מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול שונה עבור מניפולציה ploidy משתמשת הלם החום להשפיע על דוכן אחד-מחזור ב cytokinesis בעובר המוקדם. פרוטוקול זה מודגם דג הזברה אבל עשוי לחול על מינים אחרים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment. J. Vis. Exp. (118), e54492, doi:10.3791/54492 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מניפולציה של ploidy מאפשר טרנספורמציות שימושי, כגון diploids כדי tetraploids, או haploids כדי diploids. בשנתי ה rerio Danio דג הזברה, במיוחד בדור של diploids gynogenetic הומוזיגוטים שימושי בניתוח גנטי משום שהיא מאפשרת את הייצור הישיר של הומוזיגוטים מאם הטרוזיגוטיים יחידה. מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה לשכפול ploidy מבוסס על הדופק חום במהלך מחזור התא הראשון, 2 הלם תרמי (HS2). באמצעות עיכוב של שכפול צנטריול, שיטה זו גורמת דוכן חלוקת התא מדויק במהלך מחזור התא השני. דוכן החלוקה חד מחזור המדויק, מצמיד את שכפול הדנ"א מעושה, תוצאה הוא שכפול הגנום כולו. פרוטוקולים הקשורים בשיטה זו כוללים ביצת אוסף זרע, UV לטיפול זרע, הפריה חוץ גופייה ודופק חום לגרום לעיכוב חלוקת מחזור אחד תאים ושכפולים ploidy. גרסה שונה של פרוטוקול זה יכול להיות מיושמתploidy כדי לגרום לשינויים בעלי חיים אחרים.

Introduction

פרוטוקול זה מאפשר מניפולציה של ploidy עוברי דג הזברה, כגון בדור של diploids gynogenetic הומוזיגוטים מן haploids gynogenetic (איור 1) או לייצור tetraploids. זו מושגת על ידי גרימת עיכוב cytokinesis המתאים מחזור התא אחת בדיוק (איור 2 א, 2 ב). מהעיכוב של מחזור מפתח cytokinesis מושג על ידי טיפול עם הלם חום. הפרוטוקול הסטנדרטי של הלם תרמי (HS) כמו במקור שתיאר Streisinger ועמיתיו מעורבים דופק הטמפרטורה במהלך MPF תקופת 13-15, וכתוצאה מכך דוכן חלוקת התא חד מחזור במהלך מחזור התא הראשון 1. היעילות של פרוטוקול זה שופרה לאחרונה על ידי סריקת מחזורי התא מוקדם עם חלון זזה זמני של טיפול בהלם חום. סריקה זו מזוהית בשלב מאוחר יותר עבור הלם חום, עדיין בתוך מחזור התא הראשון (22-24 MPF), כי תוצאות שיעור גבוה יותר של embryos עם דוכן חלוקת התא חד מחזור, אשר במקרה זה משפיע על מחזור התא השני 2. התצפית כי מניפולציות ניסיון במהלך מחזור התא הראשון להפריע חלוקת תא במהלך מחזור התא השני ולגרום DNA תוכן שכפול גם דווחה מיני דגים אחרים 3,4. אנו מתייחסים פרוטוקול שונה זה כמו חום 2 הלם (HS2 - המונח "2" משקף כי דופק החום מתרחש בנקודת הזמן יאוחר שיטת HS הרגילה, וכי עיכוב המחזור לתאים הנגרמים HS2 מתרחש במהלך מחזור התא השני ). מחקרים אלה הראו כי בסיס מעצר cytokinesis לאחר הלם חום הוא העיכוב של שכפול צנטריול במהלך הדופק החום, אשר משפיע היווצרות ציר ואינדוקצית תלם מחזור התא הבא. תוצאות HS2 בתשואות של עיכוב מחזור התא מתקרבות 100%, ושיעורים עד שכפול ploidy עד 4 פעמים גבוהות יותר מאשר תקן HS 2.

עוברים מטופלים שנינותחה הלם חום במהלך רכיבה על אופני תא blastomere מפגינים רבים השפעות מזיקות, הדבר המצביע על כך הלם החום משפיע מספר רב של תהליכים הנדרשים תא חלוק 2. מצד השני, אם הלם החום מוחל לפני תחילת רכיבת תא (פרק הזמן 0-30 MPF), זה משפיע כנראה עולה בקנה אחד עם הפרעה ספציפית עם שכפול צנטריול ואינו נראה להשפיע תהליכים בתא חיוניים אחרים 2 . מחקרים אלה הראו כי הזמן לפני התחלת חלוקת blastomere שנראה תקופת התפתחותית מקובלת באמצעות הלם חום ככלי לתמרן ploidy במיוחד באמצעות עיכוב צנטריול. הגורם הבסיסי של הסלקטיביות לכאורה הלם חום על שכפול צנטריול אינו ידוע, אך עשוי להיות קשור שפלה סלקטיבית של substructures centrosome נצפה תחת עומס חום בסוגי תאים מסוימים, כגון לויקוציטים 5.

סנכרון זמני של דה העובריvelopment מושגת על ידי הפריה חוץ גופית (IVF). השימוש בתרומת זרע מגבר מטופל במהלך תוצאות הפריה בעוברים דיפלואידי שעם HS2 הנגרמת דוכן cytokinesis חד מחזור להפוך tetraploid. השימוש בתרומת זרע מגבר שטופלו UV, אשר נושאת crosslinks כי להשבית DNA, תוצאות בעוברים gynogenetic הפלואידים 6, שעם HSII הנגרמת דוכן cytokinesis חד מחזור להפוך 2 gynogenetic diploids. בגלל שכפול הגנום כולו וכתוצאה מכך, את diploids gynogenetic האחרון הם הומוזיגוטים בכל מוקד יחיד בגנום. לקבלת תמציתיות, אנו מתייחסים gynogenetic עוברים הפלואידים כמו "haploids", ועוברים דיפלואידי gynogenetic הומוזיגוטים כמו "diploids הומוזיגוטים". אם קיימא ופורה, ניתן להשתמש diploids הומוזיגוטים ליזום קווי סטרילי וקטלני חינם. homozygosity ישיר המושרה על ידי HS2 צריך גם לשלב בקלות ניתוח גנטי או מסכי גנטי, מאז diploids הומוזיגוטים מן הנקבות כי הם נשאים הטרוזיגוטיים של mutשיעורי תערוכת ations של homozygosity בבית גבוה וקבוע (50%) יחסים 2.

הפרוטוקול הבא מתאר צעדים לביצוע HS2 ולגרום שכפול ploidy עם homozygosity מלא. לייצור tetraploid, פתרון הזרע צריך להיות מטופל. לייצור דיפלואידי הומוזיגוטים, הזרע צריך להיות מומת על ידי טיפול UV. בנוסף, כפי שמתואר הדיון, סמני פיגמנט גלויים יכולים לשמש גם כדי להקל על זיהוי של diploids הומוזיגוטים. תאומת דג זברה בעיקר במהלך השעות 3 הראשונות של הייזום של מחזור האור שלהם 7, ושניהם המבוגרים והביצים רגישות מקצבי יממת 8, כך להשגת התוצאות הטובות ביותר את תהליך ההזרעה המלאכותי אמור להתרחש בתוך פרק זמן זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם מאוניברסיטת ויסקונסין - מדיסון טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) הנחיות (אוניברסיטת ויסקונסין - מספר אבטחת מדיסון A3368-01).

1. בחירת נקבות עבור ביצה אוסף באמצעות הזדווגות בהפרעה

הערה: פרוטוקולים מבוססים IVF להסתמך על שהחול של ביציות בשלות מן הנקבות באמצעות לחץ במדריך 9. פרוטוקולים קודמים השתמשו נקבות ישירות ממיכלי או הזדווגויות זוג ללא נקבות שעברו התנהגות שחרור ביצית, אך רק חלק קטן מן הנקבות האלה (כ -20% או פחות, בהתאם לקו דג הזברה) להניב ביצים מעוקמות המוסמכת על לחץ ידני. בהליך משופר, נקבות הן מראש מסודר עבור נחת ביצה ידי תצפית ויזואלית ישירה, המלווה בהפרעה מיידית של הזדווגות. הליך זה הוא יעיל מאוד, כמו כמעט כל נקבות שנבחרו מראש באמצעות תשואת צעד הזדווגות חלה הפרעה זו ביצים מעוקמות מוסמכותעל לחץ ידני.

  1. אחר הצהריים לפני הניסוי, להגדיר זוגות הזדווגות של זן דג הזברה הרצוי בקופסות הזדווגות דג זברה סטנדרטיות. לגדל מספר זכרים באותו התא כמו נקבות עדיין מופרדות פיזית מהם, בין אם באמצעות חלוקת תיבת הזדווגות או על ידי צבת הזכר תחת אינסרט הטלה והנקבה בתוך להכניס את.
  2. בבוקר של הניסוי, להסיר את המחיצה הגופנית, מתן שני הזכר והנקבה בתוך אותו כנס ההטלה, כך ההזדווגות מתחילה.
  3. ראייה לבדוק המיכלים המכילים זוגות הזדווגות לזהות שחול של ביצים בעת הזדווגות טבעית. על הסימנים הראשונים של extrusions ביצה, נפרדים לגברים ונשים לקטוע רבייה. לאחר ההפרדה מן הזכרים, לשמור על הנקבות שנבחרו מראש בנפרד או נקווה באותו טנק. השתמש נקבות מרובות תלוי את מספר העוברים הרצויים (בדרך כלל 50-150 ביצים / נקבה).

2. הכנת פתרון זרע

הערה: IVF rElies על חשיפה של ביציות בשלות לפתרון זרע. פתרון זה יכול להיות מטופל, כדי ליצור zygotes דיפלואידי (שעם טיפול HS2 עוברים tetraploid להיות) או שטופלו UV, כדי ליצור zygotes הפלואידים (שעם טיפול HS2 להפוך עוברים דיפלואידי הומוזיגוטים). פרוטוקולים כנים זרע קודמים הציעו את השימוש של צינורות נימים לאסוף מלטו מהאזור פי הטבעת של גברים חיים, אבל זה היה תהליך לא יעיל כמו חלק קטן בלבד של זכרי הניב מלט 9. הפרוטוקול המובא להלן מסתמך במקום על הכנה מזרע אשכים גזורים טעונים, אשר מניבה תוצאות אמינות יותר.

  1. כן הפתרון של האנק מראש כפתרון premix של האנק, הכולל את כל הרכיבים (פתרונות 1, 2, 4 ו -5) למעט פתרון סודיום ביקרבונט (פתרון 6). הכן טרי פתרון 6 ומוסיפים premix בבוקר של הניסוי (טבלה 1). כדי להפוך הפתרון "הנקס (פתרון סופי, להכין בבוקרהליך IVF), לשלב 990 ul של Premix של האנק 10 μl של הפתרון הטרי 6.
  2. להרדים זכרים על ידי חשיפת יתר tricaine כפתרון 0.016% במים מותנים.
    1. כן tricaine כפתרון מניות 0.2% במים (חיץ 7.0 pH עם 1M טריס pH 9.0) ולשמור על 4 מעלות צלזיוס. הוסף 8 מ"ל של תמיסת tricaine המניות ל -100 מ"ל מים בכוס, ולהשתמש נטו להעביר הזכרים לפתרון tricaine.
    2. השתמש המקביל של אשכים עבור זכר אחד לכל מצמד צריך להיות מופרה בנפח של הפתרון של האנק המתאים 100 μl לכל זכר (אשכים למשל מ 10 גברים שנאספו 1 מיליליטר הפתרון של האנק, לדשן 10 מצמדים עם 100 μl / קלאץ ').
    3. אשר המתת חסד על ידי הפסקת תנועות זימים במשך 15 דקות. לאחר המתת חסד, להסיר את הזכרים מן הקנקן בכפית. שוטפים את הזכרים בקצרה עם מים מותנה ולייבש אותם קלות על ידי הצבת אותם בקצרה על כמה מקומות שלמגבת נייר.
  3. כדי להסיר את האשכים, זכרים מורדמים לערוף ראשונים באמצעות מספריים לנתח או סכין גילוח, ולעשות חתך אורכים לאורך הבטן עם לנתח scissors.Under מיקרוסקופ לנתח עם מקור אור מוחזר, להוציא איברים פנימיים עם מלקחיים לנתח. משוך את כל המוני אשכים עם מלקחיים ומניחים אותם בתוך צינור microcentrifuge המכיל הפתרון של האנק.
    הערה: אשכים ניתן לזהות כל אחד משני מבנים מאורכים של מראה שקוף נמצאו לצד קירות הגוף ואשר להתכנס ליד הביב. אשכים יכולים להישאר 2-3 דקות על משטח צלחת פטרי לאחר דיסקציה ולפני הצבה הפתרון של האנק.
  4. שחרר את הזרע לתוך התמיסה ידי מריחת האשכים עם מרית צרה ו / או בעדינות pipetting למעלה ולמטה 5-6 פעמי האשכים בתמיסה עם micropipette μl-קצה 1,000, תוך הימנעות היווצרות בועת אוויר. תנו להתיישב פסולת האשכים.
  5. אחסן את הפתרון זרע בקרח, שם הוא יכול לשמור העוצמה שלה עד 2-3 שעות. אם שימשיך UV-טיפול של פתרון זרע, להעביר את הפתרון לתוך צינור נקי microcentrifuge עוזב את החתיכות של אשכים מאחור.

3. UV טיפול

הערה: טיפול UV משמש crosslink DNA זרע כדי להבהיר את זה פעיל בעובר. צעד זה משמש רק כאשר יצירת עוברים דיפלואידי gynogenetic הפלואידים או הומוזיגוטים gynogenetic. פתרון זרע טיפול UV יש להפריד מפיסות של אשכים (שלב 2.4), כמו חתיכות גדולות עשויות לגונן מזרע טיפול UV.

  1. מעביר את פתרון הזרע אל באר נקי ויבש צלחת זכוכית דיכאון יושבת על מיטת קרח (קרח למשל בתוך צלחת פטרי). אין להשתמש ביותר מ 1 מ"ל של תמיסת זרע לכל צלחת זכוכית היטב.
  2. לחשוף את פתרון זרע UV על ידי נחת צלחת זכוכית דיכאון על מיטת הקרח תחת מנורת UV. פנק את פתרון הזרע למשך 90 שניות עם 115 וולט (60 רץ0.68A,) UV מנורה בכל 19 סנטימטר (7.5 אינץ ') מרחק. עם סיום קצה פיפטה, לערבב בעדינות הפתרון כל 30 שניות במהלך טיפול UV (להשתמש קצה פיפטה נקי כל 30 שניות).
  3. בעזרת קצה ו micropipette pipet נקי, להעביר את פתרון הזרע שטופל לצינור microcentrifuge חדש. חנות על הקרח עד הצורך עבור IVF (לא יותר מ 2-3 שעות של מיצוי).

4. שחול ידני של ביציות בשלות

הערה: נקבות מתקבלות על ידי הפרעה של הזדווגויות טבעיות יניב ביצים בקלות מורדמות לחץ ידני. במהלך הליך זה, טיפול tricaine צריך להיות מבוקר בקפידה כדי להימנע מחשיפת יתר שעשויה למנוע שחזור של הנקבות.

  1. להרדים נשים על ידי חשיפה לאור פתרון tricaine: נקבות העברה עם נטו tricaine פתרון במים מותנים (מיוצר על ידי הוספת 8 מיליליטר של פתרון מניות Tricaine 0.2% ל -100 מיליליטר מי דגים מותנים) במשך כ 2-5 דקות, עד להפסיק דגים תנועת הזימים.
  2. <li> ברגע נקבה עוצרת את תנועת זימים, בעזרת כף לאסוף אותו בקצרה לשטוף אותו במים מותנים. ובכל זאת באמצעות כפית להעביר את הדגים, לייבש אותו קלות על ידי הצבתו בקצרה שוב ושוב בכמה מקומות של מגבת נייר, ולאחר מכן להעביר אותו לצלחת פטרי בקוטר נקייה ויבשה 10 ס"מ. מתקרבים דגים בכפית הקדמי לכיוון האחורי, כדי למנוע נזק operculum הזימים פוטנציאלי.
  3. השתמש מגבונים במעבדה או רקמות רכות להמשיך בעדינות לייבש את אזור הסנפיר משית, כדי למנוע כל ביצים שוחררו מלהיות מופעל בטרם עת על ידי מים. שופכת מים קרים על האצבעות במעט מים (כדי למנוע מהם דבקות קשקשי דגים), צב אצבע אחת של יד אחת על הגבה של הנקבה כתמיכה, ועם אצבע של היד השנייה להפעיל לחץ קל לאורך של בטן הנקבה עד הביצים להיות מעוקמות.
  4. השתמש מרית צרה לעבור את הביצים מהגוף של הנקבה. מניח את הנקבה חזרה לתוך מיכל עם מים מותנים להתאוששות.
  5. הפעל (עם חשיפת מים) ולדשן (עם תוספת פתרון זרע) ביצים בו זמנית תוך 90 שניות לאחר שהחול (ראה סעיף 5).

5. הפריה חוץ גופית

הערה: הפרית דג זברה ב צלבים טבעיים הוא חיצונית, תלוי בשחרור סימולטני הפעלה על ידי מים של ביציות ותא זרע בעת ההזדווגות. בשנת מחקה הפריה חוץ גופית תהליך זה על ידי חשיפת הביצים פתרון הזרע בנוכחות מים. נפח המים הוא קטן במקור (1 מ"ל) על מנת להגדיל את ריכוז הזרע יעיל. כריכה ידי זרע מתרחשת בתוך 15-20 שניות 10 </ Sup>, ונפח המים ניתן להגדיל מכן. סיסי הרמת תורם בהמשך הסנכרון הקרוב של המצמד על ידי הגבלת החלון לכישורים עבור זרע מחייב 11,12. עובר וכתוצאה מכך ולכן להפגין מחזורי חלוקת תא בו זמנית בעיקר בשלבים המחשופים מוקדם.

  1. הוספת 100 μl של פתרון זרע (המקביל ל המקביל של אשכים מזכר אחד - ראה חלק 2) אל מקבץ ביצים מעוקמות על צלחת פטרי. מערבולת בעדינות את קצה פיפטה המשמש להוספת הפתרון הזרע בקרב ביצים לערבב את הזרע וביצים יחד, להיות בטוח שלא להרים את קצה מפני השטח של צלחת פטרי כדי למנוע נזק ביצה.
  2. מייד להפעיל את הביצים על ידי הוספת 1 מיליליטר של מדיום עוברי (E3) פתרון (מים מותנים מקובלים גם כתחליף E3 בחלקים 5 עד 7) ושוב לערבב בעדינות ביצים וזרע ידי מתערבל בעדינות עם קצה פיפטה. התחל טיימר ליזום ביחס תזמון כדי הפריה. בשעה 1 MPF בהיקף 1 מ"ל, להציף את צלחת עם E3. לפני שתמשיך, לעזוב באין מפריע עד 10-12 MPF לאפשר הפעלת ביצה, ובכלל זה, הרחבה סיסית מלאה.

6. טיפול הלם חום

הערה: זעזוע חום שיושמו העובר המוקדם מעכב שכפול צנטריול, וכתוצאה מכך מהווה השלמה חלקית של צנטריול לנהוג היווצרות ציר במהלך מחזור התא שלאחר מכן 2. עדר הציר בתוצאות פונים חוסר תלם היווצרות 13.

  1. לאחר התרחבות של chorions (10-12 MPF), יוצקים את העוברים מהצלחת פטרי לתוך מסננת תה. יש לשטוף את צלחת פטרי באמצעות בקבוק לשטוף עם E3 כדי לאסוף כל העוברים הנותרים ב מסננת תה.
  2. מניחים את מסננת תה עם העוברים בתוך מבחנה באמבט מחומם מראש עם E3 על 28.5 מעלות צלזיוס. טרום לאזן את הכוס E3 לטמפרטורה באמבט מים, וודא שיש מספיק E3 כך שכל העוברים תהמסננת נחשפת המדיום.
  3. בגיל 22 MPF, להסיר את מסננת תה מן האמבטיה במים 28.5 מעלות צלזיוס, בקצרה למחוק אותו על מגבת נייר כדי להסיר עודף לחות, ולמקם אותו בתוך מבחנה E3 שחומם מראש באופן דומה באמבט חום 41.4 מעלות צלזיוס.
  4. בגיל 24 MPF, להעביר את מסננת תה חזרה אל E3 באמבט מים על 28.5 מעלות צלזיוס לאחר סופג קצר. בגיל 29 MPF, השתמש בקבוק לשטוף עם E3 להעביר את העוברים מן מסננת תה לצלחת 10 ס"מ פטרי.

בחירת 7. עוברים עם דוכן אחד מחזור cytokinesis

  1. בזמן התקופה 35-45 MPF, תחת מיקרוסקופ לנתח עם מקור אור מועבר, בחר אלה העוברים עוברים מחשוף סימטרי לשלב 2 תאים, ולפיכך הן מופרות. סר עובר כי אינם עוברים מחשוף תא.
  2. המשך ההתבוננות עוברת המופרית, שנבחר על חלוקת תא נורמלית במהלך מחזור התא הראשון, ובמהלך השניותond מחזור התא (50-65 MPF).
  3. עובר מיון לפי הקטגוריות הבאות (איור 2 ג): 4 תאים ( "אין דוכן", ב 2: תקן הסדר 2 עבור עובר 4 תאים); 3 תאים ( "דוכן חלקי", בתוך תאים קטנים 2 סוטים: 1 סידור תאים גדול); ו -2 תאים ( "נתקעו", עובר מפגין עיכוב מחזור אחד תאים ביחס של 1: 1 הסדר זהה לזה של עובר 2 תאים). מיין את העוברים נתקעו לתוך צלחת פטרי טריה.
    הערה: בשלב זה, עובר ב 2: הסדר 2 מתאימים לאלה בם במהלך מחזור התא השני לא blastomere עבר דוכן חלוקת תא; עובר בתוך תאים קטנים 2 סוטים: 1 סידור תאים גדול מתאים שבהם הלם חום גרם דוכן מחזור התא במהלך מחזור התא השני blastomere אחד אך לא באחר; עובר "נתקע" ביחס של 1: 1 הסדר מתאים לאלה בן במהלך מחזור התא השני הוא בלסטומרים עברו חלוקת התא הרצויהדוּכָן. עובר רפת צריך לחדש מחשוף תא בתקופת מחזור התא הבאה (65-80 MPF). ההסדר של בלסטומרים עשוי להיות משתנה, בשל הרמזים השלמים ממעגל התא הקודם לייצב את 2,14 הציר, אבל רוב העוברים יהוו blastula נורמלי יחסית שיכול לעבור התפתחות תקינה.
  4. אפשר העוברים לפתח בצלחת פטרי, עם הגבלה של 80 עוברים לכל 10 צלחת ס"מ. בגיל 24 hpf, לצפות בעוברים כדי לקבוע אם יש להם מאפיין מורפולוגיה תקינה של עוברים דיפלואידי דיפלואידי או הומוזיגוטים 6 (במידה רגילה של ההארכה ציר (איור 3 א, 3 ג)), בניגוד הרחבה ציר מופחת מאפיין עובי גוף מוגבר haploids (איור 3 ב)), ו / או להעריך diploidization באמצעות סמנים גנטיים פיגמנט ב 36 MPF, כגון זהב או לבקנים מבחנים כגון אחרים (איור 3 ו ראה להלן) 2,6,9. הסר את כל עוברים שנראים יש מורפולוגיה הפלואידים, או כי יש lysed או שהם משקפים אחרים פגמים גסים נורמלים.
    הערה: אם תרצה, לאפשר עובר לפתח עד 5 ימים לאחר הפריה, תוך המשך להסיר lysed או גס נורמלי עובר על בסיס יומי והוספת E3 טרי כדי לרענן את המדיום. הערה: עובר שורד יכול להיות גם גדל לאחר אינפלצית swimbladder ביום 5 על ידי העברה למערכת מדגרת ההאכלה בתנאים סטנדרטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

למרות דוכן cytokinesis מחזור חד-תאי, שכפול ה- DNA מתרחש בדרך כלל עובר כאלה, וכתוצאה מכך שכפול של תוכן DNA של העובר (איור 1). פרוטוקול הלם חום Streisinger (HS הרגיל) כרוך דופק חום במהלך הפרית תקופת 13-15 דקות (MPF) ומשרת מעצר cytokinesis בעיקר במהלך חלוקת התא העוברית הראשונה ב 35 1,2 MPF, ואילו השיטה הנגזרת מתוארת כאן, המכונה 2 הלם תרמי (HS2), משתמש הלם חום במהלך MPF התקופה 22-24 ומשרת מעצר cytokinesis במהלך חלוקת התא העוברית שני ב 50 MPF (איור 2; 2,3,4). בגיל 24 hpf, תצפית של העוברים לאפשר לקבוע אם יש להם מאפיין מורפולוגיה תקינה של עוברים דיפלואידי דיפלואידי או הומוזיגוטים, או בגוף קצר ורחב ציר מאפיין מורפולוגיה של עוברים הפלואידים (איור 3) 2. בחירת הקווים ידי התפשטות באמצעות שיטות gynogenetic הוכחה להגדיל את התשואה של ייצור דיפלואידי הומוזיגוטים 1. אישור של שכפול הגנום כולו מדויק הצפוי לנבוע עיכוב של מחזור mitotic אחד ניתן להשיג על ידי ספירת כרומוזום 2,3,4,15 או לכמת את קוטר הגרעין 3,4. התפתחות תקינה של דג זברה כמו בעלי חיים אחרים היא רגישה מאוד למספר כרומוזום ליקויי 16, ואת התצפית כי diploids הומוזיגוטים להיות נמבוגרים iable ופורה 1,2,9 מספק ראיות נוספות עבור diploidization מוצלח. Ploidy בעובר דג הזברה ניתן לעמוד גם באמצעות שיטות מולקולריות כגון ניאון הכלאה באתרו (FISH) של ספירת הגן גרעיני תא ניאון מיון מופעל (FACS) לכמת תוכן DNA 16.

איור 1
איור 1: סוגי הפריה. (א) להזדווגות. הגמטות זכר ונקבה הם לא מטופלים, וכתוצאה מכך דיפלואידי טבעי. (ב) הזרע מטופל עם UV, וכתוצאה מכך להרס של DNA האבהי ואת הייצור של zygotes הפלואידים. אם לא מטפלים, haploids כאלה אינם שורדים בעבר יום 2-3 של פיתוח. (C) טיפול zygotes הפלואידים עם 2 הלם תרמי (HS2) מעכב מחזור אחד cytokinesis של מיטוזה בעובר המוקדם. מחזור התא זה דוכן, זוגד כדי שכפול הדנ"א מעושה, מייצר diploids הומוזיגוטים שיכול להיות מבוגרים קיימא ופורה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: HS2 מקדם שכפול הגנום כולו על ידי השתהות מחזור התא השני. (א) מחשוף Cell דפוס של עובר מטופל בשלושה מחזורי התא הראשונים, המקביל ל 2, 4, ו -8 תאי עוברים. (ב) תוצאות הטיפול HS2 בתא אחד-מחזור של חלוקת תאים במהלך מחזור התא השני. במהלך הדוכן, תוצאות סינתזת DNA מתמשכות עוברים עובר diploidization, משני הפלואידים כדי דיפלואידי (n -> 2n) או דיפלואידי כדי tetraploid (2n -> 4n) (ראה טקסט). לאחר דוכן זה, העובר יתחדש חלוקת התא, עם newly רכשה ploidy. (C) HS2 שטופל עובר יכול להפגין מגוון של סדרי blastomere בהתאם אם בלסטומרים להפגין עיכוב חלוקת תאים במהלך מחזור התא השני: i) "אין דוכן": לא מייצג blastomere עיכוב, וכתוצאה מכך 2: מאפיין הסדר -2 4 תאים עוברים שלב, ii) "דוכן חלקי": רק באחת משני בלסטומרים מפגין עיכוב, ותוצאה הוא 2 סוטה: הסדר 1, ו- III) "נתקע": הן בלסטומרים להפגין עיכוב, וכתוצאה מכך 1: 1 מאפיין סידור עובר שלב 2 תאים. ב - ג), גרעינים מיוצגים עיגולים כחולים, עם האירוע diploidization מיוצג על ידי הרחבה של גודל הגרעין. ראה התייחסות 2 עבור תרשים המתאר התנהגות centriolar כבסיס המוצע עבור דוכן חלוקת התא. אנא לחץ כאן כדי להציג versi גדולעל של נתון זה.

איור 3
איור 3: מורפולוגיה של diploids טבעי, haploids ו gynogenotes. (א) מורפולוגיה עוברית רגילה של דיפלואידי שהושג באמצעות צלבים טבעיים. (ב) עובר הפלואידים מפגינים ציר גוף קצר ורחב יותר. (C) diploids הומוזיגוטים יש מורפולוגיה גוף תקינה. עובר גם לשאת מוטציה רצסיבית של זהב גן הפיגמנטציה כדי להקל על מעקב ירושת DNA הורית: אמהות הם נישאים הומוזיגוטים מוטצית זהב, ואבות wild-type עבור הגן הזה. לפיכך, diploids הטבעי, הטרוזיגוטיים זהב, תערוכת פיגמנטציה wild-type, ואילו הן haploids (hemizygous עבור זהב) ו diploids הומוזיגוטים (הומוזיגוטים זהב) תערוכת פיגמנטציה מוטציה. סרגל קנה מידה = 0.5 מ"מ. לוחות שונים מן מחדשference 2, מודפס ברשות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פִּתָרוֹן רכיבי תנאי אחסון
פתרון 'הנקס 1 8.0 גרם NaCl, ו
0.4 גרם KCl ב 100 מ"ל DDH 2 O
חנות ב 4 מעלות צלסיוס
הפתרון 'הנקס 2 0.358 גרם נטול מים Na 2 HPO 4, ו
0.6 גרם KH 2 PO 4
ב 100 מ"ל DDH 2 O
חנות ב 4 מעלות צלסיוס
פתרון 'הנקס 4 0.72 גרם CaCl 2
ב 50 מ"ל DDH 2 O
חנות ב 4 מעלות צלסיוס
הפתרון 'הנקס 5 1.23 גרם MgSO 4 ∙ 7H 2 O
ב 50 מ"ל DDH 2 O
חנות ב 4 מעלות צלסיוס
Premix של האנק להוסיף, לפי הסדר הבא:
10.0 מ"ל פתרון 1,
1.0 מיליליטר פתרון 2,
1.0 מיליליטר פתרון 4,
86.0 מ"ל ddH2O ו -1.0 מ"ל פתרון 5
חנות ב 4 מעלות צלסיוס
פתרון 'הנקס 6 0.33 גרם NaHCO 3
ב 10 מ"ל DDH 2 O
הכן טרי בבוקר של הליך ההפריה החוץ-גופית

טבלה 1. הכנת פתרונות של האנק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

צעדים קריטיים

זה קריטי לעבוד בתנאים של יעיל הפריה חוץ גופית. כדי להבטיח אספקה ​​טובה של ביציות בשלות (שלב 1), נקבות להגדיר עבור הזדווגות לא היה צריך להגדיר ב צלבי הזדווגות במשך 5 ימים לפחות, והיא אמורה להופיע הרה. במהלך ההפרעה של רבייה, משקיף יכול לפקח 15-30 טנקים מספקים ההופעה הראשונה של שחול ביצה טבעי. הפרעה של הזדווגות אמורה להתרחש בהקדם האפשרי כאשר הביצים הראשונות משתחררות דרך הזדווגויות טבעיות, על מנת לאפשר ביותר הביצים להישאר בתוך הנקבות עבור תהליך ההזרעה המלאכותי. נקבות אלו, אשר מוכנות כעת עבור שחול ידני של ביציות בשלות, יכולות להישמר מופרד עד שעה 2 ללא השפעה נראית לעין על שחרור ביצה שלאחר מכן. כדי להכין פתרון זרע יעיל (שלב 2), זכרים אמורים להופיע חזקים באופן אידיאלי עם גוון אדמדם, אופייני רביית זכרי דג זברה. לנתיחה נקיה בדרך כלל כרוכה רמהוינג המסלול מעיים על ידי משיכתו כלפי אל האחורי של הגוף, ואת בשלפוחית ​​השחייה ידי משיכתו קדמית. לאחר הסרת איברים פנימיים מרכזיים, האשכים להישאר המונים מוארכים שקופים כמו זו לצד זו בצד של קיר הגוף הפנימי. הימנע כולל איברים לא רצויים (כגון מעיים) לתוך תמיסת הזרע; במידת הצורך להפריד אלה מן האשכים ע"י עבודה על משטח צלחת פטרי יבש לפני שיוצבו לתוך התמיסה של האנק. כדי להשיג קצבי הפריה גבוהים במהלך ההפריה חוץ הגופייה (שלב 4), זה הכרחי כי ביצים מעוקמות נשמרות המוסמכת עד בנוסף זרע. ביצים מוסמכות נגד תערוכת הפריה בנימה מעט צהובה והם שקופים. הימנע ביצים כל מגע עם מים לפני תוספת זרע, מאז מים יפעילו הפעלת ביצה והפעלה מוקדמת ימנעו הפריה. הפעלה והפרית מים אמורות להתרחש בתוך 90 שניות של שחול מן הנקבה כדי למנוע התייבשות של ביצים, אשר תהיינהלהוביל השפלה שלהם. במידת הצורך, יכולות להישמר ביצים מעוקמות לפרקי זמן ארוכים יותר (עד 1.5 שעות או יותר) ב 100-200 μl של הפתרון של האנק בתוספת 0.5% שור הסרום אלבומין (BSA) 17 (בעת הכנת הפתרון של האנק למטרה ספציפית זו, להכין premix לתקן תכולת המים הוסיף במהלך תוספת BSA). אם נשמרו ביצים מוסמכות בעזרת פתרון BSA של האנק, להסיר BSA של האנק העודף מן הביצים באמצעות micropipette ולדשן בתוך דקות 1.

שלב קריטי להצלחת diploidization באמצעות HS2 הוא המיון של עוברים נתקעו (שלב 7). מיון ראשוני של ביקוע 2 תאים עוברים באופן סימטרי בוחר עבור עוברים שהופכים מופרה ולהתחיל חלוקת תא (dispermy מדי פעם במהלך תוצאות IVF בעוברים כי מעבר ישירות 1- 4-תאים ב 35-50 MPF - עובר כזה צריך להיות מושלך). רכיבה על אופני Cell מתרחשות כל 15 דקות במהלך העוברי המוקדם אלה stגילים (35-50 MPF עבור מחזור התא הראשון, 50-65 MPF עבור מחזור התא השני, וכן הלאה), כך המיון של ביקוע עובר במהלך 10 הדקות הראשונות של כל מחזור תא מבטחים היעדר החפיפה בין מחזוריים ומדויק זיהוי של דוכן חלוקת התא.

שינויים ופתרון בעיות

כוחו של טיפול UV בשלב 3 (למשל זמן החשיפה, מנורת חשמל, מרחק מנורה) יכול להיות מותאם במידת הצורך על ידי בדיקת שיעורי הפריה הראשונית וכן תדירות haploids בהעדר טיפול עוקב HSII: את הסכום הנכון של חשיפת UV אין השפעה ניכרת על שיעורי הפריה תוך וכתוצאה מכך 100% של עוברי הפלואידים (ראה תוצאות נציג להבחין הפלואידים מעובר דיפלואידי). חשיפה UV יותר מדי גורם שיעורי הפריה מופחת ככל הנראה בשל השפעות מזיקות על תפקוד הזרע, תוך חשיפה UV מספיק מייצרת עוברים דיפלואידי בשל to איון שלם של DNA זרע.

אם עובר להפגין פגמים התפתחותיים או קטלני לאחר חידוש מחשוף תא (שלב 7), טמפרטורת הלם חום בשלב 6 ניתן להפחית מעט (למשל 41.0 ° C) להגדיל הישרדות עובר; תנאים לגרום שברים שווים של 3 תאים סוטים נתקעו עובר 2 תאים במהלך מחזור התא השני (ולכן הם ליד סף השפעה על שכפול centriolar) לגרום מומים התפתחותיים עוקבים מינימאליים וגדילת הישרדות לאחר חידוש אופני תא .

שיטת משלבת HS2 מנגנון נוח מהותי להעריך דוכן חלוקת תא (ולכן שכפול הגנום כולו), מאז תצפית הישירה של עובר כאשר הם מפתחים מאפשרת מעקב מחזור התאים השונים. בחירה ידנית של עוברים שעברו דוכן חלוקת מחזור אחד התאים מאפשרת יצירת אוכלוסייה אחידה של העובר diploidizedים. HS2 יכול להתבצע בכל זן גנטי דג זברה (למשל AB, טובינגן, WIK), כמו מעשי דוכן חלוקת תא אחד כמנגנון פנימי כדי לאשר שכפול ה- DNA. בנוסף, סמנים גנטיים גלוי מוחדר המתח ניתן להשתמש כדי להקל על זיהוי של עוברים diploidized (איור 3). לדוגמה, השימוש ביצים מנקבות כי הם הומוזיגוטים מוטציות רצסיביות בגנים פיגמנטציה, כגון זהב או לבקנים, ניתן לשלב עם הזרע נגזר wild-type זנים נושאת אללים נורמליים עבור גן הפיגמנטציה אותו. במצב זה, כי הזרע UV שטופלו לא יכול לתרום אללים פיגמנט wild-type, עוברים דיפלואידי הפלואידים ו הומוזיגוטים להפגין את המוטציה פיגמנט רצסיבי. בנוסף, diploids הומוזיגוטים להפגין מורפולוגיה wild-type ב 24 hpf, בניגוד חריף המורפולוגיה הפלואידים המורחבת פחות. השילוב של המראה של התכונה האימהית רצסיבי ואת אמברי הכוללתo מורפולוגיה מאשרת שכפול ploidy מוצלח. ניתן להשיג אישור נוסף באמצעות ספירת כרומוזום של עוברי מטופלים ואינם מטופלים.

מערכת הסימון הגנטית המתואר לעיל, מבוסס על סמנים גנטיים גלויים רצסיבי, גם מאפשרת המאשרת בהעדר DNA שמקורם זרע הצאצאים, מאז העוברי וכתוצאת תערוכת פיגמנטציה wild-type רק אם הזרע לא כבר מומת באופן מלא על ידי טיפול UV . בהעדר מערכת סימון גנטי, מדגם של עוברים ניתן לאפשר להם להתפתח על בהעדר הלם החום כדי לאשר כל העוברים להפגין את המורפולוגיה הפלואידים ב 24 hpf, ובכך איון DNA זרע, שהיה שלם. יחד עם זרע מומת באופן מלא, מערכת סימון גנטית זהה זה גם מאפשר איתור כישלון גוף קוטב ספונטני פוטנציאלי. אירוע כזה יגרום להופעת עוברים המסומנים recessively עם מורפולוגיה דיפלואידי ללא טיפול diploidization. bo הקוטב ספונטניכישלון dy לא נצפה דג זברה אבל מדווח tropicalis Xenopus 18. אם נוכח מערכת נתונה, אירוע ספונטני זה יצטרך להיות מופחת או נשלט על מנת ליישם מניפולציה ploidy בצורה אופטימלית.

מגבלות הטכניקה

היכולת להפיק gynogenotes הקיימא מסתמכת על ההיעדר וריאנטים גנטיים רקע כאשר הומוזיגוטים הם מזיקים. לפיכך, ההצלחה של ההליך ישתנה בהתאם לזן הגנטי בשימוש. מבחר זנים גנטיים דרך מספר דורות של gynogenesis הוכח לשפר כדאיות 1.

שיטת HS2, הפועל בשיתוף עם זרע מטופל לייצר עובר דיפלואידי, גם מאפשרת ייצור של עבר tetraploid בתדר גבוה. עם זאת, במקרה זה, בשל דיפלואידי לטרנספורמציה tetraploid, סמנים גנטיים אינם מאפשרים בקלות לאישור של כל genomשכפול דואר. במקרה זה, תצפית של דוכן מחזור תא אחד בעוברים מסונכרנים ובחירה עוברת נתקעו צריכה להבטיח מבחר tetraploid, וספירת כרומוזום ניתן להשתמש כדי לאשר עוד ploidy.

משמעות ביחס קיים / שיטות חלופיות

למרות שתואר על ידי Streisinger למעלה מ -40 שנים לפני 1, שיטת HS הרגילה לא נעשתה שימוש נרחב בשל יבול דל. במקום זאת, מניפולציה ploidy כמעט הסתמכה אך ורק על החלופה ויחסית יותר שיטה יעילה של לחץ מוקדם, שתוצאתה שכפול ploidy באמצעות עיכוב של חלוקת meiotic שנייה. עם זאת, תוצאות לחץ מוקדם בפרופורציות משתנות של הגן homozygosity 9,19, אשר מפחית מערכו ככלי גנטי. מחקרים אחרונים מראים כי HS2, שינוי של פרוטוקול HS רגיל, כלומר היישום של הדופק חום בזמן אחר במהלך מחזור התא הראשון (22-24 תקופת MPF ב HS2, לעומת 12-14 MPF ב HS רגיל) התוצאה עד 4 פעמים מגידול בתשואה של הפקות דיפלואידי הומוזיגוטים.

הפעולה של דופק החום ניתן להסיק להתרחש מכוח העיכוב של שכפול צנטריול בתקופת הלם חום (22-24 MPF, במהלך מחזור התא הראשון) ועל כן חסרה את המשלים הנכון כדי ליצור ציר לתווך חלוקת התא במהלך מחזור התא הבא (50-65 MPF, התואם את מחזור התא השני). שכפול צנטריול יכול לחדש בהעדר ההלם החום במהלך מחזורי תא עקב, המאפשר פיתוח להמשיך לאחר דוכן מחזור אחד תאים מדויק. בגלל מחזורי שכפול שכפול ה- DNA צנטריול תלויים זה בזה 20, שכפול הדנ"א ממשיך כרגיל גם במהלך חלוקת נתקע במחזור התא השני. התוצאה היא שכפול הגנום כולו מדויק homozygosis המלא.

יישומים עתידיים

= "Jove_content"> מניפולציה ploidy הוא שיטה נוחה כדי להקל על ניתוח גנטי. בפרט, הצימוד של ייצור עובר הפלואידים (באמצעות הפריית מבחנה עם זרע UV שטופל) ושכפול ploidy (דרך HS2) מאפשר הישיר (בדור אחד) homozygosis בחלק גדול וקבוע (50%) של מוטציות נוכחות נקבה הטרוזיגוטיים. זה בתורו עוזר דורות מעקף נוספים אשר יידרשו להגיע homozygosis באמצעות צלבי טבע, צמצום כמות השטח הדרוש תוכניות גנטיות כזה. שיטה כזו יכולה להקל תוכניות גנטיות כגון מסך גנטי, בפרט אלה שיחייבו מספר דורות המעורבים מבוגרים ו / או גנים הורי ותוצאה, או אלה הקשורים אללים מרובים, כגון מסך מדכא / משפר 21.

גישות דומות HS2 ניתן ליישם מינים אחרים בהפריה חיצונית, גם אלה כרגע לא בשימוש כמו מערכות גנטיות. שיטה זובפרט מנצל שמשך הזמן שעוברים הפריה באמצעות הייזום של אופני blastomere שבו דופק חום יכול להשפיע שכפול צנטריול וליצור דוכן חלוקת תא מדויק שכפול הגנום כולו מבלי לייצר תופעות התפתחותיות מזיקות. לפיכך, פרק הזמן מוקדם זה יכול להיחקר על רגישות הלם חום לפתח שיטות גנטיות מבוסס מניפולציה ploidy במערכות חיה אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
Na2HPO4 Sigma S3264
KH2PO4 Sigma P9791
CaCl2 Sigma C7902
MgSO4-7H2O Sigma 63138
NaHCO3 Sigma S5761
Tricaine Western Chemical Tricaine-D (MS 222) FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base Sigma 77-86-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl Sigma 920-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in) PennPlax (ThatFishThatPlace # 212370) available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon available in most standard stores
Dissecting scissors Fine Science Tools 14091-09
Dissecting forceps Dumont SS available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) Nikon SMZ645 or equivalent
Reflective light source (LED arms) Fostec KL1600 LED or equivalent
Petri plates 10 cm diameter any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml any maker
Ice bucket any maker
Pipetteman P-1000 any maker
Pipette tips 1,000 µl any maker
Narrow spatula Fisher 14-374
Depression glass plate Corning Inc 722085 (Fisher cat. No 13-748B) available from Fisher Scientific
UV lamp UVP Model XX-15 (cat No. UVP18006201) available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses any maker
Paper towels any maker
Kimwipes Kimberly-Clark 06-666-11 available from Fisher Scientific
Timer stop watch any maker
Wash bottle Thermo Scientific 24020500 available from Fisher Scientific
Tea strainer available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2) Corning Inc. 1000250 available from Fisher Scientific
water bath (2) any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1 see above see above 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2 see above see above 0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C.
Hanks’ Solution 4 see above see above 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C.
Hank's Premix see above see above add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C
Hanks’ Solution 6 see above see above 0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution) see above see above Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
  2. Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
  3. Zhang, X., Onozato, H. Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one. Aquaculture. 240, 101-113 (2004).
  4. Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus). Theriogenology. 68, 873-881 (2007).
  5. Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever. Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).
  6. Walker, C. The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. Academic Press. 43-70 (1999).
  7. Blanco-Vives, B., Sánchez-Vázquez, F. J. Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish. Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).
  8. Dekens, M. P. S., et al. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).
  9. Pelegri, F., Schulte-Merker, S. The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. Academic Press. 1-20 (1999).
  10. Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin. Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).
  11. Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. When a sperm meets an egg: block to polyspermy. Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).
  12. Wong, J. L., Wessel, G. M. Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy. Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).
  13. Rappaport, R., Rappaport, B. N. Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle. J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).
  14. Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).
  15. Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication. Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).
  16. Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).
  17. Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).
  18. Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).
  19. Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112, 311-319 (1986).
  20. Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -M., Nüsslein-Volhard, C. The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote. Development. 130, 3907-3916 (2003).
  21. Pelegri, F., Mullins, M. Met. Cell Biol. Vol. 104. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. 83-120 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics