecteurs sont entièrement chargés avec de l'huile et qu'il n'y a pas de bulles d'air dans le système (des bulles dans le microinjecteur empêchent un contrôle précis de l'injection).
  2. Vérifiez que les micromanipulateurs sont en position centrale. Cela permettra une vaste gamme de déplacement des pipettes.
  3. Insérez la pipette de maintien dans le support de micromanipulateur gauche et la pipette d'injection dans le support de micromanipulation droite.
  4. Laisser l'huile d'entrer dans les pipettes par capillarité et vérifier que le système fonctionne correctement en déplaçant l'huile et à l'intérieur de la pipette à l'aide des commandes de micro-injecteur.
    Remarque: S'il n'y a pas de mouvement de l'huile à l'intérieur des aiguilles, il pourrait y avoir un sabot. Dans ce cas, utiliser une nouvelle aiguille.
  5. Utilisez les commandes micromanipulateur pour amener les pipettes dans le centre du champ de vision du microscope. Utilisation de grossissement 4X, vérifier que les conseils de micropipette sont dans le bon angle (parallel au fond de la cuvette).
    Remarque: Une configuration correcte des aiguilles est la clé pour une injection réussie et des résultats de cohérence.
  6. Calibrer le système laser suivant le manuel d'étalonnage du fabricant.

3. Préparation de la vaisselle d'injection (Figure 2)

  1. Placer une goutte de 50 ul de réchauffé (37 ° C) FOS-HEPES (composition détaillée dans la section des matériaux) supplémenté avec du sérum de 20% de fœtus bovin (FBS) sur le centre du couvercle d'une boîte de Pétri de 100 mm. Placer un 1 - 2 ul goutte de la solution à injecter à proximité de la goutte d'injection. Veiller à ce que les embryons ne refroidissent pas en dessous de la température ambiante.
    Remarque: Dans ce protocole, nous allons ajouter le colorant de Dextran-Rouge à la solution d'injection pour être en mesure de visualiser le site d'injection et de suivre plus tard.
  2. Couvrir les gouttes dans la plaque d'injection à l'aide d'environ 10 ml d'huile minérale.
  3. Placer le plat d'injection sur la scène du microscope inversé et amener le pipEttes dans la goutte d'injection. Vérifiez que les aiguilles sont en discussion à l'intérieur de la goutte. Régler leur hauteur au besoin en utilisant les commandes micromanipulateur.
  4. À l'aide d'une micropipette, charger environ 20 - 30 zygotes (17-20 h après la fécondation (HPF)) dans la partie supérieure de la goutte d'injection. Effectuer l'injection à la température ambiante de sorte que le nombre d'embryons dans la chute d'injection est déterminé par la vitesse à laquelle la personne peut les injecter. Ne chargez pas plus d'embryons que ceux qui peuvent être injectés en 30 min.
    1. Pour charger les embryons dans le microdispenser, appuyer sur le piston complètement et immerger la pointe dans la solution contenant les embryons. Touchez les embryons à être ramassés avec la pointe du capillaire en verre (une à la fois) et libèrent lentement le piston de sorte que chaque embryon pénètre dans le capillaire. Répétez jusqu'à ce que tous les embryons sont pris en charge ou la capacité de microdispenser est pleine.
    2. Pour libérer les embryons chargés, appuyer sur le piston doucement jusqu'à ce que la totalité du volume containing les embryons est libéré du capillaire.

4. microinjection

  1. En utilisant l'objectif de 4X, charger la solution à injecter dans la pipette d'injection en appliquant une pression négative (aspiration de). Chargez une solution suffisante pour injecter 2 - 3 zygotes. Ensuite, passez à la chute de l'injection.
  2. Dans la goutte d'injection, déplacer la pipette de maintien de sorte que la pointe se rapproche à un zygote Appliquer une pression négative (aspiration) avec le micro-injecteur de maintien de sorte que le zygote se fixe à la pipette de maintien et de changement à un objectif 20X.
  3. Une fois que le zygote est fixé à la pipette de maintien, vérifier sa qualité en utilisant la pipette d'injection pour déplacer doucement l'embryon autour sans le détacher. Une bonne zygote de qualité doit avoir les deux corps polaires (bien que parfois un seul est visible) et un cytoplasme homogène. Ne pas injecter zygotes anormaux (Figure 3A).
  4. Si nécessaire, repositionner l'embryon pour une injection appropriéeemplacement. Un bon positionnement serait celui dans lequel il y a un espace entre le ZP et le PM, de sorte que le PM ne soit pas endommagé par le laser.
  5. Vérifier que la pipette d'injection est positionné sur plan médian de l'embryon en touchant doucement le zygote sur le site d'injection. S'il est pas sur son plan médian, l'aiguille aura tendance à faire tourner l'embryon au lieu de ponction. Réglez la hauteur de la pipette d'injection selon les besoins.
  6. Faire un trou dans la ZP utilisant un laser (figure 3B).
    1. En utilisant le logiciel la place du laser, le laser à réticule dans la ZP où le trou est réalisé (sur le côté opposé à celui où l'embryon est fixé à la pipette de maintien). Utilisation de la fenêtre de contrôle de laser, cliquez sur le bouton de tir. Assurez-vous que la taille du trou est assez grand pour créer une ouverture dans la ZP pour l'aiguille de passer à travers sans endommager le PM (Exemple: 0,662 msec Largeur d'impulsion / 6,9 um taille du trou).
  7. Passez l'aiguille d'injectionà travers le trou dans la ZP et prendre contact avec la MP. Continuez à pousser la pipette avant jusqu'à ce que l'aiguille est ¾ du chemin dans l'embryon (figure 3C).
  8. Observer la position du ménisque à l'interphase solution d'huile, car cela va être utilisé pour contrôler régulièrement le volume d'injection.
  9. Appliquer une pression négative (aspiration) sur la pipette d'injection, ce qui se traduira par PM et le cytoplasme étant aspiré dans l'aiguille d'injection. Continuez jusqu'à ce que le mouvement du cytoplasme dans l'aiguille accélère ou lorsque la teneur en cytoplasme mélangeant avec une solution d'injection peut être vu. Ceux - ci indiquent la rupture de la PM (Figure 3D).
  10. Injecter retour le contenu cytoplasmique suivie par la solution dans le cytoplasme de la zygote en appliquant une pression positive (injection), jusqu'à ce que le ménisque à l'interphase solution-huile a avancé diamètre équivalent d'un zygote passé le point de départ.
    Remarque: Dans nos conditions, ce représente environ 7 pl de solution injectée (figure 3E).
  11. Modification d'un objectif 4x et déplacer l'embryon / s injecté sur la face inférieure de la goutte d'injection. Relâchez l'embryon en appliquant une pression positive sur le micro-injecteur de maintien. Garder les embryons non-injecté sur le côté supérieur et ceux injectés sur le côté inférieur de la chute pour aider à garder la trace des embryons / non-injecté injecté et travailler efficacement.

5. Embryo récupération et injection Résultats

  1. Faire 3 gouttes d'environ 200 ul dans un nouveau plat avec préchauffé SOF-HEPES. Recueillir les embryons injectés en utilisant un microdispenser (tel que décrit ci-dessus). Laver les embryons injectés en les déplaçant à travers le 3 SOF-HEPES gouttes.
  2. Compter les embryons lysées lors de microinjection et jetez-les.
    Note: Un zygote lysées peut être facilement distingué d'un un intact depuis le premier apparaît translucide, remplir toute la ZP, et il a généralement cytoplasmiquele contenu fuit vers l'extérieur de l'embryon.
  3. En option, vérifier l'efficacité de microinjection en utilisant un microscope à fluorescence. Soyez conscient que l'exposition aux rayons UV peut provoquer des lésions de l'embryon qui peut affecter le développement ultérieur.
  4. Les groupes de culture de 25 embryons injectés dans 50 gouttes ul de milieu d'optimisation simplex de potassium (KSOM) additionné de 4 mg / ml de sérum - albumine bovine (SAB) dans de l' huile minérale à 38,5 ° C, 5% de CO 2 dans l' air et à l' humidité jusqu'à saturation.
  5. Compléter le milieu de culture avec 5% de SBF deux jours après l'injection.
  6. Vérifiez blastocyste (BL) taux de 7 jours après l'injection. Calculer les taux BL que le nombre total de blastocyste embryons / nombre total d'embryons cultivés dans cette goutte.

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Representative Results

Assistée par laser microinjection cytoplasmique est un protocole puissant et fiable pour fournir des solutions dans le cytoplasme des zygotes de bétail. La figure 3 montre un aperçu général des zygotes avant et après l' injection, ainsi que le contour global de la technique. Dextran-rouge est utilisé comme solution d'injection pour permettre site de suivi de l'injection et l'injection d'efficacité et de précision. La livraison réussie de la solution est illustrée sur la figure 4 montrant un embryon récemment injecté dans laquelle le colorant est réparti de façon homogène dans le cytoplasme. En utilisant cette technique 100% des embryons sont injectés dans leur cytoplasme.

Ce protocole a démontré que les taux de lyse minimes bovins et ovins zygotes. Seulement 15,6 ± 5 5,8 ± 3,9% des embryons injectés ont été lysées dans bovins et les ovins, respectivement, à la suite d'une microinjection figure 6, il n'y a aucune différence statistiquement significative dans les taux de développement du blastocyste dans le contrôle par rapport à des groupes injectés pour les deux bovine (contrôle 32,8 ± 6,6%, 31,4 ± 5,9% injecté) et d' embryons ovines (40,3 ± 7,8 commande, 30,3 ± 6,0% injectée).

Ces résultats indiquent que l'injection intracytoplasmique assistée par laser provoque un minimum de dommages lors de l'injection et les résultats des taux de développement des blastocytes normaux.

Figure 1
Figure 1: Schéma général Affichage Comment faire la Holding et injection Pipettes. AB) pipette d'injection, CE) Tenir la pipette. A) toucher délicatement le filament avec la pipette tiré au diamètre désiré (5 um). Activer brièvement le chauffage (montré en o gamme). Ce sera légèrement fondre la pipette de sorte qu'il adhère au filament et lors du refroidissement, la pipette se brisera au point de contact générant une coupe droite. B) Marque et angle dans la pipette environ 0,5 cm de la pointe en positionnant la pipette environ 10 um loin du filament chauffant. Continuer à chauffer jusqu'à ce que l'angle souhaité soit atteint. C) Utilisez un stylo à pointe de diamant pour marquer et couper la pipette de maintien au niveau du diamètre désiré (180 um). D) En position verticale, le feu-polish la pointe de la pipette de maintien jusqu'à ce qu'il atteint le diamètre désiré interne (40 pm). E) Faire un angle sur la pipette apportant la pipette de retour à un positionnement horizontal quelques um loin du filament et environ 0,5 cm de son extrémité. Activer le chauffage pour plier la pipette sur le filament. Continuer à chauffer jusqu'à ce que l'angle souhaité soit atteint. Voir 8,9,10 pour plus de détails sur la façon de faire des aiguilles.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:.. Configuration générale de Dish d'injection Disposition des pipettes, des gouttes, et les embryons sont affichés dans ce dessin S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Protocole d'injection intracytoplasmique assistée par laser A) est un schéma général d'un zygote fixé à la pipette de maintien avant l' injection. PB: les corps polaires, ZP: zone pellucide, Cyt: cytoplasme, PN: pronuclei, PM: Membran Plasmae, HP: pipette de maintien, IP:. pipette d'injection BE) étapes de microinjection: B) Faire un trou dans la ZP d'un zygote attaché à la pipette de maintien en utilisant un laser C) Introduire la pipette d'injection vers le côté opposé de l'embryon. . Position du ménisque (a). D Vérifier) Casser la membrane plasmique en aspirant le contenu cytoplasmique dans la pipette d'injection. E) Injecter retour contenu cytoplasmique et une solution dans le cytoplasme zygotique, jusqu'à ce que le ménisque atteint un diamètre de zygote (b) au- delà du point de départ . Représente la distance ab ~ 7 pl de solution injectée. F) un schéma général d'un zygote après l' injection. Notez que la solution injectée se propage de façon homogène dans le cytoplasme. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 4:.. Figure Représentant d'une image lumineuse sur le terrain du zygote injecté B Zygote Injecté avec Dextran-rouge A)) Image Fluorescent du zygote injecté S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5:. Proportion de lysées Embryons après Zygote microinjection dans deux différentes espèces de données représente 4 répétitions pour les embryons de bovins (total de 103 zygotes injectés) et 3 réplique pour les embryons de bovins (total de 173 zygotes injectés). Les barres d'erreur représentent sem S'il vous plaît cliquez ici pour voirune version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6:. Blastocyste Tarifs en bovins et ovins Embryons données représente 4 répétitions pour l'espèce bovine avec un total de 102 injecté et 156 embryons de contrôle et de 3 répétitions pour les espèces ovines avec un total de 163 injecté et 239 embryons témoins. Les barres d'erreur représentent sem S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Microinjection de zygotes est une méthode bien établie pour l'introduction de solutions dans des embryons de mammifères. Avec quelques variations dépendant de l'espèce et du but de l'expérience, cette technique peut être utilisée au sens large. Nous montrons comment effectuer microinjection intracytoplasmique utilisant un laser pour aider l'entrée d'une micropipette extrémité franche. Zygotes de certaines espèces animales (comme les bovins, les moutons et les porcs) ont un cytoplasme sombre, ce qui entrave la visualisation de la pipette d'injection, une fois à l'intérieur de l'embryon. En outre, leurs membranes plasmiques sont très élastiques, ce qui rend leur pénétration avec une aiguille à pointe biseautée (habituellement utilisé pour injecter zygotes des espèces de rongeurs) difficiles à atteindre. Pour surmonter ces limitations, on a utilisé un laser pour permettre le passage d'une aiguille à extrémité émoussée à travers la zone pellucide et l'aspiration ultérieure du contenu cytoplasmique pour assurer la rupture de la membrane plasmique et la libération de la solution à l'intérieur du cytoplasme de l'embryon. Par ailleurs, en INJECTIng dans le site en face de l'entrée de l'aiguille (environ 3/4 à l'intérieur de l'embryon) nous cherchons à déplacer le PN et éviter ainsi leur aspiration / injection. De plus, cela fournit plus de point de contact pour la membrane brisée à guérir, ce qui entraîne des taux de lyse inférieurs.

Produire de bons micropipettes (spécialement la pipette d'injection) et de manière appropriée les mettre dans le micromanipulateur est la clé pour obtenir de bons résultats avec cette technique. L'aiguille d'injection peut être utilisé aussi longtemps que la solution d'injection se déplace en douceur à l'intérieur de l'aiguille. Parfois, le contenu contenu ou même pronuclei cytoplasmique est bloqué à l'intérieur de la pointe de l'aiguille, ce qui provoque l'écoulement de fonctionner de façon inégale et complique l'injection (ce qui augmente également les taux de lyse et retarde le processus). Remplacement de l'aiguille d'injection lorsque cela se produit est nécessaire pour obtenir des résultats optimaux avec ce protocole. La quantité de temps que les embryons sont à l'extérieur de l'incubateur est crucialpour obtenir des taux de survie cohérents et ne devrait pas dépasser 30 minutes. Après la formation et la pratique, les opérateurs réalisent habituellement une vitesse d'injection de 1-2 embryons injectés par minute. Un autre point clé pour le succès de ce protocole consiste à injecter toujours la même quantité de volume de solution par embryon. Ceci est facilement et précisément contrôlée en observant le déplacement de l'interface solution-huile ménisque. Il est important que le diamètre de la pipette est constant entre les manipulations et que l'embout présente un diamètre constant et régulier. Avec 5 pipettes uM d'identité à la pointe, un 7 - 10 pl de volume d'injection est obtenue en injectant l'équivalent de la longueur d'un zygote. Over-injection entraîne souvent l'embryon lyse.

En utilisant ce protocole, 100% des embryons sont injectés correctement dans le cytoplasme, évitant complètement faux périvitelline injections d'espace (figure 4). Ceci maximise la fiabilité et la reproductibilité de l'analyse étant effectuée (quelle que soit la solution injectée), étant donné que les résultats ne sont dues qu'à l'effet de la solution injectée et non à des incohérences d'injection. Certains des zygotes injectés sera généralement lyser en raison de dommages mécaniques lors de l'injection. Un taux habituel de survie après injection est de 75% 11. En utilisant cette méthode, nous sommes en mesure d'obtenir des taux minimaux d'embryons lysées (figure 5). En outre, les taux de développement de blastocystes étaient comparables à la non-injecté (contrôle) des embryons (Figure 6), indiquant que la technique d'injection n'a pas d' effets néfastes sur le développement embryonnaire précoce. L'efficacité de ce protocole a été récemment comparé au protocole microinjection cytoplasmique conventionnel (microinjection cytoplasmique directe à l' aide d' une aiguille de verre biseauté à pointes sans l'utilisation du laser pour pénétrer de ZP) pour injecter zygotes bovine 5. Les résultats ont montré des taux significativement plus élevés d'embryons lysées et des taux inférieurs de formation de blastocystes pour la cytopl directemicroinjection asmic. Nous croyons que ces différences sont dues à moins de dommages mécaniques lors de la pénétration de l'aiguille lors de l'utilisation de la micro-injection cytoplasmique assistée par laser, ce qui rend ce protocole l'un préféré pour injecter des espèces d'élevage dans notre laboratoire.

Ici, nous présentons des données pour les embryons de bovins et ovins obtenus par fécondation in vitro, mais nous avons également testé le protocole en utilisant in vivo et in vitro des embryons de porcs ayant obtenu des résultats similaires (données non présentées). En fonction de la solution injectée, ce protocole peut être utilisé pour de nombreuses applications. Récemment, nous avons utilisé pour introduire un / système cas9 CRISPR pour knock-out des gènes spécifiques sur in vitro fécondé embryons de bovins et a constaté une forte proportion de blastocystes séquencés avec des mutations: 50% des embryons (n = 6) avaient des mutations bialléliques , 33% (n = 4) avaient des mutations monoalléliques, et 17% (n = 2) étaient de type sauvage 5. Ce protocole a été très fiable et pourrait être utilisé dansplusieurs espèces et une myriade d'applications.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micropipette puller Sutter Instrument P-97
Glass capillary Sutter instruments B100-75-10 These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge Narishige MF-9 Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator Nikon/ Narishige NT88-V3
Inverted microscope Nikon TE2000-U Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.
Laser Research Instruments 7-47-500 Saturn 5 Active laser.
Microdispenser Drummond 3-000-105 The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
100 x 15 mm culture dish Falcon 351029 Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.
35 mm culture dish Corning 430165 These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.
Incubator Sanyo MCO-19AIC Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope Nikon SMZ800 Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.
Control Unit HT Minitube 12055/0400 Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage Minitube 12055/0003 Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red Thermo Scientific D1828 A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil sigma M8410 Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine Zenit ZEBV-100 Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.
FBS Gemini-Bio 100-525 Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl Sigma S5886 Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl Sigma P5405 Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4 Sigma P5655 Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCl2 6H2O Sigma M2393 Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate Sigma L4263 Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2 Sigma C7902 Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose  Sigma F3510 Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES  Sigma H4034 Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA Sigma M7145 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA Sigma B6766 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3 Sigma S5761 Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate Sigma P4562 Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax Gibco 35050 Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA Sigma A-3311 Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin Sigma G-1397 Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer Sigma W1503 Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium Made in the lab pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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