Laser-assisted cytoplasmatisk mikroinjektion i Boskap Zygoter

1Department of Animal Science, University of California, Davis
Published 10/05/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Genetics

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Bogliotti, Y. S., Vilarino, M., Ross, P. J. Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes. J. Vis. Exp. (116), e54465, doi:10.3791/54465 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Cytoplasmisk mikroinjektion av embryon 1-cell är en mycket kraftfull teknik. Det kan användas för att leverera en lösning i embryot till, till exempel, producera genprodukter knock-outs för att studera genfunktion eller för att generera gen-redigerade djur. Mest agrikulturellt relevanta husdjurs zygotes har en mycket hög fettsyrasammansättning som gör deras cytoplasma ogenomskinlig och mörk en. De har också en ganska elastiskt plasmamembran (PM). Dessa egenskaper gör mikroinjektion med användning av konventionell pronukleär / cytoplasma injektion som används i gnagare utmanande och ofta felaktiga.

Cytoplasmisk mikroinjektion har fördelar jämfört med pronukleär mikroinjektion eftersom det är lättare att utföra och orsakar också mindre skador på de injicerade embryon, vilket resulterar i högre lönsamhet 2. Det övergripande målet med detta protokoll är att visa en framgångsrik metod för att leverera lösningar i cytoplasman av husdjurs zygoter. För att kunna utföracytoplasmisk mikroinjektion med hög effektivitet på embryon boskap, är en laser används för att generera ett hål i zona pellucida (ZP) och sedan en trubbig ände glasnål används för mikroinjektion. Denna strategi syftar till att minska den mekaniska skador tryckt på embryot under injektion. Därefter, aspiration av cytoplasmisk innehåll i injektionsnålen möjliggör effektiv och säker brott på PM säkerställa att lösningen levereras i cytoplasman av embryot.

Denna teknik har redan använts framgångsrikt i embryon från nötkreatur för att leverera siRNA in i zygotiska cytoplasman 3,4 och generera mutationer med hjälp av klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (crispr) / crispr tillhörande system 9 (Cas9) systemet 5. Det är också lämpligt (med smärre ändringar) för att injicera nötkreatur cumulus-inneslutna oocyter 6. Här beskriver vi vår injektionsprotokoll leverera ett färgämne, som kan tillämpas på injicering någon desired lösning i zygoten, och visar att användningen av denna teknik orsakar minimal lys och påverkar inte tidig embryoutveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikropipett Produktion

  1. injektion mikropipett
    1. Placera en borosilikatglas kapillär (ytterdiameter (OD): 1,0 mm, innerdiameter (ID): 0,75 mm) i en mikropipett avdragare (i mitten av höger och vänster kapillär hållare) och låsa den.
    2. Använd ett lämpligt program för att dra glaset kapillär så det resulterar i en tunn spets med en lång tapper. (Exempel: Värme: 825; Pull: 30; Hastighet: 120; Tid: 200; Tryck: 500).
    3. Försiktigt bort drog pipetter från enheten och placera den på en microforge i horisontellt läge.
    4. Ta drog pipett och microforge värmaren glödtråden med sin glaspärla i fokus. Använd okular hårkorset att mäta önskad tjocklek och flytta pipetten horisontellt tills värmaren glödtråden når målet innerdiameter (5 pm).
    5. Justera värmen till ca 45% och försiktigt föra pipetten ner så det berör tråden. Aktivera värmaren kortvarigt. denna wsjuk något smälta pipetten så det följer att glödtråden och vid kylning kommer pipetten bryta vid kontaktpunkten genererar ett rakt snitt.
      Obs: Inställning av lämplig temperatur är nyckeln i detta steg eftersom temperaturen för hög kommer att göra pipetten böja och därmed ett rakt snitt inte kommer att vara möjligt och temperaturer alltför låga kommer inte att vara tillräcklig för att smälta pipetten (Figur 1A).
    6. Göra en ungefärlig 30 ° vinkel i närheten av pipettspetsen genom att placera det ungefär 10 | j, m bort från uppvärmningsglödtråden. Ställ in temperaturen på 60% och aktivera värmaren.
      Obs: Detta kommer att böja pipetten över glödtråden. Denna vinkel är önskvärd så att nålspetsen är parallell med ytan av insprutningsplattan när den är monterad i injektorn (Figur 1B).
    7. Hantera mikroinjektion pipetter med försiktighet eftersom de är mycket vassa och bräcklig.
  2. håller mikropipett
    1. Placera en borosilicåt glaskapillär (OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) i en mikropipett avdragare (i mitten av höger och vänster kapillär hållare) och låsa den.
    2. Använd ett lämpligt program för att dra glaset kapillär så det resulterar i en tunn spets med en lång och med kona och parallella väggar (Exempel: Värme: 815; Pull: 20; Hastighet: 140; Tid: 175; Tryck: 200).
    3. Försiktigt bort drog pipett ur avdragare enheten och placera den på microforge hållaren i ett horisontellt läge. Ställ in skärpan på värmaren glödtråden och pipett.
    4. Använd okular hårkorset att mäta pipetten diameter och flytta pipetten tills dess diameter över glödtråden når 180 pm.
    5. Vid den angivna storleken, markera glaskapillär med en diamantpenna, och sedan försiktigt trycka på den drog spetsen för att bryta glaset. Detta bör leda till ett rakt snitt (Figur 1C).
    6. Flytta pipetten till ett vertikalt läge med sin spets nära glödtråden. Ställ in temperaturen av microforge till 60%.
    7. Brand-polish spetsen av pipetten med hjälp av standardtekniker 7 tills den når en ID på 40 | j, m. Använd okular hårkorset för att kontrollera ID (figur 1D).
    8. Bildar en vinkel på pipetten.
      1. Föra pipetten tillbaka till ett horisontellt läge omkring 10 | j, m bort från glödtråden och 5 mm från dess spets. Ställ in temperaturen på ca 60% och aktivera värmaren att böja pipetten över glödtråden. Fortsätt upphettningen till dess att en önskad vinkel (på omkring 30 o) har uppnåtts. Kontrollera vinkeln visuellt (figur 1E).
        Notera: Pipetten är vanligtvis monterad till microinjector med en ungefärlig vinkel av 60 o i förhållande till botten av injektions skålen. Spetsen av pipetten är böjd så att den är parallell med botten av skålen, vilket är nödvändigt för en korrekt injektion av embryot vid dess mittplanet.
le "> 2. mikromanipulator Setup

  1. Kontrollera att microinjectors är fullastade med olja och att det inte finns några luftbubblor i systemet (bubblor i microinjector förhindra finreglering av injektion).
  2. Kontrollera att micromanipulators är i mittläget. Detta gör det möjligt för ett brett spektrum av rörelse av pipetterna.
  3. Sätt håll pipetten i den vänstra mikromanipulator hållaren och insprutnings pipetten i rätt mikromanipulering innehavaren.
  4. Låt oljan att ingå pipetterna av kapillärkraften och kontrollera att systemet fungerar korrekt genom att föra olja upp och ner inuti pipetten med hjälp microinjector kontrollerna.
    Obs: Om det inte finns någon rörelse hos oljan inuti nålarna, kan det finnas en träsko. I detta fall, använda en ny kanyl.
  5. Använda mikromanipulator kontroller för att bringa pipetterna in i centrum av mikroskopets synfält. Med hjälp av 4X förstoring, kontrollera att mikropipett tips är i rätt vinkel (parallel till botten av skålen).
    Obs: En korrekt installation av nålarna är nyckeln till en lyckad injektion och resultat konsekvens.
  6. Kalibrera lasersystemet följa tillverkarens kalibrering manual.

3. Framställning av Injection Dish (Figur 2)

  1. Placera en 50 | il droppe av värmt (37 ° C) SOF-HEPES (komposition som beskrivs i avsnittet material) kompletterat med 20% fetalt bovint serum (FBS) på mitten av locket på en 100 mm petriskål. Placera en 1 - 2 | il droppe av den lösning som skall injiceras nära injektions droppe. Se till att embryona inte svalna under RT
    Obs: I detta protokoll kommer vi att lägga till Dextran-röd färgämnet till injektionslösningen för att kunna visualisera injektionsstället och spåra den senare.
  2. Täck dropparna i injektionsplattan med användning av cirka 10 ml av mineralolja.
  3. Placera injektions skålen på scenen av den inverterade mikroskopet och bringa pipEttes in i insprutnings droppe. Kontrollera att nålarna är i fokus i droppen. Anpassa sin höjd efter behov med hjälp av mikromanipulator kontrollerna.
  4. Med användning av en microdispenser, belastas med ca 20-30 zygoter (17-20 h efter befruktning (HPF)) i den övre sidan av injektions droppe. Utföra injektionen vid rumstemperatur så att antalet embryon i injektions droppe bestäms av den hastighet med vilken den person som kan spruta in dem. Fyll inte fler embryon än de som kan injiceras i 30 min.
    1. Att ladda embryon till microdispenser, tryck in kolven helt och sänk spetsen i lösningen innehållande embryona. Tryck på embryon som skall plockas upp med spetsen av glaset kapillär (en åt gången) och släpp sakta kolven så att varje embryo in i kapillären. Upprepa detta tills alla embryon plockas upp eller microdispenser kapaciteten är full.
    2. För att frigöra de laddade embryon tryck in kolven försiktigt tills hela volymen containing embryona frigörs från kapillären.

4. Mikroinjektion

  1. Med hjälp av 4X målet, laddar den lösning som skall injiceras i injektions pipetten genom att applicera negativt tryck (aspire). Fyll tillräcklig lösning, att injicera 2 - 3 zygoter. Sedan flytta till injektions droppe.
  2. Inom injektions droppe, flytta hålla pipetten så spetsen närmar sig en zygot. Tillämpa undertryck (aspirera) med håll microinjector så zygoten blir fäst vid anläggningen pipett och förändring till en 20X mål.
  3. När zygoten är ansluten till anläggningen pipett kontrollera dess kvalitet med hjälp av injicering av pipetten för att försiktigt flytta embryot runt utan att lossa den. En god kvalitet zygot ska ha de två polära kroppar (även om det ibland bara en ses) och en homogen cytoplasman. Injicera inte onormala zygoter (figur 3a).
  4. Om det behövs, flytta embryot för en ordentlig injektionplats. En bra placering skulle vara den i vilken det finns ett mellanrum mellan ZP och PM, så PM inte skadas av lasern.
  5. Kontrollera att injektionspipetten är placerad på embryots mittplanet genom att försiktigt röra zygoten på platsen för injektion. Om det inte är på dess mittplanet, kommer nålen tenderar att göra embryot rotera i stället för punktering. Justera höjden på insprutnings pipetten efter behov.
  6. Göra ett hål i den ZP med användning av en laser (figur 3B).
    1. Med hjälp av laser mjukvara plats laserriktmedel i ZP där hålet skall göras (på den motsatta sidan till där embryot fäst på fasthållnings pipett). Med hjälp av laser kontrollfönstret klicka på elden knappen. Säkerställa att storleken på hålet är tillräckligt stort för att skapa en öppning i ZP för nålen att passera genom utan att skada PM (Exempel: 0,662 msek pulsbredd / 6,9 | im Hålstorlek).
  7. Passera injektionsnålgenom hålet i ZP och göra kontakt med PM. Fortsätt att trycka på pipetten framåt tills nålen är tre fjärdedelar av vägen in i embryot (Figur 3C).
  8. Observera positionen för menisken vid lösning-olja-interfas, eftersom detta kommer att användas för att konsekvent styra injektionsvolym.
  9. Applicera negativt tryck (aspirera) på insprutnings pipett, vilket kommer att resultera i PM och cytoplasman som aspireras in i injektionsnålen. Fortsätt tills rörelse cytoplasman in nålen accelererar eller när cytoplasman innehåll blandas upp med injektionslösning kan ses. Dessa kommer att indikera brott på PM (Figur 3D).
  10. Injicera tillbaka den cytoplasmiska innehåll följt av lösningen in i cytoplasman av zygoten genom att applicera positivt tryck (injicering), tills menisken vid lösning-olja-interfas har avancerat en zygot diameter ekvivalent förbi startpunkten.
    Obs: Under våra förhållanden, denna representerar cirka 7 pl av injicerade lösningen (Figur 3E).
  11. Byt till en 4X mål och flytta den injicerade embryot / s till den nedre sidan av injektions droppe. Släpp embryot genom att applicera positivt tryck på anläggningen microinjector. Håll icke-injicerade embryon på ovansidan och de injicerade dem på den nedre sidan av droppen för att hålla koll på de injicerade / icke-injicerade embryon och arbeta effektivt.

5. Embryo Recovery och Injection Resultat

  1. Gör 3 droppar cirka 200 pl i en ny maträtt med förvärmda SOF-HEPES. Samla injicerade embryon med hjälp av en microdispenser (som beskrivits ovan). Tvätta injicerade embryon genom att flytta dem genom tre SOF-HEPES droppar.
  2. Räkna embryon lyserade under mikroinjektion och kasta dem.
    Obs: Ett lyserade zygot kan lätt skiljas från en intakt en sedan den första verkar genomskinlig, fyll i hela ZP, och det oftast har cytoplasmainnehåll läcker till utsidan av embryot.
  3. Eventuellt kontrollera mikroinjektion effektiviteten med hjälp av en fluorescerande mikroskop. Var medveten om att UV-ljusexponering kan inducera embryoskador som kan påverka efterföljande utveckling.
  4. Odlings grupper om 25 injicerade embryon i 50 fil droppar av kalium simplex optimering mediet (KSOM) kompletterat med 4 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) under mineralolja vid 38,5 ° C, 5% CO 2 i luft och fuktighet till mättnad.
  5. Komplettera odlingsmediet med 5% FBS två dagar efter injektion.
  6. Kontrollera blastocyst (BL) satser 7 dagar efter injektion. Beräkna BL priser som det totala antalet blastocyst embryon / totala antalet embryon odlade i det droppe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Laser-assisted cytoplasma mikroinjektion är en kraftfull och pålitlig protokoll för att leverera lösningar i cytoplasman av boskaps zygoter. Figur 3 visar en allmän översikt över de zygoter före och efter injektion samt övergripande beskrivning av tekniken. Dextran-rött används som injicera lösningen för att tillåta spårning injektionsstället och injektion effektivitet och noggrannhet. Framgångsrik leverans av lösningen illustreras i Figur 4 som visar ett nyligen injicerat embryo i vilken färgämnet är homogent fördelad i cytoplasman. Användning av denna teknik 100% av embryona injiceras i deras cytoplasma.

Detta protokoll har visat sig ha minimal lys priser på nötkreatur och får zygoter. Endast 15,6 ± 5 och 5,8 ± 3,9% av de injicerade embryona lyserades i nötkreatur och får, respektive, som ett resultat av mikroinjektion figur 6, finns det inga statistiskt signifikanta skillnader i blastocyst utvecklingshastigheter i kontroll kontra injicerade grupper för både bovina (32,8 ± 6,6% kontroll, 31,4 ± 5,9% injicerade) och embryon från får (40,3 ± 7,8 kontroll, 30,3 ± 6,0% injicerad).

Dessa resultat indikerar att laserassisterad intracytoplasmatisk injektion orsakar minimal skada under injektion och resulterar i normala blastocyst utvecklingshastigheter.

Figur 1
Figur 1: En allmän diagram som visar hur man gör de Holding och Injection pipetter. AB) Injektion pipett CE) Holding pipett. A) Rör försiktigt tråden med drog pipetten vid önskade diametern (5 pm). Aktivera kort värmaren (visade i o räckvidd). Detta kommer något smälta pipetten så det följer att glödtråden och vid kylning, pipetten kommer att bryta vid kontaktpunkten genererar ett rakt snitt. B) Gör och vinkel i pipetten ca 0,5 cm från sin spets genom att placera pipetten ca 10 um bort från värmaren glödtråden. Fortsätt upphettningen tills önskad vinkel har uppnåtts. C) Använd en diamantpenna för att markera och skära innehavet pipetten vid önskade diametern (180 nm). D) I en vertikal position, brand polish spetsen av innehavet pipetten tills det når önskad innerdiameter (40 um). E) Gör en vinkel på pipetten föra pipetten tillbaka till ett horisontellt positionering ett par im bort från glödtråden och ca 0,5 cm från sin spets. Aktivera värmaren att böja pipetten över glödtråden. Fortsätt upphettningen tills önskad vinkel har uppnåtts. Se 8,9,10 för mer information om hur man gör nålar.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2:.. Allmän inställning injektions Dish Arrangemang av pipetter, droppar, och embryon visas i denna ritning Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. Laser-assisted Intracytoplasmatisk Injection protokoll A) En allmänt schema över en zygot fäst på fasthållnings pipetten före injektion. PB: Polar organ, ZP: zona pellucida, Cyt: cytoplasman PN: prokärnor, PM: Plasma membrane, HP: håller pipett IP. injektionspipetten BE) Mikroinjektion steg: b) Gör ett hål i ZP av en zygot fäst på fasthållnings pipetten med hjälp av en laser c) införa injektions pipetten mot den motsatta sidan av embryot. . Kontrollera positionen av menisken (a). D) Bryt plasmamembranet genom att aspirera cytoplasmiska innehåll inuti injektionspipetten. E) Injicera tillbaka cytoplasmisk innehåll och lösningen i den zygotiska cytoplasman, tills menisken når en zygot diameter (b) tidigare startpunkten . Avstånd ab representerar ~ 7 pl av injicerade lösningen. F) En allmänt schema över en zygot efter injektion. Observera att den injicerade lösningen sprids homogent i cytoplasman. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 4:.. Representativt värde av en injicerad Zygot med dextran-röd A) Bright fält bild av den injicerade zygoten B) Fluorescerande bild av den injicerade zygot Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5:. Andel av lyserade embryon efter Zygote mikroinjektion i två olika arter Data representerar fyra replikat för embryon från nötkreatur (totalt 103 injicerade zygoter) och tre replikat för embryon (totalt 173 injicerade zygoter). Felstaplar representerar sem Klicka här för att seen större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6:. Blastocyst priser i nötkreatur och får Embryon Data representerar fyra replikat för nötkreatur med totalt 102 injiceras och 156 kontrollembryon och tre replikat för fårarter med totalt 163 injiceras och 239 kontrollembryon. Felstaplar representerar sem Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroinjektion av zygoter är en väletablerad metod för att införa lösningar i däggdjursembryon. Med vissa variationer beroende på djurart och syftet med experimentet, kan denna teknik användas brett. Vi visar hur man utför intracytoplasmatisk mikroinjektion med hjälp av en laser för att underlätta ingången till en trubbig ände mikropipett. Zygoter av vissa djurarter (såsom nötkreatur, får och svin) har en mörk cytoplasma, hindrar visualisering av injektions pipett en gång inne i embryot. Även deras plasmamembran är mycket elastiskt, vilket gör deras penetration med en avfasad spetsade nål (vanligtvis används för att injicera zygoter av gnagare) svårt att uppnå. För att övervinna dessa begränsningar, använde vi en laser för att möjliggöra passage av en trubbig ände nålen genom zona pellucida och den efterföljande aspiration av cytoplasmiskt innehåll för att säkerställa brott på plasmamembranet och frigörande av lösningen inuti cytoplasman av embryot. Dessutom, genom att injecting i motsatt sida av nålen ingången (ca 3/4 inuti embryot) vi strävar efter att förskjuta PN och därmed undvika deras aspiration / injektion. Dessutom ger detta mer kontaktpunkt för det brutna membranet att läka, vilket resulterar i lägre lyseringshastigheter.

Producera bra mikropipetter (speciellt insprutnings pipett) och på lämpligt sätt ställa in dem i mikromanipulator är nyckeln till att uppnå goda resultat med denna teknik. Injektionsnålen kan användas så länge som injektionslösningen rör sig jämnt inuti nålen. Ibland blir cytoplasmatisk innehåll eller ens pronuclei innehåll fastnat inuti nålspetsen, vilket gör att flödet att köra ojämnt och komplicerande injektion (detta ökar även lysepriser och fördröjer processen). Byta injektionsnålen när detta händer krävs för att uppnå optimala resultat med detta protokoll. Den tid att embryona är utanför inkubatorn är avgörandeatt få konsekventa överlevnad och bör inte överstiga 30 minuter. Efter utbildning och praktik, operatörer uppnå vanligen en injektion hastighet av 1-2 injicerade embryon per minut. En annan viktig punkt för att lyckas med detta protokoll är att konsekvent injicera samma mängd volym lösning per embryo. Detta är lätt och noggrant styras genom att observera förskjutningen av lösning-olja-gränssnittet menisken. Det är viktigt att pipetten diametern är överensstämmande mellan manipulationer och att spetsen har en regelbunden och konstant diameter. Med 5 iM ID pipetter i spetsen, en 7 - är 10 pl av injektionsvolymen uppnås genom att injicera motsvarar en zygot längd. Under injektion resulterar ofta i embryo lys.

Med hjälp av detta protokoll, är 100% av embryona korrekt injiceras i cytoplasman, helt undvika falsk perivitellina rymd injektioner (Figur 4). Detta maximerar tillförlitligheten och reproducerbarheten av analysen som görs (oberoende av den injicerade lösningen) eftersom resultaten beror endast på effekten av den injicerade lösningen och inte till injektions inkonsekvenser. Några av de injicerade zygoter vanligtvis lysera på grund av mekaniska skador under injektion. En vanlig hastighet av överlevnaden efter injektion är 75% 11. Med denna metod kan vi få minimala andelen lyserade embryon (Figur 5). Även blastocyst utvecklings var jämförbara med icke-injicerade (kontroll) embryon (figur 6), som anger att injektionstekniken har inga skadliga effekter på tidig embryoutveckling. Effektiviteten av detta protokoll har nyligen jämfört med den konventionella cytoplasmiska mikroinjektion protokoll (direkt cytoplasmisk mikroinjektion med hjälp av en fasad spetsiga glas nålen utan användning av laser för att penetrera de ZP) för injicering av nötkreatur zygoter 5. Resultaten visade betydligt högre lyserade embryon och lägre blastocyster formation för direkt cytoplasmic mikroinjektion. Vi anser att dessa skillnader beror på mindre mekanisk skada under nålpenetration vid användning av laser-assisted cytoplasma mikroinjektion, vilket gör detta protokoll att föredra för att injicera djurarter i vårt laboratorium.

Här presenterar vi data för nötkreatur och får embryon som erhållits genom in vitro-fertilisering, men har också testat protokoll med in-vivo och in-vitro svinembryon erhålla liknande resultat (data visas ej). Beroende på den injicerade lösningen, kan detta protokoll användas för många tillämpningar. Nyligen har vi använt den för att införa en crispr / Cas9 system knock-out specifika gener på in vitro befruktade embryon från nötkreatur och fann en stor andel av sekvense blastocyster med mutationer: 50% av embryon (n = 6) hade bialleliska mutationer , 33% (n = 4) hade monoallel mutationer, och 17% (n = 2) var vild-typ 5. Detta protokoll har varit mycket pålitlig och skulle kunna användas iflera arter och otaliga applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micropipette puller Sutter Instrument P-97
Glass capillary Sutter instruments B100-75-10 These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge Narishige MF-9 Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator Nikon/ Narishige NT88-V3
Inverted microscope Nikon TE2000-U Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.
Laser Research Instruments 7-47-500 Saturn 5 Active laser.
Microdispenser Drummond 3-000-105 The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
100 x 15 mm culture dish Falcon 351029 Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.
35 mm culture dish Corning 430165 These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.
Incubator Sanyo MCO-19AIC Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope Nikon SMZ800 Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.
Control Unit HT Minitube 12055/0400 Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage Minitube 12055/0003 Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red Thermo Scientific D1828 A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil sigma M8410 Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine Zenit ZEBV-100 Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.
FBS Gemini-Bio 100-525 Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl Sigma S5886 Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl Sigma P5405 Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4 Sigma P5655 Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCl2 6H2O Sigma M2393 Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate Sigma L4263 Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2 Sigma C7902 Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose  Sigma F3510 Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES  Sigma H4034 Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA Sigma M7145 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA Sigma B6766 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3 Sigma S5761 Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate Sigma P4562 Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax Gibco 35050 Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA Sigma A-3311 Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin Sigma G-1397 Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer Sigma W1503 Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium Made in the lab pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118, (1), 163-170 (2000).
  2. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, (13), 4438-4442 (1985).
  3. Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8, (1), (2008).
  4. Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (7), 2400-2405 (2012).
  5. Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27, (1), 94-94 (2015).
  6. Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9, (9), 1271-1279 (2014).
  7. Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10, (1), 123-128 (2008).
  8. Sutter Instrument. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. Sutter Instrument. www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2015).
  9. Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
  10. Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. Academic Press. (2002).
  11. Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60, (4), 433-438 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats