Laser-assistita citoplasmatica microiniezione nel bestiame zigoti

1Department of Animal Science, University of California, Davis
Published 10/05/2016
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Genetics

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Summary

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Bogliotti, Y. S., Vilarino, M., Ross, P. J. Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes. J. Vis. Exp. (116), e54465, doi:10.3791/54465 (2016).

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Abstract

Introduction

microiniezione citoplasmatica di embrioni di 1-Cell è una tecnica molto potente. Può essere usato per erogare qualsiasi soluzione nell'embrione, per esempio, producono gene knock-out per studiare la funzione del gene o per generare animali geni modificati. La maggior parte agricolo-zigoti rilevanti animali da allevamento hanno una composizione molto alto acido grasso che rende il loro citoplasma opachi e scuri 1. Hanno anche una membrana plasmatica mediamente elastiche (PM). Queste caratteristiche rendono la microiniezione utilizzando convenzionale pronuclear iniezione / citoplasmatica usati in specie di roditori impegnative e spesso imprecisi.

Microiniezione citoplasmatica ha dei vantaggi rispetto microiniezione pronuclear poiché è più facile da eseguire e provoca anche meno danni agli embrioni iniettati, con conseguente maggiore vitalità 2. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare un metodo di successo per fornire soluzioni nel citoplasma degli zigoti animali da allevamento. Per poter eseguiremicroiniezione citoplasmatica con alta efficienza sugli embrioni bestiame, un laser viene utilizzato per generare un foro nella zona pellucida (ZP) e poi un ago di vetro smussato-end viene utilizzato per la microiniezione. Questa strategia mira a ridurre il danno meccanico impresso l'embrione durante l'iniezione. Poi, l'aspirazione del contenuto citoplasmatica dentro l'ago dell'iniezione permette la rottura efficiente e sicuro del PM garantire che la soluzione è consegnato nel citoplasma dell'embrione.

Questa tecnica è già stata utilizzata con successo in embrioni di bovini per fornire siRNA nel citoplasma zygotic 3,4 e generare mutazioni utilizzando i cluster si ripete regolarmente intervallati brevi palindromi (CRISPR) / CRISPR associato sistema 9 Sistema 5 (Cas9). E 'anche adatto (con piccole modifiche) per iniettare bovini ovociti cumulo-racchiuso 6. Qui, descriviamo il nostro protocollo di iniezione fornire un colorante, che può essere applicabile a qualsiasi iniezione dessoluzione ired nel zigote, e mostrano che l'utilizzo di questa tecnica provoca la lisi minima e non influenza lo sviluppo embrionale precoce.

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Protocol

1. Micropipetta Produzione

  1. micropipetta iniezione
    1. Posizionare un capillare di vetro borosilicato (diametro esterno (OD): 1,0 mm, diametro interno (ID): 0.75 mm) in un estrattore micropipetta (al centro dei titolari dei diritti e capillari sinistra) e bloccarlo.
    2. Utilizzare un programma appropriato per tirare il capillare di vetro in modo che si traduce in una punta sottile con una lunga tapper. (Esempio: Heat: 825; Pull: 30; Velocity: 120; Tempo: 200; Pressione: 500).
    3. Rimuovere con cura le pipette tirato dal dispositivo e posizionarlo su una microforge in posizione orizzontale.
    4. Portare la pipetta tirato e il riscaldamento del filamento microforge con la sua perla di vetro a fuoco. Utilizzare il reticolo oculare per misurare lo spessore desiderato e spostare la pipetta orizzontale fino filamento riscaldatore raggiunge il diametro interno di destinazione (5 micron).
    5. Regolare il calore a circa il 45% e delicatamente portare la pipetta verso il basso in modo che tocchi il filamento. Attivare brevemente il riscaldamento. Questo will leggermente fondere la pipetta in modo da aderire al filamento e per raffreddamento, la pipetta si romperà nel punto di contatto generando un taglio dritto.
      Nota: L'impostazione della temperatura appropriata è fondamentale in questa fase dal momento che le temperature troppo alte renderanno la curva pipetta e quindi un taglio dritto, non sarà possibile e le temperature troppo basse non saranno sufficienti a fondere la pipetta (Figura 1A).
    6. Fare un approssimativo di 30 ° angolo vicino alla punta della pipetta posizionandola a circa 10 micron di distanza dal filamento di riscaldamento. Impostare la temperatura a 60% ed attivare il riscaldamento.
      Nota: Questo piegare la pipetta sul filamento. Questo angolo è desiderato in modo che la punta dell'ago è parallelo alla superficie della piastra di iniezione quando montato nell'iniettore (Figura 1B).
    7. Maneggiare pipette microiniezione con cautela in quanto sono estremamente nitide e fragile.
  2. tenendo micropipetta
    1. Posizionare un borosilicate capillare di vetro (OD: 1,0 mm ID: 0.75 mm) in un estrattore micropipetta (al centro dei titolari dei diritti e capillari sinistra) e bloccarlo.
    2. Utilizzare un programma appropriato per tirare il capillare di vetro in modo che si traduce in una punta sottile con una lunga anche cono e pareti parallele (Esempio: Heat: 815; Pull: 20; Velocity: 140; Tempo: 175; Pressione: 200).
    3. Rimuovere con cautela la pipetta tirato dal dispositivo estrattore e posizionarlo sul supporto microforge in posizione orizzontale. Regolare il fuoco sul filamento riscaldatore e pipetta.
    4. Utilizzare il reticolo oculare per misurare il diametro pipetta e spostare la pipetta fino al suo diametro sopra il filamento raggiunge 180 micron.
    5. Alla dimensione indicata, segnare il capillare di vetro con una penna punta di diamante, e quindi premere delicatamente sulla punta tirato a rompere il vetro. Questo dovrebbe portare a un taglio dritto (Figura 1C).
    6. Spostare la pipetta in posizione verticale con la punta vicino al filamento. Impostare la temperatura del microforge al 60%.
    7. Fuoco smalto la punta della pipetta utilizzando tecniche standard 7 fino a raggiungere un ID di 40 micron. Utilizzare il reticolo oculare per controllare l'ID (Figura 1D).
    8. Realizzare un angolo la pipetta.
      1. Portare la pipetta torna in posizione orizzontale a circa 10 micron di distanza dal filamento e lontano dalla punta 5 mm. Impostare la temperatura a circa il 60% ed attivare il riscaldamento di piegare la pipetta sul filamento. Continuare riscaldamento fino a raggiungere un angolo desiderato (di circa 30 °). Controllare l'angolo visivo (Figura 1E).
        Nota: La pipetta è di solito montato al microinjector ad un angolo approssimativo di 60 o rispetto al fondo del piatto iniezione. La punta della pipetta è piegata in modo che sia parallelo al fondo del piatto, che è necessaria per la corretta iniezione dell'embrione al suo piano medio.
Le "> 2. Impostazione Micromanipolatore

  1. Controllare che le microiniettori sono a pieno carico con olio e che non ci siano bolle d'aria nel sistema (bolle nel microinjector impediscono un controllo preciso di iniezione).
  2. Controllare che i micromanipolatori sono nella posizione centrale. Ciò consentirà per una vasta gamma di movimento delle pipette.
  3. Inserire la pipetta tenendo nel supporto micromanipolatore sinistra e la pipetta di iniezione nel supporto micromanipolazione giusta.
  4. Lasciare che l'olio di entrare nelle pipette per capillarità e verificare che il sistema funzioni correttamente spostando olio su e giù dentro la pipetta utilizzando i controlli microinjector.
    Nota: se non c'è movimento di olio all'interno degli aghi, ci potrebbe essere uno zoccolo. In questo caso, utilizzare un ago nuovo.
  5. Utilizzare i controlli micromanipolatore per portare le pipette nel centro del campo del microscopio di vista. Utilizzando 4X ingrandimento, controllare che le punte micropipetta sono nella corretta angolazione (parallel al fondo del piatto).
    Nota: Una corretta impostazione degli aghi è la chiave per una iniezione di successo e per i risultati coerenza.
  6. Calibrare il sistema laser seguente manuale di taratura del produttore.

3. Preparazione del piatto iniezione (figura 2)

  1. Mettere una goccia 50 ml di riscaldato (37 ° C) SOF-HEPES (composizione descritto nella sezione materiali) supplementato con siero fetale bovino 20% (FBS) sul centro del coperchio di una piastra di Petri di 100 mm. Inserire un 1 - 2 goccia microlitri della soluzione da iniettare vicino alla goccia iniezione. Assicurarsi che gli embrioni non raffreddare sotto RT
    Nota: In questo protocollo aggiungeremo il colorante Destrano-Red per la soluzione parenterale per essere in grado di visualizzare il sito di iniezione e tenere traccia in un secondo momento.
  2. Coprire le gocce nella piastra iniezione utilizzando circa 10 ml di olio minerale.
  3. Porre la capsula di iniezione sul palco del microscopio invertito e portare il pipEttes nella goccia iniezione. Verificare che gli aghi sono a fuoco all'interno della goccia. Regolare la loro altezza in base alle esigenze utilizzando i controlli micromanipolatore.
  4. Utilizzando un microdispenser, caricare circa 20 - 30 zigoti (17 - 20 hr post-fecondazione (HPF)) nella parte superiore della goccia iniezione. Eseguire iniezione a temperatura ambiente in modo che il numero di embrioni nella goccia iniezione è determinata dalla velocità con cui la persona può iniettare. Non caricare più embrioni di quelli che possono essere iniettati in 30 min.
    1. Per caricare gli embrioni nel microdispenser, premere lo stantuffo completamente ed immergere la punta nella soluzione contenente gli embrioni. Toccare gli embrioni che vengono raccolti con la punta del capillare di vetro (uno alla volta) e rilasciano lentamente il pistone così ogni embrione entra nel capillare. Ripetere questa operazione fino a quando tutti gli embrioni vengono prelevati o la capacità microdispenser è piena.
    2. Per rilasciare gli embrioni caricati, premere delicatamente lo stantuffo fino a quando l'intero volume di containing gli embrioni viene rilasciato dal capillare.

4. microiniezione

  1. Utilizzando l'obiettivo 4X, caricare la soluzione da iniettare nella pipetta di iniezione applicando pressione negativa (aspirazione). Caricare soluzione sufficiente per iniettare 2 - 3 zigoti. Quindi spostare la goccia iniezione.
  2. All'interno della goccia iniezione, spostare la pipetta tenendo così la punta si avvicina a uno zigote. Applicare una pressione negativa (aspirazione) con la partecipazione microinjector così lo zigote viene fissata alla pipetta detenzione e la modifica a un obiettivo 20X.
  3. Una volta che lo zigote è attaccato alla pipetta holding, controllarne la qualità utilizzando la pipetta iniettando per spostare delicatamente l'embrione in giro senza staccarla. Un zigote buona qualità dovrebbe avere i due corpi polari (anche se a volte è visto solo uno) e un citoplasma omogeneo. Non iniettare zigoti anormali (Figura 3a).
  4. Se necessario, riposizionare l'embrione di iniezione correttoluogo. Un buon posizionamento sarebbe quella in cui vi è uno spazio tra la ZP e PM, in modo che il PM non danneggiare dal laser.
  5. Verificare che la pipetta di iniezione è posizionato sul piano medio dell'embrione sfiorando zigote sul sito di iniezione. Se non è sul suo piano di mezzeria, l'ago tenderà a rendere l'embrione ruotare invece di foratura. Regolare l'altezza della pipetta di iniezione come necessario.
  6. Fare un buco nella ZP utilizzando un laser (Figura 3B).
    1. Utilizzando posto software del laser del reticolo laser nel ZP cui verrà effettuato il foro (sul lato opposto a dove l'embrione è attaccato alla pipetta tenuta). Utilizzando la finestra di controllo del laser, fare clic sul pulsante di fuoco. Assicurarsi che la dimensione del foro è grande abbastanza per creare un'apertura nella ZP per l'ago di passare attraverso senza danneggiare il PM (Esempio: 0,662 ampiezza impulso msec / 6,9 micron Formato del foro).
  7. Passare l'ago per l'iniezioneattraverso il foro nella ZP e prendere contatto con il PM. Continuare a spingere la pipetta in avanti fino a quando l'ago è ¾ del modo in l'embrione (Figura 3C).
  8. Osservare la posizione del menisco all'interfase soluzione di olio, in modo da essere usato per controllare costantemente volume di iniezione.
  9. Applicare pressione negativa (aspirazione) sulla pipetta di iniezione, che si tradurrà in PM e citoplasma essere inspirate l'ago di iniezione. Continuare finché il movimento di citoplasma all'interno dell'ago accelera o quando il contenuto citoplasma mescolando con la soluzione iniettabile può essere visto. Questi indicheranno rottura del PM (Figura 3D).
  10. Iniettare nuovamente il contenuto citoplasmatico seguita dalla soluzione nel citoplasma dello zigote applicando pressione positiva (iniezione), finché il menisco all'interfase soluzione-olio ha avanzato diametro equivalente di uno zigote oltre il punto di partenza.
    Nota: Nelle nostre condizioni, questo rappresenta circa 7 pl di soluzione iniettata (Figura 3E).
  11. Passare un obiettivo 4X e spostare l'embrione / s iniettato al lato inferiore della goccia iniezione. Rilasciare l'embrione mediante l'applicazione di una pressione positiva sul microinjector azienda. Mantenere gli embrioni non iniettati sul lato superiore e quelli iniettati sul lato inferiore della goccia per tenere traccia degli embrioni iniettati / non-iniettato e lavorare in modo efficiente.

5. Embrione di recupero e iniezione Risultati

  1. Fare 3 gocce di circa 200 ml in un nuovo piatto con pre-riscaldato SOF-HEPES. Raccogliere gli embrioni iniettati usando una microdispenser (come descritto sopra). Lavare gli embrioni iniettati spostandoli attraverso il 3 SOF-HEPES gocce.
  2. Contare gli embrioni lisati durante la microiniezione e gettarli.
    Nota: Un zigote lisato può essere facilmente distinguibili da un uno intatto dal momento che il primo appare traslucido, compilare l'intero ZP, e ha di solito citoplasmaticacontenuti fuoriuscita all'esterno dell'embrione.
  3. Facoltativamente, verificare l'efficienza microiniezione utilizzando un microscopio a fluorescenza. Essere consapevoli del fatto che l'esposizione ai raggi UV può indurre danni embrione che può influenzare il successivo sviluppo.
  4. Gruppi Cultura di 25 embrioni iniettati in 50 gocce microlitri di media ottimizzazione simplex di potassio (KSOM) integrato con 4 mg / ml albumina sierica bovina (BSA) sotto olio minerale a 38,5 ° C, 5% di CO 2 in aria, umidità e alla saturazione.
  5. Integrare il terreno di coltura con il 5% di FBS due giorni dopo l'iniezione.
  6. Controllare blastocisti (BL) i tassi di 7 giorni dopo l'iniezione. Calcola BL tariffe come numero totale di embrioni blastocisti / numero totale di embrioni coltivati ​​in quella goccia.

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Representative Results

Laser-assistita microiniezione citoplasmatica è un protocollo potente e affidabile per fornire soluzioni nel citoplasma di zigoti bestiame. La figura 3 mostra uno schema generale dei zigoti prima e dopo l'iniezione e la sagoma complessiva della tecnica. Destrano-rosso viene usato come iniettare soluzione per consentire il monitoraggio sito di iniezione e iniezione efficienza e precisione. Il raggiungimento della soluzione è illustrata nella figura 4 che mostra un embrione recentemente iniettato in cui il colorante è omogeneamente distribuito nel citoplasma. Utilizzando questa tecnica 100% degli embrioni vengono iniettati nel loro citoplasma.

Questo protocollo ha dimostrato di avere tassi di lisi minimi di zigoti bovini e ovini. Solo 15,6 ± 5 e 5,8 ± 3,9% degli embrioni iniettati sono state lisate in bovini e ovini, rispettivamente, a seguito della microiniezione figura 6, vi sono differenze statisticamente significative nei tassi di sviluppo blastocisti nel controllo contro gruppi iniettati sia per bovini (controllo 32,8 ± 6,6%, 31,4 ± 5,9% iniettato) ed embrioni ovini (controllo 40.3 ± 7.8, 30.3 ± 6,0% iniettato).

Questi risultati indicano che l'iniezione intracitoplasmatica laser assistita provoca danni minimi durante l'iniezione e risultati nelle normali tassi di sviluppo blastocisti.

Figura 1
Figura 1: uno schema generale che mostra come fare le pipette Holding e iniezione. AB) pipetta di iniezione, CE) Tenendo pipetta. A) toccare delicatamente il filamento con la pipetta tirato al diametro desiderato (5 micron). Attivare brevemente il riscaldamento (indicato o gamma). Ciò leggermente fondere la pipetta in modo da aderire al filamento e per raffreddamento, la pipetta si romperà nel punto di contatto generando un taglio dritto. B) Effettuare e l'angolo nella pipetta circa 0,5 cm di distanza dalla punta posizionando la pipetta 10 micron lontano dal filamento riscaldatore. Continuare il riscaldamento fino a raggiungere l'angolazione desiderata. C) Utilizzare una penna punta di diamante per segnare e tagliare la pipetta partecipazione al diametro desiderato (180 micron). D) in posizione verticale, il fuoco-polacco la punta della pipetta partecipazione fino a quando non raggiunge il diametro desiderato interna (40 micron). e) Effettuare un angolo la pipetta portare la pipetta nuovo ad un posizionamento orizzontale coppia micron distanza dal filamento e circa 0,5 cm di distanza dalla sua punta. Attivare il riscaldatore per piegare la pipetta sul filamento. Continuare il riscaldamento fino a raggiungere l'angolazione desiderata. Vedere 8,9,10 per maggiori dettagli su come fare gli aghi.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2:.. Configurazione generale di piatto Iniezione Disposizione delle pipette, scende, e gli embrioni vengono visualizzati in questo disegno prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Laser-assistita intracitoplasmatica Protocol iniezione A) Uno schema generale di un zigote attaccato alla pipetta tenuta prima dell'iniezione. PB: globuli polari, ZP: zona pellucida, Cyt: Citoplasma, PN: pronuclei, PM: membran PlasmaE, HP: tenendo pipetta, IP:. iniezione pipetta BE) passi di microiniezione: B) fare un buco nella ZP di uno zigote attaccato alla pipetta partecipazione utilizzando un laser C) Introdurre la pipetta di iniezione verso il lato opposto dell'embrione. . Posizione del menisco (a). D Verificare) Rottura membrana plasmatica aspirando contenuto citoplasmatico all'interno della pipetta di iniezione. E) Iniettare indietro il contenuto citoplasmatica e soluzione nel citoplasma zigotica, finché il menisco raggiunge uno diametro zigote (b) oltre il punto di partenza . Distanza ab rappresenta ~ 7 pl di soluzione iniettata. F) Uno schema generale di un zigote dopo l'iniezione. Si noti che la soluzione iniettata si diffonde in modo omogeneo nel citoplasma. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 4:.. Rappresentante Figura di un campo immagine luminosa dello zigote iniettato B Zigote iniettato con Destrano-rosso A)) immagine fluorescente dello zigote iniettato Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5:. Percentuale di lisato embrioni dopo zigote microiniezione in due specie diverse di dati rappresenta 4 repliche per gli embrioni di bovini (totale di 103 zigoti iniettati) e 3 replica per gli embrioni ovini (per un totale di 173 zigoti iniettato). Le barre di errore rappresentano SEM Clicca qui per vedereuna versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6:. Blastocisti Tariffe in bovini e ovini embrioni dati rappresenta 4 repliche per le specie bovina, con un totale di 102 iniettato e 156 embrioni di controllo e 3 repliche per specie ovina con un totale di 163 iniettato e 239 embrioni di controllo. Le barre di errore rappresentano SEM prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Microiniezione di zigoti è un metodo consolidato per l'introduzione di soluzioni in embrioni di mammiferi. Con alcune variazioni dipendenti dalla specie e l'obiettivo dell'esperimento, questa tecnica può essere utilizzata largamente. Mostriamo come eseguire microiniezione intracitoplasmatica utilizzando un laser per assistere all'ingresso di una micropipetta smussato-end. Zigoti di alcune specie di bestiame (come bovini, ovini, suini e) hanno un citoplasma scuro, ostacolando la visualizzazione della pipetta di iniezione una volta dentro l'embrione. Inoltre, le loro membrane plasmatiche sono molto elastici, rendendo la loro penetrazione con un ago a punta smussata (di solito usato per iniettare zigoti di specie di roditori) difficili da raggiungere. Per superare queste limitazioni, abbiamo usato un laser per consentire il passaggio di un ago smussato-end attraverso la zona pellucida e la successiva aspirazione di contenuti citoplasmatica per garantire la rottura della membrana plasmatica e il rilascio della soluzione all'interno del citoplasma dell'embrione. Inoltre, iniezng nel sito opposto all'ingresso dell'ago (circa 3/4 all'interno dell'embrione) che mirano a spostare il PN e quindi evitare loro aspirazione / iniezione. Inoltre, questo fornisce più punto di contatto per la membrana rotta di guarire, con il risultato di tassi di lisi più bassi.

Produrre buoni micropipette (specialmente la pipetta di iniezione) e opportunamente impostandole in micromanipolatore è la chiave per ottenere buoni risultati con questa tecnica. L'ago per iniezione può essere utilizzato fintanto che la soluzione iniettabile muove agevolmente all'interno dell'ago. Talvolta, contenuti contenuto o addirittura pronuclei citoplasmatica rimane bloccata all'interno della punta dell'ago, causando il flusso di funzionare in modo non uniforme e complicando iniezione (questo aumenta anche tariffe lisi e ritarda il processo). Sostituzione dell'ago iniezione quando questo accade è necessario per ottenere risultati ottimali con questo protocollo. La quantità di tempo che gli embrioni sono al di fuori dell'incubatore è crucialeper ottenere tassi di sopravvivenza coerenti e non deve superare i 30 minuti. Dopo l'allenamento e la pratica, gli operatori di solito raggiungono una velocità di iniezione di 1-2 embrioni iniettati al minuto. Un altro punto chiave per il successo di questo protocollo è quello di iniettare sempre la stessa quantità di volume di soluzione per embrioni. Questo è facilmente e accuratamente controllato osservando lo spostamento dell'interfaccia menisco soluzione di olio. È importante che il diametro pipetta è coerente tra manipolazioni e che la punta ha un diametro regolare e costante. Con 5 pipette micron ID sulla punta, a 7 - 10 pl di volume di iniezione si ottiene iniettando l'equivalente alla lunghezza di uno zigote. Over-iniezione si traduce spesso in embrione lisi.

Usando questo protocollo, il 100% degli embrioni vengono iniettati correttamente nel citoplasma, evitando completamente falsa perivitellino iniezioni spaziali (Figura 4). Questo massimizza l'affidabilità e riproducibilità del dosaggio viene fatto (indipendentemente dalla soluzione iniettata) poiché i risultati sono dovuti soltanto l'effetto della soluzione iniettata e non incongruenze iniezione. Alcuni degli zigoti iniettati sarà solitamente la lisi a causa di danni meccanici durante l'iniezione. Un tasso usuale di sopravvivenza dopo l'iniezione è del 75% 11. Utilizzando questo metodo, siamo in grado di ottenere tassi minimi di embrioni lisati (Figura 5). Inoltre, tassi di sviluppo blastocisti erano paragonabili a non per iniezione (controllo) embrioni (figura 6), che indica che la tecnica di iniezione non ha effetti negativi sullo sviluppo embrionale precoce. L'efficienza di questo protocollo è stato recentemente rispetto al convenzionale protocollo microiniezione citoplasmatica (microiniezione citoplasmatica diretta usando un ago di vetro spillo smussato senza l'uso del laser di penetrare de ZP) per iniettare zigoti bovina 5. I risultati hanno mostrato tassi significativamente più elevati di embrioni lisati e tassi più bassi di formazione blastocisti per la cytopl direttamicroiniezione asmic. Crediamo che queste differenze sono dovute a meno danni meccanici durante la penetrazione dell'ago quando si utilizza la microiniezione citoplasmatica laser assistita, rendendo questo protocollo quello preferito per l'iniezione di specie animali nel nostro laboratorio.

Qui, vi presentiamo i dati di embrioni di bovini e ovini ottenuti dai vitro in fecondazione, ma abbiamo anche testato il protocollo utilizzando in vivo e in vitro embrioni suini ottenendo risultati simili (dati non mostrati). A seconda della soluzione iniettata, questo protocollo può essere utilizzato per molte applicazioni. Di recente, lo abbiamo usato per introdurre un / sistema Cas9 CRISPR per knock-out geni specifici su in-vitro fecondato embrioni di bovini e ha trovato un'alta percentuale di blastocisti in sequenza con mutazioni: 50% degli embrioni (n = 6) ha avuto mutazioni bialleliche , il 33% (n = 4) ha avuto mutazioni monoallelic, e il 17% (n = 2) erano wild-type 5. Questo protocollo è stato molto affidabile e potrebbe essere utilizzata indiverse specie e una miriade di applicazioni.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micropipette puller Sutter Instrument P-97
Glass capillary Sutter instruments B100-75-10 These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge Narishige MF-9 Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator Nikon/ Narishige NT88-V3
Inverted microscope Nikon TE2000-U Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.
Laser Research Instruments 7-47-500 Saturn 5 Active laser.
Microdispenser Drummond 3-000-105 The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
100 x 15 mm culture dish Falcon 351029 Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.
35 mm culture dish Corning 430165 These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.
Incubator Sanyo MCO-19AIC Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope Nikon SMZ800 Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.
Control Unit HT Minitube 12055/0400 Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage Minitube 12055/0003 Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red Thermo Scientific D1828 A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil sigma M8410 Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine Zenit ZEBV-100 Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.
FBS Gemini-Bio 100-525 Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl Sigma S5886 Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl Sigma P5405 Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4 Sigma P5655 Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCl2 6H2O Sigma M2393 Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate Sigma L4263 Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2 Sigma C7902 Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose  Sigma F3510 Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES  Sigma H4034 Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA Sigma M7145 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA Sigma B6766 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3 Sigma S5761 Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate Sigma P4562 Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax Gibco 35050 Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA Sigma A-3311 Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin Sigma G-1397 Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer Sigma W1503 Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium Made in the lab pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.

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References

  1. McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118, (1), 163-170 (2000).
  2. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, (13), 4438-4442 (1985).
  3. Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8, (1), (2008).
  4. Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (7), 2400-2405 (2012).
  5. Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27, (1), 94-94 (2015).
  6. Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9, (9), 1271-1279 (2014).
  7. Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10, (1), 123-128 (2008).
  8. Sutter Instrument. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. Sutter Instrument. www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2015).
  9. Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
  10. Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. Academic Press. (2002).
  11. Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60, (4), 433-438 (2001).

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