De alto rendimento, Multi-Imagem Cryohistology de mineralizadas tecidos

Biology

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Dyment, N. A., Jiang, X., Chen, L., Hong, S. H., Adams, D. J., Ackert-Bicknell, C., Shin, D. G., Rowe, D. W. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J. Vis. Exp. (115), e54468, doi:10.3791/54468 (2016).

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Abstract

Introduction

Pesquisa biológica, muitas vezes requer fenotipagem eficiente, o que é frequentemente associada com algum tipo de análise histológica 1-3. Esta necessidade é ainda mais evidente com os projectos ambiciosos para interromper cada gene no genoma do rato 4. Estas análises histológicas pode variar de avaliar a morfologia celular e / ou características anatómicas a expressão de mapeamento de genes específicos ou proteínas para células individuais. Na verdade, uma das contribuições fundamentais de histologia para o campo da genômica é a capacidade de associar um sinal molecular específica para uma região ou célula tipo específico.

Os métodos tradicionais de histologia, especialmente para tecidos músculo-esqueléticas, são muitas vezes demorado e trabalhoso, exigindo, por vezes semanas para corrigir, descalcificação, seção, mancha e imagem do espécime, em seguida, analisar as imagens através da interpretação humana. Análise de múltiplos sinais moleculares, quer seja através de imuno-histoquímica, em hybridizat situion, ou colorações especiais, requer várias seções e até mesmo várias amostras para realizar de forma adequada. Além disso, estas várias respostas não podem ser co-localizadas à mesma célula e, por vezes, pode não ser co-localizados a uma região específica de uma dada amostra. Como o campo da genómica e epigenomics se move para a era digital, o campo histológico também deve seguir o mesmo caminho para fornecer eficiente e de alta taxa de transferência e análise automatizada de uma variedade de sinais moleculares dentro de um único corte histológico.

De fato, há uma demanda para melhoria de técnicas histológicas que podem associar vários sinais moleculares às células específicas dentro de uma dada amostra. Recentemente, publicou um novo método cryohistological de alto rendimento para avaliar várias medidas de resposta dentro de um determinado seção de tecido mineralizado 5-14. O processo envolve a estabilização do criocorte com cryotape congelado, fazendo aderir a secção gravado rigidamente a uma lâmina de microscópio, ea realização de várias rodadas de coloração e de imagem em cada seção. Estes ciclos de imagens são então alinhadas manualmente ou através de automação computador antes de análise de imagem (Figura 1). Aqui, apresentamos protocolos detalhados deste processo e fornecer exemplos onde estas técnicas têm melhorado nossa compreensão dos diferentes processos biológicos.

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Protocol

A Universidade do comitê de cuidados com os animais institucional e uso Connecticut Centro de Saúde aprovou todos os procedimentos com animais.

1. Fixação and Embedding

  1. Eutanásia do animal através de CO 2 asfixia ou outros métodos aprovados.
  2. Colheita do tecido de interesse (por exemplo, membro, vértebras, etc.) e colocar em 10% de formalina tamponada neutra a 4 ° C até ser adequadamente fixo. Tome especial cuidado para manter a colocação anatômica consistente antes da fixação. Por exemplo, corrigir membros com juntas em flexão consistente, rotação interna e rotação externa ângulos 11. Normalmente, corrigir membros integrais do mouse para 1 - 3 dias.
    Cuidado: formol é tóxico e deve ser tratado em um exaustor enquanto usava o equipamento de protecção individual adequado.
    Nota: O período de tempo de fixação depende do tamanho da amostra. Se o experimento permite, cortando abrir o osso vai melhorar a fixação do compartimento de medula.Algumas amostras podem exigir fixação da perfusão 15 para minimizar o fundo fluorescente (por exemplo, os sinais fluorescentes fracos dentro da medula óssea).
  3. Transferência Espécimes de formalina a 30% de sacarose feito em 1x PBS e incubar durante 12-24 horas a 4 ° C.
    Observação: Uma vez incubadas durante 12-24 horas, em seguida, as amostras podem ser colocadas a -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Este método de armazenamento é recomendado para experiências em que os investigadores pretendem incorporar várias amostras no mesmo bloco, mas pode não colher todas estas amostras ao mesmo tempo (por exemplo, as experiências com vários pontos de tempo).
  4. Retirar amostras a partir da sacarose e dissecar afastado qualquer excesso de tecido.
  5. Encha uma cryomold (tamanho do molde é dependente do tamanho da amostra) parte do caminho com crio a incorporação médio. Coloque amostra no molde de tal forma que o corte de avião para a região de interesse é paralelo com a parte inferior do molde.
    Nota: Um exemplo de colocação de tecido específico e orientaçãopode ser encontrada na Figura 2A - B.
  6. Coloque o cryomold sobre um pedaço de gelo seco até que uma fina camada de material crio a incorporação congela médio e, posteriormente, corrige a amostra no lugar. Encher o volume restante da cryomold com crio de meio de inclusão, mantendo a cryomold na pelete de gelo seco.
  7. Coloque a cryomold num recipiente contendo 2-metil-butano previamente arrefecido por gelo seco. Uma vez que as amostras são completamente congelado, retire cryomolds e sacuda o excesso de 2-metil-butano. Enrole cryomolds em celofane e coloque em uma temperatura de -20 ° C ou -80 ° C congelador para armazenamento.
    Nota: As amostras pode secar ao longo do tempo quando armazenado em meio de incorporação de crio, especialmente à temperatura de -20 ° C. Sugerimos que de armazenamento de amostras durante mais do que 1 - 2 meses de crio de meio de inclusão a -80 ° C ou em 30% de sacarose a -80 ° C (ver passo 1.3).

2. Seccionamento Tissue estabilizou-Tape

  1. Remover os blocos de amostras do freezer e coloque em cryostat com a temperatura ajustada entre -20 e -25 ° C.
  2. Retire o bloco do cryomold e corte o excesso de crio a incorporação meio com uma lâmina de barbear.
  3. Coloque algum meio de crio incorporação no disco de amostra e, em seguida, alinhar o bloco de tal modo que a superfície do disco de amostra é paralela à superfície inferior do bloco estabelecendo assim o plano de corte apropriado para a região de interesse.
  4. Coloque o disco de amostra no criostato e permitem a incorporação de crio forma de congelar.
  5. Coloque o disco de amostra para o cabeçote da amostra e ajustar a cabeça de tal modo que os cortes de lâminas paralelas à superfície do bloco de amostra.
  6. Apare o bloco para baixo para um nível dentro da região de interesse e escovar fora quaisquer aparas a partir da superfície do bloco.
  7. Corte um pedaço do cryotape suficientemente grande para cobrir a região de interesse e pré-frio no criostato.
    Nota: Várias peças podem ser cortadas de tamanhos consistentes e armazenado dentro do cryostno durante o corte.
  8. Remover apoio não-aderente do cryotape segurando a fita pelas abas de prata não pegajosa / ouro usando uma pinça, em seguida, coloque a fita no bloco pegajoso do lado do baixo.
  9. Aplicar pressão à cryotape usando o rolete (Figura 2C).
  10. Faça uma seção (5-8 mm) usando o motor automático ou roda de corte manual da criostato.
    Nota: É uma boa prática para manter a borda da cryotape como ele vem para o palco de modo que a secção não cair do palco durante o corte (Figura 2D).
  11. Coloque o lado do tecido seção em uma lâmina de microscópio de plástico dentro do criostato.
  12. Remover a corrediça de plástico do criostato e permitir que o meio de crio incorporação para derreter de tal modo que a secção adere à superfície da lâmina.
  13. Repita seccionamento de cortes seriados ou de outras regiões de interesse.
  14. Uma vez terminado, armazenar as seções em uma caixa de slides umat 4, -20 ou -80 ° C, dependendo do comprimento de armazenamento necessária e as medidas de resposta a jusante. Por exemplo, usar lâminas que vão ser coradas para actividade enzimática (veja 5,2-5,3) dentro de um mês quando armazenada a 4 ° C.

3. Adesão de seções para lâminas de microscópio

  1. método adesivo curável por UV.
    1. Rotular a lâmina de microscópio.
      Nota: Para uma maior automatização, amostras e lâminas podem ser rotulados com códigos de barras.
    2. Aplicar uma gota de adesivo óptico activado por UV para duas lâminas de vidro e usar o bordo de uma lâmina de plástico para espalhar uma camada fina de adesivo sobre a superfície das lâminas de vidro.
    3. Cortar a guia prata / ouro e colocar o lado do tecido seção gravadas no adesivo do primeiro slide. Aplicar a secção de um movimento de rolamento de uma ponta à outra, a fim de minimizar a formação de bolhas aprisionadas debaixo da fita adesiva.
      NOTA: A primeira corrediça é usada para pré-molhar a parte inferior de tele fita antes de o colocar no segundo slide (permanente) (passo 3.1.4).
    4. Retirar a parte gravada a partir da primeira lâmina e colocá-lo sobre a camada adesiva da segunda corrediça (Figura 3A). Mais uma vez, tome cuidado para evitar o aprisionamento de bolhas.
      NOTA: Esta etapa requer prática para dominar.
    5. Uma vez que o número apropriado de seções para o experimento dado é colocado em cada slide, limpe o excesso de adesivo das áreas circundantes.
    6. Inspecionar cada seção de perto por bolhas ou fibras debaixo da fita. Realize esta inspeção sob um microscópio ou lupa. Se existirem obstruções, remover a secção indivíduo, remover as obstruções, e em seguida, reaplicar-lo para a lâmina de vidro.
    7. Uma vez que seja determinado que não existem obstruções sob as seções gravadas, coloque as lâminas de microscópio sob a luz negra UV para 5 - 10 min para reticular o adesivo.
  2. método adesiva quitosano.
    1. Prepare the 1% de adesivo de quitosano. Preparar uma solução de ácido acético através da dissolução de 0,25 ml de ácido acético concentrado em 100 ml de água Dl (0,25% v / v). Dissolve-se 1 g de pó de quitosano em 100 ml de solução de ácido acético e agita-se a solução de O / N ou até que todo o pó de quitosano é dissolvido.
      NOTA: A solução é estável à temperatura ambiente.
    2. Depositar uma gota de solução de quitosano para cada secção que vai ser colocada sobre a corrediça.
    3. Cortar a guia prata / ouro da fita e colocar cada lado do tecido seção gravada para cima do adesivo (Figura 3A). Use muito cuidado para evitar o aprisionamento de bolhas.
    4. Uma vez que todas as secções são colocadas sobre a corrediça, a corrediça inclinar-se sobre uma das suas bordas longas e arrastar quitosano excessiva para a borda inferior com a pinça.
    5. Colocar as lâminas com esta orientação em cima de uma toalha de papel numa caixa de corrediça. A gravidade vai fazer com que o excesso de quitosano para cair sobre a toalha, dando origem a uma camada plana e uniforme de quitosano.
    6. Place a caixa de slides com a tampa mantida aberta na geladeira O / N para permitir que a quitosana para secar.
      NOTA: Ver Tabela 1 para uma comparação entre os dois métodos adesivas.

4. Aplicação de marcadores de referência aos slides

  1. Preparar a solução de marcador de referência através da dissolução de 50 ul de verde e 50 ul de microesferas vermelhos em 100 ul de água. Armazenar a solução no escuro a 4 ° C.
  2. Coloque a 10 mL ou 20 mL ponta da pipeta na solução microesfera. Adicionar uma pequena gota de solução de microesfera para cada secção adjacente à região de interesse (Figura 3C). Tenha cuidado para não ficar microesferas dentro da região de interesse.
  3. Secam-se as lâminas à TA (protegida da luz), durante 30 minutos, se o processamento das lâminas nesse dia. Se não, coloque os slides em uma caixa de slides a 4 ° C.
    Nota: Enquanto a solução microesfera seca antes de hidratar os slides, o microspheres permanecerá aderiu aos slides durante várias rodadas de coloração / imagem.

5. várias rodadas de Coloração

NOTA: Ao escolher uma sequência de imagens compatível, coloração, e passos de re-imagem, é possível detectar e co-localizar muitos sinais biológicos no mesmo corte de tecido. Cada rodada de imagem / coloração / recriação tem de ser desenvolvido para a questão histológica particular. A sequência de imagens / coloração / recriação tipicamente envolve a aquisição dos sinais fluorescentes endógenos (por exemplo, GFP celular, corantes de mineralização, in vivo sondas de imagem) na primeira rodada de imagem seguido de imunocoloração multiplexado fluorescente e várias rodadas de manchas de atividade enzimática. Por fim, a secção pode ser corada com corantes cromogénicos (por exemplo, H & E, azul de toluidina, safranina O, etc.) para realçar a arquitectura dos tecidos. Apresentados nesta secção são métodos personalizados adaptados deprotocolos comercialmente disponíveis.

  1. Coloração azul calceína de mineral acumulada
    NOTA: Calce�a azul coloração produz uma superfície mineral consistente, que é passível de análise de imagem automatizado ao contrário contraste de campo escuro ou de interferência diferencial de imagem (DIC). O problema com a coloração azul calceína é que o espectro fluorescente sobrepõe com tetraciclina e rotulagem demeclocycline. Portanto, se a amostra contém esses rótulos minerais, imagem os rótulos na primeira rodada de imagem antes da coloração com azul calceína.
    1. Se os sinais endógenos dentro do tecido são gravadas antes desta etapa coloração, submergir os slides da rodada de imagem anterior em uma jarra de Coplin preenchido com 1xPBS até que as lamelas cair longe dos slides. Retire e seque as folhas de cobertura.
    2. Prepare a 30 mg / ml de solução de azul de calceína em 2% de NaHCO 3 (preparado dissolvendo 2 g de NaHCO3 em 100 ml de H 2 O e ajustarção a um pH de 7,4 com HCl). Alíquotas e armazenar a solução à temperatura de -20 ° C.
    3. Imergir as lâminas em um frasco Coplin contendo 1x PBS durante 15 minutos para hidratar as secções, se já não estiver hidratado da ronda anterior.
    4. Retirar as lâminas e secar a parte de trás e arestas com uma toalha de papel.
    5. Aplicar 100 - 500 ul de solução de azul de calceína por lâmina e incubar durante 10 min numa câmara de humidade a temperatura ambiente.
    6. Lavar as lâminas em 1x PBS durante 10 minutos com 3 alterações.
    7. Aplicar ~ 200 mL de glicerol a 50% em 1x PBS a cada slide e montar a lamínula.
    8. Remover o excesso de glicerol e seca-se a parte inferior das lâminas.
  2. Tartarato resistente fosfatase ácida (TRAP) de coloração de actividade enzimática
    NOTA: a TRAP é expressa por vários tipos de células da linhagem hematopoiética no incluindo os osteoclastos. A coloração TRAP aqui apresentado usa um substrato de fosfatase ácida amarelo fluorescente. Certos sinais fluorescentes ovERLAP com o conjunto de filtro amarelo personalizado incluindo etiquetas de tetraciclina / demeclociclina de mineralização, calceína corante azul e DAPI contracoloração.
    1. Submergir slides da rodada de imagem anterior em uma jarra de Coplin preenchido com 1x PBS até que as lamelas cair longe dos slides. Retire e seque as folhas de cobertura.
    2. Preparar tampão 1 por dissolução de 9,2 g de anidro acetato de sódio e 11,4 g de tartarato de sódio dibásico di-hidratado em água e levando o volume final a 1000 mL. Ajustar o pH para 4,2 com ácido acético concentrado glacial (~ 1,5 - 2 ml). Guardar a solução a 4 ° C por até 12 meses.
    3. Preparar tampão 2 por dissolução de 40 mg de nitrito de sódio em água e levando o volume final a 1 ml. Guardar a solução a 4 ° C durante até 1 semana.
    4. No dia da coloração, preparar o tampão de reacção por mistura de 7,5 ml de tampão 1 e 150 ul de tampão 2.
    5. Aplicar o tampão de reacção, sem substrato para a corrediças durante 10 - 15 minutos para equilibrar o tecido ao pH mais baixo.
      NOTA: O volume típico é ~ 200 ul, mas precisa ser grande o suficiente para cobrir todas as seções.
    6. Dilui-se o substrato da fosfatase ácida amarelo fluorescente entre 1:50 e 1: 100 no tampão de reacção.
      NOTA: A diluição será ditada pela actividade da TRAP no interior da amostra.
    7. Verter o tampão de reacção fora das lâminas e aplicar o tampão de reacção com o substrato fluorescente amarela para as lâminas.
    8. Colocar as lâminas sob a luz negra UV para ~ 5 min para ativar o substrato.
      NOTA: O tempo de incubação pode variar em função da actividade de TRAP no interior da amostra.
    9. Lavar as lâminas em 1x PBS durante 10 minutos com 3 alterações.
    10. Aplicar ~ 200 mL de glicerol a 50% em 1x PBS a cada slide e montar a lamínula.
    11. Remover o excesso de glicerol e seca-se a parte inferior das lâminas.
      NOTA: O tampão TRAP ácida vai descalcificação as seções. O benefício adicional do decalcificação é que certas cores estará disponível novamente para a coloração jusante (por exemplo, etiquetas de mineralização). Por exemplo, a coloração com azul de calceína vai ser removida durante a coloração TRAP. Portanto, DAPI contracoloração podem ser visualizados neste canal durante uma rodada subseqüente.
  3. A fosfatase alcalina (AP) de coloração de actividade enzimática
    NOTA: Vários tipos de células envolvidas com a mineralização incluindo osteoblastos e condrócitos mineralizing expressam AP. O substrato Fast Red utilizado neste protocolo provoca tanto um sinal vermelho e vermelho cromogénico fluorescente. Devido a isto, o substrato cromogénico apagará sinais fluorescentes nas regiões onde o substrato precipita. Portanto, é melhor para fazer esta mancha após imagiologia os sinais fluorescentes que podem ser temperados por o substrato de AP.
    1. Submergir slides da rodada de imagem anterior em uma jarra de Coplin preenchido com 1x PBS até que as lamelas cair longe dos slides. Remove e secar as lamelas.
    2. Prepare Tris 1 M por dissolução de 12,1 g de Tris em 100 ml de água. Ajustar o pH para 9,5 com NaOH 1 M.
    3. Prepare 1 M MgCl 2 hexahidrato por dissolução de 20,33 g de MgCl 2 em 100 ml de água desionizada.
    4. Prepare de NaCl 2 M por dissolução de 11,68 g de NaCl em 100 ml de água desionizada.
    5. Prepare a 100x (20 mg / ml) solução de estoque de TR vermelho rápido de sal por dissolução de 1 g de pó em 50 ml de água desionizada. Adicione 100 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C.
    6. Prepare a 100x (10 mg / ml), solução de partida de fosfato de naftol AS-MX por dissolução de 500 mg de pó em 50 ml de N, N-dimetilformamida. Adicione 100 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C.
    7. No dia da coloração, preparar o tampão de AP através da adição de 1 ml de Tris 1 M, 0,5 mL de 1 M de MgCl2, 0,5 ml de NaCl 2 M e levar o volume final para 10 ml, utilizando água desionizada (concentrações finais: 100 mM Tris, 50 mM de MgCl 2, 100 mM de NaCl).
    8. Coloque AP bpode ser prejudicado em cada lâmina e incubar numa câmara de humidade durante 10 min à TA.
    9. Prepare tampão de substrato AP diluindo 100x estoques de fast Red TR Sal e Naphthol AS-MX para 1x no buffer AP.
    10. Despeje tampão AP off de lâminas e substituir com tampão de substrato AP. Incubar as lâminas durante 5 - 10 min numa câmara de humidade a temperatura ambiente.
      NOTA: O tempo de incubação será ditada pela actividade de AP da amostra.
    11. Lavagem das lâminas 3x em PBS 1X durante 5 minutos cada.
    12. Montagem de cobertura desliza com solução DAPI contracoloração (1: 1000 de diluição de DAPI em 50% de glicerol em PBS 1x).
  4. Azul de toluidina O (TB) coloração cromogénico
    Observação: Como todas as etapas anteriores são gravadas sob a montagem aquosa temporária em 50% de glicerol / PBS solução, o passo cromogénico também é fotografada em condições aquosas. No entanto, a solução corante pode tender para lixiviar ao longo do tempo. Portanto, sugere-se a imagem do azul de toluidina, o mais rapidamente possível após a coloração.
    1. Submergir slides da rodada de imagem anterior em uma jarra de Coplin cheia com água deionizada até que as lamelas cair longe dos slides. Retire e seque as folhas de cobertura.
    2. Depois de retirar as peças de cobertura, substitua com água fresca e incubar as lâminas durante pelo menos 10 minutos, para que os sais de PBS são suficientemente removidos do tecido.
    3. Preparar a solução de TB 0,025% em água desionizada.
    4. Colocar as lâminas na solução de TB por 1-5 min.
      NOTA: O tempo de incubação é dependente da preferência do usuário, mas deve ser mantido consistente em todas as amostras.
    5. Colocar as lâminas em jarra de Coplin com água e lavagem das lâminas deionizada 3x por 5 minutos cada.
    6. Mount tampa de deslizamento com 30% de glicerol dissolvidos em água deionizada (NÃO 1x PBS, pois isso fará com que a mancha seja liberado a partir do tecido). NOTA: Glicerol meio de montagem pode ser substituo com xarope de frutose, o que ajuda a evitar a difusão do corante do tecido. Parapreparar o xarope de frutose, dissolve-se 30 g de frutose em 10 ml de água desionizada e aquece-se a 60 ° C até se dissolver.

6. várias rodadas de Imagiologia

  1. Colocar as lâminas nas bandejas de microscópio (Figura 3D).
    Nota: As bandejas são a mola.
  2. Insira as bandejas na pilha bandeja do microscópio de varredura de slides (Figura 3E).
  3. Clique na lista de perfis para carregar um perfil para cada slide com tempos de exposição apropriados para cada fluoróforo. Clique no nome do slide para nomear cada slide manualmente ou ter o software leia o código de barras fornecido no rótulo do slide. Clique no botão de digitalização pré-visualização início para tirar uma imagem de visualização do slide.
  4. Definir as regiões de interesse no assistente de detecção de tecido e guardá-las para as rodadas subseqüentes de imagem. Uma vez que cada slide é a instalação, iniciar o processo de digitalização, clicando no botão Iniciar verificação.
    Nota: O sistema pode armazenar até 100 SLIdes de cada vez.
  5. Uma vez que a imagem tenha terminado, exportar as imagens de cada canal e imagem rodada indivíduo como .tif ou .jpg para montagem e análise de imagem.

7. Imagem Assembléia

  1. método manual usando o Photoshop (ou software de edição de imagem semelhante capaz de produzir imagens em camadas).
    1. Abra cada imagem canal individual de cada rodada de imagem.
    2. Monte as imagens individuais como camadas dentro de uma imagem composta. Para fazer isso, clique sobre a camada na paleta camada de uma imagem. Em seguida, arraste a camada em uma outra imagem. Esta operação de arrastar e soltar irá criar uma nova camada na imagem. Faça isso para todas as outras imagens. Como alternativa, use um script (Arquivo> Scripts> Carregar Arquivos na Pilha ...) para automatizar esse processo ao carregar vários arquivos de imagens como camadas em uma pilha de imagens.
    3. Uma vez que cada imagem é listado como uma camada individual na imagem composta, clique duas vezes no nome da camada para renomear a layers como necessário para discernir os diferentes canais.
    4. A fim de ver através de cada camada e criar uma imagem verdadeiramente composto, mudar o modo de mistura para cada camada de "Normal" para "Screen" dentro da paleta de camadas.
      Nota: Para acelerar este passo, mudar uma única camada para a tela, clique com o botão direito sobre a camada, selecione "estilo de camada cópia", em seguida, destacar todas as outras camadas e selecione "colar estilo de camada" para aplicar o estilo tela para o outro camadas.
    5. Se desejado, diminuir a opacidade (valor de alteração a 10 - 40%) da camada cromogénico (isto é, azul de toluidina) para melhor visualizar os sinais fluorescentes através da camada cromogénico.
      Nota: O microscópio de varredura de azulejos utilizados no presente protocolo mantém os slides em 3 arestas, minimizando assim a quantidade de rotação que pode ocorrer ao slide durante cada rodada de imagem. Portanto, é muito mais fácil para o usuário para alinhar manualmente as imagens sem ter que rodar as imagens derivadasa partir de diferentes rondas de imagiologia.

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Representative Results

Um fluxo de trabalho geral para o Alto Rendimento, Multi-Imagem Cryohistology

A Figura 1 representa o fluxo de trabalho geral utilizado para esta técnica. Ele inclui várias etapas de fixação através de várias rodadas de imagem e, finalmente, de alinhamento de imagem / análise. O processo pode demorar tão pouco como uma semana para ir de fixação de amostra através de 4 rodadas de imagem, o que é menos tempo do que leva a descalcificação este tipo de amostras. A ordem da imagem começa tipicamente com os sinais endógenos que já se encontram na amostra (por exemplo, GFP, etiquetas de mineralização, etc.), seguida de imunocoloração fluorescente multiplexado seguida por ensaios de actividade enzimática fluorescentes (por exemplo., TRAP, PA, etc.) e do ciclo celular ensaios de análise (por exemplo, UDE) e, finalmente, termina com uma mancha cromogénica (por exemplo, azul de toluidina O, hematoxylin, safranina O, etc).

Exemplo Representativo de um juvenil tornozelo 6 Joint

O objetivo deste estudo particular foi demonstrar a correlação entre a expressão de diferentes tipos de colágeno (ou seja, COL1A1, COL2A1, e Col10a1) com mineralização da fibrocartilagem do site do tendão de Aquiles-to-bone de inserção (ou seja, entese). Assim, um ratinho transgénico fluorescente repórter tripla incluindo COL1A1-GFPTpz, COL2A1-PCP, e Col10a1-mCherry foi usada para identificar células que expressam cada transgene. A primeira ronda de imagem foi de expressão do transgene endógena a partir de um rato de duas semanas de idade, o que corresponde a quando os mineraliza entese no tendão de Aquiles (Figura 4B). A segunda rodada de imagiologia foi então realizada namultifotônica microscópio para adquirir imagens da arquitectura do colagénio por meio de dois fotões segunda geração harmónica (SHG, a Figura 4C). Este passo foi utilizado para identificar as células na base das fibras de colagénio dentro da entese. A terceira rodada de imagiologia foi um passo imunocoloração para hedgehog indiana (IHH), que é um dos principais ligantes de sinalização que promove a mineralização do entese (Figura 4D). A quarta rodada da imagiologia foi coloração AP usando um kit de substrato de fosfatase alcalina azul, que provoca tanto a fluorescência Cy5 e sinais cromogénicos azuis, para visualizar as áreas de deposição mineral ativa (Figura 4E). Finalmente, a quinta rodada de imagiologia foi coloração TB para visualizar as características anatômicas, incluindo o conteúdo de proteoglicanos na fibrocartilagem (Figura 4F). Todas as imagens foram alinhados manualmente dentro do software de edição de imagem. Os cinco rodadas de imagem foram realizados ao longo de um período de 4 dias, que se seguiu 3dias de processamento de amostras e secção (7 dias total).

Exemplo Representativo de um joelho Adulto Joint 11

O objetivo deste experimento foi determinar as mudanças de mineralização que ocorrem no entese do ligamento colateral medial (LCM) do joelho após desestabilização joint via transecção do ligamento cruzado anterior (LCA). mudanças de mineralização pode ser visto no MCL entese tão cedo quanto duas semanas pós-cirurgia nestes murganhos 3 meses de idade. Para monitorar aposição mineral de fibrocartilagem no interior da entese, uma etiqueta mineral foi dada aos ratinhos no dia da cirurgia (demeclociclina) e no dia antes do sacrifício (calceína) às 2 semanas pós-cirurgia. Os ratinhos também incluídos COL1A1-PCP e Col10a1-mCherry repórteres fluorescentes para monitorizar a expressão de colagénio mineralizado e fibrochondrocyt unmineralizedES, respectivamente. A primeira ronda de imagem foi de sinais endógenos, que neste caso correspondiam às proteínas fluorescentes e marcadores fluorescentes de mineralização (Figura 5A). A segunda ronda de coloração incluída armadilha para demonstrar a expressão desta enzima em fibrocondrócitos mineralizantes na entese, bem como os osteoclastos em medula óssea subjacente (Figura 5B). A terceira ronda foi AP coloração para demonstrar regiões de mineralização activa de fibrocondrócitos, bem como os osteoblastos do osso subjacente (Figura 5C). Finalmente, coloração TB foi conduzido para a quarta rodada (Figura 5D). Todas as imagens foram alinhados manualmente dentro do software de edição de imagem. Mais uma vez, o tempo total desde a colheita de tecido para o alinhamento da imagem foi de 7 dias.

Exemplo representante do osso trabecular de distal do fêmur

(Figura 3B). Este processo foi realizado no dia 8 do sexo feminino e 8 do sexo masculino ratinhos em 3 níveis diferentes dentro da medula óssea, obtendo-se um número total de 12 lâminas. Os marcadores de referência (microesferas) foram aplicadas na epífise e a diáfise do membro nas secções secos (Figura 3C). Todos os 12 lâminas foram coradas for calceína azul e fotografada por mineral acumulado (azul calceína) e rótulos de mineralização (calceína e alizarin complexone) durante a primeira rodada de imagiologia (Figura 6A). As lâminas foram então fotografadas para a atividade TRAP (Figura 6B) na segunda rodada e atividade AP (Figura 6C) na terceira rodada da imagem. Finalmente, as lâminas foram coradas com azul de toluidina na quarta rodada (Figura 6D). Os marcadores de referência foram fotografadas durante cada rodada de imagem, incluindo a rodada cromogénico, e foram alinhadas usando o software personalizado. Para dar uma ideia do rendimento para este procedimento, 32 ossos (16 fémures e 16 vértebras) foram incluídos em blocos de 8, 3 seções foram retiradas de cada bloco, os cortes foram distribuídos em 12 slides, e os 12 lâminas foram fotografadas 4 vezes produzindo 96 pilhas de imagens compósitas. O tempo total para a realização desta experiência foi de 8 dias.


Figura 1. fluxo de trabalho típico para o protocolo. Etapas gerais incluem: 1) tecido fixação, 2) cryosectioning estabilizou-tape, 3) aderência de seções gravadas para lâminas de vidro, 4) a aplicação de marcadores de referência, 5) várias rodadas de coloração e 6) imagem, e 7) de montagem de imagem, alinhamento e análise. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Incorporação de alta capacidade e cryosectioning. Devido à estabilidade a cryotape fornece, múltiplos ossos pode ser incorporado adjacentes uns aos outros (AB) e seccionados simultaneamente estabilizado-fita (CD). Um pedaço de gelo seco é usado durante oprocesso de incorporação para fixar rigidamente os ossos no lugar antes de congelar toda a crio-bloco (B). O cryotape é rolada para o bloco (C) ea seção permanece preso à fita durante o corte (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. A adesão de secções gravada para lâminas de vidro, a aplicação de marcadores de referência, e carregamento de diapositivos numa bandeja de corrediça do microscópio de varrimento. Gravado secções são coladas à superfície de lâminas de vidro, quer com cura por UV ou um adesivo à base de quitosano (A ). Após a cura ou secagem, apenas uma camada fina, plana de adesivo permanece entre a superfície de vidro cryotape e (B). mar de referênciakers são aplicadas a lâminas secas (C, seta aponta a queda de solução de microesferas). Slides são então montados em bandejas de microscópio (D) e carregados no microscópio (E). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. cinco rodadas de Imagiologia do Tendão de Aquiles de um rato de duas semanas de idade. A pilha de composto (A) foi criado a partir de cinco rodadas de imagem. Round 1 (B): endógena COL1A1-GFPTpz, COL2A1-PCP e expressão do transgene Col10a1-mCherry. Round 2 (C): colágeno geração de segundo harmônico (SHG) no microscópio de dois fotões. Round 3 (D): imunocoloração para IHH. Round 4(E): a actividade enzimática AP. Round 5: O azul de toluidina (F). Este valor foi modificado a partir Dyment et al., 2015 6. Barra de escala = 200 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. quatro rodadas de Imagiologia da MCL entese Seguindo desestabilização conjunta. Os joelhos foram desestabilizadas em camundongos de três meses de idade, levando ao aumento da mineralização do entese MCL. Uma etiqueta mineral demeclociclina foi dada no dia da cirurgia e uma etiqueta mineral calceína foi dada no dia antes do sacrifício. Round 1 (A): endógena COL1A1-PCP, a expressão do transgene Col10a1-mCherry com rótulos minerais demeclociclina e calce�a. Round 2 (B) </ Strong>: atividade enzimática TRAP. Ronda 3 (C): a actividade enzimática AP. Round 4 (D): toluidine O. azul da armadilha e de sinal AP foi sobreposto em cima do sinal de TB em painéis BC. O canal amarelo pode ser utilizado novamente para a TRAP porque o tampão TRAP descalcifica do tecido, remover a etiqueta de demeclociclina. Este valor foi modificado a partir Dyment et al., 2015 11. Barra de escala = 200 mm. Dem: demeclocycline, TRAP: resistente ao tartarato de fosfatase ácida, AP: fosfatase alcalina, MCL: medial ligamento colateral. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. quatro rodadas de imagem dentro Distal de Fêmur contendo microesferas marcadores de referência. Mic de três meses de idadee foram dadas etiquetas minerais calce�a e complexone alizarin Round 1 (AA '):. calce�a e complexone alizarain etiquetas endógenos, além de calceína coloração azul mineral acumulada Round 2 (BB'.): atividade enzimática TRAP Round 3 (CC '). :. atividade enzimática AP Round 4 (DD '): azul de toluidina O. as microesferas verdes foram fotografadas durante cada round (A'-D', seta denota a mesma microesfera em todas as imagens). Barra de escala = 200 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

adesiva quitosana adesiva curável por radiação ultravioleta
mecanismo adesiva Evaporação UVPolimerização
tempo de cura > 24 hr <20 min
seções podem ser removidas após adesivo cura? sim Não
É curada dissolúvel adesiva? Sim, em soluções ácidas com pH baixo Não
Será adesiva suportar recuperação antigênica calor? Não sim
É auto-adesiva fluorescente? Não Mínima na faixa de UV

Tabela 1. Comparação entre quitosana adesiva e adesivo de cura UV

Cryotape Tape-Transfer System
Possível seção osso mineralizado usando este sistema? sim Sim, mas pedaços de osso mineralizadonão poderá transferir totalmente para o slide
Possível seção articulações mineralizadas usando este sistema? sim sim
Possível seção de cérebro usando este sistema? Sim, mas o tecido poderá cair da fita após várias rodadas de imagiologia sim
Possível cortar várias amostras embutidas no mesmo bloco? sim sim
Possível realizar várias rodadas de imagem na mesma seção? sim sim

Tabela 2. Comparação entre Cryotape Sistema e de transferência de Tape Sistema

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Discussion

Aqui nós apresentamos um protocolo cryohistology detalhada para co-localizar e quantificar várias medidas biológicas, alinhando imagens de várias rodadas de coloração / imagens em uma única seção. O método descrito utilizando o cryotape é especialmente útil uma vez que mantém a morfologia do tecido difícil de secção (por exemplo, osso mineralizado e cartilagem). Além disso, o tecido seccionados é aderida firmemente para a lâmina de vidro, para permitir que vários ciclos de coloração / imagem da mesma secção; Ao contrário dos métodos tradicionais, onde cortes seriados são cada coradas com um protocolo diferente. Usando secções em série pode representar um problema quando se tenta co-localizam sinais entre as secções, algo que não é um problema com as secções individuais que foram coradas e fotografada com múltiplas voltas.

O primeiro corte do produto tecido estabilizado-tape no mercado era um sistema de transferência de fita 16, 17. Ele usa fita plástica revestidacom um adesivo de baixa temperatura que é colocada sobre a superfície do tecido cryoblock. Quando a lâmina corta criostato sob a fita, a secção é removido intacto e aderente à fita. Subsequentemente, a fita é colocada lado da amostra para baixo em lâminas que são revestidas com cola de cura por UV de tal modo que o tecido fica rigidamente fixado à corrediça. Uma vez que a fita é pelado para longe da secção, o diapositivo pode ser processado para histologia, quer de fluorescência ou cromogénico. A fluorescência dos adesivos de fundo é baixo, e vários ciclos de coloração e de imagem funciona bem com a maioria dos tecidos moles. No entanto, com secções mineralizados, pode haver perda de fragmentos minerais durante a transferência do tecido a partir da fita adesiva para as lâminas de vidro. Além disso, é um sistema relativamente caros para instalar no criostato (> $ 8000) e os custos de consumo são elevados (> $ 2 / corrediça).

Outra estratégia de estabilização fita desenvolvido pelo Dr. Tadafumi utiliza um Kawamotorevestida com adesivo filme de cloreto de polivinilideno para capturar a secção de tecido. Em seu protocolo, um tecido fresco congelado é seccionado na fita e imediatamente fixado em PFA ou etanol 18. Subsequentemente, a fita é corado e, em seguida, montado sobre uma lâmina de vidro com o lado de baixo da amostra para o exame microscópico. Assim, cada protocolo de coloração é realizada sobre uma secção diferente gravadas.

Temos modificado e adicionada ao protocolo de Kawamoto em um número de maneiras, incluindo a amostra fixa em formalina antes da incorporação. Este passo é crítico para fixar a GFP solúvel citoplasmática de animais transgénicos, dentro dos limites da célula. Utilizámos o cryotape para uma ampla gama de tipos de tecidos 5-13. O pessoal do laboratório com experiência histológica limitada pode produzir seções de alta qualidade com este método. As principais vantagens deste protocolo são o custo relativamente baixo (sem instrumentos especiais, <$ 1,00 por slide), sem perda de fragmentos minerais,e a capacidade de realizar múltiplos ciclos de coloração e de imagens sobre a mesma secção.

Porque imagiologia as mesmas regiões de um slide várias vezes na repetição seria razoável para um grande número de slides, mesmo usando um palco motorizado, outro passo fundamental deste protocolo é a utilização de uma lâmina de microscópio de varredura para aumentar a consistência e rendimento. O microscópio é um scanner de slides digital que opera tanto sob epifluorescência e luz transmitida. É equipado com uma torre motorizada de 10 posições e ambos B & W câmeras e cor. A verdadeira novidade do sistema, nas nossas mãos, é que as regiões específicas de interesse pode ser rapidamente e facilmente definida pelo utilizador ou automaticamente detectado pelo software de imagem. Estas regiões de interesse pode então ser salvo da primeira rodada de imagem e, em seguida, recarregado rapidamente durante as rodadas subseqüentes. Portanto, as mesmas regiões de interesse são gravadas durante cada rodada de imagem. Com base em pelo utilizadorparâmetros definidos no software, o microscópio foco automático e digitalizar imagens de azulejos que são costuradas durante a aquisição dentro das regiões de interesse.

A ordem pela qual o usuário executa as várias rodadas de coloração é importante. A ordem geral está delineado na Figura 1. O número de fluoróforos que pode ser suficientemente separados por meio de microscopia de fluorescência é o principal factor limitante para o número de medidas de resposta que podem ser adquiridas num determinado troço. No entanto, os canais fluorescentes pode ser reutilizado em certos casos. Por exemplo, calceína azul e demeclociclina tanto emitir um sinal forte no canal amarelo utilizado para medir a actividade da TRAP. Esta a infiltração é evitada, porque embora o tampão TRAP a secção descalcifica, removendo assim o mineral antes da imagiologia da actividade da TRAP. Além disso, DAPI contracoloração irá emitir no canal amarelo bem. No entanto, o usuário pode substituir DAPI com outro counterstain in the vermelho ou vermelho-extremo alcance. Além disso, os anticorpos podem ser retirados e re-corados com anticorpos diferentes, usando os mesmos canais fluorescentes. Por conseguinte, este método é bastante adaptável a aumentar o número de medidas de resposta que podem ser gravadas numa determinada secção.

Há certas limitações com o protocolo apresentado. 1) O cryotape não podem aderir suficientemente a certos tecidos. Por exemplo, secções do cérebro fixadas com formalina tendem a cair a fita depois de vários ciclos de coloração. Para tecidos, tais como este, o sistema de transferência de fita pode ser mais apropriado como o tecido é aderida à superfície do vidro através de adesivo activado por UV (ver Tabela 2 para comparação entre estes dois métodos). 2) O adesivo quitosana, oferecendo propriedades ópticas transparentes, não vai sobreviver etapas de processamento duras que incluem altas temperaturas ou ácidos fortes. Portanto, o adesivo activado por UV é mais adequado para estas aplicações (ver Tabela 1 fou comparação entre esses dois adesivos).

Os protocolos cryohistological aqui apresentados também se prestam a um maior rendimento e automação. Por exemplo, a estabilização fita fornecida pela cryotape permite aos utilizadores relativamente inexperientes para cortar múltiplos ossos e articulações de uma só vez no mesmo bloco, aumentando significativamente a taxa de transferência. Usando um scanner automatizado reduz significativamente o tempo técnico e os custos relacionados com a imagem, que tem sido tipicamente o passo limitante da velocidade na nossa experiência. Ser capaz de forma consistente e fiável imagem da mesma região de interesse várias vezes num curto período de tempo fornece uma plataforma para análise automatizada, objectivo de tecidos. Na verdade, o nosso grupo desenvolveu uma plataforma para o alinhamento e histomorfometria do osso automatizada por computador. Em primeiro lugar, o software alinha as múltiplas rondas de imagens com base nos marcadores fluorescentes de referência. Em seguida, as imagens alinhados são alimentados a um gasoduto histomorfometria onde o Computer software define a região de interesse e mede objectivamente várias medições estáticas e dinâmicas (veja mais em www.bonebase.org) 13. Esta plataforma foi tornada possível por causa do aumento de produção e consistência fornecido pelo seccionamento cryotape, lâmina de microscópio de varredura digital e software de análise personalizada. Este protocolo representa um avanço significativo em rendimento elevado cryohistology e deve ser útil para aqueles imagiologia difícil de tecidos de secção tal como osso, bem como aqueles inexperiente com seccionamento de tecidos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose Sigma Aldrich S9378 Multiple suppliers available.
PBS Sigma Aldrich P5368 Multiple suppliers available.
Cryomolds Fisher Scientific Fisherbrand #22-363-554 Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix Thermo Scientific 6769006 Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane Sigma Aldrich M32631 Multiple suppliers available.
Cryostat Leica Biosystems 3050s Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc Leica Biosystems 14037008587 Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades Thermo Scientific 3051835 Can be substituted with other brands/models.
Cryotape Section Lab Cryofilm 2C
Roller Electron Microscopy Sciences 62800-46 Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides Electron Microscopy Sciences 71890-01 Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides Thermo Scientific 3051 Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61 Norland Optical Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light General Electric F15T8-BLB
Glacial acetic acid Sigma Aldrich ARK2183 Multiple suppliers available.
Chitosan Sigma Aldrich C3646 Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres ThermoFisher Scientific I-14787
InSpeck green microspheres ThermoFisher Scientific I-14785
Calcein Blue Sigma Aldrich M1255 Multiple suppliers available.
Calcein Sigma Aldrich C0875  Multiple suppliers available.
Alizarin complexone Sigma Aldrich A3882  Multiple suppliers available.
Demeclocycline Sigma Aldrich D6140  Multiple suppliers available.
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761 Multiple suppliers available.
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate ThermoFisher Scientific E-6588
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific R37108 Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous Sigma Aldrich S2889 Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate  Sigma Aldrich T6521 Multiple suppliers available.
Sodium nitrite Sigma Aldrich S2252 Multiple suppliers available.
Tris Sigma Aldrich 15504 Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate Sigma Aldrich M9272 Multiple suppliers available.
NaCl Sigma Aldrich S7653 Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt Sigma Aldrich F8764 Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX  Sigma Aldrich N4875 Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide Sigma Aldrich D158550 Multiple suppliers available.
Toluidine blue O Sigma Aldrich T3260 Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1 Carl Zeiss AG Axio Scan.Z1 Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set Chroma Technology Corp. 49000
CFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49001
GFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49020
YFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set Chroma Technology Corp. custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set Chroma Technology Corp. 49004
Cy5 Filter Set Chroma Technology Corp. 49009
CryoJane Tape Transfer System Electron Microscopy Sciences 62800-10 Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows Electron Microscopy Sciences 62800-72 Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides Electron Microscopy Sciences 62800-4X Multiple suppliers available.

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References

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