Hög genomströmning, Flerbilds Cryohistology mineraliserat vävnader

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Dyment, N. A., Jiang, X., Chen, L., Hong, S. H., Adams, D. J., Ackert-Bicknell, C., Shin, D. G., Rowe, D. W. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J. Vis. Exp. (115), e54468, doi:10.3791/54468 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Biologisk forskning kräver ofta effektiv fenotypning, som ofta förknippas med någon form av histologisk analys 1-3. Detta behov är ännu tydligare med de ambitiösa projekt för att störa varje gen i musgenomet 4. Dessa histologiska analyser kan variera från att bedöma cellmorfologi och / eller anatomiska funktioner för att kartlägga uttryck av specifika gener eller proteiner till enskilda celler. I själva verket, en av de fundamentala bidrag histologi till genforskning är förmågan att associera en specifik molekylär signal till en viss region eller celltyp.

Traditionella metoder för histologi, särskilt för muskuloskeletala vävnader, är ofta tidskrävande och mödosam och kräver ibland veckor att fixa, Avkalka avsnitt, bets, och bild provet analyseras sedan bilderna via mänsklig tolkning. Analysera multipla molekylära signaler, antingen via immunohistokemi, in situ hybridizatjon, eller särskilda fläckar, kräver flera sektioner och även flera prover för att utföra ett lämpligt sätt. Dessutom är dessa flera svar kan inte vara co-lokaliserad till samma cell och ibland kan inte vara co-lokaliserad till en specifik region inom en given prov. Som genomik och epigenomik fältet flyttar in i den digitala tidsåldern, måste den histologiska fältet också följa efter för att ge effektiv, hög genomströmning och automatiserad analys av olika molekylära signaler inom en enda histologiska avsnitt.

I själva verket finns det ett behov av förbättrade histologiska tekniker som kan koppla flera molekylära signaler till specifika celler inom ett givet prov. Nyligen har vi publicerat en ny hög genomströmning cryohistological metod för att bedöma flera motåtgärder inom en given sektion av mineraliserad vävnad 5-14. Processen innebär att stabilisera kryosektion med fryst cryotape, fästa tejpade delen stelt till ett objektglas, ochgenomföra flera omgångar av färgning och bildbehandling på varje avsnitt. Dessa rundor av bilder är inriktas därefter manuellt eller via dator automatisering före bildanalys (Figur 1). Här presenterar vi detaljerade protokoll av denna process och ger exempel där dessa tekniker har förbättrat vår förståelse av olika biologiska processer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

University of Connecticut Health Center institutionella djurvård och använda Utskottet godkände alla djurförsök.

1. Fixering och inbäddning

  1. Avliva djuret via CO2 kvävning eller andra godkända metoder.
  2. Skörda vävnaden av intresse (t.ex. lem, kotor, etc.) och placera i 10% neutral buffrad formalin vid 4 ° C tills ordentligt fastsatta. Var särskilt noga med att hålla en jämn anatomisk placering före fixering. Till exempel, fixa lemmar med skarvar på konsekvent flexion, intern rotation och extern rotation vinklar 11. Typiskt, fixa hela musen lemmar för 1 - 3 dagar.
    Varning: Formalin är giftig och bör hanteras i ett dragskåp iklädd lämplig personlig skyddsutrustning.
    Notera: Tidsramen för fixering beror på storleken av provet. Om försöket tillåter, kommer att skära öppna benet förbättra fixeringen av märgutrymmet.Vissa prover kan kräva perfusion fixering 15 för att minimera fluorescerande bakgrund (t.ex. svaga fluorescerande signaler inom benmärgen).
  3. Överföring Exemplar från formalin till 30% sackaros gjordes i 1 x PBS och inkubera i 12-24 timmar vid 4 ° C.
    Obs! När inkuberades under 12-24 h, kan prover därefter placeras vid -80 ° C för långtidsförvaring. Denna metod för lagring rekommenderas för experiment där forskare har för avsikt att bädda in flera prover i samma block, men kan inte skörda alla dessa prover samtidigt (t.ex. experiment med flera tidpunkter).
  4. Ta prover från sackaros och dissekera bort överflödigt vävnad.
  5. Fyll en cryomold (storlek av mögel är beroende av provstorleken) en del av vägen med Cryo bädda medium. Placera provet i gjutformen så att skärplan för regionen av intresse är parallell med botten av formen.
    Notera: Ett exempel på specifik vävnad placering och orienteringkan hittas i figur 2A - B.
  6. Placera cryomold på en bit torris tills ett tunt skikt av kryo inbäddningsmedium fryser och därefter fixerar provet på plats. Fyll den återstående volymen av cryomold med Cryo bädda mediet samtidigt som cryomold på torris pellets.
  7. Placera cryomold i en behållare innehållande 2-metyl-butan förväg kylt av torris. När proverna är helt frysta, ta bort cryomolds och skaka bort överflödigt 2-metyl-butan. Wrap cryomolds i cellofan och lägg i en -20 ° C eller -80 ° C frys för förvaring.
    Notera: Prov kan torka ut med tiden vid förvaring i kryo inbäddningsmedium, särskilt vid -20 ° C. Vi rekommenderar lagring av prover under längre tid än 1 - 2 månader i kryo inbäddning medium vid -80 ° C eller i 30% sackaros vid -80 ° C (se steg 1.3).

2. Tape-stabiliserad Tissue Sektione

  1. Ta bort prov kvarter från frysen och placera i cryostat med inställd temperatur mellan -20 och -25 ° C.
  2. Ta bort kvarter från cryomold och trimma bort överflödigt Cryo bädda medium med ett rakblad.
  3. Placera en del kryo bädda medium på preparatskivan och sedan rikta blocket så att ytan av provet skivan är parallell med bottenytan av blocket och därigenom fastställa korrekt skärplanet för regionen av intresse.
  4. Placera preparatskivan i kryostaten och göra det möjligt att kryo inbäddningsmedium att frysa.
  5. Placera preparatskivan på preparathuvudet och justera huvud så att bladet skär parallellt med ytan av preparatet.
  6. Trimma block ner till en nivå inom regionen av intresse och borsta bort eventuella spån från ytan av blocket.
  7. Skär en bit av cryotape tillräckligt stor för att täcka området av intresse och pre-chill i kryostaten.
    Obs! Flera stycken kan skäras av konsekventa storlekar och lagras inom cryostpå under snittning.
  8. Avlägsna icke-vidhäftande underlag från cryotape genom att ta tag i bandet av icke-klibbigt silver / guld flikar med hjälp av pincett och placera bandet på blocket klibbiga sidan nedåt.
  9. Pressa på cryotape med hjälp av valsen (figur 2C).
  10. Gör en sektion (5-8 um) med antingen automatisk motor eller manuell kapskiva av kryostaten.
    Obs: Det är bra att hålla kanten av cryotape som kommer in på scenen så att avsnittet inte ramla av scenen under sektionering (figur 2D).
  11. Placera vävnadssnittet uppåt på en plastobjektglas i kryostaten.
  12. Avlägsna plastglid från kryostaten och låt kryo inbäddningsmedium för att smälta, så att sektionen vidhäftar till ytan av objektglaset.
  13. Upprepa sektionering för seriesektioner eller andra regioner av intresse.
  14. När det är klart, lagra avsnitt i en bild lådant 4, -20 eller -80 ° C beroende på längden lagringsutrymme som krävs och nedströms motåtgärder. Till exempel, använder bilder som kommer att färgas för enzymatisk aktivitet (se 5,2-5,3) inom en månad om den förvaras vid 4 ° C.

3. Adhesion av avsnitten till objektglas

  1. UV-härdbar adhesiv metod.
    1. Märk objektglas.
      Obs! För ökad automatisering, prover och bilder kan märkas med streckkoder.
    2. Applicera en droppe av UV-aktiverade optiskt lim till två glasskivor och använda kanten av en plast slid för att sprida ett tunt lager av bindemedel över ytan av de glasskivor.
    3. Avbröt / tab silver guld och lägga tejpade vävnadssnittet uppåt på limmet i den första bilden. Tillämpa det avsnitt i en rullande rörelse från en kant till den andra för att minimera bildningen av infångade bubblor på undersidan av bandet.
      OBS: Den första bilden används för att i förväg väta undersidan av tHan band innan placera den på den andra (permanent) slide (steg 3.1.4).
    4. Avlägsna tejpade delen från den första bilden och placera den på klisterskiktet av den andra sliden (figur 3A). Återigen, vara noga med att undvika infångning av bubblor.
      OBS: Detta steg kräver övning att behärska.
    5. När ett lämpligt antal sektioner för givet experiment placeras på varje bild, torka bort överflödigt lim från de omgivande områdena.
    6. Inspektera varje avsnitt noga för bubblor eller fibrer nedanför bandet. Utför denna kontroll under ett mikroskop eller förstoringsglas. Om det finns hinder, ta bort enskilda avsnitt, ta bort hinder, och sedan återanvända den till objektglaset.
    7. När det är fastställt att det inte finns några hinder under tejpade sektioner, placera objektglas under UV svart ljus under 5 - 10 min för att tvärbinda limmet.
  2. Kitosan adhesiv metod.
    1. förbereda the 1% kitosan lim. Framställa ättiksyralösning genom upplösning av 0,25 ml koncentrerad ättiksyra i 100 ml Dl-vatten (0,25% volym / volym). Lös upp 1 g kitosan pulver i 100 ml ättiksyralösning och rör om lösningen O / N eller tills allt chitosan pulver är upplöst.
      OBS: Lösningen är stabil vid RT.
    2. Deponera en droppe kitosanlösning för varje avsnitt som kommer att placeras på bilden.
    3. Avskurna fliken silver / guld bandet och placera varje tejpade vävnadssnitt uppåt på lim (Figur 3A). Använd stor försiktighet för att undvika infångning av bubblor.
    4. När alla delar är placerade på bilden, luta bilden upp på en av sina långa kanter och dra alltför kitosan till nederkanten med hjälp av pincett.
    5. Placera objektglasen i denna orientering på toppen av en pappershandduk i en glidlåda. Tyngdkraften kommer då att orsaka att överskott av kitosan för att falla ned på handduken, vilket ger en platt och likformigt skikt av kitosan.
    6. PlaCE glid låda med lock bredden i kylskåpet O / N för att låta kitosan torka.
      OBS: Se Tabell 1 för en jämförelse mellan de två klister metoder.

4. Tillämpning av referensmarkörer till Slides

  1. Förbereda referensmarkör lösning genom upplösning av 50 pl av grönt och 50 ul av röda mikrosfärer i 100 pl vatten. Förvara lösningen i mörker vid 4 ° C.
  2. Placera en 10 | il eller 20 | j, l pipettspetsen in i mikrosfärlösning. Tillsätt en liten droppe av mikrosfären lösning till varje avsnitt i anslutning till regionen av intresse (Figur 3C). Var noga med att inte få mikrosfärerna inom regionen av intresse.
  3. Torka glasen vid RT (skyddade från ljus) under 30 minuter om bearbetning av bilder på den dagen. Om inte, placera glasen i en glidlåda vid 4 ° C.
    Obs: Så länge mikrosfär lösningen torkar innan återfuktande bilderna, MIcrospheres förblir anslutit sig till bilderna i flera omgångar av färgning / avbildning.

5. Flera rundor av färgning

OBS: Genom att välja en kompatibel sekvens av bildbehandling, färgning och reimaging steg, är det möjligt att detektera och co-lokalisera många biologiska signaler på samma vävnadssnitt. Varje runda av avbildning / färgning / reimaging måste utvecklas för särskilda histologiska frågan. Avbildning / färgning / reimaging sekvens innebär vanligtvis att förvärva de endogena fluorescerande signaler (t.ex. cellulära GFP, mineraliserings färgämnen, in vivo imaging sonder) på den första omgången av avbildning följt av fluorescerande multiplex immunfärgning och flera omgångar av enzymatisk aktivitet fläckar. Slutligen kan avsnittet färgas med hjälp av kromogena färgämnen (t.ex. H & E, toluidinblått, safranin O, etc.) för att markera vävnadsarkitektur. Presenteras i detta avsnitt är anpassade metoder anpassade frånkommersiellt tillgängliga protokoll.

  1. Calcein blåfärgning för ackumulerade mineral
    OBS: kalcein blåfärgning ger en konsekvent mineral yta som är mottaglig för automatiserad bildanalys skillnad mörkfält eller differential interferens kontrast (DIC) avbildning. Problemet med kalcein blåfärgning är att det fluorescerande spektrat överlappar med tetracyklin och Demeclocycline märkning. Därför, om provet innehåller dessa mineral etiketter, bild etiketterna i den första omgången av avbildning före färgning med kalcein blå.
    1. Om de endogena signaler inom vävnaden avbildas före denna färgningssteg, översvämmas bilderna från den föregående bildåtergivnings runt i en coplinkärlet fylld med 1 x PBS tills täckglas faller bort från objektglasen. Ta bort och torka täckglas.
    2. Förbered 30 mg / ml av kalcein blå lösning i 2% NaHCOs 3 (tillverkad genom upplösning av 2 g NaHCOs 3 i 100 ml H2O och justeraning till pH 7,4 med HCl). Alikvot och förvara lösningen vid -20 ° C.
    3. Doppa objektglasen i ett Coplin-kärl innehållande 1 x PBS under 15 minuter för att hydratisera sektionerna, om de inte redan hydratiserades från den föregående omgången.
    4. Ta bort bilder och torka ryggen och kanter med en pappershandduk.
    5. Tillsätt 100 - 500 | il av kalcein blå lösning per bild och inkubera i 10 min i en fuktkammare vid RT.
    6. Skölj objektglasen i 1x PBS i 10 min med 3 byten.
    7. Applicera ~ 200 pl 50% glycerol i 1x PBS till varje bild och montera locket glida.
    8. Avlägsna överskott av glycerol och torka botten av objektglasen.
  2. Tartrat syrafosfatas (TRAP) enzymatisk aktivitet färgning
    OBS! TRAP uttrycks av flera celltyper i det hematopoietiska härstamning inklusive osteoklaster. Färgnings TRAP presenteras här använder en gul fluorescerande surt fosfatas-substrat. Vissa fluorescerande signaler kommer ovERLAP med den anpassade gult filter set inklusive tetracyklin / Demeclocycline mineraliserings etiketter, kalcein blånad och DAPI motfärg.
    1. Sänk diabilder från tidigare avbildnings runt i en coplinkärlet fylld med 1x PBS tills täckglas faller bort från bilderna. Ta bort och torka täckglas.
    2. Förbereda Buffert 1 genom att lösa 9,2 g natriumacetat vattenfritt och 11,4 g natrium-tartrat dibasiskt dihydrat i vatten och bringa den slutliga volymen till 1000 ml. Justera pH till 4,2 med koncentrerad isättika (~ 1,5 - 2 ml). Förvara lösning vid 4 ° C i upp till 12 månader.
    3. Förbereda Buffert 2 genom att lösa 40 mg av natriumnitrit i vatten och bringa den slutliga volymen till 1 ml. Lagra lösningen vid 4 ° C i upp till en vecka.
    4. På dagen för färgning Bered reaktionsbuffert genom att blanda 7,5 ml av buffert 1 och 150 | il av buffert 2.
    5. Applicera reaktionsbuffert utan substratet till rutschbanas under 10 - 15 min för att jämvikta vävnaden vid lägre pH.
      OBS: Den typiska volymen är ~ 200 | al, men måste vara tillräckligt stort för att täcka alla sektioner.
    6. Späd den gula fluorescerande syrafosfatas substratet mellan 1:50 och 1: 100 i reaktionsbufferten.
      OBS: Utspädning kommer att dikteras av TRAP aktivitet i provet.
    7. Häll reaktionsbufferten bort av sliderna och applicera reaktionsbufferten med den gula fluorescerande substrat till objektglasen.
    8. Placera glasen under UV svart ljus för ~ 5 min för att aktivera substratet.
      OBS: Inkubationstiden kan variera beroende på TRAP-aktivitet i provet.
    9. Skölj objektglasen i 1x PBS i 10 min med 3 byten.
    10. Applicera ~ 200 pl 50% glycerol i 1x PBS till varje bild och montera locket glida.
    11. Avlägsna överskott av glycerol och torka botten av objektglasen.
      OBS: Den sura TRAP bufferten avkalka sektionerna. Den ytterligare fördelen med den decalcificaning är att vissa färger blir tillgänglig igen för efterföljande färgning (t.ex. mineraliserings etiketter). Till exempel kommer kalcein blåfärgning tas bort under TRAP färgning. Därför kan DAPI kontrast avbildas i denna kanal under en efterföljande runda.
  3. Alkaliskt fosfatas (AP) enzymatisk aktivitet färgning
    OBS: Flera celltyper är involverade med mineralisering inklusive osteoblaster och mineralise kondrocyter uttrycka AP. Fast Red substrat som används i detta protokoll framkallar både en fluorescerande röd och kromogen röd signal. På grund av detta, kommer det kromogena substratet släcka fluorescerande signaler i de regioner där substratet fällningar. Därför är det bäst att göra denna fläck efter avbildning av fluorescenssignaler som kan släcktes genom AP-substrat.
    1. Sänk diabilder från tidigare avbildnings runt i en coplinkärlet fylld med 1x PBS tills täckglas faller bort från bilderna. remove och torka täckglas.
    2. Förbereda en M Tris genom att lösa 12,1 g Tris i 100 ml vatten. Justera pH till 9,5 med 1 M NaOH.
    3. Förbereda en M MgCl2 hexahydrat genom att lösa 20,33 g av MgCl2 i 100 ml avjoniserat vatten.
    4. Förbered två M NaCl genom att lösa 11,68 g NaCl i 100 ml avjoniserat vatten.
    5. Förbereda 100x (20 mg / ml) stamlösning av Fast Red TR Salt genom att lösa 1 g pulver i 50 ml avjoniserat vatten. Göra 100 | il alikvoter och förvara vid -20 ° C.
    6. Förbereda 100x (10 mg / ml) Naftol AS-MX-fosfat förrådslösning genom att lösa 500 mg pulver i 50 ml N, N dimetylformamid. Göra 100 | il alikvoter och förvara vid -20 ° C.
    7. På dagen för färgning, förbereda AP-buffert genom att tillsätta 1 ml av 1 M Tris, 0,5 ml av 1 M MgCl2, 0,5 ml av 2 M NaCl och bringa den slutliga volymen till 10 ml med användning av avjoniserat vatten (slutkoncentrationer: 100 mM tris, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl).
    8. Placera AP bUffer på varje objektglas och inkubera i en fuktkammare under 10 min vid RT.
    9. Förbered AP substratbuffert genom att späda 100x lager av Fast Red TR Salt och Naftol AS-MX till 1x i AP-buffert.
    10. Häll AP buffert bort av diabilder och ersätta med AP substratbuffert. Inkubera objektglasen i 5 - 10 minuter i en fuktkammare vid RT.
      OBS: Inkubationstiden kommer att dikteras av AP-aktivitet i provet.
    11. Tvätta objektglasen 3x i 1x PBS i 5 minuter vardera.
    12. Mount täckglas med DAPI motfärgning lösning (1: 1000 utspädning av DAPI i 50% glycerol i 1x PBS).
  4. Toluidinblått O (TB) kromogent färgning
    OBS! Eftersom alla tidigare steg avbildas under tillfällig vatten montering i 50% glycerol / PBS-lösning, är det kromogena steg också avbildas i vattenlösning. Emellertid kan färgningslösningen tenderar att läcka ut med tiden. Därför föreslås det att bilden toluidinblå så snart som möjligt efter färgning.
    1. Dränka diabilder från föregående bildåtergivnings runt i en coplinkärlet fylld med avjoniserat vatten till dess att täckglas faller bort från objektglasen. Ta bort och torka täckglas.
    2. Efter avlägsnande av täckglas, ersätta med färskvatten och inkubera objektglasen i åtminstone 10 minuter så att salter från PBS är tillräckligt bort från vävnaden.
    3. Förbereda 0,025% TB lösning i avjoniserat vatten.
    4. Placera glasen i TB lösningen för 1-5 min.
      OBS: Inkubationstiden är beroende på användarens preferenser, men bör hållas konsekvent i alla prover.
    5. Placera objektglasen i coplinkärlet med avjoniserat vatten och tvätta objektglas 3x under 5 min vardera.
    6. Mount täckglas med 30% glycerol löst i avjoniserat vatten (INTE 1x PBS som detta kommer att orsaka fläcken att läcka ut från vävnaden). OBS: Glycerol monteringsmedium kan vara substituerad med fruktossirap, vilket hjälper till att förhindra diffusion av fläcken från vävnaden. Tillbereda sirap fruktos, upplösa 30 g fruktos i 10 ml avjoniserat vatten och värm till 60 ° C tills det är upplöst.

6. Flera rundor av Imaging

  1. Ladda bilderna i mikroskop fack (Figur 3D).
    Obs: Brickorna är fjäderbelastade.
  2. Sätt facken i facket bunten med glid scanning mikroskop (figur 3E).
  3. Klicka på profillistan för att läsa in en profil för varje bild med lämpliga exponeringstider för varje fluorofor. Klicka på bilden namn att nämna varje bild manuellt eller har programmet läsa streckkoden som finns på bilden etiketten. Klicka på startförhandsskanning för att ta en förhandsgranskning av bilden.
  4. Ställ regionerna av intresse i guiden detekteringsvävnaden och spara dem för efterföljande omgångar av avbildning. När varje bild är inställt startar skanningen genom att klicka på Starta skanning knappen.
    Obs: Systemet kan hålla upp till 100 slides i taget.
  5. När avbildning är klar, exportera bilderna från varje enskild kanal och bildbehandling runda som .tif eller .jpg-filer för bildenheten och analys.

7. Bild Assembly

  1. Manuella metoden med Photoshop (eller liknande bildbehandlingsprogram kan producera skiktade bilder).
    1. Öppna varje enskild kanal bild från varje bild runda.
    2. Montera enskilda bilder som skikt inom en sammansatt bild. För att göra det, klicka på lagret i lagerpaletten från en bild. Dra sedan lagret till en annan bild. Detta drag och släpp kommer att skapa ett nytt lager i bilden. Gör detta för alla andra bilder. Alternativt kan du använda ett skript (Arkiv> Skript> Läs in filer i Stack ...) för att automatisera processen genom att ladda flera bildfiler som lager i en bildstapel.
    3. När varje bild visas som ett enskilt skikt i den sammansatta bilden, att dubbelklicka på lagernamnet döpa om layers enligt behov för att urskilja de olika kanalerna.
    4. För att se igenom varje lager och skapa en verkligt sammansatt bild, ändra blandningsläget för varje skikt från "Normal" till "Screen" i lagerpaletten.
      Obs: För att påskynda detta steg, ändra ett enda lager till skärmen, högerklicka på lagret, välj "kopiera lagerstil", markera sedan alla andra lager och välj "Klistra in lagerstil" att tillämpa skärmen stil till andra skikten.
    5. Om så önskas, minska opaciteten (avvikelsevärdet till 10 - 40%) av det kromogena skiktet (dvs., toluidinblått) för att bättre visualisera de fluorescerande signaler genom det kromogena skiktet.
      Obs: Den kaklade svepmikroskop som används i detta protokoll har bilderna på 3 kanter, vilket minimerar mängden rotation som kan uppstå till sliden under varje omgång av avbildning. Därför är det mycket lättare för användaren att manuellt justera bilder utan att behöva rotera bilder som härrörfrån olika omgångar av avbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En allmän arbetsflöde för hög genomströmning, Flerbilds Cryohistology

Figur 1 representerar det generella arbetsflödet som används för denna teknik. Den innehåller flera steg från fixering genom flera omgångar av avbildning och slutligen bildjustering / analys. Processen kan ta så lite som en vecka att gå från provfixering genom 4 omgångar av bildbehandling, vilket är mindre tid än det tar att kalka dessa typer av prover. Ordningen på bild börjar normalt med de endogena signaler som redan finns i provet (t.ex. GFP, mineraliserings etiketter, etc.), då multiplex fluorescerande immunfärgning följt av fluorescerande enzymatisk aktivitetsanalyser (eg., TRAP, AP, etc.) och cellcykelanalys-analyser (t.ex., EDU) och slutligen avslutas med ett kromogent färgämne (t.ex., toluidinblå O, fållatoxylin, safranin O, etc.).

Representativt exempel från en Juvenile fotled 6

Syftet med denna studie var att demonstrera korrelationen mellan uttryck av olika typer av kollagen (dvs Col1a1, Col2a1 och Col10a1) med mineralisering av fibrobrosk av hälsenan-to-bone insättningsstället (dvs enthesis). Därför var en trippel transgen fluorescerande reporter mus inklusive Col1a1-GFPTpz, Col2a1-GFP, och Col10a1-mCherry används för att identifiera celler som uttrycker varje transgen. Den första omgången av avbildning var av den endogena transgenexpression från en två veckor gammal mus, vilket motsvarar när enthesis mineralizes i hälsenan (Figur 4B). Den andra omgången av avbildning utfördes sedan påmultifoton mikroskop för att förvärva bilder av kollagen arkitekturen via två foton andra harmoniska generationen (SHG, figur 4C). Detta steg användes för att identifiera celler vid basen av kollagenfibrerna inom enthesis. Den tredje omgången av avbildning var en immunfärgning steg för Indian hedgehog (IHH), som är en av de huvudsakliga signaleringsligander som främjar mineralisering av den enthesis (Figur 4D). Den fjärde omgången av avbildning var AP-färgning med användning av en blå alkaliskt fosfatassubstrat kit, som framkallar både Cy5-fluorescens och blå kromogena signaler, för att visualisera områden med aktiv mineralavsättning (Figur 4E). Slutligen, den femte omgången av avbildning var TB färgning att visualisera anatomiska funktioner inklusive proteoglykan innehåll i fibrobrosk (Figur 4F). Alla bilder manuellt linje inom bildbehandlingsprogrammet. De fem omgångar avbildning utfördes under en 4-dagars period, som följde tredagars provbearbetning och sektionering (7 dagar totalt).

Representativt exempel från en vuxen knäled 11

Syftet med detta experiment var att bestämma de mineraliserings förändringar som sker i den enthesis av den mediala säkerheter ligament (MCL) i knä följande gemensamma destabilisering via transektion av den främre korsband (ACL). Mineraliserings förändringar kan ses i MCL enthesis så tidigt som två veckor efter operation i dessa tre månader gamla möss. Att övervaka mineral apposition av fibröst brosk inom enthesis ades en mineral etikett som ges till möss på dagen för kirurgi (demeklocyklin) och dagen före avlivning (kalcein) vid 2 veckor efter operation. Mössen innehöll också Col1a1-GFP och Col10a1-mCherry fluorescerande reportrar för att övervaka kollagen uttryck av unmineralized och mineraliserad fibrochondrocytes, respektive. Den första omgången av avbildning var av de endogena signaler, som i detta fall motsvarade de fluorescerande proteinerna och fluorescerande mineraliserings etiketter (figur 5A). Den andra omgången ingår TRAP-färgning för att påvisa expression av detta enzym i mineraliserings fibrochondrocytes i enthesis samt osteoklaster i den underliggande benmärgen (figur 5B). Den tredje omgången var AP färgning visa regioner aktiv mineralisering av fibrochondrocytes liksom osteoblaster i det underliggande benet (figur 5C). Slutligen TB färgning genomfördes för fjärde omgången (figur 5D). Alla bilder manuellt linje inom bildbehandlingsprogrammet. Återigen den totala tid det tar från vävnad skörd till bildjustering var 7 dagar.

Representativt exempel på trabekulärt ben från distala lårbenet

(Figur 3B). Denna process genomfördes på åtta kvinnor och åtta hanmöss på 3 olika nivåer inom benmärgen, vilket gav ett totalt antal av 12 objektglas. De referensmarkörer (mikrosfärer) tillämpades inom epifysen och mitt diafys på de torra delarna (figur 3C). Alla 12 objektglas färgades for kalcein blå och avbildas för ackumulerade mineral (calcein blå) och mineralisering etiketter (calcein och alizarin complexone) under den första omgången av avbildning (Figur 6A). Glasen sedan avbildas för TRAP-aktivitet (Figur 6B) i den andra omgången och AP-aktivitet (Figur 6C) i den tredje omgången av avbildning. Slutligen var glasen färgades med toluidinblått i den fjärde omgången (figur 6D). Referens markörerna avbildas under varje avbildnings runt, inklusive kromogena runda, och var i linje med hjälp av kundanpassad programvara. För att ge en uppfattning om genomströmningen för detta förfarande, 32 ben (16 lårben och 16 kotor) bäddades in i 8 block, var 3 sektioner tagna från varje block, sektionerna fördelade över 12 bilder, och 12 glider avbildades 4 gånger producera 96 ​​sammansatta bildstaplar. Den totala tiden för att utföra detta experiment var 8 dagar.


Figur 1. typiskt arbetsflöde för protokollet. Allmänna steg inkluderar 1) vävnadsfixering, 2) band stabiliserad cryosectioning, 3) vidhäftning av tejpade sektioner till objektglas, 4) tillämpning av referensmarkörer, 5) flera omgångar av färgning och 6) avbildning, och 7) bildenheten, justering och analys. klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. hög kapacitet inbäddning och band stabiliserad cryosectioning. På grund av stabilitet cryotape ger, kan flera ben bäddas intill varandra (AB) och sektioneras samtidigt (CD). En bit av torris används underbädda process att stelt fixera benen på plats före frysning hela Cryo-blocket (B). Den cryotape rullas på blocket (C) och sektionen förblir fastnat på bandet under sektionering (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Vidhäftning av Tejpade snitten till objektglasen, Tillämpning av referensmarkörer, och lastning av Slides i fack av Slide-svepmikroskop. Tejpade sektioner är limmade till ytan av glasskivor med antingen UV-härdande eller kitosan baserad adhesiv (A ). Efter härdning eller torkning, återstår endast ett tunt, plant skikt av bindemedel mellan cryotape och glasytan (B). referens markers tillämpas på torra diabilder (C, pilen pekar för att släppa av mikrosfär lösning). Diabilder monteras sedan i mikroskop brickor (D) och laddas in i mikroskop (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Fem rundor avbildning av hälsenan från en två veckor gammal mus. Den sammansatta bildstapel (A) skapades från fem omgångar av avbildning. Omgång 1 (B): endogen Col1a1-GFPTpz, Col2a1-GFP, och Col10a1-mCherry transgenexpression. Omgång 2 (C): kollagen andra harmoniska generationen (SHG) på de två photon mikroskop. Omgång 3 (D): immunfärgning för IHH. Omgång 4(E): AP enzymatisk aktivitet. Rund 5: toluidinblå O (F). Denna siffra har modifierats Dyment et al., 2015 6. Skala bar = 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. fyra rundor av avbildning av MCL Enthesis följande gemensamma destabilisering. Knän destabiliseras i tre månader gamla möss, vilket leder till ökad mineralisering av MCL enthesis. En demeklocyklin mineral etikett gavs operationsdagen och en kalcein mineral etikett gavs dagen före avlivning. Omgång 1 (A): endogen Col1a1-GFP, Col10a1-mCherry transgenexpression med Demeclocycline och kalcein mineral etiketter. Omgång 2 (B) </ Strong>: TRAP enzymatisk aktivitet. Runda 3 (C): AP enzymatisk aktivitet. Rund 4 (D): toluidinblå O. Den TRAP och AP-signal överskiktades på toppen av TB-signalen i paneler BC. Den gula kanal kan användas på nytt för TRAP eftersom TRAP-buffert kalkas ur vävnad, avlägsnande av demeklocyklin etikett. Denna siffra har modifierats Dyment et al., 2015 11. Skalstreck = 200 nm. Dem: demeklocyklin, TRAP: tartrat syrafosfatas, AP: alkaliskt fosfatas, MCL: mediala säkerheter ligament. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. fyra rundor av Imaging inom distala lårbenet innehållande Mikrosfärreferensmarkörer. Tre månader gamla mice gavs calcein och alizarin complexone mineral etiketter Omgång 1 (AA). endogena calcein och alizarain complexone etiketter utöver calcein blåfärgning av ackumulerad mineral Round 2 (BB. '): TRAP enzymatisk aktivitet Round 3 (CC). . AP enzymatisk aktivitet Round 4 (DD): toluidinblått O. de gröna mikrosfärerna avbildas under varje runda (A'-D ', pil betecknar samma mikrosfär i alla bilder). Skalstreck = 200 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

kitosan adhesiv UV-härdande lim
adhesiv mekanism Indunstning UVPolymerisation
härdningstid > 24 h <20 min
Kan sektioner tas bort efter självhäftande botemedel? Ja Nej
Härdas klisterupplösande? Ja, i sura lösningar med lågt pH Nej
Har lim tål värme antigenåtervinning? Nej Ja
Är vidhäftande auto-fluorescerande? Nej Minimal i UV-området

Tabell 1. Jämförelse mellan Chitosan Lim och UV-härdande lim

Cryotape Band Transfer System
Möjligt att avsnitt mineraliserat ben med detta system? Ja Ja, men delar av mineraliserat benfår inte överföra helt till bilden
Möjligt att avsnittet mineraliserade fogarna med detta system? Ja Ja
Möjligt att avsnitt hjärna med detta system? Ja, men vävnad kan ramla av bandet efter flera omgångar av avbildning Ja
Möjligt att skära flera prover är inbäddade i samma kvarter? Ja Ja
Möjligt att genomföra flera omgångar av avbildning på samma avdelning? Ja Ja

Tabell 2. Jämförelse mellan Cryotape System och band-överföringssystem

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här har vi presenterat en detaljerad cryohistology protokoll att samarbeta lokalisera och kvantifiera flera biologiska åtgärder genom att rikta in bilder från flera omgångar av färgning / avbildning på ett enda avsnitt. Den metod som anges med hjälp av cryotape är särskilt användbar eftersom den bibehåller morfologin hos svårt att vävnadssektionen (t.ex., mineraliserat ben och brosk). Dessutom är den sektionerade vävnaden vidhäftar ordentligt till objektglaset, vilket möjliggör flera rundor av färgning / avbildning av samma sektion; till skillnad från traditionella metoder där seriella sektioner var och en är färgade med ett annat protokoll. Med hjälp av seriesnitt kan utgöra ett problem när du försöker att samarbeta lokalisera signaler mellan sektionerna, något som inte är ett problem med enskilda sektionerna som har färgats och avbildade med flera omgångar.

Den första band stabiliserad vävnad sektione produkt på marknaden var ett system tejp överföring 16, 17. Den använder plastband belagdmed en kall temperatur lim som placeras på ytan av vävnaden cryoblock. När kryostat bladet skär nedanför bandet, är sektionen avlägsnas intakt och vidhäftande till bandet. Därefter tejpen placeras provsidan nedåt på objektglas som är belagda med UV-härdande lim så att vävnaden blir stelt fäst vid sliden. När bandet skalas bort från avsnittet kan bilden behandlas antingen fluorescens eller kromogen histologi. Bakgrundsfluorescensen av limmen är låg, och multipla rundor av färgning och avbildning fungerar bra med de flesta mjuka vävnader. Men med mineraliserade sektioner, kan det finnas förlust av mineralfragment vid överföring av vävnad från tejpen till objektglas. Dessutom är det ett relativt dyrt system för att installera i kryostaten (> $ 8000) och förbrukningskostnaderna är höga (> $ 2 / slide).

Ett annat band stabiliseringsstrategi som utvecklats av Dr Tadafumi Kawamoto använder enadhesivbelagda polyvinylidenkloridfilm att fånga vävnadssektionen. I deras protokoll är en fryst vävnad sektioneras på bandet och omedelbart fast i PFA eller etanol 18. Därefter, går bandet färgas och monteras sedan på en glasskiva med provsidan nedåt för mikroskopisk undersökning. varje färgningsprotokollet utförs således på en annan tejpade avsnitt.

Vi har ändrat och lagt till Kawamoto protokollet på ett antal sätt, bland annat fastställande av provet i formalin före inbäddning. Detta steg är avgörande för att fixera den lösliga cytoplasmiska GFP av transgena djur inom gränserna för cellen. Vi har utnyttjat cryotape för ett stort antal vävnadstyper 5-13. Laboratoriepersonal med begränsad histologiska erfarenhet kan producera högkvalitativa delar med denna metod. De främsta fördelarna med detta protokoll är den relativa låga kostnad (ingen speciell instrumentering, <$ 1,00 per glas), ingen förlust av mineralfragment,och förmågan att utföra flera omgångar av färgning och avbildning på samma sektion.

Eftersom avbildning av samma regioner av en glid flera gånger i upprepning vore orimligt att ett stort antal bilder även med hjälp av en motordriven stadium, är en annan avgörande steg i detta protokoll användningen av en slide-svepmikroskop för att öka samstämmigheten och genomströmning. Mikroskopet är en digital bild scanner som verkar under både epifluorescence och transmitterat ljus. Den är utrustad med en 10-ställning motoriserade torn och både B & W och färgkameror. Den sanna nyhet av systemet, i våra händer, är att specifika regioner av intresse kan snabbt och enkelt definieras av användaren eller detekteras automatiskt av bildprogram. Dessa områden av intresse kan sedan sparas från den första omgången av avbildning och sedan laddas snabbt under de efterföljande rundorna. Därför är de samma regioner av intresse avbildas under varje omgång av avbildning. Baserat på användardefinierade parametrar i programvaran, kommer mikroskopet autofokus och skanna kaklade bilder som sydda under förvärv inom områden av intresse.

Ordningen med vilken användaren utför flera omgångar av färgningen är viktig. Den allmänna ordning skisseras i Figur 1. Antalet fluoroforer som kan tillräckligt åtskilda via fluorescensmikroskopi är den primära begränsande faktorn för det antal motåtgärder som kan förvärvas på en given sektion. Emellertid kan fluorescerande kanaler återanvändas i vissa fall. Exempelvis kalcein blått och demeklocyklin båda avger en stark signal i den gula kanalen används för att mäta TRAP-aktivitet. Detta genomblödning undviks men eftersom TRAP bufferten kalkas ur avsnittet varigenom mineral före avbildning av TRAP aktivitet. Dessutom kommer DAPI motfärg avger i den gula kanalen också. Däremot kan användaren ersätta DAPI med en annan motfärg i the rött eller långt röda området. Dessutom kan antikroppar strippas och åter färgades med olika antikroppar med användning av samma fluorescerande kanaler. Därför är denna metod ganska anpassningsbar till att öka antalet motåtgärder som kan spelas in på en given sektion.

Det finns vissa begränsningar med den presenterade protokollet. 1) Den cryotape kanske inte häfta tillräckligt till vissa vävnader. Till exempel, formalinfixerade hjärnsektioner tenderar att falla av bandet efter multipla rundor av färgning. För vävnader såsom detta, kan systemet bandöverförings vara lämpligare som vävnads vidhäftas till glasytan via UV-aktiverat adhesiv (se tabell 2 för jämförelse mellan dessa två metoder). 2) chitosan lim, samtidigt som transparenta optiska egenskaper, kommer inte att överleva hårda processteg som innehåller höga temperaturer eller starka syror. Därför är mer lämplig för dessa tillämpningar UV-aktiverade klister (se tabell 1 feller jämförelse mellan dessa två lim).

De cryohistological protokoll som presenteras här också lämpar sig för högre genomströmning och automation. Till exempel, bandstabilisering som tillhandahålls av cryotape möjliggör relativt nybörjare att skära flera ben eller leder samtidigt i samma kvarter, avsevärt öka genomströmningen. Användning av en automatiserad scanner minskar avsevärt tekniker tid och kostnader i samband med avbildning, som normalt har varit det hastighetsbegränsande steget i vår erfarenhet. Att kunna konsekvent och tillförlitligt bild samma region av ränte flera gånger under en kort tidsperiod ger en plattform för automatiserad, objektiv analys av vävnader. I själva verket har vår grupp utvecklat en plattform för dator automatisk anpassning och histomorfometri av ben. I första hand inriktar programmet de multipla omgångar av bilder baserat på de fluorescerande referensmarkörer. Då, är de inriktade bilderna matas in i en histomorfometri rörledning där computer programvara definierar området av intresse och objektivt mäter flera statiska och dynamiska mätningar (se mer på www.bonebase.org) 13. Denna plattform har gjorts möjlig på grund av den ökade genomströmningen och konsistens som tillhandahålls av cryotape sektione, digital bild-svepmikroskop, och anpassade analysprogram. Detta protokoll utgör ett betydande framsteg i hög genomströmning cryohistology och bör vara till nytta för dem avbildning svårt att sektions vävnader såsom ben liksom de oerfarna med vävnadssnittning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose Sigma Aldrich S9378 Multiple suppliers available.
PBS Sigma Aldrich P5368 Multiple suppliers available.
Cryomolds Fisher Scientific Fisherbrand #22-363-554 Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix Thermo Scientific 6769006 Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane Sigma Aldrich M32631 Multiple suppliers available.
Cryostat Leica Biosystems 3050s Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc Leica Biosystems 14037008587 Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades Thermo Scientific 3051835 Can be substituted with other brands/models.
Cryotape Section Lab Cryofilm 2C
Roller Electron Microscopy Sciences 62800-46 Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides Electron Microscopy Sciences 71890-01 Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides Thermo Scientific 3051 Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61 Norland Optical Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light General Electric F15T8-BLB
Glacial acetic acid Sigma Aldrich ARK2183 Multiple suppliers available.
Chitosan Sigma Aldrich C3646 Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres ThermoFisher Scientific I-14787
InSpeck green microspheres ThermoFisher Scientific I-14785
Calcein Blue Sigma Aldrich M1255 Multiple suppliers available.
Calcein Sigma Aldrich C0875  Multiple suppliers available.
Alizarin complexone Sigma Aldrich A3882  Multiple suppliers available.
Demeclocycline Sigma Aldrich D6140  Multiple suppliers available.
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761 Multiple suppliers available.
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate ThermoFisher Scientific E-6588
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific R37108 Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous Sigma Aldrich S2889 Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate  Sigma Aldrich T6521 Multiple suppliers available.
Sodium nitrite Sigma Aldrich S2252 Multiple suppliers available.
Tris Sigma Aldrich 15504 Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate Sigma Aldrich M9272 Multiple suppliers available.
NaCl Sigma Aldrich S7653 Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt Sigma Aldrich F8764 Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX  Sigma Aldrich N4875 Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide Sigma Aldrich D158550 Multiple suppliers available.
Toluidine blue O Sigma Aldrich T3260 Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1 Carl Zeiss AG Axio Scan.Z1 Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set Chroma Technology Corp. 49000
CFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49001
GFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49020
YFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set Chroma Technology Corp. custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set Chroma Technology Corp. 49004
Cy5 Filter Set Chroma Technology Corp. 49009
CryoJane Tape Transfer System Electron Microscopy Sciences 62800-10 Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows Electron Microscopy Sciences 62800-72 Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides Electron Microscopy Sciences 62800-4X Multiple suppliers available.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5, (1), 19-25 (2012).
  2. Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7, (5), 515-524 (2014).
  3. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2, (4), e61 (2006).
  4. Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23, (9-10), 600-610 (2012).
  5. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24, (2), 335-344 (2016).
  6. Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405, (1), 96-107 (2015).
  7. Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33, (11), 1693-1703 (2015).
  8. Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33, (8), 1142-1151 (2015).
  9. Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28, (10), 1338-1347 (2010).
  10. Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29, (5), 1283-1294 (2014).
  11. Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23, (6), 996-1006 (2015).
  12. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, (2), 187-196 (2012).
  13. Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004 (2012).
  14. Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
  15. Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33, (7), 948-956 (2015).
  16. Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53, (5), 593-602 (2005).
  17. Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53, (3), 239-240 (2001).
  18. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66, (2), 123-143 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics