Laser-assistert Cytoplasmatiske Mikroinjeksjon i Husdyr zygoter

1Department of Animal Science, University of California, Davis
Published 10/05/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Genetics

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Bogliotti, Y. S., Vilarino, M., Ross, P. J. Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes. J. Vis. Exp. (116), e54465, doi:10.3791/54465 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Cytoplasmatiske mikroinjeksjon av en-celle embryo er et veldig kraftig teknikk. Den kan brukes for å levere en hvilken som helst oppløsning inn i embryo for å, for eksempel, fremstille gene knock-out for å studere gen-funksjon eller for å generere gen redigert-dyr. Mest agriculturally-relevante husdyr zygotes har en meget høy fettsyresammensetning som gjør deres cytoplasma ugjennomsiktig og mørkt 1. De har også et forholdsvis elastisk plasmamembranen (PM). Disse egenskapene gjør mikroinjeksjon ved hjelp av konvensjonelle pronuclear / cytoplasma injeksjon som brukes i gnagerarter utfordrende og ofte unøyaktige.

Cytoplasmatiske mikroinjeksjon har fordeler fremfor pronuclear mikroinjeksjon, siden det er enklere å utføre og fører også til mindre skader på de injiserte embryoer, noe som resulterer i høyere 2 levedyktighet. Det overordnede målet med denne protokollen er å demonstrere en vellykket metode for å levere løsninger i cytoplasma av husdyr zygotes. For å være i stand til å utførecytoplasmatisk mikroinjeksjon med høy effektivitet på husdyr embryo, blir en laser som brukes til å generere et hull i zona pellucida (ZP), og deretter en butt-ende glass nål brukes for mikroinjeksjon. Denne strategien har som mål å redusere mekanisk skade trykt på fosteret under injeksjon. Deretter, aspirasjon av cytoplasmisk innhold i injeksjonsnålen tillater effektiv og trygg brekkasje av PM å sikre at oppløsningen blir levert til cytoplasma av embryoet.

Denne teknikken har allerede blitt brukt i storfe embryoer å levere siRNA inn i zygotiske cytoplasma 3,4 og å generere mutasjoner ved hjelp av grupperte regelmessig avbrutt av korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CRISPR forbundet system 9 (Cas9) til 5. Det er også egnet (med mindre modifikasjoner) for å injisere storfe cumulus-vedlagte oocytter 6. Her beskriver vi vår injeksjon protokollen levere et fargestoff, kan det være aktuelt å injisere noe desIRED løsning i zygote, og viser at bruk av denne teknikken fører til minimal lyse og påvirker ikke tidlig embryoutvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikropipette Produksjon

  1. injeksjon mikropipette
    1. Plasser en borsilikatglass kapillær (ytre diameter (OD): 1,0 mm, indre diameter (ID): 0,75 mm) i en mikropipette avtrekker (i midten av høyre og venstre kapillær eierne) og lås den.
    2. Bruke et passende program for å trekke glasskapillar slik at det resulterer i en tynn spiss med en lang tapper. (Eksempel: Heat: 825; Trekk: 30; Velocity: 120; Tid: 200; Trykk: 500).
    3. Fjern forsiktig trakk pipettene fra enheten og plassere den på et microforge i horisontal stilling.
    4. Ta trakk pipette og microforge glødetråd med glassperle i fokus. Bruk okularet trådkorset til å måle den ønskede tykkelse og bevege pipetten horisontalt inntil glødetråd når målet indre diameter (5 um).
    5. Justere varmen til ca 45% og forsiktig bringe pipetten ned slik at den berører filament. Aktiver varmeapparat kort. denne will litt smelte pipetten slik at det fester seg til filament og ved avkjøling, vil pipetten pause på kontaktpunktet generere et rett snitt.
      Merk: Innstilling av riktig temperatur er nøkkelen i dette trinnet, siden temperaturen for høy vil gjøre pipette svingen og dermed rett snitt vil ikke være mulig og temperaturer for lav vil ikke være tilstrekkelig til å smelte pipetten (figur 1A).
    6. Lag en omtrentlig 30 ° vinkel nær pipettespissen ved å plassere det ca 10 mikrometer vekk fra glødetråd. Sett temperaturen på 60% og aktivere varmeren.
      Merk: Dette vil bøye pipetten over filament. Denne vinkel er ønskelig, slik at tuppen av nålen er parallell med overflaten av injeksjonsplaten når den er montert til injektoren (figur 1B).
    7. Håndtak mikroinjeksjon pipetter med varsomhet som de er svært skarpe og skjøre.
  2. Holding mikropipette
    1. Plasser en borosilicspiste glass kapillær (OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) i en mikropipette avtrekker (i midten av høyre og venstre kapillær eierne) og lås den.
    2. Bruke et passende program for å trekke glasskapillar slik at det resulterer i en tynn spiss med en lang og med avta og parallelle vegger (Eksempel: Heat: 815; Trekk: 20; Hastighet: 140; Tid: 175; Trykk: 200).
    3. Fjern forsiktig trukket pipette fra avtrekker enheten og plassere den på microforge holderen i horisontal stilling. Juster fokus på glødetråd og pipette.
    4. Bruk okularet reticle å måle pipette diameter og flytte pipetten til sin diameter over tråd når 180 mikrometer.
    5. På den angitte størrelsen, markere glass kapillær med en diamant penn, og deretter forsiktig trykk på revet spissen for å bryte glasset. Dette skulle resultere i et rett snitt (figur 1C).
    6. Bevege pipetten til en vertikal stilling med sin spiss i nærheten av filamentet. Sett temperatur av microforge til 60%.
    7. Brann-polish spissen av pipetten ved hjelp av standardteknikker 7 inntil den når en ID på 40 um. Bruk okularet reticle å sjekke ID (figur 1D).
    8. Lag en vinkel på pipetten.
      1. Bringe pipetten tilbake til en horisontal stilling 10 um bort fra glødetråden og 5 mm fra dens spiss. Sett temperaturen på ca. 60% og aktivere varmeren for å bøye pipetten i løpet av filamentet. Fortsett oppvarming til en ønsket vinkel (fra ca. 30 °) er nådd. Sjekk vinkelen visuelt (figur 1E).
        Merk: pipette er vanligvis montert på microinjector med en omtrentlig vinkel på 60 ° i forhold til bunnen av injeksjons fatet. Spissen av pipetten er bøyd slik at den er parallell med bunnen av fatet, som er nødvendig for riktig innsprøyting av embryoet ved dens midtplan.
le "> 2. mikromanipluatoren Setup

  1. Kontroller at microinjectors er fullastet med olje, og at det ikke er luftbobler i systemet (bobler i microinjector hindre fin kontroll av injeksjon).
  2. Kontroller at micromanipulators er i midtstilling. Dette åpner for et bredt spekter av bevegelse i pipettene.
  3. Sett holde pipetten inn i den venstre micromanipulator holderen og injeksjons pipette inn i det høyre micromanipulation holderen.
  4. La oljen til å inngå pipettene av capillarity og kontroller at systemet fungerer ved å flytte olje opp og ned inne i pipetten ved hjelp av microinjector kontroller.
    Merk: Hvis det ikke er noen bevegelse av olje inne nålene, kan det være en tresko. I dette tilfellet, bruk en ny nål.
  5. Bruk mikromanipluatoren kontroller for å bringe pipettene inn i sentrum av mikroskopet synsfelt. Ved hjelp 4X forstørrelse, sjekk at Mikropipette tips er i riktig vinkel (parallel til bunnen av fatet).
    Merk: En korrekt oppsett av nålene er nøkkelen for en vellykket injeksjon og for resultatene konsistens.
  6. Kalibrere lasersystemet etter fabrikantens kalibrering manual.

3. Utarbeidelse av Injection Dish (figur 2)

  1. Plasser en 50 ul dråpe varmet (37 ° C) SOF-HEPES (sammensetning beskrevet i materialer seksjon) supplert med 20% føtalt bovint serum (FBS) på midten av lokket på en 100 mm petriskål. Plasser en 1 - 2 ul dråpe av oppløsningen som skal injiseres nær injeksjons dråpe. Pass på at embryoene ikke kjøle ned under RT
    Merk: I denne protokollen vil vi legge til Dextran-Red fargestoff til sprøyte løsning for å kunne visualisere injeksjonsstedet og spore den senere.
  2. Dekk til dråper i sprøyteplaten ved bruk av ca. 10 ml mineralolje.
  3. Sett injeksjon rett på scenen av invertert mikroskop og bringe pipEttes inn injeksjonen slipp. Sjekk at nålene er i fokus innenfor slipp. Justere høyden etter behov ved hjelp mikromanipluatoren kontroller.
  4. Ved hjelp av en microdispenser, legge inn omtrent 20 - 30 For zygotes (17-20 timer etter befruktning (HPF)) i den øvre side av injeksjons slipp. Utføre injeksjon ved romtemperatur, slik at antall embryoer i injeksjonsfallet bestemmes av den hastighet ved hvilken personen kan injisere dem. Ikke legg flere embryoer enn de som kan injiseres i 30 min.
    1. For å laste embryoene inn i microdispenser stemplet trykkes fullt og dyppe spissen i løsningen inneholder embryoer. Berører embryoene å bli plukket opp med spissen av glasskapillar (en på tiden) og langsomt frigjøre stempelet, slik at hver embryo trer inn i kapillaren. Gjenta dette til alle embryoer blir plukket opp eller microdispenser kapasiteten er full.
    2. For å frigjøre lastet embryoer, trykk stempelet forsiktig til hele volumet containing embryoene frigjøres fra kapillær.

4. Mikroinjeksjon

  1. Ved hjelp av 4X objektiv, legger oppløsningen som skal injiseres i injeksjons pipetten ved påføring av negativt trykk (aspirering). Last tilstrekkelig løsning å injisere 2 - 3 zygotes. Deretter flytter til injeksjons slipp.
  2. Innenfor injeksjon drop, flytter du holder pipetten slik at spissen kommer nær en zygote Påfør undertrykk (aspirer) med holde microinjector så zygote blir fikset til holde pipette og endring i en 20X objektiv.
  3. Når zygote er festet til holde pipette, sjekke kvaliteten ved hjelp av injisering pipette til å forsiktig flytte embryo rundt uten å demontere den. En god kvalitet zygote bør ha de to polare legemene (selv om noen ganger bare en sees) og en homogen cytoplasma. Må ikke injiseres unormale zygotes (figur 3A).
  4. Om nødvendig, flytte embryo for en skikkelig injeksjonplassering. En god posisjonering vil være den hvor det ikke er noe rom mellom de ZP og PL, så PL ikke blir skadet av laseren.
  5. Sjekk at injeksjonen pipette er plassert på fosteret midtplan ved å forsiktig berøre zygote på injeksjonsstedet. Dersom den ikke er på dens midtplan, vil nålen har en tendens til å gjøre den embryo rotere i stedet for punktering. Juster høyde av injeksjons pipetten etter behov.
  6. Lag et hull i den ZP ved hjelp av en laser (figur 3B).
    1. Ved hjelp av laser programvare sted laseren trådkorset i ZP hvor hullet vil bli gjort (på motsatt side av der embryoet er festet til holde pipetten). Bruke laserkontroll vinduet klikker du på bålet knappen. Sørge for at størrelsen av hullet er stort nok til å skape en åpning i ZP for at nålen kan passere gjennom uten å skade PM (Eksempel: 0,662 ms pulsbredde / 6,9 mikrometer hull størrelse).
  7. Pass kanylengjennom hullet i ZP og ta kontakt med PM. Fortsett å skyve pipetten frem til nålen er ¾ av veien inn embryoet (Figur 3C).
  8. Observere posisjonen av menisken ved den løsnings olje inter, da dette vil bli brukt til å styre gjennomgående injeksjonsvolum.
  9. Påfør undertrykk (aspirer) på injeksjons pipette, som vil resultere i PM og cytoplasma blir aspirert inn kanylen. Fortsette inntil bevegelsen av cytoplasma inn i nålen akselererer eller når cytoplasma innholdet blandes opp med injeksjonsoppløsningen kan sees. Disse vil indikere brekkasje av PM (figur 3D).
  10. Injiser tilbake den cytoplasmiske innhold, etterfulgt av oppløsningen inn i cytoplasma av zygoten ved å anvende positivt trykk (injisering), inntil menisken ved oppløsning-olje-interfase har avansert en zygote største diameter tilsvarende forbi startpunktet.
    Merk: Under våre forhold, dette representerer ca 7 pl av injisert løsning (figur 3E).
  11. Endring til et 4x objektiv og bevege den injiserte embryo / s til den nedre side av injeksjons slipp. Slipp embryo ved å påføre et positivt press på driftsenheten microinjector. Hold ikke-injisert embryo på oversiden og injiserte de på nedsiden av fallet for å holde styr på de injiserte / ikke-injisert embryoer og arbeide effektivt.

5. Embryo Recovery og injeksjons resultater

  1. Lag 3 dråper ca 200 mL i en ny tallerken med forvarmet SOF-HEPES. Samle de injiserte embryoer ved hjelp av en microdispenser (som beskrevet ovenfor). Vask de injiserte embryoer ved å flytte dem gjennom tre SOF-HEPES dråper.
  2. Tell embryoene løses opp ved mikroinjeksjon og kast dem.
    Merk: En lysert zygote kan lett skilles fra en intakt en siden den første vises gjennomskinnelig, fylle ut hele ZP, og det har vanligvis cytoplasmainnhold lekker til utsiden av embryoet.
  3. Alternativt, merk av mikroinjeksjon effektivitet ved hjelp av et fluorescerende mikroskop. Vær oppmerksom på at UV-lys, kan indusere embryo skader som kan påvirke senere utvikling.
  4. Kultur grupper av 25 injiserte embryoer i 50 pl dråper av kalium simplex optimalisering medium (KSOM) supplert med 4 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) under mineralolje ved 38,5 ° C, 5% CO2 i luft og fuktighet til metning.
  5. Supplere dyrkingsmedier med 5% FBS to dager etter injeksjon.
  6. Sjekk blastocyst (BL) priser 7 dager etter injeksjon. Beregn BL priser som totalt antall blastocyst embryo / totalt antall embryoer dyrket i det slipp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Laserassistert cytoplasmatiske mikroinjeksjon er en kraftig og pålitelig protokoll for å levere løsninger inn i cytoplasmaet til husdyr zygoter. Figur 3 viser en generell oversikt over de zygotes før og etter injeksjonen, samt den generelle omriss av teknikken. Dekstran-rødt anvendes som injeksjonsløsning for å tillate sporing injeksjonsstedet og injeksjon effektivitet og nøyaktighet. Vellykket levering av oppløsningen er illustrert på figur 4 som viser en nylig injisert embryo i hvilket fargestoffet er homogent fordelt i cytoplasma. Ved hjelp av denne teknikken 100% av embryoene blir injisert i sitt cytoplasma.

Denne protokollen har vist seg å ha minimal lysis priser i storfe og sauer zygotes. Bare 15,6 ± 5, og 5,8 ± 3,9% av de injiserte embryoer ble lysert i storfe og sau, henholdsvis, som et resultat av mikroinjeksjon figur 6, er det ingen statistisk signifikante forskjeller i blastocyst utviklingshastigheten i kontrollgruppen versus injiserte grupper både for storfe (32,8 ± 6,6% kontroll, 31,4 ± 5,9% injisert) og sauer embryoer (40,3 ± 7,8 kontroll, 30,3 ± 6,0% injisert).

Disse resultatene indikerer at laserassistert intracytoplasmatisk injeksjon forårsaker minimal skade under injeksjon og resulterer i normale blastocyst utviklingshastigheten.

Figur 1
Figur 1: En generell Diagram Viser Hvordan få de Holding og injeksjons Pipettes. AB) Injeksjon pipette, CE) Hold pipetten. A) berører forsiktig filament med revet pipetten på ønsket diameter (5 mm). Aktiver ovnen kort (viste i o område). Dette vil lett smelte pipetten slik at det fester seg til filament og ved avkjøling, vil pipetten pause på kontaktpunktet generere et rett snitt. B) Lag og vinkel i pipetten ca 0,5 cm fra tuppen ved å plassere pipette ca 10 um bort fra glødetråd. Fortsett oppvarming til ønsket vinkel er oppnådd. C) Bruk en diamant penn for å markere og kutte vente pipetten på ønsket diameter (180 mm). D) I en vertikal posisjon, brann-polsk tuppen av driftsenheten pipetten til det når den ønskede indre diameter (40 mm). e) Lag en vinkel på pipetten bringe pipetten tilbake til en horisontal posisjonering et par um bort fra glødetråden og ca. 0,5 cm bort fra dens spiss. Aktivere varmeren for å bøye pipetten i løpet av filamentet. Fortsett oppvarming inntil den ønskede vinkelen er oppnådd. Se 8,9,10 for mer informasjon om hvordan du kan lage nåler.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2:.. Hovedoppsett Injiserbare Dish Arrangement av pipetter, drops, og embryoer er vist i denne tegningen Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3:. Laser-assistert Intracytoplasmic Injection Protocol A) En generell diagram av en zygote knyttet til driftsenheten pipetten før injeksjon. PB: Polar organer, ZP: zona pellucida, Cyt: cytoplasma, PN: pronuklei, PM: Plasma membrane, HP: holder pipette, IP:. injeksjon pipette BE) mikroinjeksjon trinn: b) Lag et hull i ZP av en zygote knyttet til driftsenheten pipetten ved hjelp av en laser C) Innfør injeksjons pipette mot motsatt side av embryoet. . Bekrefte posisjonen til menisken (a). D) Bryt plasmamembranen ved å aspirere cytoplasmisk innhold inne i injeksjons pipetten E.) Injiseres tilbake cytoplasmisk innhold og løsningen inn i zygotiske cytoplasma, inntil menisken når en zygote diameter (b) forbi startpunktet . Avstanden ab representerer ~ 7 pl av injisert oppløsning. F) Et generelt skjema av en zygote etter injeksjon. Merk at den injiserte løsningen homogent sprer inn i cytoplasma. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 4:.. Representant figur av en Injisert Zygote med dekstran-rød A) Bright felt bilde av den injiserte zygote B) Fluorescent bilde av den injiserte zygote Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5:. Andel lysert embryoer etter Zygote Mikroinjeksjon i to forskjellige arter data representerer fire gjentak for storfe embryoer (totalt 103 injisert zygotes) og 3 gjentak for sauer embryoer (totalt 173 injisert zygotes). Feilfelt representerer sem Klikk her for å seen større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6:. Blastocyst priser i Bovine og Saueskinn Embryoet data representerer fire gjentak for storfe med totalt 102 injisert og 156 kontroll embryoer og 3 gjentak for sauer arter med til sammen 163 injisert og 239 kontroll embryoer. Feilfelt representerer sem Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroinjeksjon av zygotes er en veletablert metode for å innføre løsninger i pattedyr embryoer. Med noen variasjoner avhengig av arten og formålet med eksperiment, kan denne teknikken være bredt anvendt. Vi viser hvordan du utfører intracytoplasmatisk mikroinjeksjon ved hjelp av en laser for å bistå inngangen til en butt-end mikropipette. Zygotes av enkelte husdyrarter (for eksempel storfe, sau og svin) har en mørk cytoplasma, hindrer visualisering av injeksjons pipetten en gang inne i embryo. Også deres plasmamembraner er svært elastisk, noe som gjør deres penetrasjon med en skrå spiked nål (vanligvis brukes til å injisere zygotes av gnagerarter) vanskelig å oppnå. For å overvinne disse begrensningene det benyttet en laser for å muliggjøre passering av en butt-ende-nål gjennom zona pellucida og den påfølgende aspirasjon av cytoplasmisk innhold for å sikre brudd av plasmamembranen og frigjøringen av oppløsningen inne i cytoplasmaet av embryoet. Videre, ved injecting i motsatt side av nålen inngangen (ca 3/4 inne embryo) tar vi sikte på å fortrenge PN og dermed unngå deres aspirasjon / injeksjon. Videre gir dette mer kontaktpunkt for den ødelagte membranen til å helbrede, noe som resulterer i lavere oppløsnings priser.

Produsere gode mikropipetter (spesielt sprøyte pipette) og hensiktsmessig å sette dem inn i micromanipulator er nøkkelen til å oppnå gode resultater med denne teknikken. Injeksjonsnålen kan anvendes så lenge som injeksjonsvæsken beveger seg jevnt inne i nålen. Noen ganger blir cytoplasma innhold eller pronuklei innhold fast inne i tuppen av nålen, slik at flyten til å kjøre ujevnt og kompliserende injeksjon (dette øker også lysis priser og forsinker prosessen). Bytte kanylen når dette skjer er nødvendig for å oppnå best mulig resultat med denne protokollen. Den tiden at embryoene er utenfor inkubatoren er avgjørendefor å få ensartede overlevelse og bør ikke overstige 30 min. Etter trening og praksis, operatører vanligvis oppnå en injeksjon hastighet på 1-2 injiserte embryoer per minutt. Et annet viktig punkt for å lykkes med denne protokollen er å konsekvent injisere samme mengde volum av løsningen per embryo. Dette er enkelt og nøyaktig kontrollert ved å observere forskyvning av oppløsningen-olje-grensesnittet menisk. Det er viktig at pipetten diameter er konsistent mellom manipulasjoner og at spissen har en fast og konstant diameter. Med 5 mikrometer ID pipetter på spissen, en 7 - er 10 pl av injeksjonsvolumet oppnådd ved å injisere tilsvarer en zygote lengde. Over-injeksjon resulterer ofte i embryo lyse.

Ved hjelp av denne protokollen, er 100% av embryoene injiseres ordentlig inn i cytoplasma, helt unngå falsk perivitelline plass injeksjoner (figur 4). Dette maksimerer påliteligheten og reproduserbarheten av analysen blir gjort (uavhengig av den injiserte løsning), siden resultatene er bare skyldes virkningen av den injiserte oppløsning og ikke til injeksjons uoverensstemmelser. Noen av de injiserte zygotes vil vanligvis lysere på grunn av mekanisk skade under injeksjon. En vanlig hastighet på overlevelse etter injeksjon er 75% 11. Ved hjelp av denne metoden, er vi i stand til å få minimale priser av lysert embryoer (figur 5). Også blastocyst utviklingshastigheten var sammenlignbare med ikke-injiserte (kontroll) embryoer (figur 6), som angir at injeksjonsteknikken ikke har noen skadelig effekt på tidlige embryoutvikling. Effektiviteten av denne protokollen ble nylig sammenlignet med den konvensjonelle cytoplasmiske mikroinjeksjon protokoll (direkte cytoplasmatiske mikroinjeksjon ved anvendelse av en skråkant spiked glass nålen uten bruk av laser for å trenge inn i de ZP) for injisering av bovine zygotes 5. Resultatene viste signifikant høyere forekomst av lysert embryoer og lavere priser på blastocysts formasjon for direkte cytoplasmic mikroinjeksjon. Vi mener at disse forskjellene skyldes mindre mekanisk skade under nålepenetrering ved bruk av laser-assistert cytoplasmatisk mikroinjeksjon, noe som gjør denne protokollen foretrukket en for injisering av husdyrarter i vårt laboratorium.

Her presenterer vi data for storfe og sauer embryoer innhentet av in-vitro fertilisering, men har også testet protokollen med in vivo og in vitro svine embryoer skaffe tilsvarende resultater (data ikke vist). Avhengig av den injiserte løsning, kan denne protokollen kan brukes for mange anvendelser. Nylig har vi brukt den til å innføre en CRISPR / Cas9 system for å banke ut spesifikke gener på in-vitro befruktede storfe embryoer og fant en høy andel av sekvensert blastocysts med mutasjoner: 50% av embryoene (n = 6) hadde biallelic mutasjoner , 33% (n = 4) hadde monoallelic mutasjoner, og 17% (n = 2) ble villtype-5. Denne protokollen har vært meget pålitelig og kan bli brukt iflere arter og utallige applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micropipette puller Sutter Instrument P-97
Glass capillary Sutter instruments B100-75-10 These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge Narishige MF-9 Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator Nikon/ Narishige NT88-V3
Inverted microscope Nikon TE2000-U Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.
Laser Research Instruments 7-47-500 Saturn 5 Active laser.
Microdispenser Drummond 3-000-105 The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
100 x 15 mm culture dish Falcon 351029 Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.
35 mm culture dish Corning 430165 These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.
Incubator Sanyo MCO-19AIC Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope Nikon SMZ800 Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.
Control Unit HT Minitube 12055/0400 Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage Minitube 12055/0003 Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red Thermo Scientific D1828 A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil sigma M8410 Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine Zenit ZEBV-100 Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.
FBS Gemini-Bio 100-525 Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl Sigma S5886 Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl Sigma P5405 Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4 Sigma P5655 Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCl2 6H2O Sigma M2393 Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate Sigma L4263 Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2 Sigma C7902 Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose  Sigma F3510 Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES  Sigma H4034 Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA Sigma M7145 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA Sigma B6766 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3 Sigma S5761 Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate Sigma P4562 Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax Gibco 35050 Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA Sigma A-3311 Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin Sigma G-1397 Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer Sigma W1503 Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium Made in the lab pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118, (1), 163-170 (2000).
  2. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, (13), 4438-4442 (1985).
  3. Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8, (1), (2008).
  4. Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (7), 2400-2405 (2012).
  5. Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27, (1), 94-94 (2015).
  6. Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9, (9), 1271-1279 (2014).
  7. Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10, (1), 123-128 (2008).
  8. Sutter Instrument. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. Sutter Instrument. www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2015).
  9. Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
  10. Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. Academic Press. (2002).
  11. Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60, (4), 433-438 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats