La manipulación de ploidía de embriones de pez cebra con el Heat Shock Treatment 2

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Developmental Biology

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Summary

Un protocolo modificado para la manipulación de ploidía utiliza un choque de calor para inducir una parada de un ciclo en la citocinesis en el embrión temprano. Este protocolo se demuestra en el pez cebra, pero puede ser aplicable a otras especies.

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Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment. J. Vis. Exp. (118), e54492, doi:10.3791/54492 (2016).

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Abstract

La manipulación de la ploidía permite transformaciones útiles, tales como diploides a tetraploides, o haploides a diploides. En el pez cebra Danio rerio, específicamente la generación de diploides ginogenéticos homocigotos es útil en el análisis genético, ya que permite la producción directa de los homocigotos de una sola madre heterocigotos. Este artículo describe un protocolo modificado para la duplicación de la ploidía en base a un pulso de calor durante el primer ciclo celular, Heat Shock 2 (HS2). A través de la inhibición de la duplicación de centríolos, este método resulta en un puesto de la división celular precisa durante el segundo ciclo celular. La cabina de la división de un ciclo precisa, unida a la duplicación de ADN no afectado, se traduce en la duplicación del genoma entero. Protocolos asociados a este método incluyen huevo y la recogida de esperma, el tratamiento UV de esperma, fertilización in vitro y el pulso de calor para provocar un retraso división ciclo de una célula y la duplicación de ploidía. Una versión modificada de este protocolo se podría aplicarpara inducir cambios de ploidía en otras especies animales.

Introduction

Este protocolo permite la manipulación de la ploidía en embriones de pez cebra, como en la generación de los diploides ginogenéticos homocigotos de haploides ginogenéticos (Figura 1) o la producción de tetraploides. Esto se logra mediante la inducción de un retraso en la citocinesis correspondiente a exactamente un ciclo celular (Figura 2A, 2B). El retardo de tecla de un ciclo en la citocinesis se logra mediante el tratamiento con choque térmico. El protocolo estándar de choque térmico (HS) como se describe originalmente por Streisinger y colegas involucrado un pulso de temperatura durante el período de 13 a 15 MPF, resultando en un puesto de la división celular de un ciclo durante el primer ciclo celular 1. La eficiencia de este protocolo se ha mejorado recientemente mediante el escaneo de los ciclos tempranos de la célula con una ventana temporal de deslizamiento de tratamiento de choque térmico. Esta exploración identificado un punto de tiempo más tarde para un choque térmico, todavía dentro de la primera del ciclo celular (22-24 MPF), que resulta en una mayor tasa de EMBRyos con un puesto de la división celular de un ciclo, que en este caso afecta al segundo ciclo celular 2. La observación de que las manipulaciones experimentales durante el primer ciclo celular interfieren con la división celular durante el segundo ciclo celular y causan ADN duplicación de contenido también se ha informado en otras especies de peces 3,4. Nos referimos a este protocolo modificado como Heat Shock 2 (HS2 - el término "2" indica que el impulso de calor se produce en un momento más tarde que el método uniforme del SA, y que el retraso del ciclo celular causada por HS2 se produce durante el segundo ciclo celular ). Estos estudios mostraron que la base de detención citocinesis después de choque térmico es la inhibición de la duplicación centriolo durante el impulso de calor, lo que afecta a la formación del huso y la inducción surco en el siguiente ciclo celular. Resultados de HS2 en los rendimientos de la detención del ciclo celular se acercan al 100%, y las tasas de ploidía la duplicación hasta 4 veces más altos que la norma 2 del SA.

ingenio embriones tratadosja choque térmico durante el ciclo celular blastómeras presentan muchos efectos nocivos, lo que sugiere que el choque térmico afecta a múltiples procesos necesarios para la división celular 2. Por otra parte, si se aplica el choque térmico antes de la iniciación de ciclo celular (período de tiempo de 0-30 MPF), que parece tener efectos consistentes con la interferencia específica con la duplicación centriolo y no parece afectar a otros procesos celulares esenciales 2 . Estos estudios mostraron que el tiempo antes de la iniciación de la división de blastómeros que parece ser un período de desarrollo susceptibles a la utilización de choque térmico como una herramienta para manipular específicamente ploidía través de la inhibición de centríolos. La causa subyacente de la selectividad aparente para el choque de calor en la duplicación centríolo es desconocida, pero puede estar relacionado con una degradación selectiva de subestructuras centrosoma observados bajo el estrés por calor en ciertos tipos de células, tales como leucocitos 5.

la sincronización temporal de la de embrionariodesarrollo se logra mediante la fertilización in vitro (FIV). El uso de espermatozoides sin tratar durante resultados de fertilización in embriones diploides que al HS2 inducida por un ciclo de parada citocinesis convertido tetraploide. El uso de espermatozoides con tratamiento UV, que lleva entrecruzamientos que inactivan su ADN, da lugar a embriones haploides ginogenéticos 6, que tras inducida por hsü un ciclo de parada citocinesis convertirse diploides ginogenéticos 2. Debido a la duplicación del genoma completo resultante, las últimas diploides ginogenéticos son homocigotos en cada locus en todo el genoma. Por razones de concisión, nos referimos a ginogenéticos embriones haploides como "haploides", y los embriones diploides homocigóticos ginogenéticos como "diploides homocigóticos". Si viables y fértiles, diploides homocigóticos se pueden utilizar para iniciar líneas estéril y libre de letales. homocigosis directa inducida por HS2 también debería incorporarse fácilmente en el análisis genético o cribados genéticos, ya que los diploides homocigotos de hembras que son portadores heterocigotos de mutlas tasas de exposición ations de homocigosidad en (50%) y altas relaciones de fijos 2.

El siguiente protocolo describe pasos para realizar HS2 e inducir la duplicación ploidía con plena homocigosis. Para la producción de tetraploides, solución de espermatozoides debe ser tratada. Para la producción diploide homocigotos, el esperma debe ser inactivado mediante tratamiento UV. Además, como se describe en la discusión, marcadores de pigmentos visibles pueden también ser usados ​​para facilitar la identificación de los diploides homocigóticos. Compañero de pez cebra principalmente durante las primeras 3 horas del inicio de su ciclo de luz 7, y tanto los adultos como los huevos son sensibles a los ritmos circadianos 8, por lo que para obtener mejores resultados debe producirse la fecundación in vitro dentro de este período de tiempo.

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Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Universidad de Wisconsin - Madison y Cuidado de Animales institucional y el empleo directrices del Comité (IACUC) (Universidad de Wisconsin - Madison Aseguramiento número A3368-01).

1. Selección de hembras en la colección del huevo a través de apareamiento interrumpido

NOTA: protocolos basados en la FIV se basan en la extrusión de huevos maduros de las mujeres a través de la presión manual 9. protocolos anteriores han utilizado las hembras directamente de los tanques o en los apareamientos de pares sin las mujeres se someten a un comportamiento de liberación del huevo, pero sólo una pequeña fracción de estas mujeres (alrededor del 20% o menos, dependiendo de la línea de pez cebra) producen huevos extruidos y competentes en caso de presión manual. En un procedimiento mejorado, las hembras son pre-ordenados para la puesta de huevos por observación visual directa, seguida por la interrupción inmediata de apareamiento. Este procedimiento es muy eficaz, ya que casi todas las mujeres pre-seleccionados a través de este rendimiento de la etapa de apareamiento interrumpido huevos extruidos y competentesde la presión manual.

  1. La tarde anterior al experimento, estableció parejas de apareamiento de la cepa deseada pez cebra en cajas de apareamiento de pez cebra estándar. Mantenga los machos en la misma cámara como hembras separadas físicamente de ellos todavía, ya sea a través de un cuadro de división de apareamiento o colocando el varón menor de un inserto de puesta de huevos y la hembra dentro del inserto.
  2. La mañana del experimento, eliminar la partición física, como de la colocación macho y hembra dentro de la misma inserción puesta de huevos, por lo que comienza el apareamiento.
  3. una inspección visual de los tanques que contienen parejas de apareamiento para detectar la extrusión de huevos durante el apareamiento natural. A los primeros signos de extrusiones de huevo, separados para hombres y mujeres para interrumpir la reproducción. Después de la separación de los machos, mantener las hembras pre-seleccionados ya sea por separado o combinados en el mismo tanque. El uso de múltiples hembras en función del número de embriones deseados (típicamente 50-150 huevos / hembra).

2. Preparación de una solución de esperma

NOTA: FIV rElies sobre la exposición de los óvulos maduros a una solución de esperma. Esta solución puede estar sin tratar, para generar cigotos diploides (que tras el tratamiento HS2 embriones tetraploides convertido) o UV-tratada, para generar cigotos haploides (que tras el tratamiento HS2 se convierten en embriones diploides homocigóticos). Anteriores protocolos de preparación de esperma sugirieron el uso de tubos capilares para recoger la lecha de la región anal de los machos vivos, pero esto fue un proceso ineficaz, ya que sólo una pequeña fracción de los machos produjo lecha 9. El protocolo se presenta a continuación se basa en cambio en la preparación de esperma de los testículos disecados cortados, lo que da resultados más fiables.

  1. Preparar la solución de Hank antes de tiempo como solución de premezcla de una madeja, que comprende de todos los componentes (Soluciones 1, 2, 4 y 5), excepto la solución de bicarbonato de sodio (solución 6). Preparar la solución de 6 fresca y añadir a la mezcla previa la mañana del experimento (Tabla 1). Para hacer la solución de Hanks (solución final, preparar la mañana de laprocedimiento de FIV), se combinan 990 ul de la premezcla de Hank y 10 l de la solución recién hecha 6.
  2. La eutanasia a los hombres por la sobreexposición a Tricaína como una solución de 0,016% en agua acondicionada.
    1. Preparar tricaína como una solución de 0,2% en agua (tampón a pH 7,0 con Tris 1 M pH 9,0) y mantener a 4 ° C. Añadir 8 ml de solución de stock tricaína por 100 ml de agua en un vaso de precipitados, y el uso de una red para transferir los machos a la solución tricaína.
    2. Utilice el equivalente de los testículos de un macho por embrague necesaria para ser fertilizados en un volumen de solución de Hank correspondiente a 100 l por macho (por ejemplo, los testículos de 10 machos recogidas en 1 ml de solución de Hank, para fertilizar 10 embragues con 100 l / embrague).
    3. Confirmar la eutanasia por cese de los movimientos de enmalle durante 15 minutos. Después de la eutanasia, los machos de un vaso de precipitados con una cuchara. Enjuague los machos brevemente con agua acondicionada y secarlos suavemente colocando brevemente en varias ubicaciones de untoalla de papel.
  3. Para quitar los testículos, los primeros sacrificados decapitar a los hombres que usan las tijeras de disección o una hoja de afeitar, y haga un corte longitudinal a lo largo del abdomen con la disección de scissors.Under un microscopio de disección con una fuente de luz reflejada, extraer los órganos internos con pinza de disección. Tire de cada una de las masas testículos con unas pinzas y colocarlos en el interior del tubo de microcentrífuga que contiene la solución de Hank.
    NOTA: Los testículos pueden ser identificados como cada una de dos estructuras alargadas de aspecto translúcido que se encuentran junto a las paredes del cuerpo y que convergen cerca de la cloaca. Los testículos pueden quedarse 2-3 min en una superficie de la placa de Petri después de la disección y antes de colocarlos en la solución de Hank.
  4. Soltar el esperma en la solución por cizallamiento de los testículos con una espátula estrecha y / o suavemente pipeteando arriba y abajo 5-6 veces a los testículos en solución con una micropipeta 1000 l de punta, evitando la formación de burbujas de aire. Dejar depositar los desechos testículos.
  5. Almacenar la solución de esperma en hielo, en los que puede mantener su potencia durante hasta 2-3 horas. Si de proceder a UV-tratamiento de la solución de esperma, transferir la solución en un tubo de microcentrífuga limpio dejando las piezas de testículos atrás.

3. Tratamiento UV

NOTA: El tratamiento UV se utiliza para reticular ADN de esperma con el fin de hacerla inactiva en el embrión. Este paso sólo se utiliza cuando la producción de embriones diploides ginogenéticos haploides o homocigotos ginogenéticos. solución de esperma para el tratamiento UV debe ser separado de piezas de testículos (paso 2.4), como grandes piezas pueden proteger a los espermatozoides del tratamiento UV.

  1. Transferir la solución de esperma a un pozo limpia y seca de una placa de vidrio la depresión se sienta en una cama de hielo (por ejemplo, el hielo dentro de una placa de Petri). Utilice un máximo de 1 ml de solución de espermatozoides por placa de vidrio así.
  2. Exponer la solución de los espermatozoides a la radiación UV mediante la colocación de la placa de vidrio la depresión en la cama de hielo bajo una lámpara UV. Trate la solución de los espermatozoides durante 90 segundos con un 115 V (60 Hz, 0.68A) lámpara UV en un 19 cm (7,5 pulgadas) de distancia. Con el final de una punta de pipeta, mezclar suavemente la solución cada 30 segundos durante el tratamiento UV (utilizan una punta de pipeta limpia cada 30 segundos).
  3. Utilizando una punta de pipeta limpia y micropipeta, transferir la solución de esperma tratado a un nuevo tubo de microcentrífuga. Almacenar en hielo hasta que se necesite para la FIV (no más de 2-3 horas desde la extracción).

4. Extrusión Manual de óvulos maduros

NOTA: Las hembras obtenidas por interrupción de la monta natural rendirá fácilmente los huevos bajo anestesia y la presión manual. Durante este procedimiento, el tratamiento tricaína debe ser cuidadosamente controlada para evitar la sobreexposición que pueden impedir la recuperación de las hembras.

  1. Anestesiar a las hembras por exposición a la luz a la solución tricaína: hembras de transferencia con una red de Tricaína solución en agua acondicionada (hecho mediante la adición de 8 ml de Tricaína 0,2% solución madre a 100 ml de agua de la pecera acondicionado) durante aproximadamente 2-5 minutos, hasta que el tope de pescado movimiento de las branquias.
  2. <li> Tan pronto como una mujer se detiene el movimiento de enmalle, usar una cuchara para recoger y breve enjuague en agua acondicionada. Aún utilizando la cuchara para mover el pescado, secarlo suavemente colocando brevemente y repetidamente en varias ubicaciones de una toalla de papel, y luego transferirlo a un 10 cm placa de Petri de diámetro limpio y seco. Acercarse a los peces con la cuchara en la zona anterior a la dirección posterior, para evitar dañar potencialmente el opérculo branquial.
  3. Usar toallitas de laboratorio o de tejidos blandos para secar suavemente aún más el área de la aleta anal, para evitar cualquier tipo de huevos liberados de forma prematura ser activado por agua. Humedeciendo los dedos ligeramente con agua (para evitar que se peguen a las escamas de pescado), coloque un dedo de una mano en la espalda de la hembra como soporte, y con un dedo de la otra mano se aplica una ligera presión a lo largo del abdomen de la hembra hasta que los huevos se convierten en extruido.
  4. Use una espátula estrecha para mover los huevos fuera del cuerpo de la hembra. Coloque la espalda de la mujer en un tanque con agua acondicionada para la recuperación.
  5. Activa (con la exposición al agua) y fertilizar (con adición de la solución de esperma) los huevos de forma simultánea y dentro de 90 segundos después de la extrusión (véase la sección 5).

5. Fertilización In Vitro

NOTA: la fertilización de pez cebra en los cruzamientos naturales es externo, dependiente de la liberación y la activación simultánea por el agua de los huevos y el esperma durante el apareamiento. En imita de fertilización in vitro de este proceso mediante la exposición de los huevos a la solución de esperma en presencia de agua. El volumen de agua es originalmente pequeño (1 ml) con el fin de aumentar la concentración de espermatozoides eficaz. Encuadernación por el espermatozoide se produce dentro de 15-20 seg 10 </ Sup>, y el volumen de agua a continuación, se pueden aumentar. Corion elevación contribuye aún más a la estrecha sincronización del embrague mediante la limitación de la ventana para la competencia de los espermatozoides vinculante 11,12. Por lo tanto, los embriones resultantes exhiben ciclos de división celular en gran medida simultáneas durante las etapas tempranas de escisión.

  1. Añadir 100 l de solución de esperma (que corresponde al equivalente de los testículos de un macho - véase la Parte 2) para el embrague de huevos extruidos en un plato petri. Hacer girar suavemente la punta de la pipeta se utiliza para añadir la solución de esperma entre los huevos para mezclar el esperma y los huevos juntos, asegurándose de no levantar la punta de la superficie de la placa de Petri para evitar daños huevo.
  2. activar inmediatamente los huevos mediante la adición de 1 ml de solución de embriones medio (E3) (agua acondicionada también es aceptable como un sustituto para el E3 en las partes 5 a 7) y de nuevo mezclar suavemente los huevos y el esperma girando suavemente con la punta de la pipeta. Iniciar un temporizador para iniciar la sincronización relativa a la fertilización. A la 1 MPF en el volumen de 1 ml, inundar el plato con E3. Antes de continuar, dejar reposar hasta 10-12 MPF para permitir la activación del huevo, incluyendo la expansión completa corion.

6. El tratamiento de choque térmico

NOTA: un choque de calor aplicado en el embrión temprano inhibe la duplicación centríolos, dando como resultado un complemento incompleta de centriolos para conducir la formación del huso durante el ciclo celular posterior 2. La ausencia de husillo a su vez resulta en la falta de formación de surco 13.

  1. Después de la expansión de los chorions (10-12 MPF), vierta los embriones procedentes de una placa de Petri en un colador de té. Enjuague la placa de petri usando una botella de lavado con E3 con el fin de recoger los embriones que quedan en el colador de té.
  2. Coloque el colador de té con los embriones dentro de un vaso de precipitados en un baño precalentado con el E3 a 28,5 ° C. Pre-equilibrar el vaso de precipitados y E3 a la temperatura del baño de agua, y asegurarse de que hay suficiente E3 para que todos los embriones en el técolador están expuestos al medio.
  3. A los 22 MPF, retire el colador de té desde el 28,5 ° C baño de agua, se borra brevemente sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de humedad, y colocarlo dentro de un vaso de precipitados E3 precalentado de manera similar en un baño térmico a 41,4 ° C.
  4. A los 24 MPF, transferir el colador de té de nuevo a la E3 en el baño de agua a 28,5 ° C después de un breve Blot. A los 29 años MPF, utilice una botella de lavado con el E3 para transferir los embriones desde el colador de té en una placa de Petri de 10 cm.

7. La selección de embriones con un solo ciclo de Citocinesis Stall

  1. Durante el período de tiempo MPF 35-45, bajo un microscopio de disección con una fuente de luz transmitida, por lo tanto, seleccionar aquellos embriones que se someten a la división simétrica en la etapa de 2 células, y que son fertilizados. Eliminar embriones que no se someten a la escisión celular.
  2. Continuar la observación de los embriones fertilizados, seleccionados para la división celular normal durante el primer ciclo celular, y durante el secEn segundo ciclo celular (50-65 MPF).
  3. Ordenar los embriones de acuerdo con las siguientes categorías (Figura 2 C): 4 celdas ( "sin parada", en el 2: 2 arreglo estándar de un embrión de 4 celdas); 3 células ( "parada parcial", en un aberrantes 2 células más pequeñas: 1 arreglo de células grandes); y 2 células ( "estancadas", los embriones que presenta un retraso del ciclo de una sola célula en un 1: 1 disposición idéntica a la de un embrión de 2 células). Clasificar los embriones estancadas en una placa de petri fresco.
    NOTA: En esta etapa, los embriones en el 2: disposición 2 corresponden a aquellos en los que durante el segundo ciclo celular ni de blastómeros se sometió a un puesto de la división celular; embriones en un aberrantes 2 células más pequeñas: 1 arreglo de células grandes corresponden a aquellos en los que el choque térmico causado una parada del ciclo celular durante el segundo ciclo celular en un blastómero pero no el otro; y embriones "estancadas" en un 1: 1 disposición corresponden a aquellos en los que durante el segundo ciclo celular ambos blastómeros se sometieron a la división celular deseadopuesto. estancadas embriones deben reanudar la división celular durante el período del ciclo celular siguiente (65-80 MPF). La disposición de blastómeros puede ser variable, debido a las señales incompletos de ciclo celular anterior para estabilizar el husillo de 2,14, pero la mayoría de los embriones se formará una blástula relativamente normal que puede someterse el desarrollo normal.
  4. Permitir que los embriones se desarrollen en la placa de Petri, con un límite de 80 embriones por placa de 10 cm. En 24 hpf, observar los embriones para determinar si tienen una característica morfología normal de los embriones diploides diploides o homocigotos 6 (medida normal de la extensión del eje (Figura 3A, 3C)), en contraste con la extensión del eje reducida y el aumento de cuerpo espesor característico de haploides (Figura 3B)), y / o evaluar diploidization el uso de marcadores genéticos de pigmento en 36 MPF, tales como oro o albino y otros tales ensayos (Figura 3 y véase a continuación) 2,6,9. Retire cualquier embriones que parecen tener una morfología haploides, o que han lisadas o exhibir otros defectos muy anormal.
    NOTA: Si lo desea, permitir que los embriones que se desarrollan hasta 5 días después de la fecundación, sin dejar de remover embriones lisadas o gravemente anormales sobre una base diaria y la adición fresca E3 para refrescar el medio. NOTA: Sobrevivir embriones también pueden ser cultivadas después de la inflación vejiga natatoria en día 5 mediante la transferencia a un sistema de incubación y alimentación bajo condiciones estándar.

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Representative Results

A pesar de la parada del ciclo de la citocinesis de una célula, la replicación del ADN se produce normalmente en tales embriones, dando como resultado la duplicación del contenido de ADN del embrión (Figura 1). El protocolo Streisinger choque térmico (HS estándar) consiste en un pulso de calor durante el período de 13-15 minutos después de la fertilización (MPF) e induce principalmente detención citocinesis durante la primera división celular embrionaria a 35 MPF 1,2, mientras que el método derivado describe aquí, el calor se hace referencia como shock 2 (SH2), utiliza un choque de calor durante el periodo 22-24 y MPF induce la detención citocinesis durante la segunda división celular embrionaria a 50 MPF (Figura 2; 2,3,4). A las 24 HPF, la observación de los embriones permite determinar si tienen una morfología característica normal de los embriones diploides homocigotos diploides o, o el cuerpo más corto y ancho eje característico morfología de los embriones haploides (Figura 3) 2. Selección de líneas de propagación a través de métodos ginogenéticos ha demostrado aumentar el rendimiento de la producción diploide homocigotos 1. Confirmación de la totalidad precisa la duplicación del genoma esperado de la inhibición de un ciclo mitótico se puede obtener recuentos cromosómicos 2,3,4,15 o cuantificación del diámetro nuclear 3,4. El desarrollo normal en el pez cebra como otros animales es muy sensible a número de cromosomas anomalías 16, y la observación de que los diploides homocigóticos convertirse viable adultos y fértiles 1,2,9 proporciona evidencia adicional para diploidization éxito. Ploidía en el embrión de pez cebra también se puede evaluar utilizando métodos moleculares como la hibridación in situ fluorescente (FISH) de recuento de genes nucleares y células activadas por fluorescencia (FACS) para cuantificar el contenido de ADN 16.

Figura 1
Figura 1: tipos de fertilización. (A) La monta natural. Los gametos masculinos y femeninos están sin tratar, lo que resulta en un diploide natural. (B) El esperma se trata con UV, lo que resulta en la destrucción del DNA paterno y la producción de cigotos haploides. Si no se trata, tales haploides no sobreviven más allá de los días 2-3 del desarrollo. (C) Tratamiento de cigotos haploides con Heat Shock 2 (HS2) inhibe un ciclo de la citocinesis de la mitosis en el embrión temprano. Esta parada del ciclo celular, parejad para la replicación del ADN no afectado, genera diploides homocigóticos que pueden convertirse en adultos viables y fértiles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: HS2 promueve toda duplicación del genoma por cale el segundo ciclo celular. Patrón (A) de escisión de la célula de un embrión no tratado durante los primeros tres ciclos celulares, correspondientes a los embriones de células 8 de 2, 4, y. Resultados de tratamiento (B) HS2 en una parada de un ciclo de la división celular durante el segundo ciclo celular. Durante la parada, en curso Resultados de la síntesis de ADN en embriones sometidos a diploidization, ya sea haploide de diploides (n -> 2n) o diploide de tetraploides (2n -> 4n) (véase el texto). Después de esta parada, el embrión se reanuda la división celular, con la neWLY adquirida ploidía. (C) HS2-tratados embriones pueden exhibir una variedad de arreglos de blastómeros en función de si blastómeras exhiben un retraso división celular durante el segundo ciclo celular: i) "sin parada": ni exhibe blastómeros un retraso, que resultan en una proporción 2: 2 disposición característica del 4 de células de embriones de la etapa, ii) "parada parcial": sólo una de dos blastómeros exhibe un retraso, lo que resulta en un aberrante 2: 1 arreglo, y iii) "estancado": ambos blastómeros exhiben un retraso, lo que resulta en un 1: 1 disposición característica de embriones en la etapa de 2 células. En (A - C), los núcleos se representan como círculos azules, con el evento diploidization representada por una expansión del tamaño nuclear. Véase la referencia 2 para un diagrama que representa el comportamiento centriolar como base propuesto para el puesto de la división celular. Haga clic aquí para conocer el Versi más grandesel de esta figura.

figura 3
Figura 3: Morfología de diploides naturales, haploides y gynogenotes. (A) la morfología embrionaria normal de un diploide obtenida a través de cruces naturales. (B), los embriones haploides exhiben un eje del cuerpo más corto y ancho. (C) diploides homocigóticos tienen una morfología normal del cuerpo. Los embriones, además, llevan una mutación recesiva en el gen de la pigmentación de oro para facilitar el seguimiento de la herencia del ADN de los padres: las madres son portadores homocigotos para una mutación en oro, y los padres de tipo salvaje para este gen. Por lo tanto, los diploides naturales, heterocigotos para el oro, presentan una pigmentación de tipo salvaje, mientras que ambos haploides (hemizygous de oro) y diploides homocigóticos (homocigotos para el oro) presentan una pigmentación mutante. Barra de escala = 0,5 mm. Los paneles modificados de reConferencia 2, reimpreso con el permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Solución componentes Condiciones de almacenaje
Solución 1 de Hanks 8,0 g de NaCl, y
0,4 g de KCl en 100 ml de ddH2O
Almacenar a 4 ° C
Solución 2 de Hanks 0,358 g anhidro Na 2 HPO 4, y
0,6 g de KH 2 PO 4
en 100 ml de ddH2O
Almacenar a 4 ° C
Solución 4 de Hanks 0,72 g de CaCl 2
en 50 ml de ddH2O
Almacenar a 4 ° C
Solución 5 de Hanks 1,23 g MgSO4 ∙ 7H 2 O
en 50 ml de ddH2O
Almacenar a 4 ° C
Premezcla de Hank Añadir, en el siguiente orden:
10,0 ml de solución 1,
1,0 ml Solución 2,
1,0 ml Solución 4,
86,0 ml ddH2O, y 1,0 ml de solución 5
Almacenar a 4 ° C
Solución 6 de Hanks 0,33 g de NaHCO3
en 10 ml de ddH2O
Preparar fresca la mañana del procedimiento de FIV

Tabla 1. Preparación de soluciones de Hank.

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Discussion

Los pasos críticos

Es fundamental trabajar en condiciones de eficacia en la fertilización in vitro. Para asegurar un buen suministro de óvulos maduros (paso 1), las mujeres establecieron para el apareamiento no debería haber sido creado en cruces de apareamiento durante al menos 5 días y debe aparecer grávido. Durante la interrupción de la cría, un observador puede controlar el 15-30 tanques adecuadamente para la primera aparición de la extrusión de huevo natural. La interrupción del apareamiento debe hacerse tan pronto como sea posible cuando se liberan los primeros huevos a través de la monta natural, con el fin de permitir que la mayoría de los huevos de las hembras permanecen en el interior para el procedimiento de FIV. Estas mujeres, que ahora están listos para la extrusión manual de los óvulos maduros, se pueden mantener separados para un máximo de 2 horas sin un efecto aparente sobre la liberación del huevo posterior. Para preparar una solución efectiva espermatozoides (paso 2), los machos deben aparecer robusta e idealmente con un tinte rojizo, que es característica de la cría de machos de pez cebra. Una disección de limpia normalmente implica removing la pista intestinal tirando de él hacia a la parte posterior del cuerpo, y la vejiga natatoria tirando de ella en sentido anterior. Después de la eliminación de los órganos internos centrales, los testículos se mantienen masas alargadas como translúcidos junto a cada lado de la pared interna del cuerpo. Evitar incluyendo los órganos no deseados (por ejemplo, los intestinos) en la solución de esperma; si es necesario separar estos de los testículos mediante el trabajo en una superficie de la placa de Petri seco antes de ser colocado en la solución de Hank. Para lograr altas tasas de fertilización durante la FIV (paso 4), es esencial que los huevos se mantienen extruidos competente hasta la adición de esperma. Los huevos competentes para la fertilización exhiben un tono ligeramente amarillo y son translúcidos. Evitar los huevos que tienen cualquier contacto con el agua antes de la adición de esperma, ya que el agua se disparará la activación del huevo y la activación prematura impedirá la fertilización. activación del agua y la fertilización debe ocurrir dentro de 90 segundos de la extrusión de la hembra con el fin de evitar la deshidratación de los huevos, que seconducir a su degradación. Si es necesario, los huevos extruidos pueden mantenerse durante períodos más largos (hasta 1,5 hr o más) en 100 a 200 l de solución de Hank suplementado con 0,5% albúmina de suero bovino (BSA) 17 (en la preparación de la solución de Hank para este propósito específico, preparar la premezcla para corregir el contenido de agua añadido durante la suplementación de BSA). Si los huevos se han mantenido competente con la ayuda de la solución de BSA de Hank, BSA eliminar el exceso de Hank de los huevos utilizando una micropipeta y fertilizar dentro de 1 min.

Un paso crítico para el éxito de diploidization usando HS2 es la clasificación de los embriones estancadas (paso 7). clasificación inicial de escindir simétricamente embriones de 2 células selecciona para los embriones que se convierten en fertilizan y comienzan la división celular (dispermy ocasional durante los resultados de FIV en los embriones que la transición directamente de 1 a 4 células a 35-50 MPF - tales embriones deben ser desechados). el ciclo celular se produce cada 15 minutos durante estos primeros st embrionariaedades (35 a 50 MPF para el primer ciclo celular, 50-65 MPF para el segundo ciclo celular, etc.), de modo de clasificación de escindir los embriones durante la primera 10 min de cada ciclo celular asegura una ausencia de solapamiento entre ciclos y precisa identificación de un puesto de la división celular.

Modificaciones y solución de problemas

La fuerza del tratamiento UV en el paso 3 (por ejemplo, tiempo de exposición, potencia de la lámpara, la distancia a la lámpara) se puede ajustar si es necesario mediante el ensayo las tasas de fertilización iniciales, así como la frecuencia de haploides en ausencia de tratamiento posterior hsü: la cantidad correcta de la exposición UV no tiene un efecto notable en las tasas de fertilización, mientras que resulta en 100% de los embriones haploides (ver resultados representativos para distinguir haploides a partir de embriones diploides). El exceso de exposición a rayos UV provoca la reducción de las tasas de fertilización, presumiblemente debido a los efectos deletéreos sobre la función de los espermatozoides, mientras que la exposición UV insuficiente produce embriones diploides debido to la inactivación incompleta de ADN de esperma.

Si los embriones exhiben defectos en el desarrollo o la letalidad después de la reanudación de la división celular (paso 7), la temperatura de choque térmico en el paso 6 puede reducirse ligeramente (por ejemplo, a 41,0 ° C) para aumentar la supervivencia de los embriones; condiciones que resultan en fracciones aproximadamente iguales de aberrante de células 3 y paralizados embriones de 2 células durante el segundo ciclo celular (y por lo tanto cerca de umbral para un efecto sobre la duplicación centriolar) da lugar a defectos de desarrollo posteriores mínimos y aumento de la supervivencia después de la reanudación de ciclo celular .

El método HS2 incorpora un mecanismo conveniente y intrínseca para evaluar puesto de la división celular (y por lo tanto toda la duplicación del genoma), ya que la observación directa de embriones a medida que desarrollan permite el seguimiento de los distintos ciclos celulares. La selección manual de embriones que han sido sometidos a un puesto de división ciclo de una célula permite generar una población uniforme de embrión diploidizeds. HS2 puede llevarse a cabo en cualquier cepa genética pez cebra (por ejemplo, AB, Tübingen, WIK), como las de una célula división parada actúa como un mecanismo intrínseco para confirmar la duplicación del ADN. Además, los marcadores genéticos visibles introdujo en la cepa se pueden utilizar para facilitar la identificación de los embriones diploidized (Figura 3). Por ejemplo, el uso de huevos de hembras que son homocigotos para mutaciones recesivas en genes de pigmentación, tales como oro o albino, se puede combinar con el esperma derivado de cepas de tipo salvaje que llevan alelos normales para el mismo gen de la pigmentación. En esta situación, porque los espermatozoides con tratamiento UV no puede contribuir alelos de pigmento de tipo salvaje, embriones diploides haploides y homocigotos exhiben la mutación recesiva pigmento. Además, los diploides homocigotos muestran una morfología de tipo salvaje a las 24 HPF, en agudo contraste con la morfología haploides menos extendida. La combinación de la aparición del rasgo recesivo materna y embry generalo morfología confirma la duplicación exitosa ploidía. La confirmación adicional se puede obtener a través de recuentos cromosómicos de embriones tratados y no tratados.

El sistema de marcado genético descrito anteriormente, basado en marcadores genéticos visibles recesivos, también permite confirmando la ausencia de ADN de esperma de derivados en la progenie, ya que los embriones resultantes exhiben de tipo salvaje pigmentación sólo si el esperma no ha sido completamente inactivado por el tratamiento UV . En ausencia de un sistema de marcado genético, una muestra de los embriones se puede permitir que se desarrollan en ausencia de choque térmico a confirmar que todos los embriones exhiben la morfología haploide a las 24 hpf, y por lo tanto que la inactivación de DNA de esperma fue completa. En conjunción con el esperma totalmente inactivado, este mismo sistema de marcaje genética también permite detectar posibles fallos cuerpo polar espontánea. Tal acontecimiento daría lugar a la aparición de embriones recesiva marcados con morfología diploide sin un tratamiento diploidization. bo polar espontáneafracaso dy no se ha observado en el pez cebra, pero se informó en Xenopus tropicalis 18. Si está presente en un sistema dado, este evento espontáneo tendría que ser reducido o controlado por el fin de aplicar de manera óptima manipulación de ploidía.

Las limitaciones de la técnica

La capacidad de producir gynogenotes viables se basa en la ausencia de fondo variantes de genes que, cuando se homocigotos son perjudiciales. Por lo tanto, el éxito del procedimiento variará dependiendo de la cepa genética utilizada. Selección de cepas genéticas a través de múltiples generaciones de gynogenesis se ha demostrado que mejora la viabilidad 1.

El método HS2, cuando se utiliza junto con el esperma sin tratar para producir embriones diploides, también permite la producción de embriones tetraploides a una frecuencia alta. Sin embargo, en este caso, debido a la diploide a la transformación tetraploide, marcadores genéticos no permiten fácilmente para la confirmación de genoma enteroe duplicación. En este caso, la observación de la cabina de un ciclo de células en embriones sincronizados y selección de embriones estancadas deben asegurar la selección tetraploide, y recuentos cromosómicos se pueden utilizar para confirmar aún más la ploidía.

Significativas en relación con los métodos existentes / alternos

Aunque se ha descrito por Streisinger hace más de 40 años 1, el método uniforme del SA no ha sido ampliamente utilizado debido a un mal rendimiento. En lugar de ello, la manipulación de ploidía se ha basado casi exclusivamente en el método alternativo y relativamente más eficiente de la presión inicial, lo que resulta en la duplicación de ploidía a través de la inhibición de la segunda división meiótica. Sin embargo, los resultados de presión inicial en proporciones variables de homozygosity gen 9,19, lo que disminuye su valor como herramienta genética. Estudios recientes muestran que HS2, una modificación del protocolo SA estándar, a saber, la aplicación del impulso de calor en un momento diferente en el primer ciclo celular (el 22 a 24MPF periodo del SH2, en comparación con 12-14 MPF en uniforme del SA) se traduce en hasta 4 veces mayor rendimiento de las producciones diploides homocigóticos.

La acción del impulso de calor se puede inferir que se produzca en virtud de la inhibición de la duplicación centriolo durante el tiempo de choque térmico (22-24 MPF, durante el primer ciclo celular), que por lo tanto carece de la complemento adecuado para generar un husillo y mediar la división celular durante el siguiente ciclo celular (50-65 MPF, correspondiente a la segunda del ciclo celular). duplicación centriolo puede reanudar en ausencia de choque térmico durante los ciclos posteriores de células, lo que permite el desarrollo de proceder después de una parada del ciclo de una célula precisa. Debido a que los ciclos de duplicación centríolo y la replicación del ADN son interdependientes 20, la replicación del ADN se produce normalmente, incluso durante la división pausa en el segundo ciclo celular. Esto da lugar a la duplicación del genoma precisa entera y completa homocigosis.

Las aplicaciones futuras

21.

Enfoques similares a HS2 se puede aplicar a otras especies con fecundación externa, incluso los que no está siendo utilizado como sistemas genéticos. Este metodoen particular, se aprovecha de un período de tiempo desde la fertilización hasta el inicio de la bicicleta blastómeras que un pulso de calor puede afectar a la duplicación de centríolos y generar un puesto de la división celular y precisa toda la duplicación del genoma sin producir efectos nocivos en el desarrollo. Por lo tanto, este período de tiempo a tiempo puede ser explorado para la sensibilidad de choque térmico para desarrollar métodos genéticos basados ​​en la manipulación de ploidía en otros sistemas animales.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
Na2HPO4 Sigma S3264
KH2PO4 Sigma P9791
CaCl2 Sigma C7902
MgSO4-7H2O Sigma 63138
NaHCO3 Sigma S5761
Tricaine Western Chemical Tricaine-D (MS 222) FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base Sigma 77-86-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl Sigma 920-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in) PennPlax (ThatFishThatPlace # 212370) available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon available in most standard stores
Dissecting scissors Fine Science Tools 14091-09
Dissecting forceps Dumont SS available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) Nikon SMZ645 or equivalent
Reflective light source (LED arms) Fostec KL1600 LED or equivalent
Petri plates 10 cm diameter any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml any maker
Ice bucket any maker
Pipetteman P-1000 any maker
Pipette tips 1,000 µl any maker
Narrow spatula Fisher 14-374
Depression glass plate Corning Inc 722085 (Fisher cat. No 13-748B) available from Fisher Scientific
UV lamp UVP Model XX-15 (cat No. UVP18006201) available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses any maker
Paper towels any maker
Kimwipes Kimberly-Clark 06-666-11 available from Fisher Scientific
Timer stop watch any maker
Wash bottle Thermo Scientific 24020500 available from Fisher Scientific
Tea strainer available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2) Corning Inc. 1000250 available from Fisher Scientific
water bath (2) any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1 see above see above 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2 see above see above 0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C.
Hanks’ Solution 4 see above see above 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C.
Hank's Premix see above see above add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C
Hanks’ Solution 6 see above see above 0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution) see above see above Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)

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References

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