Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo

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Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart. J. Vis. Exp. (115), e54497, doi:10.3791/54497 (2016).

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Abstract

El corazón de los mamíferos es un gran consumidor de ATP y requiere un suministro constante de sustratos de energía para la contracción. No es sorprendente, alteraciones del metabolismo del miocardio se han relacionado con el desarrollo de la disfunción contráctil y la insuficiencia cardíaca. Por lo tanto, desentrañar la relación entre el metabolismo y la contracción debe arrojar luz sobre algunos de los mecanismos que regulan la adaptación cardiaca o mala adaptación en estados de enfermedad. La preparación de corazón de rata aislado de trabajo se puede utilizar para seguir, de forma simultánea y en tiempo real, la función contráctil cardiaca y el flujo de la energía proporcionando sustratos en las vías metabólicas oxidativas. El presente protocolo tiene como objetivo proporcionar una descripción detallada de los métodos utilizados en la preparación y la utilización de tampones para la medición cuantitativa de las tasas de oxidación de glucosa y los ácidos grasos, la energía principal que proporciona sustratos del corazón. También se discuten los métodos utilizados para el análisis de muestras y la interpretación de datos.En resumen, la técnica se basa en el suministro de 14 C-glucosa marcada radiactivamente y un ácido graso de cadena larga radiomarcado 3 H- a un corazón latiendo a través de la perfusión ex vivo cristaloides normotérmica. 14 CO 2 y 3 H 2 O, subproductos finales de las reacciones enzimáticas implicadas en la utilización de estos sustratos de energía que proporciona, a continuación, se recuperaron cuantitativamente a partir del efluente coronario. Con el conocimiento de la actividad específica de los sustratos radiomarcados usados, es entonces posible cuantificar de forma individual el flujo de glucosa y ácidos grasos en las vías de oxidación. la función contráctil del corazón aislado se puede determinar en paralelo con el equipo de grabación apropiada y directamente correlacionado con los valores de flujo metabólico. La técnica es muy útil para estudiar la relación metabolismo / contracción en respuesta a diversas condiciones de estrés, tales como alteraciones en pre y después de la carga y de la isquemia, un fármaco o una Circulafactor de ting, o después de la alteración en la expresión de un producto génico.

Introduction

Relevancia clínica

En el corazón de los mamíferos, hay una fuerte relación positiva entre el flujo de sustratos a través de las vías metabólicas oxidativas, la generación de ATP y el trabajo cardíaco 1. Durante las últimas dos décadas, la investigación de la intrincada relación entre el metabolismo y la función cardíaca se ha llevado a reconocer que las alteraciones en el metabolismo cardíaco son una causa para la disfunción contráctil y remodelación estructural posiblemente patológica en la fijación de diferentes tipos de enfermedades del corazón 2-4. por lo tanto, se espera que nuestra comprensión de los mecanismos que regulan la remodelación metabólica del corazón subrayado dará lugar a la identificación de dianas terapéuticas para la prevención o tratamiento de la insuficiencia cardíaca 5-7. La reciente publicación de una declaración científica de la American Heart Association sobre "Evaluación de metabolismo cardíaco", subraya el creciente interés de la comunidad científica para tsu campo de investigación 8. Sin embargo, aunque los avances tecnológicos en imagen cardiaca ahora permiten una evaluación rápida y precisa de la morfología y la función cardíaca, el estudio in vivo del metabolismo cardiaco sigue siendo limitado y onerosa: la espectroscopia y resonancia magnética nuclear (RMN) Tomografía por Emisión de Positrones (TEP) puede se utiliza para seguir el metabolismo del fosfato de alta energía cardiaca y la actividad del ciclo de Krebs, pero estas técnicas se ven afectadas por los altos costos de operación y por su incapacidad para determinar la contribución de diversos sustratos para el metabolismo oxidativo en condiciones de estado estacionario 9 .Para esta fecha, el ex vivo trabajando preparación de corazón representa la sola y única técnica disponible para estudiar, de forma simultánea y en tiempo real, la función contráctil y el flujo de sustratos metabólicos oxidativos en las vías de 7,9. El siguiente protocolo tiene como objetivo proporcionar directrices para la preparación y utilización de los reactivos utilizados para determinar la rataes la utilización de sustratos en el corazón de rata aislado de trabajo.

El aparato aislado del corazón de roedores de Trabajo

Aunque la técnica es casi la mitad de un siglo de antigüedad, la preparación aislada de corazón de rata de trabajo sigue siendo un método de elección para la investigación cardiovascular. Al igual que con la preparación de corazón Langendorff, el corazón de roedores de trabajo ofrece una manera relativamente simple, fiable y de bajo costo para medir una amplia gama de parámetros cardíacos independientemente de los efectos de confusión de otros órganos, y otros factores neurohormonales circulantes. Pero en contraste con el corazón perfundido Langendorff, el corazón trabaja sigue llevando a cabo el trabajo cardíaco cercanas a las fisiológicas, un requisito previo para la generación de flujo metabólico oxidativo a niveles que son relevantes a las condiciones in vivo. Esto se logra mediante la entrega de la memoria intermedia de perfusión en el ventrículo izquierdo (VI) a través de una cánula conectada a la aurícula izquierda, y como el LV se llena y se contrae, latampón es expulsado a través de la línea aórtica frente a una presión hidrostática de la poscarga determinado. El diseño del aparato de perfusión descrito originalmente por Neely et al 10 fue mejorado posteriormente por Taegtmeyer, dobladillos y Krebs 11, pero ha cambiado muy poco desde entonces. Como se describe en el aparato original, la función contráctil se puede evaluar mediante la determinación del gasto cardíaco, utilizando no más de probetas graduadas y un cronómetro para medir los flujos aórtico y coronario 10,11. Varios vendedores ofrecen ahora sistemas completos de roedores de trabajo de perfusión del corazón. Estos aparatos disponibles en el mercado se puede adquirir con flowprobes, transductores de presión, un catéter de presión-volumen y todo el equipo necesario para la adquisición de datos de la función cardíaca y el análisis. Los proveedores ofrecen extensas sesiones de documentación y formación para familiarizar a los nuevos usuarios con sus equipos. Varios artículos de revisión también protocolos de detalle en el corazón trabaja instrumentación y en el uso de catéteres para medir la función cardiaca en los roedores 12-15. Por esta razón, sólo mencionaremos brevemente la configuración del aparato de perfusión y el aparato de control. El presente protocolo y no tiene por objeto complementar la información ya disponible con una descripción de los métodos que se pueden implementar para medir simultáneamente las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos de cadena larga, los dos principales sustratos energéticos que proporciona en el corazón normal. Describimos aquí todos los pasos implicados en el uso de sustratos de energía radiomarcados para la evaluación del metabolismo oxidativo del miocardio, de la preparación de los reactivos y tampones a la recuperación y procesamiento de las muestras, al análisis de datos.

Principios del método

Cardiomiocitos generan la mayor parte de su energía para la contracción de la fosforilación oxidativa de los ácidos grasos (ácidos grasos de cadena larga principalmente) y carbohidratos (Glucose y lactato). El corazón se ha muy limitada reservas energéticas y depende de un suministro constante de estos sustratos de energía que proporciona a partir de la circulación. El catabolismo de la glucosa a través de la vía glucolítica produce piruvato que después se descarboxila por el complejo piruvato deshidrogenasa de la membrana mitocondrial interna. ácidos grasos de cadena larga, extraídos de circulación de albúmina o lipoproteína de triglicéridos, se activan primero en moléculas de acil-CoA en el citosol y posteriormente transportados dentro de la matriz mitocondrial a través de la lanzadera de la carnitina para entrar en la vía de oxidación beta. Las moléculas de acetil-CoA producidos por el catabolismo de la glucosa y los ácidos grasos combustible el ciclo de Krebs para generar los equivalentes reductores (NADH y FADH 2) que son utilizados por la cadena de transporte de electrones para construir la fuerza protón-motriz través de la membrana mitocondrial interna y generar ATP a través de la actividad de la ATP sintasa. Agua y dióxido de carbono son los subproductos de extremo delas reacciones enzimáticas que tienen lugar dentro del ciclo de Krebs. El suministro de 14 C y 3 H- sustratos radiomarcados (como 14 C-glucosa radiomarcada y ácido oleico 3 H-radiomarcado) para el corazón aislado de trabajo será por consiguiente dar lugar a la producción de 14 CO 2 y 3 H 2 O que puede recuperar cuantitativamente a partir del efluente coronario. La colección de 14 CO 2 se lleva a cabo manteniendo el corazón aislado y perfundido en una cámara sellada y por la recuperación inmediatamente el efluente coronario a medida que sale del corazón. Una columna pequeña de intercambio aniónico se usa para separar y recuperar 3 H 2 O del efluente coronario. La radiactividad de las muestras procesadas se mide con un contador de centelleo líquido, y con el conocimiento de la actividad específica de los sustratos radiomarcados utilizado, entonces es posible cuantificar de forma individual el flujo de glucosa y ácido graso en lala oxidación vías 16,17.

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Protocol

NOTA: Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la Política de Servicio de Salud Pública de los NIH sobre el Cuidado Humano y Uso de Animales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Mississippi Medical Center. Todos los procedimientos que implican el uso de radioisótopos se aprobaron y se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas por la oficina de la seguridad radiológica de la Universidad de Mississippi Medical Center.

1. Preparación de soluciones de estabilización y Reactivos

  1. Krebs-Henseleit (KH) Soluciones para la reserva de estabilización
    1. Preparar 2 L de una solución concentrada 20x sal de reserva que contenía (en mol / L) 2,37 NaCl, KCl 0,0948, 0,0236 KH 2 PO 4, y 0.0236 MgSO 4 * 7H 2 O. Filtrar en una unidad de filtración de 0,45 micras de poro y se almacena a temperatura ambiente hasta por 1 mes.
    2. Preparar 2 L de una solución de 20x concentrado (0,5 mol / L) de NaHCO3. La solución puede seralmacenado a temperatura ambiente durante un período indefinido de tiempo.
    3. Preparar 250 ml de una / L solución de reserva 1 mol de CaCl 2. Filtrar en una unidad de filtración de 0,45 micras de poro y se almacena a temperatura ambiente hasta por 1 mes.
  2. La conversión de intercambio de aniones de la resina de la forma de cloruro a la forma de hidróxido
    1. Se lava la resina de intercambio aniónico mediante la resuspensión en agua ultrapura 1 L. Deje que la resina se asiente y verter el exceso de agua. Repita este paso 4 veces más.
    2. Se vierte la resina en un soporte de filtro de vacío microanálisis de vidrio montada en un matraz de filtración.
    3. Convertir la resina a la forma de hidróxido haciendo pasar lentamente a través de 22 volúmenes de NaOH 1 N. Mezclar la suspensión de forma intermitente con una espátula de acero inoxidable.
    4. Se lava la resina con agua ultrapura hasta que el pH cae por debajo de 9,0. Comprobar el pH regularmente por inmersión de una tira de prueba de pH cerca de la superficie de la suspensión de resina. Tapar y guardar la resina con agua ultrapura en un borosilicate botella de vidrio y protegerlo de la luz. No permita que la resina se seque antes de su uso.
      NOTA: Cuando se almacena adecuadamente, la resina tendrá una duración de al menos 3 meses.
  3. Ácido oleico-albúmina 8x Concentrado de Solución
    1. En un matraz de 4 L Erlenmeyer, mezclar 200 ml de la solución madre 20x de sal concentrada y 200 ml de la solución concentrada de NaHCO3 20x con agua ultrapura 3,6 L.
    2. El uso de un tubo de dispersión de gas con un cilindro poroso, el gas de la solución durante 15 min con una mezcla de dióxido de carbono 5% y oxígeno 95% para estabilizar el pH.
    3. Pour buffer de 470 ml en un vaso de precipitados de vidrio de 1 L. Añadir 8,75 ml de la 1 mol / L de solución de CaCl 2 stock en el búfer de 3530 ml restante en el matraz Erlenmeyer de 4 litros y dejar de lado.
    4. Añadir 40 g de ácidos grasos libres de BSA al vaso de precipitados de vidrio de 1 litro y se agita con una varilla de agitación hasta que se disuelva.
    5. En un tubo cónico de 15 ml, preparar 4 ml de un 50% (v: v) de etanol en agua ultrapura. Añadir 487 mg sodium oleato y agitar hasta que el polvo se haya disuelto completamente.
      NOTA: Algunos investigadores utilizan ácido palmítico en lugar de ácido oleico en el tampón de perfusión. Una solución de ácido palmítico albúmina se puede preparar siguiendo el mismo procedimiento. Sin embargo, se recomienda calentar la solución a 70 ºC para lograr la solubilización completa de palmitato de sodio.
    6. Añadir gota a gota la solución de oleato a la solución de BSA libre de ácidos grasos con agitación constante y esperar 10 minutos más para el complejo de ácido oleico-BSA para formar.
      NOTA: La solución debe tener un color amarillo claro y estar desprovisto de partículas visibles. La presencia de un precipitado o partículas insolubles puede indicar conjugación incompleta del ácido graso a BSA. Si esto sucede, la solución debe ser desechado y el proceso iniciado de nuevo.
      NOTA: palmitato precipitará si se le permite sentarse en una pipeta y no se puede añadir gota a gota. La solución agitada de BSA se puede calentar a 37 ºC para facilitar binding de ácido palmítico. No calentar demasiado ya que esto puede causar la desnaturalización y agregación de BSA.
      PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos de este protocolo implica la manipulación de material radiactivo. Use el EPP apropiado y siga las normas de eliminación de residuos y de seguridad establecidos por la oficina de la seguridad radiológica de la institución.
    7. Añadir 160 l (0,8 mCi) [9,10- 3 H] ácido oleico a la solución en agitación de ácido oleico-BSA y se agita durante otros 10 min.
    8. Añadir 2,5 ml de la 1 mol / L de solución de CaCl 2 stock a la solución en agitación de ácido oleico-BSA.
    9. Cortar aproximadamente 1,2 m de tubo de membrana de diálisis y enjuague tanto dentro como fuera con agua del grifo. Frote los tubos de diálisis vigorosamente con agua del grifo durante 10 a 15 min para eliminar el revestimiento de glicerol de la membrana. Como alternativa, eliminar el recubrimiento por inmersión del tubo de diálisis en agua caliente durante 1 hora antes de su uso. Finalizar enjuagando los tubos de diálisis con finales ultrapurar.
    10. Segura atar un extremo del tubo de diálisis. Rellenar con la solución de ácido oleico-BSA y atar el otro extremo del tubo de diálisis.
    11. Colocar el tubo de diálisis se introduce en el matraz Erlenmeyer 4 L de tampón KH y permitir dializar durante la noche a 4 ºC con agitación suave con una barra de agitación.
    12. Al día siguiente, se retira la solución concentrada 8x ácido oleico-BSA a partir de los tubos de diálisis. Use la solución de ácido oleico-BSA inmediatamente para la perfusión o alícuota y almacenar a -20 ºC. alícuotas congeladas son estables durante al menos 2 meses. Evitar ciclos de congelación-descongelación, ya que puede poner en peligro la solubilidad del complejo de ácido oleico-BSA.
      NOTA: Use sólo agua ultrapura (resistividad de 18,2 MΩ.cm a 25 ºC, carbono orgánico total <10 ppb, microorganismos ≤ 1 UFC / ml, partículas con un tamaño de más de 0,22 micras ≤1 / ml) para preparar los reactivos y tampones utilizado para la perfusión del corazón. La conversión de la resina de intercambio aniónico de su cloruro dem a la forma hidróxido se puede evitar la compra directa de la forma de hidróxido en un gasto adicional (ver Tabla de Materiales). Además de oleato o palmitato, cualquier otro tipo de ácido graso de origen natural también se puede utilizar, siempre y cuando una versión tritiada del ácido graso está disponible para seguir su oxidación.

2. Preparación del tampón de perfusión

  1. En un matraz de 4 L Erlenmeyer, mezclar 200 ml de la solución madre 20x de sal concentrada y 200 ml de la solución concentrada de NaHCO3 20x con agua ultrapura 3,6 L. Gas de la solución durante 15 min con una mezcla de dióxido de carbono 5% y oxígeno 95%, y a continuación, añadir 10 ml de la / L CaCl solución 2 stock 1 mol para ajustar la concentración de Ca2 + libre en 2,5 mmol / L.
    PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos implican la manipulación de material radiactivo. Use el EPP apropiado y siga las normas de seguridad y eliminación de residuos establecidos por la AR de la instituciónoficina de seguridad diación.
  2. Transferir 1.750 l de tampón KH a una botella de vidrio de borosilicato de 2 l. Añadir 250 ml de la solución de ácido 8x concentraron-BSA oleico, 1,802 g de D-glucosa, insulina 400 l a 0.4 U / ml, y 200 l (0,2 mCi) [U-14C] glucosa. Invertir botella para mezclar. Esto dará a 2 L de tampón de perfusión completa que contiene ácido oleico (0,4 mmol / L), D-glucosa (5 mmol / L), y la insulina (40 mU / ml).
    NOTA: Un volumen de 2 L es suficiente para perfundir un corazón de rata adulta trabajando en condiciones no de recirculación durante un mínimo de 60 min.
  3. Use un poco de la memoria intermedia de KH no radiactivo para llenar dos platos de disección y colocar en hielo para enfriar.

3. Preparación del aparato de perfusión

NOTA: El investigador puede elegir utilizar un aparato de perfusión hecha a la medida, tal como la descrita por Taegtmeyer, dobladillos y Krebs 11, o uno de los sistemas disponibles en el mercado. sistemas de perfusión se componen típicamente de laelementos descritos en la Figura 1 a continuación. Además de la tubería y la cristalería, el resto del aparato de control es opcional y su utilización dependerá de las necesidades del investigador para abordar la cuestión experimental que se preguntó. No obstante, se recomienda el uso de microelectrodos de oxígeno para determinar la concentración de O 2 en la entrada y salida de búfer de la circulación coronaria (Figura 1). Esto ayudará al control de investigador que el corazón se suministra con una cantidad adecuada de oxígeno, y que el suministro de oxígeno no varía entre los experimentos. Además, la determinación de la diferencia de oxígeno "arteriovenosa" se puede utilizar para calcular el consumo de oxígeno del miocardio y eficacia cardiaca 16,18.

  1. Encienda el baño de agua circulante y regulado a 37 ° C para calentar el aparato de perfusión.
  2. Encienda el ordenador y el sistema de adquisición de datos que seser utilizado para medir la función cardiaca.
  3. Conectar los dispositivos de grabación (catéter de presión, el catéter de presión-volumen, microelectrodos de oxígeno, medidores de flujo, etc.) al sistema de adquisición de datos y realizar la calibración de los instrumentos siguientes instrucciones del fabricante.
  4. Llenar el depósito de regulación con agua ultrapura. Encienda la bomba peristáltica y expulsar el agua a través de toda la tubería y cristalería para enjuagar el sistema. Apagar la bomba peristáltica y asegúrese de que no hay agua se queda en el tubo y / o material de vidrio ya que esto puede afectar a la concentración del tampón de perfusión y la preparación del corazón.
  5. Conectar un nuevo filtro de fibra de vidrio 1,0 micras en el sistema. Conectar el depósito de gas que contiene una mezcla de dióxido de carbono 5% y oxígeno 95% a la cámara de oxigenación.
    PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos implican la manipulación de material radiactivo. Use el EPP apropiado y siga las normas de seguridad y eliminación de residuos establecidos por la institución'S oficina de la seguridad radiológica.
  6. Llenar el depósito de regulación con tampón de perfusión. Encienda la bomba y asegurar el llenado de todos los tubos y cristalería con el tampón de perfusión. Ejecutar el tampón de perfusión a través del aparato de perfusión en el modo de recirculación de compuestos oxigenados y por lo menos 30 min antes de su uso.
  7. Estrechamente unir el tubo de una jeringa 20 ml debajo de la cámara del corazón para recuperar el efluente coronario. Conectar la punta de la jeringa a la parte superior de una llave de paso de tres vías. Conectar el brazo lateral a una jeringa de 3 ml. Conectar el brazo inferior mediante un tubo a un recipiente para residuos radiactivos líquidos.
    NOTA: Cuando se utiliza el complejo de ácido graso-BSA, la oxigenación del tampón de perfusión no se puede llevar a cabo a través de burbujeo directo con un tubo de dispersión de gas ya que esto hará excesiva formación de espuma de la solución. Use un oxigenador de membrana (Figura 1) o de una cámara de oxigenación flujo hoja para ese propósito. Es muy recomendable para verificar que un nivel adecuado of oxigenación se alcanza mediante la colocación de un microelectrodo de oxígeno en el circuito de perfusión (Figura 1).

4. Aislamiento de la rata del corazón y canulación

  1. Pesar de rata en una escala.
  2. Preparar una jeringa con la dosis de anestesia de 150 mg / kg tiobutabarbital hidrato de sal de sodio y una jeringa de tuberculina con 200 unidades USP de heparina.
  3. Inyectar tiobutabarbital IP y esperar a que el animal pierda la consciencia. Otros agentes de inducción pueden ser utilizados siempre que esto no interfiera con la finalidad del experimento (véase Elección del anestésico en la sección de discusión más adelante).
  4. Compruebe que el nivel adecuado de anestesia mediante la confirmación de la falta de reflejo de los pies pellizco. Asegúrese de mantener la adecuada profundidad de la anestesia para asegurar que el animal no siente dolor durante el procedimiento.
  5. Una vez que la rata es totalmente inconsciente y no responde a la pizca dedo del pie, lo coloca en la espalda a la mesa de operaciones y secure extremidades con cinta adhesiva o alfileres.
  6. Clip de la libre abdomen del cabello y realizar una incisión en la línea media del abdomen. No abrir la cavidad torácica en este punto todavía. Mueva el estómago y el intestino lado para revelar la vena cava inferior. Inyectar la heparina directamente en la vena cava inferior y esperar 5 a 10 seg antes de continuar.
  7. Usando tijeras cortan el diafragma y los lados de la caja torácica para exponer el contenido de la cavidad torácica.
  8. Delicadamente agarrar el corazón entre los dedos pulgar, índice y medio y los impuestos especiales tanto corazón y los pulmones juntos. Cortar a nivel de la aorta descendente, teniendo cuidado de no dañar el arco aórtico y la aorta ascendente en el proceso. Inmediatamente transferir corazón y los pulmones a uno de los platos de disección llenos con tampón KH enfriado con hielo.
  9. Después de que el corazón deja de latir, la transferencia a la segunda plato de disección y recortar los grandes fragmentos de tejido pulmonar adjuntos, manteniendo el corazón sumergido en tampón KH helada. Cortar el descensoing aorta justo por encima del arco aórtico.
    PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos implican la manipulación de material radiactivo. Use el EPP apropiado y siga las normas de eliminación de residuos y de seguridad establecidos por la oficina de la seguridad radiológica de la institución.
  10. Enjuague la línea aórtica del aparato de perfusión para llenar la cánula aórtica con tampón caliente y para eliminar cualquier agua o aire que todavía puede estar presente en el tubo. Dejar que el tampón de perfusión gotee de la cánula aórtica para minimizar la posibilidad de embolia de aire en el momento que el corazón está unido a la cánula.
  11. El uso de dos pinzas de disección micro abierto con cuidado a la aorta y el corazón deslice hacia arriba en la cánula aórtica. Fije la aorta en la cánula con un clip de micro e iniciar Langendorff perfusión del corazón. Observe el corazón comience a latir de nuevo y expulsar toda la sangre que queda en la vasculatura coronaria en los segundos siguientes al inicio de la perfusión.
    NOTA: Es muy importante llevar a cabo los pasos 4.6 a través de 4,10 tan rápido como sea posible para evitar el daño isquémico irreversible al corazón. Con la experiencia, todo el procedimiento debe tener entre 1 y 2 minutos. Al deslizar la aorta arriba en la cánula, tener cuidado de no pasar a la raíz aórtica ya que esto puede dar lugar a una hipoperfusión miocárdica y daños a la válvula aórtica.
  12. Ate la aorta a la cánula aórtica con una sutura de seda 3-0 y quitar la pinza micro. Localizar la vena pulmonar. Puede ser necesario recortar los tejidos no cardíacos para encontrarlo, pero no cortar demasiado de los tejidos no cardíacos, ya que servirán para atar la aurícula izquierda a la cánula.
  13. Enjuague la línea de la aurícula izquierda del aparato de perfusión para llenar la cánula auricular con tampón caliente y para eliminar cualquier agua o aire que todavía puede estar presente en el tubo. Tenga especial cuidado de eliminar cualquier burbuja de aire del aparato para minimizar la posibilidad de embolia de aire en el momento que el corazón está unido a la cánula.
  14. El uso de dos forc micro diseccióneps agarran con delicadeza la apertura de la vena pulmonar y el corazón se deslizan arriba sobre la cánula auricular. Puede ser necesario cambiar la posición del corazón haciendo girar suavemente la cánula de la aurícula y / o aórtica para llevar a cabo este paso. En cualquier caso, asegúrese de que el procedimiento no impone una carga excesiva sobre el corazón y causar la flexión de la aorta. Atar la aurícula izquierda a la cánula auricular con una sutura de seda 3-0.
  15. Abra la línea de fibrilación y al mismo tiempo cambiar la línea aórtica desde el modo de Langendorff al modo de trabajo. Si hay fugas de búfer fuera de la aurícula izquierda, cerca de la línea de la fibrilación, cambiar de nuevo la línea de perfusión de Langendorff aórtica, y el uso de otra sutura de seda 3-0 para empatar la aurícula izquierda con más seguridad a la cánula.

5. La medición de la función cardiaca y Toma de Muestra

NOTA: La determinación de los flujos metabólicos requerirá el conocimiento del flujo coronario (CF). Como se describe a continuación, los valores de flujo coronario puede serobtenida con el simple uso de un cronómetro. Además, la medición de flujo aórtico (FA) con el mismo método permitirá la determinación del gasto cardíaco (CO = CF + AF), que luego se puede utilizar para calcular la potencia cardiaca (CP) como una medida general de la función cardíaca mediante la aplicación de la fórmula CP = CO (m3 / s) * poscarga (Pa). Otro método disponible para la evaluación de la función cardiaca se basa en la medición del tiempo real de la presión de pulso con un transductor de presión (figuras 3 y 4). Aunque es opcional, las mediciones más precisas y detalladas de la función contráctil cardiaca y hemodinámica, incluyendo la determinación de la presión sistólica ventricular izquierda y diastólica funciones, se consiguen con el uso de un catéter de conductancia de presión-volumen (PV). En esta sección se describe brevemente la cateterización del corazón aislado. Información adicional acerca de la calibración de los catéteres PV y el análisis de datos con el software estadístico puede serencontrado en las referencias 14,15.
PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos implican la manipulación de material radiactivo. Use el EPP apropiado y siga las normas de eliminación de residuos y de seguridad establecidos por la oficina de la seguridad radiológica de la institución.

  1. Si el experimento incluye la medición directa de la función ventricular izquierda con un catéter, perforar el ápice del VI con una aguja de 26 G e introducir el catéter a través de la punción.
  2. Cuando se utiliza un catéter de presión-volumen, posicionar cuidadosamente el catéter de manera que su eje está alineado con el eje longitudinal del VI, con el electrodo distal derecho por debajo de la válvula aórtica y adyacente a la frontera endocárdica, y el electrodo proximal justo dentro de la pared ventricular.
  3. Sellar el corazón en la cámara del corazón con camisa de agua y controlar los parámetros funcionales cardíacos con el software de adquisición de datos. Iniciar la grabación después de los parámetros cardíacos de línea de base se han mantenido estables durante más de 5 minutos.
  4. Determinar el flujo coronario por measuring el tiempo requerido para llenar el tubo de la jeringa 20 ml unido por debajo de la cámara del corazón. Después de la medición, abrir la llave de tres vías para vaciar el efluente coronario en el contenedor de residuos radiactivos líquidos.
    NOTA: Las mediciones de flujo también se pueden realizar utilizando un medidor de flujo y flowprobes.
  5. Usar la jeringa 3 ml unido al brazo lateral de la llave de tres vías para recuperar ~ 2 ml efluente coronario a medida que sale del corazón. Transferir 0,5 ml del efluente coronario en un tubo sin tapón de microcentrífuga de 2 ml y proceder inmediatamente con la determinación de las tasas de oxidación de la glucosa (Sección 6 más adelante).
  6. Transferir el resto de la muestra del efluente coronario (~ 1,5 ml) en un tubo de microcentrífuga debidamente etiquetados y almacenar en hielo.
  7. Repita los pasos 5.4 hasta 5.6 a intervalos regulares (por ejemplo, cada 5 o 10 minutos) hasta el final del experimento de perfusión.
  8. Si se utiliza un catéter de presión-volumen, inyectar un bolo de 10 l de la solución salina hipertónica (15%)en la línea de la aurícula derecha y antes de la cánula auricular antes de concluir el experimento. Utilice esta inyección en bolo para calcular la conductancia en paralelo (V p), que es crítica para la determinación exacta del volumen cardíaco 15.
  9. Quitar el sello de la cámara del corazón y retirar el catéter del LV si uno se utilizó en el experimento. Recuperar el corazón utilizando una de las siguientes opciones:
    1. Si no hay necesidad de aislar zonas específicas del corazón para los análisis posteriores y si el aparato de perfusión permite, tanto los tubos de auriculares y la aorta cerca e inmediatamente congelar-abrazadera del corazón en sus cánulas utilizando pinzas Wollenberger previamente enfriado en nitrógeno líquido.
    2. Como alternativa, cortar el corazón de las cánulas y soltarlo en tampón KH helada. secar rápidamente el corazón en una toalla de papel y medir su peso en húmedo. El corazón puede ser diseccionado y recogido muestras de tejido para realizar mediciones específicas. Congelar el tejido restante usando pinzas Wollenbergers pre-enfriado en nitrógeno líquido.
  10. Almacenar el tejido del corazón congelado a -80 ° C hasta la determinación del peso en seco (ver sección 8. Los cálculos).

6. Determinación del infarto de oxidación de la glucosa tarifas

NOTA: El método consiste en la recuperación cuantitativa de 14 CO 2 a partir del efluente coronario con una solución de captura de hidróxido de hiamina. El 14 de CO 2 disuelto como H 14 CO3- se recupera después de la acidificación del tampón con ácido perclórico. Las muestras deben ser procesadas inmediatamente después de su recuperación como difusión pasiva de gas entre el aire y la muestra se traducirá en una pérdida de 14 CO 2 en el tiempo. Los viales de centelleo deben estar bien selladas con los tapones de la manga de goma para evitar la pérdida de 14 CO 2 después de la adición de ácido perclórico. Si es necesario, Parafilm puede ser usado para asegurar los tapones de goma a la mangaviales (Figura 2).

  1. Añadir 1 ml de 10x concentrada de hidróxido de hiamina a viales de centelleo de vidrio (un vial por muestra + dos viales adicionales para la determinación de la actividad de fondo).
    PRECAUCIÓN: Hidróxido de hiamina es altamente tóxico y provoca graves quemaduras. Consultar la ficha de seguridad de productos para el manejo y almacenamiento apropiado.
  2. Con ayuda de pinzas delicadamente transfieren el tubo sin tapón de microcentrífuga de 2 ml que contiene la muestra de efluente 0,5 ml coronaria a un vial precargada con el hidróxido de hiamina. Use 0,5 ml de tampón de perfusión para la determinación de la actividad de fondo.
  3. Se tapa el vial con un tapón de manguito de goma. Parafilm puede ser usado para asegurar el sellado del vial. Usando una jeringa de 1 ml y una aguja larga 23 G, inyectar 200 l de ácido perclórico (60% w: w%) a través del tapón de manguito de goma y directamente en el tubo sin tapón 2 ml.
    NOTA: El efluente coronario debe girar blanco debido a la precipitación de BSA.
  4. Dejar que los viales sdurante la noche.
    PRECAUCIÓN: El ácido perclórico es altamente corrosivo, puede actuar como un oxidante y / o provocar un riesgo de explosión. Consultar la ficha de seguridad de productos para el manejo y almacenamiento apropiado.
  5. Al día siguiente, quitar los tapones de goma de la manga. recuperar cuidadosamente cada tubo sin tapón 2 ml con unas pinzas y se lava la parte inferior del tubo en la parte superior del vial abierto con 1 ml de cóctel de centelleo para recuperar todo el hidróxido de hiamina. Desechar el tubo sin tapón en un contenedor de residuos radiactivos debidamente etiquetado.
  6. Añadir un cóctel de centelleo 9 ml por vial adicional. Añadir 0,5 ml de tampón de perfusión directamente a dos viales llenos con 10 ml de cóctel de centelleo líquido para la determinación de la actividad específica. Agitar vigorosamente los viales con la mano y esperar por lo menos 6 horas para permitir que las burbujas de aire se disipe antes de la medición en un contador de centelleo líquido configurado de forma adecuada para los experimentos de marcado doble.
    NOTA: Usar frascos de vidrio transparente para visualizar el NEedle al perforar los tapones de goma de la manga. No deje caer el ácido perclórico en el hidróxido de hiamina ya que esto va a arruinar la reacción. La adición de los comunicados de ácido perclórico al 14 CO 2 a partir del efluente coronario en el aire. A pesar de que los viales se deben encerrar y todo el 14 de CO 2 deben quedar atrapadas en el hiamina de hidróxido, se recomienda realizar este ensayo bajo la campana química.

7. Determinación de miocardio oleato de oxidación tarifas

NOTA: El método se basa en la separación cuantitativa y recuperación de 3 H 2 O del efluente coronario usando una resina de intercambio aniónico fuerte. A diferencia de la recuperación de 14 CO 2, no hay problema de estabilidad de la muestra y el efluente coronario se puede mantener en hielo o se almacena en el congelador antes de realizar el ensayo.

  1. Preparar columnas de resina de intercambio de aniones (una columna por ejemplo t +wo columnas adicionales para la determinación de la actividad de fondo) llenando la punta de los tubos de jeringas de 3 ml con lana de vidrio. Añadir la suspensión de resina / agua con una pipeta de transferencia hasta que la resina alcanza la marca de 2 ml en el tubo de la jeringa.
  2. Lavar la resina haciendo pasar 2 ml de agua ultrapura a través de la columna. Repita este paso dos veces más.
  3. Coloque viales de centelleo abiertas en las columnas y la carga de 0,5 ml del efluente coronario por columna. Cargar 0,5 ml de tampón de perfusión para la determinación de la actividad de fondo.
  4. Se lavan las columnas sucesivamente con 0,5, 1 y 2 ml de agua ultrapura. Una vez que se realiza la elución, desechar las columnas en un contenedor de residuos radiactivos debidamente etiquetado.
  5. Añadir cóctel de centelleo de 13 ml de líquido por vial de centelleo. Añadir 0,5 ml de tampón de perfusión directamente a dos viales llenos con 13 ml de cóctel de centelleo líquido para la determinación de la actividad específica. Agitar vigorosamente los viales y esperar al menos 6 horas antes de medir en un líquido de cienciacontador ntillation valor apropiado para experimentos de marcado doble.

8. Cálculos

  1. Si no lo ha hecho, determinar el peso húmedo de todo el corazón perfundido.
    NOTA: No permita que el tejido congelado se descongele si los análisis moleculares y bioquímicos se van a realizar posteriormente en el tejido restante.
  2. Determinar el peso húmedo de una muestra de tejido del conjunto perfuse-corazón (utilice aproximadamente 15 a 30% de todo el corazón). Colocar la muestra de tejido en un horno a 50 ° C durante la noche y medir su peso en seco. Utilice la proporción peso húmedo / peso seco de la muestra de tejido para determinar el peso en seco de todo el corazón en gramos (g de peso seco.).
  3. Para cada punto de tiempo x expresar el valor de flujo coronario CF x en ml / min.
  4. Determinación de la tasa de oxidación de la glucosa
    1. Se promedian los dos desintegración / min (dpm) los valores medidos para la actividad de fondo de 14 C a DETERMIne el factor de corrección 14C dpm ba.
    2. Determinar el promedio de 14C valor de actividad específica 14C dpm sa.
    3. Determinar la radiactividad específica de la glucosa en dpm / mol (F Glu) mediante la aplicación de la fórmula
      Ecuación 1
      NOTA: Cuando n Glu (mol) = C Glu (mol / L) * volumen de la muestra (L) = 2,5 cuando se utiliza la glucosa a 5 mmol / L y una muestra de 0,5 ml.
    4. Determinar, para cada punto de tiempo x la velocidad de producción de 14 CO 2 en dpm / min (A) mediante la aplicación de la fórmula
      Ecuación 1
      NOTA: En caso Vol x (ml) = 0,5
    5. Una brecha entre el valor determinado del peso del corazón seco para obtener la tasa normalizada de producción de 14 CO 2 (una norma
    6. Aplicar la fórmula GO = A Norma / F Glu para obtener la velocidad de oxidación de la glucosa (GO) en mol de glucosa / min por g de peso seco.
  5. Determinación de la velocidad de oxidación de oleato
    1. La media de los valores de dos desintegración / min (dpm) medidos para la actividad de fondo de 3 H para determinar el factor de corrección 3H dpm ba.
    2. Determinar el promedio de 3H valor de actividad específica 3H dpm sa.
    3. Determinar la radiactividad específica de oleato en dpm / mol (F Ol e) mediante la aplicación de la fórmula
      Ecuación 1
      NOTA: Cuando n Ole (mol) = C Ole (mol / L) * volumen de la muestra (L) = 0,2 cuando se utiliza oleato a 0,4 mmol / L y una muestra de 0,5 ml.
    4. Determinar para cada timpunto e x la velocidad de producción de 3 H 2 O en dpm / min (B) mediante la aplicación de la fórmula
      Ecuación 1
      NOTA: En caso Vol x (ml) = 0,5
    5. Divide B por el valor determinado de peso del corazón seco para obtener la tasa normalizada de producción de H 2 O 3 (B Norma) en dpm / min por g de peso seco.
    6. Aplicar la fórmula OO = B Norma / F Ole para obtener la tasa de oxidación de oleato (OO) en mol de oleato / min por g de peso seco.

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Representative Results

Dos experimentos representativos se describen en las siguientes figuras. En ambos casos, se aisló el corazón de un 16 semanas de edad macho Sprague Dawley de rata perfundido y en el modo de trabajo con tampón KH preparado de acuerdo con el protocolo anterior. En cada experimento, el corazón se sometió a una condición de estrés para afectar el trabajo cardíaco. la función contráctil cardiaca se evaluó por registro continuo de la presión de pulso a través de la inserción de un transductor de presión en la línea aórtica y por la determinación de la energía cardiaca. Las consecuencias de cada condición de estrés en la utilización de sustratos de energía proporcionando al mismo tiempo se determinaron por medición de las tasas de glucosa y la oxidación de oleato.

En el primer experimento, un aumento agudo de la carga de trabajo se simuló después de 20 min de perfusión en la carga de trabajo cercana a la fisiológica mediante el aumento de la poscarga por 40% (consigue manualmenteel aumento de la cámara de desbordamiento aórtica) y mediante la adición de epinefrina (1 mol / L) al tampón de perfusión (Figura 3A). La frecuencia cardíaca, que puede ser determinado midiendo el intervalo entre los valores de pico de presión sistólica en la traza de la presión de pulso, aumentó inmediatamente por más de 50% después de la inducción workjump (Figura 3B). Potencia cardiaca aumentó en más de un 40% a workjump, que fue acompañado por un aumento en las tasas de glucosa y la oxidación de oleato (Figura 3C). Los resultados muestran que, bajo la presión de un aumento agudo en la carga de trabajo, el corazón se adapta rápidamente a aumentar la generación de energía para la contracción de la glucosa y la oxidación de ácidos grasos. Sin embargo, el aumento relativo de la velocidad de oxidación era más importante para la glucosa (~ 2,8 veces) lo que era para oleato (~ 1,3 veces). El aumento de la dependencia de la oxidación de hidratos de carbono para hacer frente a la carga de trabajo adicional es una característica típica del corazón de los mamíferos sobrecarga de presión-18

En el segundo experimento, el corazón se perfundió en condiciones basales durante 20 min seguido de 15 min,, isquemia normotérmica mundial (inducido por el cierre tanto de la fibrilación y las líneas de la aorta) y 30 min de reperfusión (Figura 4A). En estas condiciones experimentales, una presión de pulso casi normal fue restaurado entre 2 y 3 min después del comienzo de la reperfusión (Figura 4B). Potencia cardiaca aumentó rápidamente por encima de los valores anteriores a la isquemia durante los primeros 10 minutos de la reperfusión antes de caer de nuevo a los valores cercanos a la línea de base (Figura 4C). En comparación con la línea de base, la velocidad de oxidación de oleato se incrementó durante la reperfusión, mientras que la oxidación de glucosa rápidamente vuelto a los niveles pre isquémicos. Al medir simultáneamente la función contráctil y las tasas de oxidación de sustratos uno puede apreciar claramente que, en las presentes condiciones experimentales, la variación en las tasas de óxido de ácidos grasosación es el principal determinante de los cambios en la cantidad de trabajo generados en la reperfusión. El interruptor de alta hacia la utilización de ácidos grasos de post isquemia es una característica bien estalished-reperfundido del corazón 19.

Figura 1
Figura 1:. Simplificado Esquema del aislado Aparato corazón de rata de Trabajo El tampón de Krebs-Henseleit complementado con la solución de ácido graso-BSA se oxigena mediante el paso a través de un oxigenador de membrana. valores de precarga y poscarga cardíacas típicas para un corazón de rata perfundido en condiciones cercanas a las fisiológicas se indican. Los ajustes se pueden modificar mediante el ajuste de la altura del embalse auricular y cámara de desagüe aórtica. Los tubos de jeringas graduadas se han colocado debajo de la cámara del corazón y la cámara de desbordamiento de la aorta con el fin de medir el flujo coronario y el flujo aórtico, respectivamente. El flujo detampón puede ser detenido (cuando la medición de los flujos aórticos y coronarios) o desviado (cuando se cambia de la Langendorff para el modo de trabajo) mediante el uso de llaves de paso de tres vías. Las flechas rojas indican el posicionamiento óptimo para conexión en línea microlelectrodes de oxígeno para determinar la diferencia de oxígeno "arteriovenosa". En la línea de sondas de flujo y transductores de presión se pueden colocar en las líneas de precarga y la poscarga para medir las tasas de flujo auricular y la aorta y las presiones (flechas verdes). presiones y volúmenes del ventrículo izquierdo también se pueden grabar con un catéter PV insertado a través del vértice del ventrículo izquierdo. No se muestra en la figura es la camisa de agua que rodea todos los elementos de cristalería y el tubo de perfusión en el color azul oscuro. Estos elementos con camisa de agua están todos conectados en serie mediante un tubo a un baño de agua circulante a 37 ºC. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de tsu figura.

Figura 2
Figura 2:. La representación de los diferentes pasos en la configuración del CO 2 Trampa (A) Añadir 1 ml de 10x concentrada de hidróxido de hiamina. (B) Añadir una muestra de 0,5 ml contenida en un tubo sin tapón. (C) sellar el vial. (D) Inyectar 200 l de ácido perclórico (60% w: w%). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Los resultados representativos de un experimento Workjump (A) registro continuo de la presión del pulso.. (B) Breve engrabación valo que representa el cambio en la presión del pulso en el momento de la iniciación workjump. (C) las tasas cardíacas de oxidación de la glucosa (trazo rojo con círculos) y la oxidación de oleato (trazo azul con cuadrados) se determinaron mediante análisis del efluente coronario en un intervalo de 5 min. Potencia cardiaca (trazo negro con triángulos) se determina mediante la medición del gasto cardiaco al mismo tiempo, se recuperaron las muestras de los efluentes coronarios. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Los resultados representativos de un experimento por isquemia-reperfusión (A) registro continuo de la presión del pulso.. (B) la grabación de intervalo corto que representa la recuperación de la función contráctil dusonar los primeros 5 minutos de la reperfusión. (C) las tasas cardiacas de oxidación de la glucosa (trazo rojo con círculos) y la oxidación de oleato (trazo azul con cuadrados) se determinaron mediante análisis del efluente coronario en un intervalo de 5 minutos, excepto durante los primeros 5 minutos de la reperfusión, donde se realizaron análisis en un intervalo de 1 min. Potencia cardiaca (trazo negro con triángulos) se determina mediante la medición del gasto cardiaco al mismo tiempo, se recuperaron las muestras de los efluentes coronarios. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo anterior detalla los métodos para cuantificar simultáneamente el flujo de sustrato a través de la oxidación de la glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de trabajo. Las mediciones se pueden superponer a los parámetros funcionales cardíacos registrados, para determinar la relación entre el metabolismo de los sustratos y el trabajo cardíaco en condiciones basales y de estrés (cambio en la carga de trabajo, por isquemia-reperfusión, etc ...). También es posible evaluar cómo la relación metabolismo / contracción se ve afectada por las condiciones preexistentes, tales como insuficiencia cardíaca y diabetes. Además, el corazón de roedores modificados genéticamente se puede usar para interrogar el efecto de una proteína específica en el metabolismo y la función cardíaca. Por último, el efecto de los fármacos y otros factores que circulan en estos parámetros se puede probar de forma individual. Debido a que el flujo de glucosa a través de la glucólisis no siempre se correlaciona con la tasa de oxidación de la glucosa, puede ser informaTIVE seguir las tasas de flujo de glucosa a través de ambas vías en un solo entorno experimental.

Las tasas de glucólisis se pueden determinar mediante la adición de [5- 3 H] glucosa al tampón de perfusión, debido a que la liberación de 3 H 2 O está determinado por la actividad de la etapa enolasa de la glucólisis 20. Alternativamente [2- 3 H] glucosa, que lleva a la producción de 3 H 2 O en el paso de fosfoglucosa isomerasa de la vía glicolítica, puede ser utilizado para interrogar a las tasas de captación de glucosa por el músculo cardiaco 16,17,21. La posibilidad de elegir entre múltiples trazadores radiomarcados para investigar el destino de la glucosa en diferentes niveles de su catabolismo es otro ejemplo de la versatilidad de la técnica. Sin embargo, como todas las mediciones de flujo se basan en la recuperación cuantitativa de cualquiera de las 3 H 2 O o 14 CO 2 a partir del efluente coronario, sólo dos radiomarcadortrazadores ed (uno 3 H-etiquetados y el otro marcado con 14 C) se puede utilizar en el tampón de perfusión a la vez.

consideraciones metodológicas

Existen algunas limitaciones inherentes a la medición de flujo metabólico y la función cardíaca mediante este protocolo. Aunque el uso de tampón KH permite un control total sobre la composición de la perfusión, la relevancia fisiológica de esta configuración experimental puede ser cuestionable. En primer lugar, el uso de una solución cristaloide sobre sangre se conoce un impacto negativo en la hemodinámica cardíaca y la resistencia a la isquemia 22,23. En segundo lugar, el tampón de perfusión que describimos aquí carece de una variedad de hormonas y nutrientes que pueden modular directamente el metabolismo cardiaco y por consiguiente afectar a la respuesta del corazón a una condición de estrés simulado. De hecho, el corazón de los mamíferos es un omnívoro metabólica y puede, además de glucosa y ácidos grasos, utilizar otros sustratos a fulfill sus necesidades energéticas (lactato, piruvato, cuerpos cetónicos, de cadena ramificada aminoácidos). Hay una creciente evidencia de que algunos de estos sustratos juegan un papel importante en la remodelación metabólica del corazón enfermo 24,25. Es perfectamente posible que el investigador para agregar estos sustratos para el tampón de perfusión, para modular su concentración con el fin de imitar más de cerca las diferentes condiciones fisiológicas (por ejemplo, estado de alimentación frente ayunas) o estados de enfermedad, y seguir sus tasas de oxidación utilizando la trazadores radiomarcados adecuados 26,27. El metabolismo de los triglicéridos también se puede remontar, y en ese caso se recomienda evitar el uso de heparina antes de la escisión del corazón, ya que esto induce la liberación de la lipoproteína lipasa del endotelio y disminuir de manera significativa la extracción de triglicérido de la memoria intermedia 28. Con una cuidadosa selección de los trazadores radiomarcados, la incorporación de radiactividad en varmetabolitos de tejido pagarés también se pueden medir después de la perfusión para determinar los parámetros tales como la síntesis de novo de triglicéridos, la rotación de glucógeno, o las tasas de síntesis de proteínas 18,29,30. En otras palabras, el investigador puede trabajar con una amplia variedad de sustratos / hormonas combinaciones y concentraciones. La elección de la composición del tampón dependerá principalmente de los objetivos del experimento. Debido a estas condiciones de tampón controladas crean un modelo fisiológico "simplificado", los resultados de los experimentos de perfusión ex vivo de corazón de trabajo deben ser interpretados con precaución y si es posible los datos deben ser validados en vivo.

Elección del anestésico

El anestésico utilizado en las ratas antes de la extirpación del corazón debe cuidadosamente seleccionados en base a sus conocidos efectos sobre el sistema cardiovascular y el metabolismo para garantizar que esto no va a interferir con el experimento que se realiceed. Tanto los anestésicos inhalatorios inyectables y rápidamente inducen la hiperglucemia y grados variables de intolerancia a la glucosa que pueden afectar el metabolismo cardiaco durante la perfusión 31,32. En comparación con otros agentes, los efectos a corto plazo de los barbitúricos (pentobarbital y tiobutabarbital) en homeostasis de la glucosa son relativamente insignificante 31. Sin embargo, la anestesia pentobarbital intraperitoneal antes de la escisión corazón se ha demostrado que disminuye el gasto cardíaco, deteriorar la función ventricular izquierda, y aumentar la liberación de lactato de miocardio en un protocolo ex vivo de isquemia-reperfusión 33. El efecto inotrópico negativo que pentobarbital tiene en el corazón de rata aislado Se sugiere que es causada por la acumulación de tejido de la droga 34. Por el contrario el uso de anestésicos inhalatorios, que se lavan más rápidamente fuera del tejido cardiaco, se asocia con una mejor función contráctil ex vivo 33. Los anestésicos volátiles pueden proveer a cardioprotection durante la isquemia-reperfusión a través de un mecanismo que implica la apertura de los canales de K ATP mitocondrial y el aumento de la unión de la hexoquinasa a las mitocondrias 32. En resumen, el tipo de anestésico utilizado en un protocolo de perfusión del corazón aislado de trabajo es una variable importante en la evaluación de los parámetros funcionales y metabólicas que pueden afectar directamente a los resultados del experimento. Por lo tanto, el tipo y la dosis de anestésico usado siempre se deberán presentar en la sección de métodos de un experimento, y estos parámetros no se deben cambiar entre los experimentos que están destinados a ser comparado.

Los radioisótopos en la perfusión del corazón

Todas las mediciones de flujo realizadas con el protocolo anterior se realizan en el modo de no recirculación, lo que significa que el efluente coronario se descarta en lugar de ser devuelto al depósito de regulación (figura 1). El investigador más bien puedeelegir utilizar el aparato de perfusión en el modo de recirculación, que tiene la ventaja de requerir un volumen mucho menor de tampón y por lo tanto la radiactividad de operar. Sin embargo, el reciclado del efluente coronario compromete la composición en estado estacionario del tampón de perfusión a través de la recuperación de los subproductos procedentes de la actividad metabólica del corazón (incluyendo lactato, sino también 3 H 2 O y H 14 CO3-), lo que complica la determinación de flujos metabólicos y puede incluso alterar la función cardíaca con el tiempo 35. Estos problemas se evitan en la modalidad sin recirculación. Debido a la cantidad de radioactividad y al gran volumen de tampón de perfusión utilizado en un solo experimento, el investigador debe poner especial cuidado cuando se utiliza el corazón de rata que trabaja en los análisis de flujo metabólico. Cuando se utiliza un aparato de perfusión, por primera vez, se recomienda llevar a cabo varios experimentos simulados con tampón no radiactivo para familiarizarse con ladiferentes etapas del protocolo y con los procedimientos de seguridad. El montaje del corazón en las cánulas es un paso particularmente sensible, ya que requiere el establecimiento de un contacto cercano con el aparato y porque tampón pueden tener fugas o disparar hacia fuera de uno de los vasos sanguíneos seccionados del corazón. El aparato de perfusión descrita por Taegtmeyer y colegas 11 tiene la ventaja de que incluye un depósito Langendorff que es totalmente independiente del resto del aparato de perfusión, y por lo tanto puede ser llenado con tampón KH no radiactivo para evitar derrames de material radiactivo durante la canulación del corazón . Independientemente del sistema utilizado, los experimentos deben realizarse en un área dedicada con acceso restringido. El cuarto debe incluir un lavabo y un suministro de agua ultrapura para llevar a cabo la preparación de amortiguación y limpieza de equipo contaminado en la misma zona. Los investigadores deben trabajar en estrecha colaboración con la oficina de la seguridad radiológica de su institución para establecer sESPECÍFICOS procedimientos de descontaminación de contención, control y comunicaciones.

La limpieza del aparato de perfusión

El puesto de limpieza experimental del aparato de perfusión es un paso crítico que demasiado a menudo se pasa por alto y, si no son cuidadosamente ejecutada, responsable de la mayor parte de las cuestiones relacionadas con la mala reproducibilidad experimental. El tampón de perfusión rica en nutrientes y la alta temperatura del sistema de perfusión ofrecen condiciones ideales para el crecimiento de bacterias y hongos. La utilización de proteínas (insulina, BSA) y los ácidos grasos en el tampón de perfusión añade otro grado de complejidad al procedimiento de limpieza debido a que estos compuestos se adhieren a la superficie de la tubería y cristalería, haciendo difícil para eliminar del aparato. El uso de radioisótopos también impondrá restricciones adicionales, tales como la creación de un área de contención dedicado en el laboratorio para la manipulación de los equipos y la eliminación de un sólido contaminadod residuos radiactivos líquidos. Por lo tanto, el procedimiento de limpieza adecuada en su mayoría dependerá tanto de la composición del tampón de perfusión y del tipo de aparato de perfusión usado. Si se utiliza un aparato comercial, consulte el sitio web del fabricante o póngase en contacto con el servicio al cliente para obtener información sobre cómo realizar la limpieza sin dañar ninguno de los componentes del aparato. En general, todas las partes de vidrio y de plástico se pueden lavar con una amplia gama de jabones. detergentes accionados por enzimas activas son particularmente útiles para eliminar los residuos de ácido graso-BSA. La mayoría de los contaminantes también serán eliminados mediante la ejecución de HCl 0,1 M o 0,1 M HNO 3 a través del aparato durante varias horas. Obtenemos resultados de limpieza satisfactorios por el lavado del sistema primero con HCl 0,1 M, luego con una fresca 1% (w: v) de detergente alimentado enzima activo preparado en agua caliente, y finalmente enjuagando el sistema con agua ultrapura. Cuando se utiliza un aparato de perfusión hecha a la medida como la que originalmente described por Taegtmeyer y colegas 11, puede ser más fácil y más eficaz de desmantelar completamente el aparato al final de cada día experimental. El material de vidrio se limpia mediante una inmersión 15 min en un baño concentrada de un ácido crómico y la mezcla de ácido sulfúrico. Las piezas de plástico y el tubo de PVC se pueden lavar con un detergente libre de residuos. Encontramos que es más rápido y más fiable para reemplazar por completo el tubo de PVC todos los días, ya que limita la manipulación de material contaminado por radioquímicos y porque impide que queden residuos de productos de limpieza atrás. En cualquier caso, el investigador debe aplicar las siguientes reglas: 1- Limpiar el aparato de perfusión y todo el equipo sucio inmediatamente después de completar el experimento de perfusión. Esperar sólo hará que la limpieza sea más difícil y requiere mucho tiempo. 2- Compruebe el baño circulante del sistema de camisa de agua regularmente por contaminaciones. El uso de un acondicionador de agua aumentará el intervalo entre cinclinándose del baño de agua. 3- Después de la limpieza, enjuague bien el material de vidrio y tubos con agua del grifo varias veces y terminar de enjuagar con agua ultrapura para eliminar los residuos de productos de limpieza. 4- Dos preparaciones de corazón consecutivamente no cuando la disección fue cuidadosamente ejecutado y el tampón de perfusión cuidadosamente preparada es probable que indicar una contaminación del aparato (ya sea por bacterias o por residuos de disolvente). Si esto sucede, el lavado y enjuague de los procedimientos deben ser enteramente repiten.

Alineándose con el corazón del ratón

Aunque el protocolo anterior se centra en la determinación de las tasas metabólicas en un corazón de rata aislado de trabajo, los mismos procedimientos se pueden aplicar a la corazón de ratón con algunas modificaciones al aparato de perfusión y de adquisición de datos 36 equipos. Debido a su tamaño más pequeño es el corazón aislado de ratón de trabajo es técnicamente más difícil, pero debido a su forma significativatasa de flujo inferior que tiene la ventaja de requerir un volumen mucho menor de tampón de perfusión. El gran número de modelos de ratones genéticamente modificados que ya están disponibles también hace que el corazón aislado de ratón de trabajo muy atractivo para estudiar la función de un único producto génico en metabólica cardíaca y remodelación funcional. Sin embargo, los recientes avances tecnológicos en la edición del genoma y un catálogo cada vez mayor de ratas transgénicas y knockout están cerrando rápidamente la brecha entre las dos especies de roedores. Por otra parte, la rata durante mucho tiempo ha sido elogiado como un modelo animal superior para investigar las enfermedades cardiovasculares debido a su fisiopatología imita las condiciones humanas 37. Por estas razones, creemos que el corazón de rata aislado de trabajo todavía tienen un lugar importante en la era moderna de la investigación cardiovascular.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP358
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific P284
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) Fisher Scientific M63
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific S233
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670
AG 1-X8 resin, chloride form, 100 - 200 dry mesh size, 500 g Bio-Rad 1401441 This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form  (see reference below), but this will cost almost 8 times more
AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100 - 200 dry mesh size, 100 g Bio-Rad 1432445 Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol)
Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder Fisher Scientific 09-753-2
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318 Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage.
Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder Fisher Scientific 11-138B
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder EMD Millipore 820027 We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart.
Sodium Oleate Sigma-Aldrich O7501
Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- PerkinElmer NET289005MC Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter Fisher Scientific 08-667E
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glucose, D-[14C(U)]- PerkinElmer NEC042B005MC Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Humulin R U-100 Eli Lilly and Company NDC 0002-8215-01 (HI-210)
Inactin Hydrate Sigma-Aldrich T133 Controlled substance on USDEA Schedule III
3-0 Silk Black Braid Roboz Surgical SUT-15-3
10x Hyamine Hydroxide PerkinElmer 6003005 Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
20 ml Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-341-25E Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2
20 ml HDPE Scintillation Vials Fisher Scientific 03-337-23B Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O
Red Rubber Sleeve Stoppers Fisher Scientific 14-126DD Fit 20 mL scintillation vials; Reusable
BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm BD 305194 Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap
Perchloric Acid, 60% Fisher Scientific A228 Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
Ultima Gold, Scintillation Cocktail PerkinElmer 6013327
Glass Wool Fisher Scientific AC38606
Decon Dri-Clean Detergent Powder Fisher Scientific 04-355 For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing
Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent Fisher Scientific 16-000-115 For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue

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References

  1. Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
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