हीट शॉक 2 उपचार के साथ zebrafish भ्रूण की Ploidy हेरफेर

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ploidy हेरफेर के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल जल्दी भ्रूण में cytokinesis में एक एक चक्र स्टाल प्रेरित करने के लिए एक गर्मी झटका उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल zebrafish में प्रदर्शन किया है, लेकिन अन्य प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment. J. Vis. Exp. (118), e54492, doi:10.3791/54492 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ploidy के हेरफेर ऐसे diploids को tetraploids को diploids, या haploids के रूप में उपयोगी परिवर्तनों, के लिए अनुमति देता है। Zebrafish Danio rerio में, विशेष रूप से homozygous gynogenetic diploids की पीढ़ी क्योंकि यह एक एकल विषमयुग्मजी मां से समयुग्मज के प्रत्यक्ष उत्पादन की अनुमति देता आनुवांशिक विश्लेषण में उपयोगी है। यह लेख पहले कोशिका चक्र, हीट शॉक 2 (HS2) के दौरान एक गर्मी नब्ज पर आधारित ploidy दोहराव के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन है। तारककेंद्रक दोहराव के निषेध के माध्यम से, इस विधि दूसरी कोशिका चक्र के दौरान एक सटीक कोशिका विभाजन के स्टाल में यह परिणाम है। सटीक एक चक्र विभाजन स्टाल, अप्रभावित डीएनए दोहराव के लिए युग्मित, पूरे जीनोम दोहराव में यह परिणाम है। इस विधि के साथ जुड़े प्रोटोकॉल एक एक कोशिका चक्र विभाजन देरी और ploidy दोहराव पैदा करने के लिए अंडे और शुक्राणु संग्रह, शुक्राणु की यूवी इलाज, इन विट्रो निषेचन और गर्मी नाड़ी शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण लागू किया जा सकताअन्य जानवरों की प्रजातियों में ploidy परिवर्तन के लिए प्रेरित करने के लिए।

Introduction

इस प्रोटोकॉल ऐसे gynogenetic haploids (चित्रा 1) या tetraploids के उत्पादन से homozygous gynogenetic diploids की पीढ़ी के रूप में zebrafish भ्रूण में ploidy के हेरफेर की अनुमति देता है। यह cytokinesis ठीक एक कोशिका चक्र (चित्रा 2A, 2 बी) के लिए इसी में देरी उत्प्रेरण द्वारा हासिल की है। cytokinesis में महत्वपूर्ण एक चक्र देरी गर्मी झटका साथ इलाज के द्वारा हासिल की है। हीट शॉक (एचएस) के रूप में मूल रूप से Streisinger और उनके सहयोगियों द्वारा वर्णित के मानक प्रोटोकॉल की अवधि 13-15 एमपीएफ के दौरान एक तापमान पल्स शामिल है, पहली सेल चक्र 1 के दौरान एक एक चक्र कोशिका विभाजन के स्टाल में जिसके परिणामस्वरूप। इस प्रोटोकॉल की दक्षता में हाल ही में गर्मी के झटके उपचार की एक रपट अस्थायी खिड़की के साथ जल्दी सेल चक्र स्कैनिंग द्वारा सुधार किया गया है। यह स्कैन, एक गर्मी सदमे के लिए एक बाद में समय बिंदु की पहचान की है, अभी भी पहली सेल चक्र (22-24 एमपीएफ) के भीतर है कि embr की एक उच्च दर में परिणामएक एक चक्र कोशिका विभाजन के स्टाल, जो इस मामले में दूसरी कोशिका चक्र को प्रभावित करता है 2 के साथ yos। अवलोकन है कि पहली सेल चक्र के दौरान प्रायोगिक जोड़तोड़ दूसरी कोशिका चक्र के दौरान कोशिका विभाजन के साथ हस्तक्षेप और डीएनए सामग्री दोहराव का कारण भी अन्य मछली प्रजातियों 3,4 में सूचना दी गई है। शब्द "2" को दर्शाता है कि गर्मी नाड़ी मानक एचएस विधि की तुलना में एक बाद में समय बिंदु पर होता है, और सेल चक्र HS2 की वजह से देरी दूसरी कोशिका चक्र के दौरान होता है कि - हम हीट शॉक 2 (HS2 के रूप में इस संशोधित प्रोटोकॉल के लिए देखें )। इन अध्ययनों से पता चला है कि गर्मी के झटके के बाद cytokinesis गिरफ्तारी के लिए आधार गर्मी नाड़ी है, जो धुरी के गठन और निम्न सेल चक्र में कुंड प्रेरण प्रभावित दौरान तारककेंद्रक दोहराव का निषेध है। सेल चक्र गिरफ्तारी की पैदावार में HS2 परिणाम 100% में होने जा रही है, और 4 गुना अधिक करने के लिए ploidy दोहराव अप मानक एच एस 2 की तुलना की दर।

भ्रूण में इलाज बुद्धिहा blastomere सेल साइकिल चालन के दौरान गर्मी झटका कई हानिकारक प्रभाव दिखा रहे हैं, कि गर्मी झटका सुझाव कई कोशिका विभाजन 2 के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं को प्रभावित करता है। दूसरी ओर, अगर गर्मी झटका सेल साइकिल चालन (समय अवधि 0-30 एमपीएफ) की दीक्षा से पहले लागू किया जाता है, यह तारककेंद्रक दोहराव के साथ विशिष्ट हस्तक्षेप के साथ लगातार प्रभाव है प्रकट होता है और अन्य आवश्यक सेल प्रक्रियाओं 2 को प्रभावित करने के लिए नहीं लगता है । इन अध्ययनों से पता चला है कि समय blastomere विभाजन की दीक्षा से पहले एक विकासात्मक अवधि के लिए एक उपकरण के रूप में हीट शॉक का उपयोग करते हुए विशेष रूप से तारककेंद्रक निषेध के माध्यम से ploidy में हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी होना प्रतीत होता है। तारककेंद्रक दोहराव पर गर्मी सदमे के लिए स्पष्ट चयनात्मकता के अंतर्निहित कारण अज्ञात है, लेकिन इस तरह के ल्यूकोसाइट्स 5 के रूप में कुछ प्रकार की कोशिकाओं में गर्मी तनाव के तहत मनाया केंद्रपिंड substructures, के एक चयनात्मक गिरावट से संबंधित हो सकता है।

भ्रूण डी के टेम्पोरल तुल्यकालनविकास के लिए इन विट्रो फर्टिलाइजेशन (आईवीएफ) से हासिल की है। द्विगुणित भ्रूण में निषेचन परिणाम है कि इस पर HS2 प्रेरित एक चक्र cytokinesis स्टाल टेट्राप्लोइड बनने के दौरान इलाज शुक्राणु का प्रयोग करें। यूवी का इलाज शुक्राणु, crosslinks कि अपने डीएनए निष्क्रिय, gynogenetic अगुणित भ्रूण 6, जिस पर HSII प्रेरित एक चक्र cytokinesis स्टाल gynogenetic diploids 2 बनने में परिणाम वहन का प्रयोग करें। जिसके परिणामस्वरूप पूरे जीनोम दोहराव की वजह से, उत्तरार्द्ध gynogenetic diploids जीनोम भर में हर एक ठिकाना पर homozygous हैं। संक्षिप्तता के लिए, हम "haploids", और "homozygous diploids" के रूप में homozygous gynogenetic द्विगुणित भ्रूण के रूप में अगुणित भ्रूण gynogenetic को देखें। व्यवहार्य और उपजाऊ हैं, homozygous diploids बाँझ और घातक मुक्त लाइनों आरंभ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। HS2 से प्रेरित प्रत्यक्ष homozygosity भी आसानी से महिलाओं है कि mut के विषमयुग्मजी वाहक हैं, से आनुवांशिक विश्लेषण या आनुवंशिक स्क्रीन में शामिल किया जाना चाहिए homozygous diploids के बादउच्च और निश्चित (50%) अनुपात 2 पर homozygosity की ations प्रदर्शनी दरों।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल HS2 प्रदर्शन और पूर्ण homozygosity साथ ploidy दोहराव के लिए प्रेरित करने के लिए कदम का वर्णन है। टेट्राप्लोइड उत्पादन के लिए, शुक्राणु समाधान इलाज होना चाहिए। homozygous द्विगुणित उत्पादन के लिए, शुक्राणु यूवी उपचार द्वारा निष्क्रिय किया जाना चाहिए। इसके अलावा, चर्चा में वर्णित है, दिखाई वर्णक मार्करों भी homozygous diploids की पहचान की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मुख्य रूप से अपने प्रकाश चक्र 7, और दोनों वयस्क और अंडे की दीक्षा के पहले 3 घंटे के दौरान Zebrafish दोस्त circadian लय 8 के प्रति संवेदनशील हैं, तो सबसे अच्छा परिणाम के लिए आईवीएफ प्रक्रिया इस समय अवधि के भीतर हो जाना चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

मैडिसन और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के दिशा निर्देशों (विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय - - मैडिसन आश्वासन नंबर A3368-01) सभी पशु प्रयोगों को विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय अनुसार आयोजित की गई।

1. बाधित संभोग के माध्यम से अंडा संग्रह के लिए महिलाओं का चयन

नोट: आईवीएफ-आधारित प्रोटोकॉल का मार्गदर्शन दबाव के माध्यम से 9 महिलाओं से परिपक्व अंडे से बाहर निकालना पर भरोसा करते हैं। पिछले प्रोटोकॉल महिलाओं अंडे रिहाई व्यवहार के दौर से गुजर बिना टैंकों से या जोड़ी matings में सीधे महिलाओं का इस्तेमाल किया है, लेकिन केवल इन महिलाओं (के बारे में 20% या उससे कम, zebrafish लाइन पर निर्भर करता है) का एक छोटा सा अंश का मार्गदर्शन दबाव पर extruded और सक्षम अंडे निकलेगा। एक बेहतर प्रक्रिया में, महिलाओं के प्री-छाँटे गए प्रत्यक्ष दृश्य अवलोकन द्वारा अंडे बिछाने के लिए, संभोग के तत्काल रुकावट के द्वारा पीछा कर रहे हैं। यह प्रक्रिया बहुत प्रभावी है, के रूप में लगभग सभी महिलाओं इस बाधित संभोग कदम उपज के माध्यम से extruded और सक्षम अंडे पूर्व चयनितमैनुअल दबाव पर।

  1. दोपहर प्रयोग से पहले, मानक zebrafish संभोग बक्से में वांछित zebrafish तनाव की संभोग जोड़े की स्थापना की। या तो एक संभोग बॉक्स प्रभाग के माध्यम से या एक अंडे बिछाने डालने के तहत पुरुष और महिला डालने के अंदर रखकर, महिलाओं अभी तक शारीरिक रूप से उन लोगों से अलग रूप में एक ही कक्ष में पुरुषों रखें।
  2. प्रयोग की सुबह, शारीरिक, विभाजन को हटाने, एक ही अंडे बिछाने डालने के भीतर दोनों पुरुष और महिला को रखने के लिए इतना है कि संभोग शुरू होता है।
  3. दिखने में संभोग जोड़े युक्त प्राकृतिक संभोग के दौरान अंडे का पता लगाने के लिए बाहर निकालना टैंक का निरीक्षण किया। अंडा extrusions, अलग नर और मादा का पहला संकेत पर प्रजनन बाधित करने के लिए। पुरुषों से अलग होने के बाद, पूर्व चयनित महिलाओं को या तो अलग-अलग या एक ही टैंक में जमा रहते हैं। वांछित (आम तौर पर 50-150 अंडे / महिला) भ्रूण की संख्या के आधार पर कई महिलाओं का प्रयोग करें।

2. एक शुक्राणु समाधान की तैयारी

नोट: आईवीएफ rएक शुक्राणु समाधान के लिए परिपक्व अंडे के जोखिम पर Elies। यह समाधान द्विगुणित युग्मनजों उत्पन्न करने के लिए (जो HS2 इलाज बन टेट्राप्लोइड भ्रूण पर) या यूवी का इलाज, अगुणित युग्मनजों (जो HS2 उपचार पर homozygous द्विगुणित भ्रूण हो जाते हैं) उत्पन्न करने के लिए इलाज हो सकता है। पिछला शुक्राणु तैयारी प्रोटोकॉल केशिका ट्यूब के इस्तेमाल का सुझाव लाइव पुरुषों के गुदा क्षेत्र से पिलाई इकट्ठा करने के लिए, लेकिन के रूप में केवल पुरुषों का एक छोटा सा अंश पिलाई 9 झुकेंगे यह एक अप्रभावी प्रक्रिया थी। नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल जो अधिक विश्वसनीय परिणाम पैदावार sheared विच्छेदित वृषण से शुक्राणु तैयारी, पर बजाय निर्भर करता है।

  1. (समाधान 1, 2, 4 और 5) सभी घटकों के शामिल है, एक हांक Premix समाधान के रूप में समय से आगे हांक समाधान तैयार सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान को छोड़कर (समाधान 6)। तैयार समाधान 6 ताजा और प्रयोग (1 टेबल) की सुबह Premix में जोड़ें। हैंक्स 'समाधान (अंतिम समाधान बनाने के लिए, की सुबह तैयारआईवीएफ प्रक्रिया), हांक Premix के 990 उल और ताजा बना समाधान 6 के 10 μl गठबंधन।
  2. overexposure द्वारा पुरुषों Euthanize वातानुकूलित पानी में एक 0.016% समाधान के रूप में Tricaine करने के लिए।
    1. पानी में एक 0.2% शेयर समाधान के रूप में tricaine तैयार (1 एम Tris पीएच 9.0 से 7.0 पीएच को बफर) और 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं। एक बीकर में पानी की 100 मिलीलीटर प्रति tricaine शेयर समाधान के 8 मिलीलीटर जोड़ें, और tricaine समाधान करने के लिए पुरुषों को हस्तांतरण करने के लिए एक जाल का उपयोग करें।
    2. पुरुष प्रति 100 μl के लिए इसी हांक समाधान की मात्रा में निषेचित किया जा करने की जरूरत क्लच प्रति एक पुरुष के लिए वृषण के बराबर का उपयोग करें (10 पुरुषों के 1 मिलीलीटर हांक समाधान में एकत्र से जैसे वृषण, 100 μl / क्लच के साथ 10 चंगुल खाद के लिए)।
    3. 15 मिनट के लिए गिल आंदोलनों की समाप्ति से इच्छामृत्यु की पुष्टि करें। इच्छामृत्यु के बाद, एक चम्मच के साथ बीकर से पुरुषों को हटा दें। वातानुकूलित पानी के साथ संक्षिप्त पुरुषों कुल्ला और उन्हें एक के कई स्थानों पर संक्षेप में रखकर हल्के से सूखीकागज तौलिया।
  3. वृषण, पहले पुरुषों के सिर काटना euthanized विदारक कैंची या एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर निकालने के लिए, और एक परिलक्षित प्रकाश स्रोत के साथ scissors.Under एक विदारक माइक्रोस्कोप विदारक के साथ पेट के साथ एक अनुदैर्ध्य काट कर, विदारक संदंश के साथ आंतरिक अंगों को हटा दें। संदंश के साथ वृषण आम जनता में से प्रत्येक के बाहर खींच और उन्हें हांक समाधान युक्त microcentrifuge ट्यूब के अंदर जगह है।
    नोट: वृषण शरीर की दीवारों के साथ पाया पारदर्शी उपस्थिति के दो लम्बी संरचनाओं और जो गंदा नाला के पास एकाग्र में से प्रत्येक के रूप में पहचान की जा सकती है। वृषण विच्छेदन के बाद एक पेट्री प्लेट की सतह पर और उन्हें हांक समाधान में रखने से पहले 2-3 मिनट रह सकते हैं।
  4. एक संकीर्ण रंग के साथ वृषण बाल काटना और / या धीरे से ऊपर और नीचे pipetting 5-6 बार एक 1000 μl की नोक micropipette के साथ समाधान में वृषण, जबकि हवा बुलबुला गठन से बचने के द्वारा समाधान में शुक्राणु रिलीज। वृषण मलबे तय है।
  5. बर्फ, जहां यह अप करने के लिए 2-3 घंटे के लिए अपनी शक्ति रख सकते में शुक्राणु समाधान स्टोर। अगर शुक्राणु समाधान की यूवी इलाज के लिए आगे बढ़ने, वृषण के टुकड़े छोड़ने के पीछे एक साफ microcentrifuge ट्यूब में समाधान हस्तांतरण।

3. यूवी इलाज

नोट: यूवी इलाज के क्रम में यह भ्रूण में निष्क्रिय रेंडर करने में शुक्राणु डीएनए crosslink करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह कदम केवल जब gynogenetic अगुणित या समयुग्मजी gynogenetic द्विगुणित भ्रूण का निर्माण किया जाता है। यूवी इलाज के लिए शुक्राणु समाधान वृषण (2.4 चरण) के टुकड़े से अलग किया जाना चाहिए, के रूप में बड़े टुकड़े यूवी इलाज से शुक्राणु को ढाल सकता है।

  1. एक अवसाद गिलास प्लेट एक बर्फ बिस्तर पर बैठे की एक साफ, सूखे अच्छी तरह से (उदाहरण के लिए एक पेट्री प्लेट के अंदर बर्फ) के लिए शुक्राणु समाधान स्थानांतरण। अच्छी तरह से कांच की प्लेट प्रति शुक्राणु समाधान के 1 मिलीलीटर तक का प्रयोग करें।
  2. एक यूवी दीपक के नीचे बर्फ बिस्तर पर अवसाद कांच की थाली रखकर यूवी के लिए शुक्राणु समाधान बेनकाब। एक 115 वी (60 हर्ट्ज के साथ 90 सेकंड के लिए शुक्राणु समाधान समझो, 0.68A) एक 19 सेमी (7.5 इंच) की दूरी पर यूवी लैंप। एक विंदुक टिप के अंत के साथ, धीरे समाधान यूवी इलाज के दौरान हर 30 सेकंड (एक साफ पिपेट टिप हर 30 सेकंड का उपयोग करें) मिश्रण।
  3. एक साफ pipet टिप और micropipette का उपयोग करना, एक नया microcentrifuge ट्यूब करने के लिए इलाज शुक्राणु समाधान हस्तांतरण। बर्फ पर दुकान तक (निकासी से 2-3 मानव संसाधन की तुलना में अब नहीं) आईवीएफ के लिए की जरूरत है।

4. परिपक्व अंडे के मैनुअल बाहर निकालना

नोट: प्राकृतिक matings की रुकावट के द्वारा प्राप्त आसानी से संज्ञाहरण और मैनुअल दबाव में अंडे निकलेगा मादा। इस प्रक्रिया के दौरान, tricaine उपचार ध्यान overexposure है कि महिलाओं की वसूली रोक सकता से बचने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए।

  1. tricaine समाधान के लिए प्रकाश जोखिम से महिलाओं anesthetize: एक शुद्ध वातानुकूलित पानी में समाधान tricaine करने के साथ स्थानांतरण महिलाओं, के बारे में 2-5 मिनट के लिए मछली स्टॉप तक (वातानुकूलित मछली पानी की 8 Tricaine 0.2% शेयर समाधान के एमएल 100 मिलीलीटर जोड़कर बनाया) गिल आंदोलन।
  2. <ली> के रूप में जल्द ही एक महिला गिल आंदोलन बंद हो जाता है के रूप में, यह इकट्ठा करने और संक्षेप में वातानुकूलित पानी में कुल्ला करने के लिए एक चम्मच का उपयोग करें। फिर भी चम्मच का उपयोग कर मछली ले जाते हैं, एक कागज तौलिया के कई स्थानों पर संक्षेप में और बार बार इसे रखकर हल्के से यह सूखा है, तो एक साफ, सूखे 10 सेमी व्यास पेट्री प्लेट को हस्तांतरण करने के लिए। पीछे दिशा के लिए पूर्वकाल में चम्मच के साथ मछली दृष्टिकोण, संभावित गिल operculum को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए।
  3. से समय से पहले ही पानी से सक्रिय किया जा रहा है किसी भी विमोचन किया अंडे को रोकने के लिए प्रयोगशाला पोंछे या नरम ऊतक का प्रयोग करें, आगे धीरे गुदा फिन क्षेत्र सुखाने के लिए। उंगलियों कमी लाने के हल्के से पानी के साथ (उनमें मछली तराजू से चिपके से बचने के लिए), समर्थन के रूप में महिला की पीठ पर एक हाथ की एक उंगली जगह है, और दूसरे हाथ की एक उंगली के साथ महिला के पेट के साथ मामूली दबाव लागू जब तक अंडे extruded हो जाते हैं।
  4. महिला के शरीर से अंडे दूर स्थानांतरित करने के लिए एक संकीर्ण रंग का प्रयोग करें। महिला वापस वसूली के लिए वातानुकूलित पानी के साथ एक टैंक में रखें।
  5. (पानी जोखिम के साथ) को सक्रिय और बाहर निकालना के बाद एक साथ और 90 सेकंड के भीतर (शुक्राणु समाधान अलावा के साथ) खाद अंडे (धारा 5 देखें)।

5. इन विट्रो निषेचन में

नोट: प्राकृतिक पार में zebrafish निषेचन, बाहरी संभोग के दौरान एक साथ रिलीज और अंडे का पानी और शुक्राणु से सक्रियता पर निर्भर है। इन विट्रो निषेचन mimics में पानी की उपस्थिति में शुक्राणु समाधान के लिए अंडे को उजागर करके इस प्रक्रिया। पानी की मात्रा आदेश प्रभावी शुक्राणु एकाग्रता बढ़ाने के लिए मूल रूप से छोटे (1 मिलीलीटर) है। शुक्राणु से बाध्यकारी 15-20 सेकंड 10 <के भीतर होता है/ Sup>, और पानी की मात्रा तो बढ़ाई जा सकती है। जरायु शुक्राणु बाध्यकारी 11,12 के लिए क्षमता के लिए खिड़की को सीमित करके क्लच के करीब तुल्यकालन के लिए आगे योगदान उठाने। जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण इसलिए जल्दी दरार चरणों के दौरान बड़े पैमाने पर एक साथ कोशिका विभाजन चक्र दिखा रहे हैं।

  1. शुक्राणु समाधान के 100 μl जोड़ें (एक पुरुष से वृषण के बराबर करने के लिए इसी - भाग 2 देखें) एक पेट्री प्लेट पर extruded अंडे की क्लच करने के लिए। धीरे पिपेट शुक्राणु और अंडे मिश्रण करने के लिए एक साथ, पेट्री प्लेट की सतह से टिप उठा अंडे की क्षति से बचने के लिए नहीं करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा अंडे के बीच शुक्राणु समाधान जोड़ने के लिए इस्तेमाल टिप ज़ुल्फ़।
  2. इसके तत्काल बाद भ्रूण मध्यम (E3) समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़कर अंडे सक्रिय धीरे विंदुक टिप के साथ घूमता द्वारा और फिर धीरे से अंडे का मिश्रण है और शुक्राणु (वातानुकूलित पानी भी भागों 7 के माध्यम से 5 में E3 के लिए एक विकल्प के रूप में स्वीकार्य है)। निषेचन के लिए समय रिश्तेदार आरंभ करने के लिए एक टाइमर शुरू। 1 मिलीलीटर की मात्रा में 1 एमपीएफ में E3 के साथ थाली बाढ़। आगे बढ़ने से पहले, 10-12 एमपीएफ तक अबाधित छोड़ पूर्ण जरायु विस्तार सहित अंडा सक्रियण, अनुमति देने के लिए।

6. हीट शॉक ट्रीटमेंट

नोट: एक गर्मी झटका जल्दी भ्रूण में लागू तारककेंद्रक दोहराव को रोकता है, centrioles की एक अधूरी पूरक है, जिसके परिणामस्वरूप बाद में सेल चक्र 2 के दौरान धुरी गठन ड्राइव करने के लिए। कुंड गठन 13 के अभाव में बारी परिणामों में धुरी का अभाव।

  1. chorions के विस्तार (10-12 एमपीएफ) के बाद, एक चाय का झरनी में पेट्री थाली से भ्रूण डालना। आदेश में E3 के साथ एक धोने बोतल का उपयोग चाय का झरनी में किसी भी शेष भ्रूण इकट्ठा करने के लिए पेट्री प्लेट कुल्ला।
  2. 28.5 डिग्री सेल्सियस पर E3 के साथ एक पूर्व गर्म स्नान में एक बीकर के अंदर भ्रूण के साथ चाय का झरनी रखें। बीकर और E3 नहाने के पानी के तापमान को संतुलित करना प्री-, और यकीन है कि पर्याप्त E3 है इतना करना है कि चाय में सभी भ्रूणझरनी मध्यम करने के लिए सामने आ रहे हैं।
  3. 22 एमपीएफ में, 28.5 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान से चाय का झरनी हटाने संक्षेप में एक कागज तौलिया पर यह दाग अतिरिक्त नमी को दूर करने के लिए, और 41.4 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी स्नान में एक इसी तरह छोड़ देते E3 बीकर अंदर जगह है।
  4. 24 एमपीएफ में चाय का झरनी वापस E3 को नहाने के पानी में 28.5 डिग्री सेल्सियस पर संक्षिप्त सोख्ता के बाद हस्तांतरण। 29 एमपीएफ में एक 10 सेमी पेट्री थाली करने के लिए चाय का झरनी से भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए E3 के साथ एक धोने बोतल का उपयोग करें।

एक एक-चक्र cytokinesis स्टाल के साथ भ्रूण के लिए 7. चयन

  1. समय अवधि 35-45 एमपीएफ के दौरान, एक प्रेषित प्रकाश स्रोत के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, उन भ्रूण है कि 2-सेल चरण में सममित दरार के दौर से गुजर रहे हैं, और जो इसलिए निषेचित कर रहे हैं का चयन करें। भ्रूण कि सेल दरार के दौर से गुजर नहीं कर रहे हैं निकालें।
  2. निषेचित भ्रूण, पहले कोशिका चक्र के दौरान सामान्य कोशिका विभाजन के लिए चयनित किया अवलोकन जारी रखें, और सेकंड के दौरानदूसरी कोशिका चक्र (50-65 एमपीएफ)।
  3. 4 कोशिकाओं ( "कोई स्टाल", 2 में: एक 4 सेल भ्रूण के लिए 2 व्यवस्था मानक) निम्नलिखित श्रेणियां (चित्रा 2 सी) के अनुसार क्रमबद्ध भ्रूण; 3 कोशिकाओं ( "आंशिक स्टाल", एक न्यायपालिका 2 छोटे कोशिकाओं में: 1 बड़ा सेल व्यवस्था); और 2 कोशिकाओं ( "रुक", भ्रूण एक 1 में एक एक कोशिका चक्र देरी का प्रदर्शन: एक 2-सेल भ्रूण के लिए समान 1 व्यवस्था)। एक ताजा पेट्री थाली में ठप भ्रूण क्रमबद्ध करें।
    नोट: इस स्तर पर, 2 में भ्रूण: 2 व्यवस्था उन जो दूसरी कोशिका चक्र के दौरान न तो blastomere एक कोशिका विभाजन के स्टाल के अनुरूप कराना पड़ा; एक न्यायपालिका 2 छोटे कोशिकाओं में भ्रूण: 1 बड़ा सेल व्यवस्था उन जहां गर्मी झटका एक blastomere में दूसरी कोशिका चक्र के दौरान एक कोशिका चक्र स्टाल का कारण बना, लेकिन अन्य नहीं के अनुरूप; और भ्रूण "रुक" एक 1: 1 व्यवस्था उन जहां दूसरी कोशिका चक्र के दौरान दोनों blastomeres वांछित कोशिका विभाजन कराना पड़ा के अनुरूपस्टाल। ठप भ्रूण के बाद सेल चक्र अवधि (65-80 एमपीएफ) के दौरान सेल दरार को फिर से शुरू करना चाहिए। Blastomeres की व्यवस्था धुरी 2,14 स्थिर करने के लिए पिछले सेल चक्र से अधूरा संकेतों के कारण चर हो सकता है, लेकिन सबसे अधिक भ्रूण एक अपेक्षाकृत सामान्य ब्लासटुला कि सामान्य विकास से गुजरना कर सकते बनेगी।
  4. भ्रूण प्रति 10 सेमी की थाली 80 भ्रूण की एक सीमा के साथ पेट्री थाली में विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं। 24 HPF पर, तय है कि वे द्विगुणित या समयुग्मजी द्विगुणित भ्रूण 6 (अक्ष विस्तार (चित्रा 3 ए, 3 सी) के सामान्य हद तक) के एक सामान्य आकृति विज्ञान विशेषता है, कम अक्ष विस्तार के विपरीत और haploids की वृद्धि की शरीर मोटाई विशेषता भ्रूण का निरीक्षण (चित्रा 3 बी)), और / या इस तरह के स्वर्ण या सूरजमुखी मनुष्य और अन्य ऐसे assays के रूप में 36 एमपीएफ, (चित्रा 3 और नीचे देखें) 2,6,9 में आनुवंशिक वर्णक मार्कर का उपयोग diploidization का आकलन करें। किसी भी भ्रूण एक अगुणित आकृति विज्ञान है, या कि lysed है या अन्य मोटे तौर पर असामान्य दोषों का प्रदर्शन दिखाई देते हैं कि निकालें।
    नोट: अगर वांछित, भ्रूण, जब तक 5 दिनों के बाद निषेचन विकसित करने के लिए एक दैनिक आधार पर lysed या मोटे तौर पर असामान्य भ्रूण को हटाने के लिए जारी रखने और मध्यम ताज़ा करने के लिए नए सिरे से E3 जोड़ते समय देते हैं। नोट: जीवित भ्रूण भी एक हैचरी सिस्टम को स्थानांतरित और मानक शर्तों के तहत खिलाने से 5 दिन पर swimbladder मुद्रास्फीति के बाद विकसित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक सेल चक्र cytokinesis स्टाल के बावजूद, डीएनए प्रतिकृति, इस तरह के भ्रूण में सामान्य रूप से होता है भ्रूण (चित्रा 1) के डीएनए सामग्री के दोहराव में जिसके परिणामस्वरूप। Streisinger हीट शॉक प्रोटोकॉल (मानक एच एस) की अवधि 13-15 मिनट के बाद निषेचन (एमपीएफ) के दौरान एक गर्मी नाड़ी शामिल है और मुख्य रूप से cytokinesis गिरफ्तारी जबकि ली गई विधि यहाँ वर्णित है, 35 एमपीएफ 1,2 पर पहले भ्रूण कोशिका विभाजन के दौरान लाती है, के रूप में हीट शॉक 2 (HS2), अवधि 22-24 एमपीएफ के दौरान एक गर्मी झटका उपयोग करता है और 50 एमपीएफ (; 2,3,4 चित्रा 2) में दूसरे भ्रूण कोशिका विभाजन के दौरान cytokinesis गिरफ्तारी लाती है के लिए भेजा। 24 HPF पर, भ्रूण के अवलोकन का निर्धारण करने के लिए कि क्या वे द्विगुणित या समयुग्मजी द्विगुणित भ्रूण की एक सामान्य आकृति विज्ञान विशेषता है, या अगुणित भ्रूण की आकृति विज्ञान विशेषता अक्ष कम है और व्यापक शरीर की अनुमति (चित्रा 3) 2 बदलती हैं। Gynogenetic तरीकों के माध्यम से प्रचार-प्रसार से लाइनों का चयन homozygous द्विगुणित उत्पादन 1 की उपज बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। सटीक पूरे जीनोम दोहराव एक mitotic चक्र के निषेध से उम्मीद की पुष्टि गुणसूत्र मायने रखता है 2,3,4,15 या परमाणु व्यास 3,4 के quantitation द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। अन्य जानवरों के रूप में zebrafish में सामान्य विकास अत्यधिक गुणसूत्र संख्या के प्रति संवेदनशील है 16 असामान्यताओं, और प्रेक्षण homozygous diploids वी हो गया है किiable और उपजाऊ वयस्कों 1,2,9 सफल diploidization के लिए अतिरिक्त सबूत उपलब्ध कराता है। Zebrafish भ्रूण में Ploidy भी इस तरह के परमाणु जीन गिनती और फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) डीएनए सामग्री 16 यों के स्वस्थानी संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट के रूप में आणविक विधियों का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: निषेचन प्रकार के। (ए) प्राकृतिक सहवास। नर और मादा युग्मक एक प्राकृतिक द्विगुणित में जिसके परिणामस्वरूप, इलाज कर रहे हैं। (बी) के शुक्राणु यूवी के साथ व्यवहार किया जाता है, पैतृक डीएनए और अगुणित युग्मनजों के उत्पादन के विनाश में जिसके परिणामस्वरूप। अगर इलाज, ऐसे haploids पिछले दिन जीवित नहीं है विकास के 2-3। (सी) हीट शॉक 2 (HS2) के साथ अगुणित युग्मनजों का उपचार जल्दी भ्रूण में बँटवारा के cytokinesis का एक चक्र को रोकता है। यह सेल चक्र स्टाल, युगलअप्रभावित डीएनए प्रतिकृति को डी, homozygous diploids कि व्यवहार्य और उपजाऊ वयस्कों बन सकता है उत्पन्न करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: HS2 दूसरी कोशिका चक्र रोकने द्वारा पूरे जीनोम दोहराव को बढ़ावा देता है। पहले तीन सेल चक्र के दौरान एक अनुपचारित भ्रूण की (ए) सेल दरार पैटर्न, 2, 4, और 8 सेल भ्रूण के लिए इसी। (बी) HS2 उपचार दूसरी कोशिका चक्र के दौरान कोशिका विभाजन की एक एक चक्र स्टाल में परिणाम है। स्टाल के दौरान, भ्रूण में चल रहे डीएनए संश्लेषण परिणाम diploidization दौर से गुजर रहा है, से या तो अगुणित द्विगुणित करने के लिए (एन -> 2n) या द्विगुणित टेट्राप्लोइड करने के लिए (2n -> 4N) (पाठ देखें)। इस स्टाल के बाद, भ्रूण कोशिका विभाजन शुरू, पूर्वोत्तर के साथwly ploidy हासिल कर ली। (सी) HS2 इलाज भ्रूण blastomere व्यवस्था के आधार blastomeres दूसरी कोशिका चक्र के दौरान एक कोशिका विभाजन देरी दिखा रहे हैं कि क्या की एक किस्म प्रदर्शन कर सकते हैं, न blastomere दर्शाती एक देरी एक 2 में जिसके परिणामस्वरूप: i) "कोई स्टाल" के 2 व्यवस्था विशेषता 4 सेल चरण भ्रूण, द्वितीय) "आंशिक स्टाल": दो ब्लास्टोमेरेस का केवल एक ही है, एक देरी दर्शाती एक न्यायपालिका 2 में जिसके परिणामस्वरूप: 1 व्यवस्था, और iii) "रुक": दोनों blastomeres, एक देरी का प्रदर्शन एक 1 में जिसके परिणामस्वरूप: 1 2-सेल चरण भ्रूण की व्यवस्था विशेषता। (A - सी), नाभिक परमाणु आकार का एक विस्तार का प्रतिनिधित्व करती diploidization घटना के साथ, नीले हलकों के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। एक चित्र कोशिका विभाजन के स्टाल के लिए आधार के रूप में प्रस्तावित centriolar व्यवहार का चित्रण के लिए संदर्भ 2 देखें। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा की पर।

चित्र तीन
चित्रा 3: प्राकृतिक diploids, haploids और gynogenotes की आकृति विज्ञान। (ए) एक द्विगुणित प्राकृतिक पार के माध्यम से प्राप्त की सामान्य भ्रूण आकृति विज्ञान। (बी) अगुणित भ्रूण एक कम है और व्यापक शरीर अक्ष दिखा रहे हैं। (सी) Homozygous diploids सामान्य शरीर आकारिकी है। भ्रूण इसके अतिरिक्त रंजकता जीन सुनहरा ट्रैकिंग माता पिता का डीएनए विरासत की सुविधा के लिए एक अप्रभावी उत्परिवर्तन ले: माताओं गोल्डन में एक परिवर्तन के लिए homozygous वाहक, और पिता के इस जीन के लिए जंगली प्रकार के होते हैं। इस प्रकार, प्राकृतिक diploids, विषमयुग्मजी स्वर्ण के लिए, जंगली प्रकार रंजकता, दिखा रहे दोनों haploids जबकि (स्वर्ण के लिए hemizygous) और homozygous diploids (गोल्डन लिए homozygous) उत्परिवर्ती रंजकता दिखा रहे हैं। स्केल बार = 0.5 मिमी। पैनलों फिर से संशोधितसम्मेलन 2, अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

उपाय अवयव जमा करने की स्थिति
हैंक्स 'समाधान 1 8.0 छ NaCl, और
0.4 ग्राम KCl में 100 मिलीलीटर DDH 2 हे
4 हे सेल्सियस पर स्टोर
हैंक्स 'समाधान 2 0.358 छ निर्जल ना 2 HPO 4, और
0.6 ग्राम के.एच. 2 4 पीओ
100 में मिलीलीटर DDH 2 हे
4 हे सेल्सियस पर स्टोर
हैंक्स 'समाधान 4 0.72 जी 2 CaCl
50 मिलीलीटर DDH 2 हे में
4 हे सेल्सियस पर स्टोर
हैंक्स 'समाधान 5 1.23 छ MgSO 4 ∙ 7H 2
50 मिलीलीटर DDH 2 हे में
4 हे सेल्सियस पर स्टोर
हांक Premix जोड़ें, निम्न क्रम में:
10.0 मिलीलीटर समाधान 1,
1.0 मिलीलीटर समाधान 2,
1.0 मिलीलीटर समाधान 4,
86.0 मिलीलीटर ddH2O, और 1.0 एमएल समाधान 5
4 हे सेल्सियस पर स्टोर
हैंक्स 'समाधान 6 0.33 छ 3 NaHCO
10 मिलीलीटर DDH 2 हे में
नए सिरे से तैयार आईवीएफ प्रक्रिया की सुबह

तालिका 1 हांक समाधान की तैयारी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

महत्वपूर्ण कदम

यह इन विट्रो निषेचन में प्रभावी की शर्तों के तहत काम करने के लिए महत्वपूर्ण है। परिपक्व अंडे (चरण 1) की एक अच्छी आपूर्ति बीमा करने के लिए, महिलाओं को संभोग के लिए स्थापित की कम से कम 5 दिनों के लिए संभोग पार में सेट नहीं किया जाना चाहिए था और सगर्भा दिखाई देनी चाहिए। प्रजनन की रुकावट के दौरान, एक पर्यवेक्षक प्राकृतिक अंडा बाहर निकालना की पहली उपस्थिति के लिए पर्याप्त रूप से 15-30 टैंक निगरानी कर सकते हैं। जब पहली बार अंडे क्रम में सबसे अधिक अंडे आईवीएफ प्रक्रिया के लिए महिलाओं के अंदर रहने के लिए अनुमति देने के लिए, प्राकृतिक matings के माध्यम से जारी कर रहे हैं संभोग की रुकावट के रूप में संभव के रूप में जल्द ही हो जाना चाहिए। इन महिलाओं, जो अब परिपक्व अंडे के मैनुअल बाहर निकालना के लिए तैयार कर रहे हैं, बाद में अंडे की रिहाई पर एक स्पष्ट प्रभाव के बिना अप करने के लिए 2 घंटे के लिए अलग रखा जा सकता है। एक प्रभावी समाधान शुक्राणु (चरण 2) तैयार करने के लिए, पुरुषों मजबूत और आदर्श एक लाल रंग है, जो zebrafish पुरुषों प्रजनन की विशेषता है के साथ दिखाई देनी चाहिए। एक साफ विच्छेदन आम तौर पर शामिल है रेमोशरीर के पीछे है, और यह पूर्व से खींच कर तैरने मूत्राशय करने की दिशा में यह खींच कर आंतों ट्रैक ving। केंद्रीय आंतरिक अंगों को हटाने के बाद, वृषण आंतरिक शरीर दीवार के प्रत्येक पक्ष के साथ के रूप में पारदर्शी लम्बी जनता रहते हैं। अवांछित अंगों (आंतों जैसे) शुक्राणु समाधान में भी शामिल करने से बचें; हांक समाधान में रखा जा रहा से पहले एक सूखी पेट्री प्लेट की सतह पर काम करके वृषण से इन अलग अगर जरूरत है। आईवीएफ (चरण 4) के दौरान उच्च निषेचन दर को प्राप्त करने के लिए, यह जरूरी है कि extruded अंडे शुक्राणु इसके अलावा जब तक सक्षम रखा जाता है। अंडे के निषेचन प्रदर्शनी में एक से थोड़ा पीला टोन के लिए सक्षम और पारदर्शी हैं। पानी शुक्राणु अलावा पहले के साथ किसी भी संपर्क होने अंडे से बचें, क्योंकि पानी अंडा सक्रियण और समय से पहले सक्रियण गति प्रदान निषेचन रोकना होगा। जल सक्रियण और निषेचन क्रम में अंडे का निर्जलीकरण से बचने के लिए महिला से बाहर निकालना के 90 सेकंड के भीतर हो जाना चाहिए, जो होगाउनके गिरावट के लिए नेतृत्व। यदि आवश्यक हो, extruded अंडे के साथ पूरक हांक समाधान के 100-200 μl में लंबी अवधि (1.5 घंटे या उससे अधिक के लिए) के लिए रखा जा सकता है 0.5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) 17 (जब इस विशिष्ट प्रयोजन के लिए हांक समाधान की तैयारी, तैयार Premix बीएसए पूरकता के दौरान जोड़ा पानी की सामग्री) के लिए सही करने के लिए। अंडे हांक बीएसए समाधान की मदद से सक्षम रखा गया है, एक micropipette का उपयोग अंडे से अतिरिक्त हांक बीएसए को हटाने और 1 मिनट के भीतर खाद डालना।

HS2 का उपयोग कर diploidization की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कदम रुक भ्रूण (चरण 7) की छँटाई है। संतुलित रूप से 2-सेल भ्रूण cleaving की प्रारंभिक छंटाई भ्रूण कि निषेचित हो जाते हैं और (- जैसे भ्रूण खारिज किया जाना चाहिए भ्रूण में आईवीएफ परिणाम है कि संक्रमण सीधे 1- 4-कोशिकाओं में 35-50 को एमपीएफ से कभी दौरान dispermy) कोशिका विभाजन शुरू करने के लिए चुनता है। सेल साइकिल चालन इन जल्दी भ्रूण सेंट दौरान हर 15 मिनट होता हैउम्र (पहली सेल चक्र के लिए 35-50 एमपीएफ, दूसरी कोशिका चक्र के लिए 50-65 एमपीएफ, और इतने पर), इसलिए प्रत्येक कोशिका चक्र के पहले 10 मिनट के दौरान भ्रूण cleaving की छंटाई के चक्र से और सही के बीच ओवरलैप की अनुपस्थिति सुनिश्चित एक कोशिका विभाजन के स्टाल की पहचान।

संशोधन और समस्या निवारण

चरण 3 में यूवी इलाज की ताकत (जैसे जोखिम समय, दीपक शक्ति, दीपक के लिए दूरी) यदि प्रारंभिक निषेचन दरों के साथ ही बाद में HSII उपचार के अभाव में haploids की आवृत्ति परीक्षण के द्वारा की जरूरत समायोजित किया जा सकता है: की सही मात्रा यूवी जोखिम निषेचन दर पर एक नजर प्रभाव नहीं है, जबकि अगुणित भ्रूण की 100% में जिसके परिणामस्वरूप (प्रतिनिधि परिणाम देखने द्विगुणित भ्रूण से अगुणित भेद करने के लिए)। बहुत ज्यादा यूवी जोखिम, शायद शुक्राणु समारोह पर हानिकारक प्रभाव की वजह से कम निषेचन दरों का कारण बनता है, जबकि अपर्याप्त यूवी जोखिम की वजह से टी द्विगुणित भ्रूण का उत्पादनशुक्राणु डीएनए के ओ अधूरा निष्क्रियता।

भ्रूण कोशिका दरार की बहाली (चरण 7) के बाद विकास दोष या मारक दिखा रहे हैं, तो चरण 6 में गर्मी झटका तापमान भ्रूण अस्तित्व बढ़ाने के लिए (41.0 डिग्री सेल्सियस के लिए उदाहरण के लिए) से थोड़ा कम किया जा सकता है; स्थिति है कि न्यायपालिका 3-सेल के लगभग बराबर भागों में परिणाम और दूसरा सेल चक्र के दौरान 2-सेल भ्रूण ठप (और centriolar दोहराव पर एक प्रभाव के लिए सीमा के पास इसलिए कर रहे हैं) न्यूनतम बाद विकास दोष में परिणाम और सेल साइकिल की बहाली के बाद अस्तित्व में वृद्धि हुई ।

HS2 विधि, कोशिका विभाजन स्टाल (और इसलिए पूरे जीनोम दोहराव) का आकलन करने के लिए एक सुविधाजनक और आंतरिक तंत्र को शामिल किया गया भ्रूण का प्रत्यक्ष अवलोकन के बाद से वे विकास के रूप में विभिन्न कोशिका चक्र पर नज़र रखने की अनुमति देता है। कि एक एक कोशिका चक्र विभाजन स्टाल आया है भ्रूण के मैनुअल चयन diploidized भ्रूण के एक समान जनसंख्या पैदा करने की अनुमति देता हैएस। HS2 एक आंतरिक तंत्र डीएनए दोहराव पुष्टि करने के लिए के रूप में एक कोशिका विभाजन के स्टाल में कार्य करता है के रूप में, किसी भी zebrafish आनुवंशिक तनाव (जैसे एबी, Tübingen, Wik) में बाहर किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, दिखाई आनुवंशिक तनाव में पेश मार्कर diploidized भ्रूण (चित्रा 3) की पहचान की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, महिलाओं है कि इस तरह के स्वर्ण या सूरजमुखी मनुष्य के रूप में रंजकता जीन में म्यूटेशन पीछे हटने के लिए homozygous हैं से अंडे का उपयोग करते हैं, एक ही रंजकता जीन के लिए सामान्य alleles ले जाने के जंगली प्रकार के तनाव से निकाली गई शुक्राणु के साथ जोड़ा जा सकता है। इस स्थिति में, क्योंकि यूवी का इलाज शुक्राणु जंगली प्रकार वर्णक alleles, योगदान नहीं कर सकते अगुणित और homozygous द्विगुणित भ्रूण पीछे हटने का वर्णक उत्परिवर्तन दिखा रहे हैं। इसके अलावा, homozygous diploids 24 HPF पर जंगली प्रकार आकृति विज्ञान दिखा रहे हैं, कम विस्तारित अगुणित आकृति विज्ञान के लिए इसके विपरीत है। मातृ हटने विशेषता और समग्र Embry की उपस्थिति का संयोजनओ आकृति विज्ञान सफल ploidy दोहराव की पुष्टि करता है। आगे की पुष्टि और इलाज भ्रूण के गुणसूत्र की गिनती के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है।

ऊपर वर्णित आनुवंशिक अंकन प्रणाली, पीछे हटने का दिखाई आनुवंशिक मार्करों के आधार पर, यह भी संतान में शुक्राणु व्युत्पन्न डीएनए के अभाव की पुष्टि के बाद से, जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण दिखा रहे जंगली प्रकार रंजकता ही अगर शुक्राणु पूरी तरह से यूवी उपचार द्वारा निष्क्रिय नहीं किया गया है की अनुमति देता है । एक आनुवंशिक अंकन प्रणाली के अभाव में, भ्रूण का एक नमूना पुष्टि करने के लिए कि सभी भ्रूण 24 HPF पर अगुणित आकृति विज्ञान का प्रदर्शन गर्मी झटका के अभाव में विकसित करने की अनुमति दी जा सकती है, और इस तरह है कि शुक्राणु डीएनए निष्क्रियता पूरा हो गया था। पूरी तरह से निष्क्रिय शुक्राणु के साथ संयोजन के रूप में, यह एक ही आनुवंशिक अंकन प्रणाली को भी संभावित सहज ध्रुवीय शरीर विफलता का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। इस तरह की एक घटना एक diploidization इलाज के बिना द्विगुणित आकृति विज्ञान के साथ recessively चिह्नित भ्रूण की उपस्थिति में नतीजा होगा। उठना, ध्रुवीय बोवि विफलता zebrafish में मनाया नहीं किया गया है लेकिन Xenopus tropicalis 18 में सूचना दी है। एक दिया प्रणाली में मौजूद हैं, तो यह सहज घटना कम या के लिए नियंत्रित किया जा करने के लिए सबसे बेहतर रूप ploidy हेरफेर को लागू करने में होता है।

तकनीक की सीमाएं

व्यवहार्य gynogenotes उत्पादन करने की क्षमता पृष्ठभूमि जीन वेरिएंट जो जब homozygous हानिकारक हैं की अनुपस्थिति पर निर्भर करता है। इस प्रकार, प्रक्रिया की सफलता आनुवंशिक इस्तेमाल किया तनाव के आधार पर अलग अलग होंगे। Gynogenesis की कई पीढ़ियों के माध्यम से आनुवंशिक उपभेदों का चयन व्यवहार्यता 1 में सुधार करने के लिए दिखाया गया है।

HS2 विधि, जब इलाज शुक्राणु के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया द्विगुणित भ्रूण का उत्पादन करने के लिए, यह भी टेट्राप्लोइड भ्रूण के उत्पादन के लिए एक उच्च आवृत्ति पर अनुमति देता है। हालांकि, इस मामले में, टेट्राप्लोइड परिवर्तन करने के लिए द्विगुणित के कारण, आनुवंशिक मार्करों आसानी से पूरे जीनोम की पुष्टि के लिए अनुमति नहीं हैई दोहराव। इस मामले में, सिंक्रनाइज़ भ्रूण में एक कोशिका चक्र स्टाल का अवलोकन और ठप भ्रूण का चयन टेट्राप्लोइड चयन बीमा करना चाहिए, और गुणसूत्र की गिनती के आगे ploidy पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

मौजूदा / वैकल्पिक तरीकों के संबंध में महत्व

40 साल पहले 1 से अधिक Streisinger द्वारा वर्णित हालांकि, मानक एच एस पद्धति व्यापक रूप से गरीब उपज की वजह से नहीं किया गया है। इसके बजाय, ploidy हेरफेर लगभग विशेष रूप से वैकल्पिक और जल्दी दबाव है, जो दूसरी अर्धसूत्रीविभाजन के निषेध के माध्यम ploidy दोहराव में परिणाम की अपेक्षाकृत अधिक कुशल पद्धति पर भरोसा किया है। हालांकि, जीन homozygosity 9,19, जो एक आनुवंशिक उपकरण के रूप में इसकी कीमत कम की चर अनुपात में जल्दी दबाव का परिणाम है। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि HS2, मानक एच एस प्रोटोकॉल, अर्थात् पहली सेल चक्र के दौरान एक अलग समय पर गर्मी नाड़ी के आवेदन की एक संशोधन (22-24HS2 में आधुनिकीकरण की अवधि, मानक एच एस में 12-14 एमपीएफ की तुलना में) homozygous द्विगुणित प्रस्तुतियों से 4 गुना की वृद्धि हुई उपज में यह परिणाम है।

गर्मी नाड़ी की कार्रवाई (पहले सेल चक्र के दौरान 22-24 एमपीएफ,) गर्मी के झटके का समय है, जिसके फलस्वरूप उचित पूरक का अभाव एक धुरी पैदा करते हैं और मध्यस्थता करने के दौरान तारककेंद्रक दोहराव के निषेध के आधार पर घटित करने के लिए अनुमान लगाया जा सकता निम्नलिखित सेल चक्र (50-65 एमपीएफ, दूसरी कोशिका चक्र के लिए इसी) के दौरान कोशिका विभाजन। तारककेंद्रक दोहराव बाद सेल चक्र के दौरान गर्मी के झटके के अभाव में फिर से शुरू कर सकते हैं, एक सटीक एक सेल चक्र स्टाल के बाद आगे बढ़ने के विकास की इजाजत दी। क्योंकि तारककेंद्रक दोहराव और डीएनए प्रतिकृति चक्र अन्योन्याश्रित हैं 20, डीएनए प्रतिकृति भी दूसरी कोशिका चक्र में ठप विभाजन के दौरान सामान्य रूप से आय। इस सटीक पूरे जीनोम दोहराव और पूर्ण homozygosis में यह परिणाम है।

भविष्य अनुप्रयोगों

21 में के रूप में कई alleles, शामिल उन से जुड़े पीढ़ियों की आवश्यकता होगी विशेष रूप से मदद कर सकते हैं।

दृष्टिकोण HS2 के समान बाह्य निषेचन के साथ अन्य प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है, यहां तक ​​कि उन नहीं वर्तमान में आनुवंशिक प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है। यह विधिविशेष रूप से blastomere साइकिल की दीक्षा जहां एक गर्मी नाड़ी हानिकारक विकासात्मक प्रभाव उत्पादन के बिना तारककेंद्रक दोहराव प्रभावित करते हैं और एक सटीक कोशिका विभाजन के स्टाल और पूरे जीनोम दोहराव उत्पन्न कर सकते हैं के माध्यम से निषेचन से समय की अवधि का लाभ लेता है। इस प्रकार, इस प्रारंभिक समय अवधि गर्मी झटका संवेदनशीलता के लिए पता लगाया जा सकता अन्य जानवर प्रणालियों में ploidy हेरफेर आधारित आनुवंशिक तरीकों को विकसित करने के लिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
Na2HPO4 Sigma S3264
KH2PO4 Sigma P9791
CaCl2 Sigma C7902
MgSO4-7H2O Sigma 63138
NaHCO3 Sigma S5761
Tricaine Western Chemical Tricaine-D (MS 222) FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base Sigma 77-86-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl Sigma 920-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in) PennPlax (ThatFishThatPlace # 212370) available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon available in most standard stores
Dissecting scissors Fine Science Tools 14091-09
Dissecting forceps Dumont SS available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) Nikon SMZ645 or equivalent
Reflective light source (LED arms) Fostec KL1600 LED or equivalent
Petri plates 10 cm diameter any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml any maker
Ice bucket any maker
Pipetteman P-1000 any maker
Pipette tips 1,000 µl any maker
Narrow spatula Fisher 14-374
Depression glass plate Corning Inc 722085 (Fisher cat. No 13-748B) available from Fisher Scientific
UV lamp UVP Model XX-15 (cat No. UVP18006201) available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses any maker
Paper towels any maker
Kimwipes Kimberly-Clark 06-666-11 available from Fisher Scientific
Timer stop watch any maker
Wash bottle Thermo Scientific 24020500 available from Fisher Scientific
Tea strainer available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2) Corning Inc. 1000250 available from Fisher Scientific
water bath (2) any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1 see above see above 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2 see above see above 0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C.
Hanks’ Solution 4 see above see above 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C.
Hank's Premix see above see above add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C
Hanks’ Solution 6 see above see above 0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution) see above see above Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
  2. Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
  3. Zhang, X., Onozato, H. Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one. Aquaculture. 240, 101-113 (2004).
  4. Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus). Theriogenology. 68, 873-881 (2007).
  5. Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever. Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).
  6. Walker, C. The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. Academic Press. 43-70 (1999).
  7. Blanco-Vives, B., Sánchez-Vázquez, F. J. Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish. Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).
  8. Dekens, M. P. S., et al. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).
  9. Pelegri, F., Schulte-Merker, S. The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. Academic Press. 1-20 (1999).
  10. Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin. Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).
  11. Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. When a sperm meets an egg: block to polyspermy. Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).
  12. Wong, J. L., Wessel, G. M. Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy. Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).
  13. Rappaport, R., Rappaport, B. N. Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle. J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).
  14. Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).
  15. Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication. Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).
  16. Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).
  17. Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).
  18. Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).
  19. Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112, 311-319 (1986).
  20. Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -M., Nüsslein-Volhard, C. The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote. Development. 130, 3907-3916 (2003).
  21. Pelegri, F., Mullins, M. Met. Cell Biol. Vol. 104. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. 83-120 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics