عالية الإنتاجية، متعدد صورة Cryohistology من تمعدن الأنسجة

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Dyment, N. A., Jiang, X., Chen, L., Hong, S. H., Adams, D. J., Ackert-Bicknell, C., Shin, D. G., Rowe, D. W. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J. Vis. Exp. (115), e54468, doi:10.3791/54468 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

وغالبا ما يتطلب الأبحاث البيولوجية phenotyping كفاءة، والتي كثيرا ما يرتبط مع بعض النوع من التحليل النسيجي 1-3. وهذه الحاجة هي أكثر وضوحا مع المشاريع الطموحة لتعطيل كل جين في الماوس الجينوم 4. ويمكن لهذه التحليلات النسيجية تتراوح من تقييم مورفولوجيا الخلايا و / أو الخصائص التشريحية للتعبير رسم خرائط جينات معينة أو البروتينات إلى الخلايا الفردية. في الواقع، واحدة من المساهمات الأساسية من الأنسجة في مجال علم الجينوم هو القدرة على ربط إشارة الجزيئية محددة لمنطقة أو خلية معينة نوع.

الطرق التقليدية في الأنسجة، وخاصة لأنسجة العضلات والعظام، وغالبا ما تكون مضيعة للوقت وشاقة، تتطلب أسابيع لإصلاح بعض الأحيان، ويزيل الكلس، القسم، وصمة عار، وصورة العينة ثم تحليل الصور عن طريق تفسير بشري. تحليل الإشارات الجزيئية متعددة، سواء عن طريق المناعية، في hybridizat الموقعيتطلب أيون، أو البقع الخاصة، مقاطع متعددة وحتى عينات متعددة لأداء مناسب. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الاستجابات متعددة لا يمكن أن يشترك في تتمركز في نفس الخلية، وأحيانا لا يمكن أن يشترك مترجمة إلى منطقة محددة ضمن عينة معينة. كما يتحرك علم الجينوم وepigenomics الملعب في العصر الرقمي، يجب مجال النسيجي أيضا أن تحذو حذوها لتوفير كفاءة والإنتاجية العالية، والتحليل الآلي من مجموعة متنوعة من العلامات الجزيئية في قسم النسيجي واحد.

في الواقع، هناك طلب لتحسين تقنيات النسيجية التي يمكن ربط الإشارات الجزيئية متعددة لخلايا معينة في عينة معينة. في الآونة الأخيرة، نشرنا طريقة cryohistological الإنتاجية العالية جديد لتقييم العديد من تدابير الاستجابة في قسم معين من الأنسجة المعدنية 5-14. وتنطوي العملية على استقرار cryosection مع cryotape المجمدة، والتمسك قسم مسجلة بشكل صارم لشريحة المجهر، وإجراء عدة جولات من تلطيخ والتصوير على كل قسم. ثم يتم محاذاة هذه الجولات من الصور يدويا أو عن طريق أتمتة الكمبيوتر قبل تحليل الصور (الشكل 1). هنا، نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لهذه العملية وتقديم أمثلة حيث تحسنت هذه التقنيات فهمنا من العمليات البيولوجية المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وافقت جامعة جنة رعاية الحيوانات المؤسسي واستخدام مركز الصحة كونيتيكت جميع الإجراءات الحيوانية.

1. التثبيت وتضمينها

  1. الموت ببطء الحيوان عبر CO 2 الخنق أو طرق أخرى معتمدة.
  2. حصاد الأنسجة من الاهتمام (على سبيل المثال، أطرافهم، فقرات، الخ) ووضعه في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة في 4 درجات مئوية حتى الثابتة بشكل صحيح. عناية خاصة للحفاظ على وضع تشريحي ثابت قبل التثبيت. على سبيل المثال، وتحديد أطرافه مع المفاصل في انثناء ثابت، والتناوب الداخلي، والدوران الخارجي زوايا 11. عادة، وتحديد أطرافه الماوس كاملة ل1-3 أيام.
    تحذير: الفورمالين غير سامة، ويجب أن يتم التعامل معها في غطاء الدخان في حين ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    ملاحظة: الإطار الزمني لتثبيت يعتمد على حجم العينة. إذا سمحت التجربة، وقطع مفتوحة عظم شأنها تحسين تثبيت للمقصورة نخاع.قد تتطلب بعض العينات نضح تثبيت 15 للحد من الخلفية الفلورسنت (على سبيل المثال، إشارات الفلورسنت باهتة داخل نخاع العظام).
  3. نقل العينات المأخوذة من الفورمالين إلى 30٪ سكروز المحرز في برنامج تلفزيوني 1X واحتضان لمدة 12-24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بمجرد المحتضنة لمدة 12-24 ساعة، ويمكن بعد ذلك أن توضع العينات في -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. ينصح بهذا الأسلوب لتخزين التجارب التي الباحثين تنوي تضمين عينات متعددة في نفس الكتلة ولكن قد لا يحصد كل من هذه العينات في نفس الوقت (على سبيل المثال، والتجارب مع نقاط زمنية متعددة).
  4. إزالة عينات من السكروز وتشريح بعيدا أي نوع من الأنسجة الزائدة.
  5. ملء cryomold (حجم القالب يعتمد على حجم العينة) جزء من الطريق مع البرد تضمينها المتوسطة. وضع العينة في القالب بحيث قطع الطائرة لمنطقة الفائدة موازية مع الجزء السفلي من القالب.
    ملاحظة: مثال على وضع الأنسجة محددة والتوجهيمكن العثور عليها في الشكل 2A - B.
  6. وضع cryomold على قطعة من الثلج الجاف حتى طبقة رقيقة من البرد تضمين تجميد المتوسطة، وبعد ذلك يحدد العينة في المكان. ملء حجم المتبقية من cryomold مع البرد تضمينها المتوسطة مع الحفاظ على cryomold على بيليه الثلج الجاف.
  7. وضع cryomold في وعاء يحتوي على 2-ميثيل بيوتان قبل فتور من قبل الثلج الجاف. مرة واحدة يتم تجميد العينات تماما، وإزالة cryomolds والتخلص من فائض 2-ميثيل بيوتان. التفاف cryomolds في السيلوفان وضعها في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية الثلاجة لمدة التخزين.
    ملاحظة: يمكن أن عينات تجف مع مرور الوقت عند تخزينها في البرد تضمين المتوسطة، وخاصة في -20 درجة مئوية. نوصي تخزين العينات لمدة أطول من 1-2 أشهر في البرد تضمين المتوسطة في -80 درجة مئوية أو 30٪ سكروز في -80 درجة مئوية (راجع الخطوة 1.3).

2. استقرت الشريط الأنسجة باجتزاء

  1. إزالة كتل عينة من الثلاجة ووضعها في cryostaر مع درجة حرارة يقع بين -20 و -25 درجة مئوية.
  2. إزالة كتلة من cryomold وتقليم بعيدا البرد الزائد تضمين المتوسطة بشفرة حلاقة.
  3. وضع بعض البرد تضمين المتوسطة على القرص العينة ثم محاذاة كتلة هذا أن سطح القرص عينة موازية للسطح السفلي من كتلة وبالتالي تأسيس الطائرة القطع المناسبة للمنطقة من الفائدة.
  4. ضع القرص العينة في ناظم البرد والسماح للالبرد تضمين المتوسطة لتجميد.
  5. ضع القرص عينة على رأس عينة وضبط الرأس مثل أن التخفيضات شفرة موازية لسطح كتلة العينة.
  6. تقليم كتلة أسفل إلى مستوى داخل المنطقة من الفائدة وتهوين أي حلاقات من سطح الكتلة.
  7. قطع قطعة من cryotape كبيرة بما يكفي لتغطية المنطقة من اهتمام وقبل البرد في ناظم البرد.
    ملاحظة: يمكن خفض قطع متعددة من أحجام متناسقة وتخزينها داخل cryostفي خلال باجتزاء.
  8. إزالة الدعم غير ملتصقة من cryotape من خلال استيعاب الشريط بواسطة علامات التبويب غير لزجة الفضة / الذهب باستخدام ملقط ثم وضع الشريط على كتلة الجانب زجة باستمرار.
  9. ممارسة الضغط على لcryotape باستخدام الأسطوانة (الشكل 2C).
  10. جعل القسم (5-8 ميكرون) باستخدام المحرك التلقائي أو اليدوي قطع عجلة من ناظم البرد.
    ملاحظة: ومن الممارسات الجيدة لعقد حافة cryotape كما أنه يأتي على خشبة المسرح مثل أن القسم لا تسقط من على خشبة المسرح خلال باجتزاء (الشكل 2D).
  11. وضع الجانب قسم الأنسجة حتى على شريحة المجهر بلاستيكية داخل ناظم البرد.
  12. إزالة الشريحة البلاستيكية من ناظم البرد والسماح للالبرد تضمين المتوسط ​​وتذوب مثل أن القسم تتمسك سطح الشريحة.
  13. كرر باجتزاء لمسلسل أقسام أو مناطق أخرى من الفائدة.
  14. الانتهاء مرة واحدة، وتخزين المقاطع في مربع الشرائح لر 4 -20 أو -80 درجة مئوية تبعا لطول التخزين المطلوبة وتدابير الاستجابة المصب. على سبيل المثال، استخدام الشرائح التي سوف تكون ملطخة عن النشاط الأنزيمي (انظر 5،2-5،3) في غضون شهر إذا المخزنة في 4 درجات مئوية.

3. التصاق أقسام لمجهر الشرائح

  1. الأشعة فوق البنفسجية يمكن علاجها طريقة اللصق.
    1. تسمية شريحة المجهر.
      ملاحظة: للحصول على زيادة التشغيل الآلي، والعينات والشرائح يمكن أن توصف مع الباركود.
    2. تطبيق قطرة من مادة لاصقة البصرية تنشيط للأشعة فوق البنفسجية لمدة الشرائح الزجاجية واستخدام حافة شريحة بلاستيكية لانتشار طبقة رقيقة من مادة لاصقة على سطح الشرائح الزجاجية.
    3. قطع التبويب الفضة / الذهب ووضع الجانب قسم الأنسجة مسجلة حتى على لاصق من الشريحة الأولى. تطبيق القسم في حركة متجددة من حافة واحدة إلى أخرى من أجل التقليل من تشكيل فقاعات شرك تحت الشريط.
      ملاحظة: يتم استخدام الشريحة الأولى إلى ما قبل الرطب السفلي من ركان الشريط قبل وضعه على الثانية شريحة (دائمة) (الخطوة 3.1.4).
    4. إزالة المقطع مسجلة من الشريحة الأولى ووضعه على طبقة لاصقة من الشريحة الثانية (الشكل 3A). مرة أخرى، واتخاذ الحذر لتجنب الوقوع في الشرك من الفقاعات.
      ملاحظة: هذه الخطوة يأخذ الممارسة لإتقان.
    5. مرة واحدة يتم وضع عدد مناسب من المقاطع لتجربة معينة على كل شريحة، تمحو لاصقة الزائد من المناطق المحيطة بها.
    6. تفقد كل قسم عن كثب بحثا عن فقاعات أو الألياف تحت الشريط. تنفيذ هذا التفتيش تحت المجهر أو العدسة المكبرة. إذا كانت هناك عوائق، وإزالة القسم الفردي، وإزالة العوائق، ومن ثم تطبيق ذلك على شريحة زجاجية.
    7. مرة واحدة يتم تحديد أن عدم وجود عوائق في إطار الأبواب مسجلة، وضع شرائح المجهر تحت ضوء أسود للأشعة فوق البنفسجية ل5-10 دقيقة لتشعبي لاصقة.
  2. طريقة اللصق الشيتوزان.
    1. إعداد عشره 1٪ لاصقة الشيتوزان. تحضير محلول حمض الخليك عن طريق إذابة 0.25 مل من حمض الخليك المركز في 100 مل من الماء DI (0.25٪ ت / ت). حل 1 غرام من مسحوق الشيتوزان في 100 مل من محلول حمض الخليك وتحريك يا حل / N أو حتى يذوب كل مسحوق الشيتوزان.
      ملاحظة: الحل هو مستقر في RT.
    2. إيداع قطرة من حل الشيتوزان لكل قسم التي سيتم وضعها على الشريحة.
    3. قطع التبويب الفضة / الذهب من الشريط ووضع كل جانب الأنسجة قسم مسجلة حتى على لاصق (الشكل 3A). استخدام عناية كبيرة لتجنب الوقوع في الشرك من الفقاعات.
    4. متى وضعت كل أقسام على الشريحة، إمالة الشريحة أعلى على أحد أطرافها طويلة وسحب الشيتوزان المفرط إلى الحافة السفلية باستخدام ملقط.
    5. وضع الشرائح في هذا التوجه على رأس منشفة ورقية في صندوق الشرائح. والجاذبية تسبب ثم الشيتوزان الزائد لتسقط على منشفة، مما أسفر عن طبقة مسطحة وموحدة من الشيتوزان.
    6. جيش التحرير الشعبى الصينىم مربع الشرائح مع غطائه مسنود مفتوحة في الثلاجة يا / N للسماح للالشيتوزان لتجف.
      ملاحظة: انظر الجدول 1 للاطلاع على مقارنة بين طريقتين لاصقة.

4. تطبيق علامات الإشارة إلى الشرائح

  1. إعداد مرجعية الحل علامة عن طريق تذويب 50 ميكرولتر من الأخضر و50 ميكرولتر من المجهرية الحمراء في 100 ميكرولتر من المياه. تخزين الحل في الظلام عند 4 درجات مئوية.
  2. وضع 10 ميكرولتر أو 20 ميكرولتر طرف الماصة في حل microsphere. إضافة قطرة صغيرة من الحل microsphere إلى كل قسم المتاخمة لمنطقة الفائدة (الشكل 3C). كن حذرا حتى لا تحصل المجهرية داخل المنطقة من الفائدة.
  3. تجفيف الشرائح في RT (محمية من الضوء) لمدة 30 دقيقة إذا تجهيز الشرائح في ذلك اليوم. إذا لم يكن كذلك، وضع الشرائح في مربع الشريحة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: ما دام الحل microsphere يجف قبل ترطيب الشرائح، وميلستبقى crospheres الالتزام بها الشرائح خلال جولات متعددة من تلطيخ / التصوير.

5. جولات متعددة من تلطيخ

ملاحظة: عن طريق اختيار تسلسل متوافق من التصوير، والتلوين، والخطوات reimaging، فمن الممكن للكشف عن وشارك في توطين العديد من الإشارات البيولوجية على قسم الأنسجة نفسه. كل جولة من التصوير / تلطيخ / reimaging لابد من تطويرها لمسألة النسيجي معين. يتضمن تسلسل التصوير / تلطيخ / reimaging عادة الحصول على إشارات الفلورسنت الذاتية (على سبيل المثال، GFP الخلوي، والأصباغ تمعدن في الجسم الحي تحقيقات التصوير) في الجولة الأولى من التصوير تليها المناعية المضاعفة الفلورسنت وجولات متعددة من البقع النشاط الأنزيمية. وأخيرا، فإن القسم يمكن أن تكون ملطخة باستخدام الأصباغ اللونية (على سبيل المثال، H & E، طولويدين الأزرق، سفرانين O، الخ) لتسليط الضوء على بنية الأنسجة. عرض في هذا القسم هي طرق مخصصة مقتبس منالبروتوكولات المتاحة تجاريا.

  1. Calcein تلطيخ الأزرق للالمعدنية المتراكمة
    ملاحظة: Calcein تلطيخ الأزرق ينتج سطح معدني ثابت وهذا هو قابلة للتحليل الصور الآلي خلافا الساحة المظلمة أو تفاضلي تدخل النقيض (DIC) التصوير. مشكلة مع تلطيخ الأزرق calcein هي أن الطيف الفلورسنت يتداخل مع التتراسيكلين ووضع العلامات الديميكلوسيكلين. ولذلك، إذا كانت العينة تحتوي هذه التسميات المعدنية، صورة التسميات في الجولة الأولى من التصوير قبل تلطيخ مع calcein الأزرق.
    1. إذا التقط إشارات الذاتية داخل أنسجة قبل هذه الخطوة تلطيخ، غمر الشرائح من الجولة التصوير سابقة في جرة coplin مليئة 1XPBS حتى تسقط زلات غطاء بعيدا عن الشرائح. إزالة وتجفيف زلات الغطاء.
    2. إعداد 30 ملغ / مل من calcein حل الأزرق في 2٪ NaHCO 3 (الذي أدلى به حل ز 2 NaHCO 3 في 100 H 2 O مل وضبطجي لدرجة الحموضة 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك). قسامة وتخزين الحل في -20 درجة مئوية.
    3. تزج الشرائح في جرة coplin التي تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة على ترطيب أقسام، إن لم يكن رطب بالفعل من الجولة السابقة.
    4. إزالة الشرائح وتجفيف الظهر وحواف مع منشفة ورقية.
    5. تطبيق 100-500 ميكرولتر من محلول أزرق calcein لكل شريحة واحتضان لمدة 10 دقيقة في غرفة الرطوبة في RT.
    6. شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة مع 3 تغييرات.
    7. تطبيق ~ 200 ميكرولتر من 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني 1X إلى كل شريحة وجبل انزلاق الغطاء.
    8. إزالة الجلسرين الزائد وتجف أسفل الشرائح.
  2. مقاومة للطرطرات حمض الفوسفاتيز (TRAP) تلطيخ النشاط الأنزيمي
    وأعرب عن TRAP من أنواع خلايا متعددة في النسب المكونة للدم بما في ذلك الخلايا الآكلة: ملاحظة. تلطيخ TRAP المعروضة هنا يستخدم الصفراء الفلورسنت الركيزة حمض الفوسفاتيز. وإشارات الفلورسنت بعض اوفerlap مع مجموعة فلتر الأصفر مخصصة بما في ذلك التتراسيكلين / تسميات ديميكلوسيكلين تمعدن، calcein وصمة عار الأزرق، ودابي مباين.
    1. غمر الشرائح من الجولة التصوير سابقة في جرة coplin مليئة برنامج تلفزيوني 1X حتى تسقط زلات غطاء بعيدا عن الشرائح. إزالة وتجفيف زلات الغطاء.
    2. إعداد العازلة 1 عن طريق إذابة 9.2 غرام من الصوديوم اللامائية خلات و 11.4 غرام من طرطرات الصوديوم ثنائي القاعدة ثنائي الهيدرات في الماء ويصل الحجم النهائي إلى 1000 مل. ضبط درجة الحموضة إلى 4.2 مع حمض الخليك الجليدية المركزة (~ 1،5-2 مل). تخزين الحل في 4 ° مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
    3. إعداد العازلة 2 عن طريق إذابة 40 ملغ من نتريت الصوديوم في المياه ويصل الحجم النهائي إلى 1 مل. تخزين الحل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
    4. في يوم تلطيخ، وإعداد رد فعل العازلة عن طريق خلط 7.5 مل من العازلة 1 و 150 ميكرولتر من العازلة 2.
    5. تطبيق عازلة رد فعل دون الركيزة إلى الشريحةالصورة عن 10-15 دقيقة للتوازن الأنسجة في الرقم الهيدروجيني أقل.
      ملاحظة: حجم النموذجي هو ~ 200 ميكرولتر ولكن يحتاج إلى أن تكون كبيرة بما يكفي لتغطية جميع الأقسام.
    6. تمييع الصفراء الفلورسنت الركيزة حمض الفوسفاتيز بين 01:50 و 1: 100 في المخزن المؤقت رد فعل.
      سيتم تمليها التخفيف من النشاط TRAP ضمن العينة: ملاحظة.
    7. صب رد فعل العازلة الخروج من الشرائح وتطبيق رد فعل العازلة مع الركيزة الفلورسنت الصفراء على الشرائح.
    8. ضع الشرائح تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية الأسود ل~ 5 دقائق لتنشيط الركيزة.
      قد تختلف فترة حضانة اعتمادا على النشاط TRAP ضمن العينة: ملاحظة.
    9. شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة مع 3 تغييرات.
    10. تطبيق ~ 200 ميكرولتر من 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني 1X إلى كل شريحة وجبل انزلاق الغطاء.
    11. إزالة الجلسرين الزائد وتجف أسفل الشرائح.
      ملاحظة: سوف المخزن المؤقت TRAP الحمضية يزيل الكلس الأقسام. فائدة إضافية من decalcificaنشوئها هو أن بعض الألوان سيكون متاحا مرة أخرى لتلطيخ المصب (على سبيل المثال، والعلامات تمعدن). على سبيل المثال، سيتم إزالة تلطيخ الأزرق calcein خلال تلطيخ TRAP. لذلك، دابي مباين يمكن تصوير في هذه القناة خلال جولة لاحقة.
  3. الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) تلطيخ النشاط الأنزيمي
    ملاحظة: أنواع الخلايا متعددة تشارك مع تمعدن بما في ذلك الخلايا بانية العظم والتمعدن غضروفية تعبر عن AP. الركيزة الحمراء السريعة المستخدمة في هذا البروتوكول يثير على حد سواء الحمراء واللونية الإشارة الحمراء الفلورسنت. وبسبب هذا، فإن الركيزة اللونية إرواء إشارات الفلورسنت في المناطق التي ترسب الركيزة. ولذلك، فمن الأفضل أن تفعل هذا وصمة عار بعد تصوير إشارات الفلورسنت التي يمكن أن تطفئ من الركيزة AP.
    1. غمر الشرائح من الجولة التصوير سابقة في جرة coplin مليئة برنامج تلفزيوني 1X حتى تسقط زلات غطاء بعيدا عن الشرائح. ريمولقد وتجفيف زلات الغطاء.
    2. إعداد 1 M تريس عن طريق إذابة 12.1 غرام من تريس في 100 مل من الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 9.5 مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم.
    3. إعداد 1 M MgCl 2 هيدرات عن طريق إذابة 20.33 غرام من MgCl 2 في 100 مل من الماء منزوع الأيونات.
    4. إعداد 2 M كلوريد الصوديوم عن طريق إذابة 11.68 جم كلوريد الصوديوم في 100 مل من الماء منزوع الأيونات.
    5. إعداد 100X (20 ملغ / مل) حل سهم سريع الأحمر TR الملح عن طريق إذابة مسحوق 1 غرام في 50 مل من الماء منزوع الأيونات. جعل 100 مكل ومخزن في -20 درجة مئوية.
    6. إعداد 100X (10 ملغ / مل) حل سهم الفوسفات نفثول AS-MX عن طريق إذابة مسحوق 500 ملغ في 50 مل من ن، ن ثنائي ميثيل الفورماميد. جعل 100 مكل ومخزن في -20 درجة مئوية.
    7. في يوم تلطيخ، وإعداد عازلة AP بإضافة 1 مل من 1 M تريس، 0.5 مل من 1 M MgCl 0.5 مل من 2 M كلوريد الصوديوم وجلب الحجم النهائي إلى 10 مل باستخدام الماء منزوع الأيونات (تركيزات النهائي: 100 ملم تريس، 50 ملي MgCl 100 مم كلوريد الصوديوم).
    8. وضع AP بuffer على كل شريحة واحتضان في غرفة الرطوبة لمدة 10 دقيقة في RT.
    9. إعداد عازلة الركيزة ا ف ب عن طريق تمييع 100X مخزونات سريع الأحمر TR الملح ونفثول AS-MX ل1x أخرى في المنطقة العازلة AP.
    10. صب عازلة AP الخروج من الشرائح واستبدالها مع عازلة AP الركيزة. احتضان الشرائح ل5-10 دقائق في غرفة الرطوبة في RT.
      سيتم تمليها فترة حضانة حسب النشاط AP العينة: ملاحظة.
    11. غسل الشرائح 3X في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    12. جبل غطاء ينزلق مع حل دابي counterstaining (1: 1000 تخفيف من دابي في 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني 1X).
  4. طولويدين الأزرق O (السل) تلطيخ مولد اللون
    ملاحظة: لأن يتم تصوير جميع الخطوات السابقة في ظل تصاعد مائي مؤقت في 50٪ الجلسرين / حل برنامج تلفزيوني، وتصوير الخطوة اللونية أيضا في ظل ظروف المائية. ومع ذلك، فإن الحل تلطيخ قد تميل ليتش مع مرور الوقت. لذلك، يقترح لصورة الأزرق طولويدين في أقرب وقت ممكن بعد تلطيخ.
    1. غمر الشرائح من جولة التصوير سابقة في جرة coplin مملوءة بالماء منزوع الأيونات حتى تسقط زلات غطاء بعيدا عن الشرائح. إزالة وتجفيف زلات الغطاء.
    2. بعد إزالة زلات غطاء، مع استبدال الماء العذب واحتضان الشرائح لمدة 10 دقيقة على الأقل بحيث تتم إزالة الأملاح من برنامج تلفزيوني بشكل كاف من الأنسجة.
    3. يعد حل مرض السل 0.025٪ في الماء منزوع الأيونات.
    4. ضع الشرائح في حل السل عن 1-5 دقائق.
      ملاحظة: فترة حضانة يعتمد على تفضيل المستخدم ولكن يجب أن تبقى متناسقة عبر جميع العينات.
    5. مكان الشرائح في جرة coplin مع الشرائح المياه وغسل منزوع الأيونات 3X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    6. جبل تغطية زلة مع 30٪ الجلسرين المذاب في الماء منزوع الأيونات (وليس برنامج تلفزيوني 1X وهذا سوف يسبب وصمة عار ليتش الخروج من الأنسجة). ملاحظة: يمكن أن تكون بديلا الجلسرين المتوسطة المتزايدة مع شراب الفركتوز، مما يساعد على منع انتشار وصمة عار من الأنسجة. إلىتحضير شراب الفركتوز، حل 30 غراما من الفركتوز في 10 مل من الماء منزوع الأيونات والحرارة إلى 60 درجة مئوية حتى يذوب.

6. جولات متعددة من التصوير

  1. تحميل الشرائح في الأدراج المجهر (الشكل 3D).
    ملاحظة: صواني هي الربيع المحملة.
  2. إدراج الصواني في كومة علبة من المجهر مسح الشريحة (الشكل 3E).
  3. انقر على صورة قائمة لتحميل الملف الشخصي لكل شريحة مع أوقات التعرض المناسبة لكل fluorophore. انقر على اسم الشريحة على سبيل المثال كل شريحة يدويا أو لديك برنامج قراءة الباركود المقدمة على التسمية الشريحة. انقر على زر بدء الفحص معاينة لالتقاط صورة معاينة الشريحة.
  4. تعيين المناطق ذات الاهتمام في المعالج كشف الأنسجة وحفظها لجولات لاحقة من التصوير. مرة واحدة كل شريحة هي الإعداد، بدء عملية المسح الضوئي عن طريق النقر على زر البداية المسح الضوئي.
    ملاحظة: لا يمكن للنظام تعقد ما يصل إلى 100 سليدي في وقت واحد.
  5. بمجرد الانتهاء من التصوير، وتصدير الصور من كل قناة والتصوير الجولة الفردية. TIF أو ملفات .JPG لتجميع الصور وتحليلها.

7. صورة الجمعية

  1. الطريقة اليدوية باستخدام برنامج فوتوشوب (أو ما شابه ذلك برامج تحرير الصور قادرة على إنتاج صور الطبقات).
    1. فتح كل صورة قناة الفردية من كل جولة التصوير.
    2. تجميع الصور الفردية على هيئة طبقات في صورة واحدة مركبة. للقيام بذلك، انقر على طبقة في لوحة طبقة من صورة واحدة. ثم اسحب طبقة على صورة أخرى. وهذه عملية السحب والإسقاط خلق طبقة جديدة في الصورة. هل هذا لجميع الصور الأخرى. بدلا من ذلك، استخدام برنامج نصي (ملف> مخطوطات> تحميل الملفات إلى المكدس ...) لأتمتة هذه العملية عن طريق تحميل ملفات الصور متعددة على هيئة طبقات في كومة الصورة.
    3. مرة واحدة يتم سرد كل صورة كطبقة الفردية في صورة مركبة، انقر مرتين على اسم الطبقة لإعادة تسمية لاyers حسب الحاجة لتمييز قنوات مختلفة.
    4. من أجل أن نرى من خلال كل طبقة وخلق صورة مركبة حقا، تغيير وضع مزيج من أجل كل طبقة من "عادي" إلى "الشاشة" ضمن لوحة طبقة.
      ملاحظة: لتسريع هذه الخطوة، تغيير طبقة واحدة على الشاشة، ثم انقر بزر الماوس الأيمن على طبقة، حدد "نسخة نمط الطبقة"، ثم تسليط الضوء على جميع الطبقات الأخرى واختر "لصق نمط الطبقة" لتطبيق اسلوب شاشة إلى أخرى طبقات.
    5. إذا رغبت في ذلك، والحد من التعتيم (قيمة التغيير إلى 10-40٪) من الطبقة اللونية (أي طولويدين الأزرق) لتصور إشارات الفلورسنت أفضل من خلال طبقة اللونية.
      ملاحظة: مجهر المسح تجانب المستخدمة في هذا البروتوكول يحمل الشرائح في 3 الحواف، وبالتالي تقليل كمية الدوران التي يمكن أن تحدث إلى الشريحة خلال كل جولة من التصوير. وبالتالي، فمن الأسهل بكثير للمستخدم لمحاذاة الصور يدويا دون الحاجة إلى تدوير الصور المستمدةمن جولات مختلفة من التصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وسير العمل العام من أجل عالية الإنتاجية، متعدد صورة Cryohistology

يمثل الشكل 1 سير العمل عام يستخدم لوصف هذه التقنية. وهو يتضمن العديد من الخطوات من التثبيت من خلال عدة جولات من التصوير وأخيرا صورة المحاذاة / التحليل. هذه العملية يمكن أن تستغرق أقل قدر أسبوع للذهاب من عينة التثبيت من خلال 4 جولات من التصوير، وهو وقت أقل مما يلزم ليزيل الكلس هذا النوع من العينات. ترتيب التصوير يبدأ عادة مع إشارات الذاتية التي هي بالفعل في العينة (على سبيل المثال، مراكز تنسيق الشؤون الجنسانية، والعلامات تمعدن، وما إلى ذلك)، ثم المناعية فلوري المضاعفة تليها فحوصات النشاط الأنزيمي فلوري (على سبيل المثال، TRAP، ا ف ب، الخ) والمقايسات تحليل دورة الخلية (على سبيل المثال، EDU)، وأخيرا تنتهي مع وصمة عار اللونية (على سبيل المثال، طولويدين الأزرق O، تنحنحatoxylin، سفرانين O، وما إلى ذلك).

مثال تمثيلية من الأحداث الكاحل المشتركة 6

وكان الغرض من هذه الدراسة معينة لإثبات العلاقة بين التعبير من أنواع مختلفة من الكولاجين (أي Col1a1، Col2a1، وCol10a1) مع تمعدن من الغضروف الليفي للموقع وتر العرقوب إلى العظام الإدراج (أي ارتكاز). لذلك، تم استخدام المعدلة وراثيا الماوس مراسل فلوري الثلاثي بما في ذلك Col1a1-GFPTpz، Col2a1-CFP، وCol10a1-mcherry لتحديد الخلايا معربا عن كل التحوير. وكانت الجولة الأولى من التصوير للتعبير التحوير الذاتية من ماوس المستمر منذ أسبوعين، وهو ما يعادل عندما mineralizes ارتكاز في وتر أخيل (الشكل 4B). ثم أجريت الجولة الثانية من التصوير علىmultiphoton المجهر للحصول على الصور للبنية الكولاجين عن طريق اثنين من الفوتون الجيل الثاني التوافقي (SHG، الشكل 4C). وقد استخدمت هذه الخطوة لتحديد الخلايا في قاعدة ألياف الكولاجين داخل ارتكاز. وكانت الجولة الثالثة من التصوير خطوة المناعية لالقنفذ الهندي (IHH)، التي تعد واحدة من بروابط يشير الرئيسية التي تعزز تمعدن للارتكاز (الشكل 4D). وكانت الجولة الرابعة من التصوير ا ف ب تلطيخ باستخدام الزرقاء الفوسفاتيز القلوية عدة الركيزة، الذي يتسبب على حد سواء مضان Cy5 والإشارات اللونية الزرقاء، لتصور مناطق ترسب المعادن النشطة (الشكل 4E). وأخيرا، وكانت الجولة الخامسة من التصوير السل تلطيخ لتصور الخصائص التشريحية بما في ذلك المحتوى بروتيوغليكان داخل الغضروف الليفي (الشكل 4F). تمت مواءمة جميع الصور يدويا في برامج تحرير الصور. وقد أجرى خمس جولات من التصوير على مدى 4 أيام، والتي أعقبت 3أيام من تجهيز العينات وباجتزاء (7 أيام الإجمالي).

مثال تمثيلية من الركبة الكبار المشتركة 11

وكان الغرض من هذه التجربة لتحديد التغييرات تمعدن التي تحدث في ارتكاز في الرباط الجانبي الأنسي (مكل) في الركبة التالية زعزعة الاستقرار مشترك عبر transection في الرباط الصليبي الأمامي (ACL). ويمكن رؤية التغييرات تمعدن في مكل ارتكاز في وقت مبكر من أسبوعين بعد الجراحة في هذه فئران عمرها 3 أشهر. لمراقبة بدل المعدنية من الغضروف الليفي داخل ارتكاز، أعطيت تسمية المعدنية للفئران في يوم الجراحة (ديميكلوسيكلين) وقبل يوم واحد تضحية (calcein) في 2 أسابيع بعد الجراحة. وتضمن الفئران أيضا للصحفيين الفلورسنت Col1a1-CFP وCol10a1-mcherry لمراقبة التعبير الكولاجين من fibrochondrocyt unmineralized وتمعدن وفاق، على التوالي. وكانت الجولة الأولى من التصوير من إشارات الذاتية، وهو ما يعادل في هذه الحالة إلى البروتينات الفلورية والعلامات تمعدن فلوري (الشكل 5A). وتضمنت الجولة الثانية تلطيخ TRAP لإظهار التعبير عن هذا الانزيم في fibrochondrocytes التمعدن في ارتكاز وكذلك الخلايا الآكلة في نخاع العظام الكامنة (الشكل 5B). وكانت الجولة الثالثة AP تلطيخ لإثبات مناطق تمعدن نشط من fibrochondrocytes وكذلك بانيات العظم الأساسي (الشكل 5C). وأخيرا، تم إجراء السل تلطيخ للجولة الرابعة (الشكل 5D). تمت مواءمة جميع الصور يدويا في برامج تحرير الصور. مرة أخرى كان الوقت الإجمالي مأخوذة من محصول الأنسجة لمحاذاة الصورة 7 أيام.

مثال تمثيلية من التربيقي العظام من القاصي عظم الفخذ

ف together.within الصفحات = "1"> إن الغرض من هذه الدراسة هو النمط الظاهري الهيكل العظمي من الفئران مع اختلاف خلفيات وراثية عن طريق إجراء الآلي histomorphometry الحيوي (www.bonebase.org). أعطيت فئران عمرها ثلاثة أشهر تسميات اثنين تمعدن (calcein 7 أيام السابقة للتضحية وcomplexone الأليزارين قبل أن يضحي 2 أيام). كانت جزءا لا يتجزأ عظام الفخذ البعيدة من أربعة الفئران منفصلة في نفس كتلة المجمدة ثم قطع معا. تم لصقها قسم تحتوي على أربعة عظام أسفل إلى الشريحة. بعد ذلك، تم لصقها قسم آخر يحتوي على 4 عظام إضافية أسفل المتاخمة للقسم الأول. لذلك، طبقت ما مجموعه 8 العظام إلى كل شريحة (الشكل 3B). وقد أجريت هذه العملية في 8 إناث و 8 ذكور الفئران في 3 مستويات مختلفة داخل نخاع العظام، مما أسفر عن عدد 12 الشرائح. تم تطبيق علامات مرجعية (المجهرية) ضمن الكردوس ومنتصف diaphysis على أقسام الجافة (الشكل 3C). كانت ملطخة كافة الشرائح 12 فو ص calcein الأزرق وتصويرها للالمعدنية المتراكم (calcein الأزرق) والعلامات تمعدن (calcein والأليزارين complexone) خلال الجولة الأولى من التصوير (الشكل 6A). ثم تم تصوير الشرائح للنشاط TRAP (الشكل 6B) في الجولة الثانية والنشاط ا ف ب (الشكل 6C) في الجولة الثالثة من التصوير. وأخيرا، تم صبغ الشرائح مع الأزرق طولويدين في الجولة الرابعة (الشكل 6D). تم تصوير العلامات المرجعية خلال كل جولة التصوير، بما في ذلك جولة اللونية، وكانت محاذاة باستخدام برامج مخصصة. لتقديم فكرة عن الإنتاجية لهذا الإجراء، 32 العظام (16 عظام الفخذ و 16 فقرات) كانت جزءا لا يتجزأ في 8 بنات، وأخذت 3 أقسام من كل كتلة، تم توزيع الأقسام في 12 الشرائح، وتم تصوير 12 الشرائح 4 مرات إنتاج 96 مداخن صورة مركبة. كان الزمن الكلي لأداء هذه التجربة 8 أيام.

> شكل 1
الشكل 1. سير العمل نموذجي للبروتوكول. خطوات عامة تشمل 1) الأنسجة التثبيت، 2) cryosectioning استقرت الشريط، 3) التزام أقسام مسجلة على الشرائح الزجاجية، 4) تطبيق علامات مرجعية، 5) جولات متعددة من تلطيخ و 6) التصوير، و7) تجميع الصورة، والمحاذاة، والتحليل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تضمين عالية الإنتاجية وCryosectioning. ونظرا للاستقرار يوفر cryotape والعظام متعددة يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ المجاورة لبعضها البعض (AB) ومقطوع في وقت واحد استقرت شريط (CD). يتم استخدام قطعة من الثلج الجاف خلالعملية دمج لإصلاح جامد العظام في المكان قبل تجميد كامل البرد كتلة (B). يتم إرجاع cryotape على كتلة (C) ويبقى القسم عالقة على الشريط خلال باجتزاء (D). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الالتزام الأقسام مسجلة لزجاج الشرائح، تطبيق المرجعي علامات، وتحميل الشرائح داخل الدرج من مجهر الشريحة المسح. يتم لصقها أقسام مسجلة على سطح الشرائح الزجاجية مع أي من الأشعة فوق البنفسجية علاج أو لاصقة على أساس الشيتوزان (A ). بعد المعالجة أو التجفيف، سوى طبقة رقيقة مسطحة من مادة لاصقة تبقى بين سطح cryotape والزجاج (B). إشارة مارسوتطبق استعادة الطاقة الحركية إلى شرائح الجافة (C، نقطة السهم لإسقاط من حل microsphere). ثم هي التي شنت الشرائح في صواني المجهر (D) وتحميلها في المجهر (E). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. خمس جولات من التصوير في وتر العرقوب من الماوس القديم لمدة أسبوعين. تم إنشاء كومة صورة المركب (A) من خمس جولات من التصوير. الجولة 1 (ب): الذاتية Col1a1-GFPTpz، Col2a1-CFP، والتعبير التحوير Col10a1-mcherry. الجولة 2 (C): الكولاجين الجيل الثاني التوافقي (SHG) على المجهر اثنين من الفوتون. جولة 3 (D): المناعية لIHH. الجولة 4(E): AP النشاط الأنزيمي. الجولة 5: طولويدين يا الأزرق (F). تم تعديل هذا الرقم من Dyment وآخرون، 2015 6 مقياس بار = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. أربعة جولات من التصوير من مكل ارتكاز بعد زعزعة الاستقرار المشترك. وزعزعة الركبتين في فئران عمرها ثلاثة أشهر، مما يؤدي إلى زيادة تمعدن للارتكاز مكل. أعطيت تسمية المعدنية ديميكلوسيكلين يوم الجراحة وتسمية المعدنية calcein أعطيت اليوم قبل التضحية. الجولة 1 (أ): الذاتية Col1a1-CFP، Col10a1-mcherry التعبير التحوير مع ديميكلوسيكلين وcalcein العلامات المعدنية. الجولة 2 (ب) </ strong>: لTRAP النشاط الأنزيمي. جولة 3 (C): AP النشاط الأنزيمي. وقد غطى طولويدين الأزرق O. فخ وإشارة AP على أعلى إشارة السل في الألواح قبل الميلاد: الجولة 4 (D). قناة الصفراء يمكن استخدامها مرة أخرى لTRAP لأن المخزن المؤقت TRAP decalcifies الأنسجة، وإزالة الملصق ديميكلوسيكلين. تم تعديل هذا الرقم من Dyment وآخرون، 2015 (11). شريط مقياس = 200 ميكرون. ماركا: ديميكلوسيكلين، TRAP: مقاومة للطرطرات حمض الفوسفاتيز، ا ف ب: الفوسفاتيز القلوية، مكل: وسطي الرباط الجانبي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6. أربعة جولات من التصوير داخل القاصي عظم الفخذ يحتوي على Microsphere علامات مرجع. هيئة التصنيع العسكري البالغ من ثلاثة أشهرأعطيت ه calcein وcomplexone الأليزارين العلامات المعدنية جولة 1 (AA '): ​​الذاتية calcein وcomplexone alizarain تسميات بالإضافة إلى calcein تلطيخ الأزرق المعدنية المتراكمة جولة 2 (BB.'): TRAP النشاط الأنزيمي جولة 3 (CC). : AP النشاط الأنزيمي جولة 4 (DD '): تم تصوير طولويدين الزرقاء سين المجهرية الخضراء خلال كل جولة (A'-D'، السهم يدل على نفس microsphere في جميع الصور). مقياس شريط = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لاصق الشيتوزان لاصق علاج الأشعة فوق البنفسجية
آلية لاصقة تبخر الأشعة فوق البنفسجيةالتبلمر
النقاهة > 24 ساعة <20 دقيقة
ويمكن إزالة الأجزاء بعد علاج لاصقة؟ نعم فعلا لا
يتم الشفاء للذوبان لاصقة؟ نعم، في المحاليل الحمضية مع انخفاض الرقم الهيدروجيني لا
لا تحمل لاصق الحرارة استرجاع مستضد؟ لا نعم فعلا
غير لاصقة لصناعة السيارات في فلوري؟ لا الحد الأدنى في نطاق الأشعة فوق البنفسجية

الجدول 1. مقارنة بين الشيتوزان لاصق لاصق و-علاج الأشعة فوق البنفسجية

Cryotape نظام الشريط نقل
ممكن لقسم العظام المعدنية التي تستخدم هذا النظام؟ نعم فعلا نعم، ولكن قطعة من العظام المعدنيةقد لا نقل تماما إلى الشريحة
ممكن المفاصل المعدنية قسم باستخدام هذا النظام؟ نعم فعلا نعم فعلا
ممكن لقسم المخ باستخدام هذا النظام؟ نعم، ولكن الأنسجة قد تسقط من الشريط بعد جولات متعددة من التصوير نعم فعلا
ممكن لخفض عينات متعددة جزءا لا يتجزأ من نفس الكتلة؟ نعم فعلا نعم فعلا
ممكن لإجراء جولات متعددة من التصوير في نفس القسم؟ نعم فعلا نعم فعلا

الجدول 2. مقارنة بين نظام Cryotape ونظام الشريط نقل

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا قدمنا ​​بروتوكول cryohistology مفصل للمشاركة في توطين وتحديد العديد من الإجراءات البيولوجية عن طريق مواءمة الصور من جولات متعددة من تلطيخ / التصوير في مقطع واحد. الطريقة الموضحة باستخدام cryotape يكون مفيدا بشكل خاص لأنها تحافظ على التشكل من الصعب قسم الأنسجة (على سبيل المثال، العظام المعدنية والغضاريف). وبالإضافة إلى ذلك، يتم الالتزام الأنسجة مقطوع بقوة إلى الشريحة الزجاجية، والسماح لجولات متعددة من تلطيخ / التصوير من نفس القسم. على عكس الطرق التقليدية حيث يتم ملطخة كل أقسام المسلسل مع لبروتوكول آخر. باستخدام أقسام التسلسلية يمكن أن يشكل مشكلة عند محاولة للمشاركة في توطين الإشارات بين الأقسام، وهو أمر لا مشكلة مع أقسام واحدة التي تم الملون وتصوير مع جولات متعددة.

كان أول الأنسجة باجتزاء المنتج استقرت الشريط على سوق نظام نقل الشريط 16 و 17. ويستخدم الشريط البلاستيك المغلفةمع مادة لاصقة درجات الحرارة الباردة التي يتم وضعها على سطح cryoblock الأنسجة. عندما التخفيضات ناظم البرد شفرة تحت الشريط، تتم إزالة القسم سليمة وتمسكا الشريط. بعد ذلك يتم وضع شريط الجانب عينة أسفل على الشرائح التي هي المغلفة مع الأشعة فوق البنفسجية علاج الغراء بحيث النسيج يصبح تعلق بشكل صارم إلى الشريحة. بمجرد دقت الشريط بعيدا عن الباب، الشريحة يمكن معالجتها إما مضان أو الأنسجة اللونية. مضان خلفية اللاصقة منخفضة، وجولات متعددة من تلطيخ والتصوير يعمل بشكل جيد مع معظم الأنسجة الرخوة. ولكن مع أقسام المعدنية، يمكن أن يكون هناك فقدان شظايا معدنية عند نقل الأنسجة من شريط لاصق على الشرائح الزجاجية. وبالإضافة إلى ذلك، بل هو نظام مكلفة نسبيا لتثبيت في ناظم البرد (> 8000 $)، وتكاليف استهلاك مرتفعة (> 2 $ / الشرائح).

آخر استراتيجية الاستقرار الشريط التي وضعها الدكتور Tadafumi كاواموتو تستخدم للاصق المغلفة فيلم البولي فينيل كلوريد لالتقاط قسم الأنسجة. في البروتوكول، وهو مقطوع على الأنسجة الطازجة والمجمدة على الشريط وثابتة على الفور في PFA أو الإيثانول 18. وفي وقت لاحق، اتسخت الشريط ثم استوى على شريحة زجاجية مع الجانب عينة أسفل للفحص المجهري. وهكذا يتم تنفيذ كل بروتوكول تلطيخ على قسم مسجلة مختلفة.

لقد قمنا بتعديل وإضافة إلى بروتوكول كاواموتو في عدد من الطرق بما في ذلك تحديد العينة في الفورمالين قبل التضمين. هذه الخطوة مهمة لإصلاح GFP حشوية للذوبان من الحيوانات المعدلة وراثيا في حدود الخلية. لقد استخدمت cryotape لمجموعة واسعة من أنواع الأنسجة 5-13. يمكن العاملين في المختبرات من ذوي الخبرة النسيجية المحدودة تنتج أقسام ذات جودة عالية مع هذا الأسلوب. المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هي تكلفة منخفضة نسبيا (أي الأجهزة الخاصة، <1.00 $ لكل شريحة)، أي خسارة من الشظايا المعدنية،والقدرة على أداء جولات متعددة من تلطيخ والتصوير في نفس القسم.

لأن التصوير المناطق نفسها من الانزلاق عدة مرات في تكرار سيكون من غير المعقول بالنسبة لعدد كبير من الشرائح حتى باستخدام مرحلة الآلية، خطوة حاسمة أخرى من هذا البروتوكول هو استخدام المجهر الشريحة المسح إلى زيادة الاتساق والإنتاجية. المجهر هو ماسح ضوئي الشريحة الرقمية التي تعمل في إطار كل من epifluorescence والضوء المرسل. وهي مجهزة بمحركات برج 10-موقف وكلاهما B & W الكاميرات واللون. الجدة الحقيقية للنظام، في أيدينا، هو أن مناطق معينة من الفائدة يمكن أن بسرعة وسهولة محددة من قبل المستخدم أو الكشف عن تلقائيا بواسطة برنامج التصوير. ويمكن بعد ذلك يتم حفظ هذه المناطق من الاهتمام من الجولة الأولى من التصوير ومن ثم إعادة شحنها بسرعة خلال الجولات اللاحقة. لذلك، يتم تصوير نفس المناطق ذات الاهتمام خلال كل جولة من التصوير. على أساس من قبل المستخدممعايير محددة في البرنامج، سوف المجهر ضبط تلقائي للصورة ومسح الصور القرميد التي تحاك خلال الاستحواذ داخل المناطق المثيرة للاهتمام.

الأمر الذي المستخدم ينفذ جولات متعددة من تلطيخ هو المهم. ويرد النظام العام في الشكل 1، وعدد من fluorophores التي يمكن فصلها بما فيه الكفاية عن طريق المجهر الفلورسنت هو العامل المحدد الرئيسي لعدد من تدابير الاستجابة التي يمكن الحصول عليها على قسم معين. ومع ذلك، قنوات الفلورسنت يمكن استخدامها في بعض الحالات. على سبيل المثال، calcein الأزرق وديميكلوسيكلين كلا تنبعث منها إشارة قوية في قناة الصفراء المستخدمة لقياس النشاط TRAP. يتم تجنب هذا الاستنزاف من خلال الرغم لأن المخزن المؤقت TRAP decalcifies القسم، مما يزيل المعدنية قبل التصوير النشاط TRAP. وبالإضافة إلى ذلك، سوف دابي مباين تنبعث في قناة الصفراء أيضا. ومع ذلك، يمكن للمستخدم محل دابي مع مباين آخر في الالبريد الأحمر أو بعيدة الحمراء النطاق. وبالإضافة إلى ذلك، والأجسام المضادة يمكن تجريده وإعادة الملون مع الأجسام المضادة المختلفة باستخدام نفس القنوات الفلورسنت. لذلك، هذا الأسلوب هو قابل للتكيف تماما لزيادة عدد تدابير الاستجابة التي يمكن تسجيلها على قسم معين.

هناك بعض القيود مع بروتوكول المعروضة. 1) قد لا تلتزم وcryotape بما فيه الكفاية لأنسجة معينة. على سبيل المثال، تميل أقسام الدماغ الثابتة الفورمالين لتسقط الشريط بعد جولات متعددة من تلطيخ. لأنسجة مثل هذا، قد يكون نظام نقل الشريط أكثر ملاءمة كما يتم الالتزام بها للأنسجة على سطح الزجاج بواسطة لاصق تنشيط الأشعة فوق البنفسجية (انظر الجدول رقم 2 للمقارنة بين هاتين الطريقتين). 2) لاصق الشيتوزان، مع توفير الخصائص البصرية شفافة، لن يكتب له البقاء خطوات المعالجة القاسية التي تشمل درجات حرارة عالية أو الأحماض القوية. ولذلك، فإن لاصقة تنشيط للأشعة فوق البنفسجية هو أكثر ملاءمة لهذه التطبيقات (انظر الجدول 1 وأو المقارنة بين هذه المواد اللاصقة اثنين).

البروتوكولات cryohistological المعروضة هنا أيضا تصلح لأعلى إنتاجية والأتمتة. على سبيل المثال، في استقرار الشريط التي تقدمها cryotape يسمح للمستخدمين المبتدئين نسبيا لقطع العظام أو مفاصل متعددة في وقت واحد في نفس المبنى، زيادة كبيرة في الإنتاجية. باستخدام الماسح الضوئي الآلي يقلل كثيرا من الوقت فني والتكاليف ذات الصلة إلى التصوير، والتي كانت عادة الحد من معدل خطوة في تجربتنا. أن تكون قادرة على الدوام وبشكل موثوق صورة نفس المنطقة من اهتمام عدة مرات في فترة قصيرة من الزمن يوفر منبرا لالآلي، تحليل موضوعي للأنسجة. في الواقع، وقد وضعت مجموعتنا منصة لالانحياز الآلي الكمبيوتر وhistomorphometry من العظام. أولا، البرنامج يحاذي جولات متعددة من الصور على أساس علامات إشارة الفلورسنت. ثم، يتم تغذية الصور الانحياز إلى خط أنابيب histomorphometry حيث computإيه البرنامج يحدد المنطقة من اهتمام ويقيس موضوعية عدة قياسات والدينامية (انظر للمزيد في www.bonebase.org) 13. وقدم هذا البرنامج ممكنا نظرا لزيادة الإنتاجية والاتساق التي تقدمها باجتزاء cryotape، الرقمية المجهر الشريحة المسح الضوئي، وبرامج التحليل المخصصة. ويمثل هذا البروتوكول تقدما كبيرا في ارتفاع cryohistology الإنتاجية، وينبغي أن تكون ذات فائدة لتلك التصوير الصعب قسم الأنسجة مثل العظام وكذلك الخبرة مع باجتزاء الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose Sigma Aldrich S9378 Multiple suppliers available.
PBS Sigma Aldrich P5368 Multiple suppliers available.
Cryomolds Fisher Scientific Fisherbrand #22-363-554 Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix Thermo Scientific 6769006 Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane Sigma Aldrich M32631 Multiple suppliers available.
Cryostat Leica Biosystems 3050s Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc Leica Biosystems 14037008587 Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades Thermo Scientific 3051835 Can be substituted with other brands/models.
Cryotape Section Lab Cryofilm 2C
Roller Electron Microscopy Sciences 62800-46 Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides Electron Microscopy Sciences 71890-01 Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides Thermo Scientific 3051 Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61 Norland Optical Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light General Electric F15T8-BLB
Glacial acetic acid Sigma Aldrich ARK2183 Multiple suppliers available.
Chitosan Sigma Aldrich C3646 Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres ThermoFisher Scientific I-14787
InSpeck green microspheres ThermoFisher Scientific I-14785
Calcein Blue Sigma Aldrich M1255 Multiple suppliers available.
Calcein Sigma Aldrich C0875  Multiple suppliers available.
Alizarin complexone Sigma Aldrich A3882  Multiple suppliers available.
Demeclocycline Sigma Aldrich D6140  Multiple suppliers available.
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761 Multiple suppliers available.
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate ThermoFisher Scientific E-6588
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific R37108 Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous Sigma Aldrich S2889 Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate  Sigma Aldrich T6521 Multiple suppliers available.
Sodium nitrite Sigma Aldrich S2252 Multiple suppliers available.
Tris Sigma Aldrich 15504 Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate Sigma Aldrich M9272 Multiple suppliers available.
NaCl Sigma Aldrich S7653 Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt Sigma Aldrich F8764 Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX  Sigma Aldrich N4875 Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide Sigma Aldrich D158550 Multiple suppliers available.
Toluidine blue O Sigma Aldrich T3260 Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1 Carl Zeiss AG Axio Scan.Z1 Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set Chroma Technology Corp. 49000
CFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49001
GFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49020
YFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set Chroma Technology Corp. custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set Chroma Technology Corp. 49004
Cy5 Filter Set Chroma Technology Corp. 49009
CryoJane Tape Transfer System Electron Microscopy Sciences 62800-10 Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows Electron Microscopy Sciences 62800-72 Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides Electron Microscopy Sciences 62800-4X Multiple suppliers available.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5, (1), 19-25 (2012).
  2. Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7, (5), 515-524 (2014).
  3. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2, (4), e61 (2006).
  4. Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23, (9-10), 600-610 (2012).
  5. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24, (2), 335-344 (2016).
  6. Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405, (1), 96-107 (2015).
  7. Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33, (11), 1693-1703 (2015).
  8. Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33, (8), 1142-1151 (2015).
  9. Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28, (10), 1338-1347 (2010).
  10. Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29, (5), 1283-1294 (2014).
  11. Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23, (6), 996-1006 (2015).
  12. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, (2), 187-196 (2012).
  13. Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004 (2012).
  14. Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
  15. Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33, (7), 948-956 (2015).
  16. Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53, (5), 593-602 (2005).
  17. Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53, (3), 239-240 (2001).
  18. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66, (2), 123-143 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics